DE102007054049A1 - Arzneimitteltransportsystem zur Bekämpfung von Trypanosomen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft solide Partikel zum Transport pharmazeutischer Wirkstoffe in Parasitenzellen der Gattung Trypanosoma, Verfahren zu deren Herstellung, Arzneimittel, enthaltend diese Partikel, sowie die Verwendung dieser Partikel in verschiedenen ausgewählten Indikationen, gekennzeichnet dadurch, dass die soliden Partikel eine monomolekulare Matrix (Ktenat) umfassen und die Wirkstoffe durch nichtkovalente Interaktionen, z. B. Stapelkräfte, an diese Matrix gebunden sind.

Description

• Die Erfindung betrifft solide Partikel zum Transport pharmazeutischer Wirkstoffe in Parasitenzellen der Gattung Trypanosoma, Verfahren zu deren Herstellung, Arzneimittel enthaltend diese Partikel sowie die Verwendung dieser Partikel in verschiedenen ausgewählten Indikationen.
• Ein Hauptziel der pharmazeutischen Forschung ist es gegenwärtig, die gewünschten Effekte bekannter Wirkstoffe zu verstärken und die systemischen Nebenwirkungen zu minimieren, was insbesondere bei Substanzen mit hoher intrinsischer und damit unvermeidlicher Toxizität (z. B. Cytostatika) von großer Bedeutung ist. Dies kann sowohl über die Verringerung der für die therapeutische Wirkung benötigten Gesamtdosis als auch über die Ansammlung der Wirkstoffe am gewünschten Wirkort erreicht werden, was beides durch die kontrollierte, räumlich spezifische Freisetzung von Wirkstoffmolekülen im weitesten Sinne (Proteinen, Peptiden, Nukleinsäuren oder niedermolekularen Substanzen) am gewünschten Zielort – d. h. in einem Zielgewebe oder in einzelnen Zielzellen – bewerkstelligt werden kann. Darunter ist insbesondere der spezifische Transfer von therapeutisch oder diagnostisch nutzbaren Substanzen in definierte, insbesondere strukturell definierte biologische Ziele ("drug delivery" oder "drug targeting") zu verstehen, der ein wichtiges Ziel der gegenwärtigen pharmazeutischen Forschung ist.
• Von besonderer Bedeutung ist dieser Ansatz bei der Bekämpfung von eukaryontischen Parasiten wie beispielsweise pathogenen Protozoen, da der Stoffwechsel dieser eukaryontischen Parasiten dem des befallenen Säugers hinreichend ähnlich ist, dass sich eine "physiologische Achillesferse" wie die 70S-Ribosomen oder die Mureinzellwand der Bakterien nur schwierig finden lässt. Vereinfachend lässt sich sagen, dass für jeden chemischen Stoff, der für eukaryontische Parasiten toxisch ist, auch für den Säuger-Wirt zunächst einmal eine beträchtliche Toxizität anzunehmen ist; bzw. dass Stoffe, die in nur bei den Parasiten zu findende Prozesse eingreifen, zumeist eine solche Spezialisierung aufweisen, dass eine rasche Resistenzbildung zu erwarten ist. Arzneimitteltransportsysteme, die die Wirkstoff selektiv an die Parasitenzellen abgeben, könnten hierbei das Verhältnis von Wirkungen zu Nebenwirkungen verbessern und Stoffe nutzbar machen, die bislang aufgrund ihrer Toxizität gegenüber dem Säugerwirt nicht verwendet werden können.
• Eine wichtige solche durch Protozoen verursachte Erkrankung ist die durch insektenübertragene Parasiten der Gattung Trypanosoma verursachte, im Afrika südlich der Sahara verbreitete Schlafkrankheit. Mit einer geschätzten Infektionsrate von über 50'000 Personen pro Jahr, einer gefährdeten Bevölkerung von über 60 Millionen, einer hohen Morbidität und Mortalität der Infektionen, einer erheblichen volkswirtschaftlichen Bedeutung infolge des negativen Einflusses auf die Viehzucht, dem Fehlen einer Chemoprophylaxe oder Impfung und schlechter Veträglichkeit und mäßiger Wirksamkeit der vorhandenen Therapeutika ist die Schlafkrankheit als eine der bedeutendensten Infektionskrankheit unserer Zeit anzusehen.
• Die heute verfügbare Antikörpertechnologie erlaubt die Erzeugung von hochaffinen Bindungspartnern für nahezu jede beliebige biologische Struktur; überdies sind zahlreiche natürliche Liganden für zelluläre Rezeptoren, auch für Rezeptoren auf den Zellen eukaryontischer Parasiten wie etwa der Trypanosomen, charakterisiert und kloniert worden, so dass es kein Problem mehr darstellt, Moleküle mit hoher und spezifischer Affinität zu den gewünschten Zielen zu erzeugen. In vielen Fällen sind auch niedermolekulare Liganden wie z. B. Glykoside bekannt, die auf chemischem Weg imitiert und somit zur Zielsteuerung verwendet werden können. Dem Fachmann stehen somit verschiedene einschlägig bekannte Methoden zur Verfügung, einen Bindungspartner mit hoher und selektiver Affinität zu einem definierten biologischen Ziel zu erzeugen. Ein solches Molekül wird im Folgenden als "Suchermolekül" bezeichnet.
• Jedoch üben diese Suchermoleküle, ob mikro- oder makromolekular, selber im allgemeinen keine pharmazeutisch nutzbare Funktion aus, während die Wirkstoffmoleküle selbst nicht zielspezifisch sind. Ein Hauptaugenmerk muss daher darauf liegen, diese Trennung zu überbrücken und das therapeutische Potential der verfügbaren Wirkstoffmoleküle mit der Zielspezifität der Suchermoleküle zu verbinden.
• Der effizienteste bislang bekannte und am vielseitigsten verwendbare Ansatz zum Erreichen dieses Ziels besteht in der Verwendung von Trägerstrukturen im kolloidalen(d. h. Sub-μm-)Größenbereich, an deren Oberflächen entsprechende Suchermoleküle gebunden werden können. Geeignete Trägerstrukturen sind kolloidale Partikel, welche mit Antikörpern gegen oder mit natürlichen Liganden für charakteristische Molekularstrukturen des Ziels verknüpft und zugleich durch inerte Beschichtung ihrer Oberfläche gegen die Erfassung und Elimination durch das Immunsystem geschützt werden.
• Aus dem Stand der Technik sind zahlreiche auf Liposomen basierende Ansätze bekannt, die sich jedoch durch folgende Nachteile kennzeichnen:
• • Die Stabilität der Partikel ist zeitlich begrenzt.
• • Die Liposomenmembran ist selbst innerhalb der Stabilitätszeit nicht vollständig dicht, so dass mit Substanzverlust gerechnet werden muss.
• • Die Möglichkeiten der Oberflächengestaltung sind eingeschränkt.
• • Die wässrige Innenphase ist auf hydrophile Substanzen limitiert.
• • Die Beladungseffizienz ist gering: typischerweise < 0,5%.
• • Ungefähr 50% der zur Verknüpfung mit den Suchermolekülen erforderlichen reaktiven Gruppen sind auf der Innenseite der Vesikelmembran gelegen (nicht mehr praktisch verfügbar, kann jedoch unvorhersehbare Reaktionen bewirken).
• • Die Kopplung von Proteinen an Membranen kann zur Bildung von hochimmunogenen Strukturen führen und damit eine Immunreaktion gegen die Liposomen auslösen, die jede weitere Anwendung von Liposomen verhindert.
• • In molekularen Dimensionen betrachtet, sind Liposomen groß und sperrig. Zwar ist es mit entsprechendem Aufwand möglich, Liposomen mit einem Durchmesser von nicht mehr als 50 nm zu erzeugen, deren Stabilität jedoch begrenzt ist; gerade zur Behandlung von Parasitosen sind solche Partikel jedoch unbrauchbar, da typische Parasiten ihre wenigen nicht-variablen Oberflächenkomponenten typischerweise am Boden noch erheblich engerer Schlitze oder Spalten verbergen, wie z. B. der Zellmund bei Trypanosomen, den Erregern der Schlafkrankheit.
• WO 96/20698 beschreibt als Alternative zu Liposomen polymolekulare solide Nanopartikel aus natürlichen oder synthetischen Polykondensaten mit einem überwiegend allgemein beschriebenen eigenschaftsmodifizierenden Oberflächenüberzug aus natürlichen oder synthetischen Makromolekülen. Stabilität und Anwendbarkeit dieser Partikel sind jedoch sehr begrenzt.
• Weitere solide Nanopartikel sind in WO 02/00162 und WO 02/00191 offenbart, worauf hier in vollem Umfang Bezug genommen wird.
• Die aus dem Stand der Technik bekannten soliden Nanopartikel weisen häufig Probleme in der Stabilität und Herstellbarkeit wie auch im Grad und Umfang der Beladung auf und sind bisher nur sehr begrenzt einsetzbar. Insbesondere ist auch das Problem der gezielten Applikation des Wirkstoffs am gewünschten Wirkort und der Stabilität der Nanopartikel nach der Verabreichung bis zum Erreichen des Wirkortes, das "Drug Targeting", nur unzureichend gelöst. Ein zentrales Problem besteht hierbei in der Oberflächenmodifikation von Nanopartikeln. Konventionelle solid-nanopartikuläre Systeme stellen (im Gegensatz zu Liposomen) aufgrund ihrer extrem hohen spezifischen Interphase zwischen hydrophober Partikelmatrix und hydrophilem Medium ein energetisch ungünstiges System dar, das in Abwesenheit von Stabilisatoren instabil ist: Durch Zusammenlagerung von Partikeln wird die energetisch ungünstige Berührungsfläche minimiert; eine Ausfällung des hydrophoben Partikelmaterials ist die Folge. Daher benötigen solide Nanopartikel einen Überzug, z. B. aus amphiphilen Molekülen, die die Grenzflächenenergie herabsetzen und auf diese Weise die Partikel stabilisieren. Dieser Überzug deckt die Partikelmatrix vollständig ab und entzieht sie so auch dem Zugriff modifizierender Agentien; eine Modifikation des Überzugs selber führt aber andererseits zu einer drastischen Veränderung der physikalischen Eigenschaften und damit zu einer Destabilisierung des Überzugs, weswegen es nicht möglich ist, konventionelle Nanopartikel zur Bindung von Liganden und damit zum "Drug Targeting" zu modifizieren.
• DE 100 30 786.8 , DE 100 3 811.8 , DE 101 18 312.7 , DE 101 18 852.8 , WO 02/00162 , WO 02/00191 und Flaig et al. 2005 (J Drug Del. Sci. Tech. 15(1) : 59–63), auf die hier in vollem Umfang Bezug genommen wird, beschreiben ein auf monomolekularen Partikeln, als "Bdellosomen" bezeichnet, aufgebautes System oberflächenmodifizierbarer fester Partikel. Zusammenfassend basiert dieses System auf einem als "Ktenat" bezeichneten kammförmigen Poly-Polymer mit einem durchgängigen zentralen Rückgrat und mit diesem verknüpften hydrophoben Seitenketten mit reaktiver, hydrophiler Endgruppe, der in wässrigem Milieu eine Flaschenbürstenform annimmt, so dass die Wirkstoffmoleküle durch den beschriebenen Beladungsprozess ins hydrophobe Innere des Ktenat-Moleküls verpackt werden können, während die hydrophilen Enden eine diese Zone umhüllende Schicht bilden, die die Abdiffusion der Wirkstoffmoleküle verhindert, die so beladenen Ktenatmoleküle in Lösung hält und zugleich das Anhängen von zielsuchenden Molekülen, entweder direkt oder über Platzhalter wie z. B. Polyethylenglykol, erlaubt.
• Die grundsätzliche Formel des in WO 02/00162 offenbarten Ktenats ist B-([G-M]_x-G'-N-E)_Y (I)wobei
  B für ein Polymer aus Y Untereinheiten steht, z. B. Polyvinylalkohol,
  G und G' unabhängig voneinander jeweils für -O-, -C(O)O-, -OC(O)-, C(O)N(H)- oder -N(H)C(O)- stehen,
  M und N unabhängig voneinander für aliphatisches Alkyl stehen,
  E für -COOH, -NH₂ oder -SH steht, und
  X und Y unabhängig voneinander jeweils für eine ganze Zahl von 1 bis 10000 stehen.
• Es kann z. B. durch Polykondensation von einem Molekül B mit X·Y der auf M basierenden Seitenkettenmonomere und Y der auf N-E basierenden Seitenkettenendstücke erhalten werden. In einer typischen Ausführungsform wird ein Molekül Polyvinylalkohol aus 4000 Vinyleinheiten mit 400000 Molekülen Milchsäure und 4000 Molekülen an FMOC-geschütztem Alanin durch Umsetzen mit Thionylchlorid in Pyridin in ein Molekül Ktenat umgesetzt, das mithin 4000 alaninterminierte Polylaktid-Seitenketten mit einer durchschnittlichen Länge von 100 Einheiten hat. Es wird typischerweise mit in Benzylalkohol gelöstem Wirkstoff vermischt und der Benzylakohol dann durch Vermischen mit Wasser und Dialyse entzogen, so dass die mit Wirkstoff beladenen Ktenatmoleküle zurückbleiben, wobei die hydrophilen Endgruppen sich um das Molekül herumlegen, wie oben beschrieben. Dieses beladene Molekül kann z. B. über Polyethylenglykol mit Antikörpern verknüpft werden, und zeigt dann gute Zielsuchaktivität.
• Zweckmäßigerweise kann zur Herstellung der Verbindung zwischen Matrix und Suchermolekül ein terminal bifunktionalisiertes Polyethylenglykol als Zwischenstück verwendet werden, vorzugsweise ein Polyethylenglykol, das am einen Ende mit einer aminoreaktiven Gruppe wie z. B. NHS-Ester und am anderen Ende mit einer thiolreaktiven Gruppe wie z. B. Vinylsulfon versehen ist. Solche Gruppen, damit derivatisierte Polyethylenglykole und ihre Verwendung sind dem Fachmann geläufig; siehe z. B. WO 02/00162 und Flaig et al. 2005 (J Drug Del. Sci. Tech. 15(1) : 59–63).
• In einer besonderen Ausführungsform ist ein Teil des Polyethylenglykols monofunktional, insbesondere nur mit einer terminalen aminoreaktiven Gruppe versehen, so dass nur ein Teil der an ein Ktenatmolekül gebundenen Polyethylenglykolketten als Zwischenstück zwischen Matrix und Suchermolekül dienen kann, während die übrigen als inerte Beschichtung fungieren, die das Ktenatmolekül dem Zugriff des Immunsystems entzieht.
• Es wurde gezeigt (Flaig et al. 2005, J Drug Del. Sci. Tech. 15(1): 59–63), dass es möglich ist, Wirkstoffe mit solchem antikörperkonjugierten Ktenat spezifisch und wirksam in Trypanosomen-Zellen zu übertragen. Die Effizienz der Behandlung ist jedoch gemessen an dem Aufwand der Gewinnung von Antikörpern gegen die Zellmund-Komponenten von Trypanosoma mäßig.
• Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein gegenüber dem aus dem Stand der Technik bekannten verbessertes System zum Transport von Substanzen in Trypanosoma-Zellen bereitzustellen.
• Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass Trypanosomen sich gegen das Immunglobulin des Wirtes aktiv zur Wehr setzen, indem sie die hydrodynamischen Kräfte ihres Schwimmens ausnutzen, um Komplexe aus ihrem Oberflächenglykoprotein und Wirtsantikörpern (Engstler & al., Cell 121: 505–515, 2007) zum beim Schwimmen am "Heck" der Zelle gelegenen Zellmund zu strudeln und dort zu inkorporieren. Dieses aktive Fressen von Immunglobulinen eröffnet die Möglichkeit eines gezielteren Transportes.
• Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein molekulares Arzneimitteltransportsystem für Trypanosoma-Zellen basierend auf einer Ktenat-Matrix, dadurch gekennzeichnet, dass die Suchermoleküle F_C-Fragmente von Antikörpern, vorzugsweise von humanen Antikörpern, vorzugsweise auch von Antikörpern der Immunglobulinklasse IgG oder einer ihrer Subklassen sind.
• Der Begriff "Transportsystem für Trypanosoma-Zellen" ist hierbei so zu verstehen, dass das System mittels seiner Suchermoleküle imstande ist, Wirkstoffmoleküle in Trypanosoma-Zellen zu übertragen.
• Als "Wirkstoffmolekül" wird hierbei jede Substanz bezeichnet, die in einem Organismus einen detektierbaren biologischen oder chemischen, vorzugsweise biologischen und besonders bevorzugt einen potentiell therapeutisch oder diagnostisch nutzbaren Effekt hervorruft, vorzugsweise aber eine Substanz, die auf Zellen der Gattung Trypanosoma eine schädigende, vermehrungshemmende, stoffwechselinhibierende, die Genexpression der Trypanosomen modulierende und/oder die Parasitenzellen dem Immunsystem besser zugänglich machende Wirkung ausübt.
• Als "Suchermolekül" wird hierbei ein Molekül bezeichnet, das zu einer starken und selektiven Interaktion mit einer biologischen Molekularstruktur, bevorzugt einer strukturell definierten Molekularstruktur (Zielstruktur), z. B. einem Zelloberflächenprotein oder -glykoprotein besitzt.
• Verfahren zur Herstellung von Antikörpern und Antikörperderivaten wie etwa F_C-Fragmenten sind dem Fachmann vertraut. Exemplarisch seien zitiert: "Molecular Cloning – A Laboratory Manual" von Sambrook, Fritsch & Maniatis; "Current Protocols in Molecular Biology" von Ausubel et al.; "Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual" von Richard J. Simpson; "Techniques in Protein Modification" von Roger L. Lundblad; "Antibodies: A Laboratory Manual" von Harlow & Lane; und "Antibody Engineering" von Kontermann & Dübel.
• Immunglobulin von Menschen und nichtmenschlichen Säugern, insbesondere Immunglobulin der Klasse IgG und ihrer Subklassen, ist von zahlreichen Anbietern kommerziell erhältlich. Ebenso sind F_C-Fragmente heute kommerziell erhältlich. Alternativ können sie durch Spaltung von Immunglobulinmolekülen mit der Protease Papain gewonnen werden. Papain trennt die F_C-Fragmente vom antigenbindenden Teil dergestalt, dass die dimere Struktur der F_C-Fragmente erhalten bleibt. Die F_C-Fragmente können dann durch eine Vielzahl von Verfahren von den abgeschnittenen antigenbindenden Teilen getrennt werden. Entsprechende proteinchemische Verfahren sind im Stand der Technik beschrieben und dem Fachmann geläufig.
• Der Begriff "F_C-Fragment" wird hier so verstanden, dass er beliebige Modifikationen, Derivate und Subfragmente der durch Papainspaltung erhältlichen F_C-Fragmente einschließt, sofern diese noch aktiv von Trypanosomen aufgenommen werden können.
• Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein molekulares Arzneimitteltransportsystem für Trypanosoma-Zellen basierend auf einer Ktenat-Matrix, dadurch gekennzeichnet, dass die Suchermoleküle trypanosomatale Oberflächenglykoproteine oder Fragmente davon sind. Die Oberflächenglykoproteine von Trypanosoma sind identifiziert (Berriman M & al: "The genome of the African typanosome Trypanosoma brucei", Science. 309(5733): 416–22, 2005; PMID 16020726), und ihre Sequenzen sind z. B. über die NIH-Datenbank (http://www.ncbi.nih.gov) einsehbar. Der Fachmann kann anhand dieser Sequenzen ohne weiteres die Oberflächenglykoproteine von Trypanosoma rekombinant exprimieren.
• Der Begriff "Oberflächenglykoprotein von Trypanosoma" wird hier so verstanden, dass er sämtliche auf der Oberfläche von Trypanosoma-Zellen exprimierten Glykoproteine sowie beliebige Modifikationen, Derivate und Subfragmente derselben einschließt, sofern diese noch aktiv von Trypanosomen aufgenommen werden können, ganz besonders aber die "Variable Surface Glycoproteins" und ihre Modifikationen, Derivate und Subfragmente.
• Das Variable Surface Glycoprotein (VSG) wird von den Trypanosomen gebildet, um die Immunantwort des Wirts zu unterlaufen. Es handelt sich um einen sehr effektiven Anpassungsmechanismus des Erregers an die komplexen Abläufe des Immunsystems von Wirbeltieren. Das Immunsystem des Wirts wird dadurch lahmgelegt, dass ihm ständig neue Antigenvarianten präsentiert werden.
• Das VSG ist ein Glykoprotein, das die ganze Parasitenoberfläche bedeckt. Es liegt als Homodimer vor, dessen identische Untereinheiten jeweils eine Molekülmasse von etwa 60 kDa haben. Die C-terminalen Enden sind über einen Glycosylphosphatidylinositolanker in der Zellmembran fixiert. Es liegt in jeder einzelnen Zelle jeweils nur eine Variante des VSG vor, die mit ungefähr 10⁸ identischen Kopien die Parasitenmembran als dichten, 12–15 nm dicken "Pelz" umgibt. Dieser "Pelz" erfüllt mehrere Funktionen:
• • Er fokussiert die spezifische Immunantwort des Wirts auf genau eine Antigenvariante.
• • Er maskiert andere antigene Membranbestandteile gegenüber den immunkompetenten Zellen des Wirts.
• • Er wirkt als Diffusionsbarriere für Makromoleküle, die verhindert, dass das Komplementsystem des Wirts mit der Zellmembran des Erregers in Kontakt tritt.
• Der Abwehrschirm bedeutet für den Parasiten jedoch auch eine Einschränkung: Die Exozytose und Endozytose des Erregers ist auf bestimmte Bereiche an der Basis des Flagellums, die sog. Geißeltasche, beschränkt – den Zellmund. In diesem Bereich befinden sich, wie oben erwähnt, die einzigen invarianten Komponenten der Zelloberfläche, nämlich Rezeptoren für die Endozytose. Diese Rezeptoren sind charakterisiert, und es wäre daher, wie oben beschrieben, grundsätzlich möglich, Antikörper gegen sie herzustellen. Durch ihre Lage sind diese Rezeptoren jedoch vor dem Zugriff des Immunsystems ebenso wie vor dem Ansteuern durch konventionelle nanopartikuläre Formulierungen sterisch geschützt.
• VSG wird in der DNA des Erregers durch über tausend verschiedene Gene codiert, die entsprechend viele Varianten erzeugen können. Während der Vermehrung des Erregers im Wirt werden kontinuierlich neue VSG-Varianten exprimiert. Dabei markiert jeder Parasitämie-Gipfel das Vorherrschen eines neuen serologischen Typs, gegen die das Immunsystem seine Antikörperproduktion richtet. Ist eine Erreger-Variante unter Kontrolle, entwickelt sich schon die nächste Generation, gegen die diese Antikörper wirkungslos sind.
• Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein molekulares Arzneimitteltransportsystem für Trypanosoma-Zellen basierend auf einer Ktenat-Matrix, dadurch gekennzeichnet, dass die Suchermoleküle beliebige Komplexe aus trypanosomatalen Oberflächenglykoproteinen, insbesondere VSGs, oder Fragmenten davon mit Antikörpern oder Fragmenten davon sind, sofern diese aktiv von Trypanosomen aufgenommen werden können.
• In einer bevorzugten Ausführungsform besteht die Matrix des erfindungsgemäßen Arzneimitteltransportsystems aus Ktenat.
• Als "Matrix" wird die polymere Grundmasse bezeichnet, die als solche weder signifikante biologische Wirkungen auslöst noch eine signifikante spezifische Affinität zu irgendwelchen Zielstrukturen hat, aber in die die Wirkstoffe eingelagert werden können und die mit den Suchermolekülen kovalent verbunden werden kann. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung besteht die Matrix aus Ktenat.
• Als "Ktenat" wird ein kammförmig verzweigtes Poly-Polymer, wie in DE 100 30 786.8 , DE 100 3 811.8 , DE 101 18 312.7 , DE 101 18 852.8 , WO 02/00162 und Flaig et al. 2005 (J Drug Del. Sci. Tech. 15(1): 59–63) grundsätzlich beschrieben und die nachfolgende Spezifikation umfassend, bezeichnet.
• In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Bindungskräfte zwischen dem Wirkstoffmolekül und der Matrix nichtkovalent, insbesondere elektrostatisch. Es ist besonders bevorzugt, wenn diese Bindungskräfte die Stapelkräfte zwischen aromatischen Ringsystemen sind.
• Als "Stapelkräfte" (π-π-Kräfte) werden hierbei die nichtkovalenten Interaktionen zwischen aromatischen Elektronensystemen räumlich benachbarter Moleküle oder Molekülteile bezeichnet, die durch die inter- bzw. intramolekularen Überlappungen der p-Orbitale der konjugierten π-Elektronensysteme zustandekommen.
• In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die Seitenketten des Ktenatmoleküls aromatische Elektronensysteme. Grundsätzlich ist als das eine aromatische Gruppe umfassende Seitenkettenmonomer hierbei jedes mindestens eine aromatische Gruppe umfassende Molekül geeignet. Hierbei kann eine Seitenkette ein oder mehrere Arten von Seitenkettenmonomeren umfassen, wobei deren Anteile gleich oder verschieden sein können. Es ist besonders bevorzugt, wenn jede Ktenat-Seitenkette mindestens ein aromatisches Elektronensystem umfasst, und insbesondere, wenn mindestens 10%, z. B. 25%, der Monomere mindestens ein aromatisches Elektronensystem umfassen.
• In einer besonders bevorzugten Ausführungsform hat ein eine aromatische Gruppe umfassendes Monomer die Formel H-G-Ak-Ao-Ak'-G'-H (II),wobei
  G und G' wie oben definiert sind,
  Ak und Ak' für eine kovalente Bindung oder für einen linearen oder verzweigten, optional substituierten Kohlenwasserstoffrest stehen und
  Ao für ein aromatisches, optional substituiertes und/oder heterocyclisches Ringsystem steht, vorzugsweise ein aromatisches Ringsystem ausgewählt unter Phenyl, Naphthyl, Anthracyl, Tetracenyl, Pentacenyl, Benzopyrenyl, Chrysenyl, Coronenyl, Ovalenyl, Fluoranthrenyl, Phenanthrenyl, Pyrenyl, Triphenyl, Pyridinyl, Imidazolyl, Pyrazolyl, Oxazolyl, Thiophenyl und ihren benzannelierten Derivaten, besonders bevorzugt Phenyl.
• D. h., das aromatische System ist in dieser Ausführungsform linear in die Ktenatseitenkette integriert.
• Insbesondere bevorzugt ist es, wenn Ak und Ak' nicht an benachbarten C-Atomen des Ringsystems stehen, z. B. in para-Stellung. In einer äußerst bevorzugten Ausführungsform ist das Seitenkettenmonomer ausgewählt unter para-Amino-benzoesäure und para-Hydroxy-benzoesäure.
• Ein "substituiertes Ringsystem" ist hierbei ein mit 1 bis Q-2 linearen oder verzweigten, optional unabhängig voneinander substituierten Kohlenwasserstoffresten substituiertes Ringsystem, wobei Q die Anzahl der Kohlenstoffatome im Ringsystem ist.
• Ein "Kohlenwasserstoffrest" ist hierbei ein aliphatischer, linearer oder verzweigter, C₁-C₁₀-Alkyl-; aliphatischer C₃-C₈-Cycloalkyl-; aliphatischer, linearer oder verzweigter, C₁-C₁₀-Alkenyl-; oder aliphatischer, linearer oder verzweigter, C₁-C₁₀-Alkinylrest.
• Ein "substituierter Kohlenwasserstoffrest" ist hierbei ein aliphatischer, linearer oder verzweigter, C₁-C₁₀-Alkyl-; aliphatischer C₃-C₈-Cycloalkyl-; aliphatischer, linearer oder verzweigter, C₁-C₁₀-Alkenyl-; oder aliphatischer, linearer oder verzweigter, C₁-C₁₀-Alkinylrest, der ein- bis dreifach unabhängig voneinander mit Hydroxy, Halogen, Carbonyl, Carboxyl, Amin oder Imin substituiert ist.
• In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform hat ein eine aromatische Gruppe umfassendes Monomer die Formel H-G-Aq(Ao)-G'-H (III),wobei
  G, G' und Ao wie oben definiert sind und
  Aq für einen optional substituierten Kohlenwasserstoffrest steht; d. h., das aromatische System stellt in dieser besonderen Ausführungsform einen Nebenzweig der Ktenatseitenkette dar.
• In einer äußerst bevorzugten Ausführungsform ist das Seitenkettenmonomer ausgewählt unter Phenylalanin und Tyrosin.
• In einer bevorzugten Ausführungsform sind mindestens 10%, z. B. 25%, bevorzugt mindestens 40%, z. B. mindestens 60%, besonders bevorzugt mindestens 80%, z. B. mindestens 90%, insbesondere mindestens 95%, z. B. mindestens 99%, aller Seitenkettenmonomere des gesamten Moleküls eine aromatische Gruppe umfassende Monomere.
• In einer bevorzugten Ausführungsform hat das Endgruppenmonomer die Formel H-G''-An-E (IV),wobei
  G'' für -O-, -OC(O)- oder -N(H)C(O)- steht,
  An für einen optional substituierten Kohlenwasserstoffrest oder ein aromatisches, optional substituiertes und/oder heterocyclisches Ringsystem steht und
  E wie oben definiert ist und optional durch eine leicht abspaltbare Schutzgruppe wie z. B. BOC oder FMOC geschützt ist.
• In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfassen die eingelagerten Moleküle aromatische Elektronensysteme. Grundsätzlich kann jedes Molekül, das mindestens ein aromatisches System umfasst, verwendet werden. Vorzugsweise umfasst das Molekül einen mono- oder polyzyklischen aromatischen Heterozyklus. In einer beispielhaften Ausführungsform ist das eingelagerte Molekül Daunomycin.
• In einer weiteren besonderen Ausführungsform ist das Wirkstoffmolekül durch Konjugation mit einem aromatischen Ringsystem derivatisiert; hierbei ist es besonders bevorzugt, wenn das Wirkstoffmolekül mit dem aromatischen Ringsystem über eine leicht spaltbare Ether- oder Esterbindung verknüpft ist. Entsprechende Derivatisierungsverfahren sind dem Fachmann vertraut.
• Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines molekularen Arzneimitteltransportsystems wie oben beschrieben, dadurch gekennzeichnet, dass es die Synthese der Ktenat-Matrix durch Kondensation in einem im wesentlichen von Aromaten freien Medium umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren die Umsetzung eines Gemisches aus Z Molekülen Polyvinylalkohol mit einer zahlenmittleren Länge von Y Vinyleinheiten, X·Y·Z Molekülen an Seitenkettenmonomeren, z. B. einem Gemisch aus jeweils (X·Y·Z)/2 Molekülen Milchsäure und para-Hydroxy-benzoesäure, Y·Z Endgruppenmonomeren, z. B. N-FMOC-β-Alanin, und mindestens X·Y·Z Molekülen Thionylchlorid in einem apolaren, nichtaromatischen Lösungsmittel, vorzugsweise einem apolaren, nichtaromatischen Lösungsmittel mit geringer Siedetemperatur, z. B. CH₂Cl₂. Bevorzugt wird nach der Umsetzung das Lösungsmittel entfernt, z. B. durch Abdampfen.
• In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Ktenat zur Beladung mit dem Wirkstoff mit diesem zusammen in einem Lösungsmittel, z. B. einem wenig polaren oder apolaren Lösungsmittel gelöst, vorzugsweise einem wenig polaren oder apolaren, nichtaromatischen Lösungsmittel und besonders bevorzugt einem wenig polaren oder apolaren, nichtaromatischen Lösungsmittel mit geringer Siedetemperatur, z. B. einem aliphatischen Alkohol. Das zweite Lösungsmittel kann mit dem ersten identisch oder von ihm verschieden sein. Vorzugsweise umfasst das Verfahren das schrittweise Verdünnen der so erhaltenen Lösung von Ktenat und dem Wirkstoff mit einem stärker polaren Lösungsmittel, z. B. Wasser oder einer Salzlösung, optional gefolgt von Dialyse und/oder Konjugation des Ktenats mit zielsuchenden Molekülen, wie grundsätzlich in Flaig et al. 2005 (J Drug Del. Sci. Tech. 15(1): 59–63) beschrieben.
• Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines erfindungsgemäßen molekularen Arzneimitteltransportsystems zur spezifischen Übertragung der eingelagerten Wirkstoffmoleküle in eukaryontische Parasiten der Gattung Trypanosoma in vitro sowie die Verwendung eines erfindungsgemäßen molekularen Arzneimitteltransportsystems zur Herstellung eines Medikaments zur spezifischen Übertragung der eingelagerten Wirkstoffmoleküle in eukaryontische Parasiten der Gattung Trypanosoma.
• Die Erfindung wird jetzt anhand der folgenden, nicht abschließend oder beschränkend zu verstehenden Beispiele näher erläutert. Der Fachmann erkennt, dass im Rahmen der vorliegenden Erfindung zahlreiche Modifikationen und Abwandlungen des beschriebenen Verfahrens möglich sind. Sie alle sind als zu der durch die Ansprüche definierten Erfindung gehörig zu betrachten.
• Beispiele
• Beispiel 1: Herstellung von Ktenat
• Zur Herstellung von aromatischem Ktenat mit X; Y ≈ 50; 20000 werden 27 mg Polyvinylalkohol ("Mowiol") mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 100 kDa, 311 mg N-FMOC-β-Alanin und 6,91 g para-Hydroxybenzoesäure im trockenen Zustand gründlich vermischt und bei Raumtemperatur in etwa 1 l an wasserfreiem, mit Molekularsieb versetztem CH₂Cl₂ durch heftiges Rühren suspendiert. Unter fortgesetztem Rühren werden 5,9 g SOCl₂ tropfenweise zugesetzt. Die Kondensationsreaktion ist an der Freisetzung von SO₂ sowie an der Viskositätszunahme und gelblichen Verfärbung des Reaktionsansatzes zu erkennen. Das entstehende Ktenat geht in Lösung; während der Reaktion wird das Volumen durch Zugabe von wasserfreiem CH₂Cl₂ kontinuierlich auf insgesamt 3 l erhöht.
• Nach Beendigung der Kondensationsreaktion wird eventuell noch nicht umgesetztes SOCl₂ unter fortgesetztem Rühren durch Zugabe von 10 ml Wasser inaktiviert, dann wird der Reaktionsansatz im Rotationsverdampfer bis zur Trockne eingeengt, zum Waschen nochmals in 3 l CH₂Cl₂ aufgenommen und erneut eingedampft.
• Zur Abspaltung der FMOC-Schutzgruppe wird das Produkt in 500 ml Wasser aufgenommen, unter Rühren bei Raumtemperatur mit 5 ml Piperidin versetzt und 1–2 Stunden lang unter fortgesetztem Rühren inkubiert, dann wiederum im Rotationsverdampfer bis zur Trockne eingeengt, zum Waschen nochmals in 2 l CH₂Cl₂ aufgenommen und erneut eingedampft.
• Das Ktenat entsteht hierbei als gelbliche, wachsartige Masse.
• Beispiel 2: Beladung von Ktenat mit Daunomycin
• 100 mg des aromatischen Ktenats aus Beispiel 1 und 1 mg Daunomycin werden in 3,5 ml CH₂Cl₂ gelöst und unter gelindem Rühren 1 h lang bei Raumtemperatur inkubiert; dann werden unter starkem Rühren tropfenweise 6.5 ml 1 mM Tris-HCl pH 6.5 zugeführt. Die so erhaltene Rohsuspension wird in 190 ml 1 mM Tris-HCl pH 6.5 aufgenommen und über Nacht unter vorsichtigem Rühren bei Raumtemperatur inkubiert.
• Es wird auf diese Weise eine optisch klare Lösung von daunomycin-beladenem Ktenat erhalten.
• Zur radioaktiven Bestimmung der Beladungseffizienz wird wie angegeben verfahren, wobei zusätzlich 1 μCi an [³H(G)-]Daunomycin dem Beladungsansatz zugesetzt werden.
• Beispiel 3: Konjugation von Ktenat mit F_C-Fragmenten
• Zur Einstellung des pH-Wertes auf den für die Konjugation des Ktenats idealen Wert werden 90 ml der Lösung von daunomycin-beladenem Ktenat aus Beispiel 3 mit 10 ml an 25 mM Tris-HCl pH 6.0 vermischt und gründlich gerührt, anschließend mit 3 mol% (bezogen auf das Ktenat) an NHS-Ester-/Vinylsulfon-Polyethylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht von 3400 Da versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert.
• Anschließend wird der Reaktionsansatz zur Entfernung nicht umgesetzten Polyethylenglykols und zur Einstellung auf den für die Konjugation der Suchermoleküle idealen Wert durch eine Membran mit einer Ausschlussgröße von ca. 13 kDa gegen 10 mM Tris-HCl pH 8.0 dialysiert. Im Anschluss daran werden die Suchermoleküle, nämlich F_C-Fragmente von humanem IgG, in mindestens 20-fachem molaren Überschuss, bezogen auf die Ktenatmoleküle, zugesetzt und wiederum über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert.
• Zur Inaktivierung der letzten noch nicht umgesetzten Gruppen werden schließlich dem Ansatz 100 mg Cystein zugesetzt, er wird 1 h unter vorsichtigem Rühren inkubiert und dann zur Reinigung der fertigen Konjugate durch eine Membran mit einer Ausschlußgröße von ca. 100 kDa gegen 10 mM Tris-HCl pH 7.0 dialysiert.
• ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
• Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
• Zitierte Patentliteratur
• - WO 96/20698 [0009]
• - WO 02/00162 [0010, 0012, 0013, 0015, 0036]
• - WO 02/00191 [0010, 0012]
• - DE 10030786 [0012, 0036]
• - DE 1003811 [0012, 0036]
• - DE 10118312 [0012, 0036]
• - DE 10118852 [0012, 0036]
• Zitierte Nicht-Patentliteratur
• - Flaig et al. 2005 (J Drug Del. Sci. Tech. 15(1) : 59–63) [0012]
• - Flaig et al. 2005 (J Drug Del. Sci. Tech. 15(1) : 59–63) [0015]
• - Flaig et al. 2005, J Drug Del. Sci. Tech. 15(1): 59–63 [0017]
• - Engstler & al., Cell 121: 505–515, 2007 [0019]
• - Berriman M & al: "The genome of the African typanosome Trypanosoma brucei", Science. 309(5733): 416–22, 2005; PMID 16020726 [0027]
• - http://www.ncbi.nih.gov [0027]
• - Flaig et al. 2005 (J Drug Del. Sci. Tech. 15(1): 59–63) [0036]
• - Flaig et al. 2005 (J Drug Del. Sci. Tech. 15(1): 59–63) [0053]

Claims (8)

1. Molekulares Arzneimitteltransportsystem für Trypanosoma-Zellen, basierend auf einer Ktenat-Matrix, dadurch gekennzeichnet, dass die Suchermoleküle F_C-Fragmente von Antikörpern sind.
2. Molekulares Arzneimitteltransportsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Suchermoleküle F_C-Fragmente von humanen Antikörpern sind.
3. Molekulares Arzneimitteltransportsystem nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Suchermoleküle F_C-Fragmente von Antikörpern der Klasse IgG sind.
4. Molekulares Arzneimitteltransportsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Suchermoleküle trypanosomatale Oberflächenglykoproteine oder Fragmente davon sind.
5. Molekulares Arzneimitteltransportsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Suchermoleküle Komplexe aus trypanosomatalen Oberflächenglykoproteinen oder Fragmenten davon mit Antikörpern sind.
6. Verfahren zur Herstellung eines molekularen Arzneimitteltransportsystems nach einem der vorherigen Ansprüche.
7. Verwendung eines molekularen Arzneimitteltransportsystems nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur spezifischen Übertragung der eingelagerten Wirkstoffmoleküle in eukaryontische Parasiten der Gattung Trypanosoma in vitro.
8. Verwendung eines molekularen Arzneimitteltransportsystems nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung eines Medikaments zur spezifischen Übertragung der eingelagerten Wirkstoffmoleküle in eukaryontische Parasiten der Gattung Trypanosoma.