DE10118312A1 - Drug-Delivery-Systeme - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft solide Partikel zum Transport pharmazeutischer Wirkstoffe, Verfahren zu deren Herstellung, Arzneimittel, enthaltend diese Partikel sowie die Verwendung dieser Partikel in verschiedenen ausgewählten Indikationen.

Description

Die Erfindung betrifft solide Partikel zum Transport pharmazeutischer Wirkstoffe, Verfahren zu deren Herstellung, Arzneimittel enthaltend diese Partikel sowie die Verwendung dieser Partikel in verschiedenen ausgewählten Indikationen.

Ein Hauptziel der pharmazeutischen Forschung ist es, die gewünschten Effekte bekannter Wirkstoffe zu verstärken und die systemischen Nebenwirkungen zu minimieren, was insbesondere bei Substanzen mit hoher intrinsischer und damit unvermeidlicher Toxizität (z. B. Cytostatika) von großer Bedeutung ist. Dies kann sowohl über Verringerung der für die therapeutische Wirkung benötigten Gesamtdosis als auch über Ansammlung der Effektoren am gewünschten Wirkort erreicht werden, was beides durch die kontrollierte, räumlich spezifische Freisetzung von Effektormolekülen im weitesten Sinn (Proteinen, Peptiden, Nukleinsäuren oder niedermolekularen Substanzen) im gewünschten Zielgewebe bewerkstelligt werden kann. Darunter ist insbesondere der spezifische Transfer von therapeutisch oder diagnostisch nutzbaren Substanzen in definierte biologische Ziele ("drug delivery", "drug targeting") zu verstehen, der ein wichtiges Ziel der gegenwärtigen pharmazeutischen Forschung ist.

Die heute verfügbare Antikörpertechnologie erlaubt die Erzeugung von hochaffinen Bindungspartnern für nahezu jede beliebige biologische Struktur; überdies sind zahlreiche natürliche Liganden für zelluläre Rezeptoren charakterisiert und kloniert worden, so daß es kein Problem mehr darstellt, Moleküle mit hoher und spezifischer Affinität zu den gewünschten Zielen zu erzeugen. In vielen Fällen sind auch niedermolekulare Liganden (z. B. Glykoside) bekannt, die auf chemischem Weg imitiert und somit zur Zielsteuerung verwendet werden können. Jedoch üben diese "Suchermoleküle", ob mikro- oder makromolekular, selber im allgemeinen keine pharmazeutisch nutzbare Funktion aus, während die Effektoren selbst nicht zielspezifisch sind. Ein Hauptaugenmerk muß daher darauf liegen, diese Trennung zu überbrücken und das therapeutische Potential der verfügbaren Effektoren mit der Zielspezifität der Suchermoleküle zu verbinden.

Der effizienteste bislang bekannte Ansatz zum Erreichen dieses Ziels besteht in der Verwendung von Trägerstrukturen im kolloidalen (d. h. Submikrometer-) Größenbereich, an deren Oberflächen entsprechende Zielsuchermoleküle gebunden werden können. Auf diese Weise werden sowohl optimales Verhältnis von Zielsucher- zu Effektormolekülen als auch maximale Flexibilität erreicht: Während durch direkte kovalente Kopplung an ein einzelnes Antikörper- oder anderes Ligandenmolekül nur wenige (<10) Effektormoleküle gebunden werden können (was bei einem Molekulargewicht eines Antikörpers von rund 150 kDa bedeutet, daß über 90% der Masse des Konjugats auf den Antikörperteil entfallen) und Konjugate mit niedermolekularen Suchern üblicherweise ein molares Verhältnis von 1 : 1 aufweisen, ist mit kolloidalen Systemen ein Effektor : Zielsucher- Verhältnis von 10³ - 10⁴ realisierbar. Überdies wird keine chemische Veränderung des Effektors benötigt, was in jeder Hinsicht vorteilhaft ist.

Eine effiziente Möglichkeit hierzu besteht darin, die betreffenden Substanzen in kolloidale Trägerpartikel einzulagern, welche mit Antikörpern gegen oder natürlichen Liganden für charakteristische Molekularstrukturen des Ziels verknüpft und zugleich durch inerte Beschichtung ihrer Oberfläche gegen das Immunsystem geschützt werden.

Eine vielverwendete Methode zur kolloidalen Verpackung von Pharmaka besteht darin, die Effektoren in lipidmembranumhüllte Vesikel (Liposomen) einzuschließen. Durch Verwendung entsprechender Membrankomponenten ist es möglich, zum einen die gewünschten Zielsuchermoleküle an die Liposomenmembranen zu binden, zum anderen die Träger mit antiimmunogenen Beschichtungen (z. B. Polyethylenglykol) zu überziehen und dadurch vor der unspezifischen Entfernung aus dem Blutstrom durch das retikuloendotheliale System zu schützen. Den Vorteilen dieses Systems stehen folgende gravierende Nachteile gegenüber:

• - Die thermische und zeitliche Stabilität der aus einer einzelnen Lipiddoppelschicht bestehenden Vesikel ist begrenzt, ebenso die Dichtigkeit. Die Durchlässigkeit der Membranen für hydrophile Stoffe kann prinzipiell verringert werden, jedoch sind die benötigten veränderten (z. B. fluorierten) Lipide biologisch nicht unbedenklich. Überdies genügt ein einzelner "Treffer" des Komplementsystems zum Auslaufen eines vollständigen Vesikels.
• - Die mangelnde Stabilität der Membranvesikel begrenzt ihrerseits die mögliche Variabilität in der Oberflächengestaltung und limitiert dadurch die potentiellen Anwendungen.
• - Nur hydrophile Substanzen können in der wäßrigen Innenphase der Vesikel in genügender Konzentration transportiert werden.
• - Die Beladung der Liposomen erfolgt (von wenigen Spezialfällen abgesehen) durch einfachen Einschluß eines Teils der wäßrigen Phase und ist dementsprechend ineffizient: Typischerweise werden <0.5% der Effektorsubstanz in die Vesikel eingeschlossen. Hierbei wird die Substanz beträchtlichen thermischen und chemischen Belastungen ausgesetzt (die Arbeitstemperatur muß für längere Zeit oberhalb der kritischen Phasenübergangstemperatur des Lipidgemisches liegen, und die für die kovalente Modifikation benötigten reaktiven Gruppen überstehen dies nur bei sehr niedrigem pH-Wert).
• - Die Hälfte der membranständigen reaktiven Gruppen, die zur Verknüpfung mit proteinösen Suchmolekülen benötigt wird, befindet sich nach der Vesikelbildung auf der Innenseite und steht nicht zur Bindung zur Verfügung, wird jedoch nach der Auflösung der Liposomen im Organismus freigesetzt und kann zu unvorhersehbaren Reaktionen führen.
• - Die chemische Kopplung von Proteinen an liposomale Membranen (z. B. über direkt oder über einen Polyethylenglykolarm mit Lipiden verknüpftes SPDP) führt zur Bildung hochimmunogener Strukturen, die bereits zur Vakzinierung erfolgreich eingesetzt wurden, auf dem Gebiet des "drug targeting" jedoch als unbrauchbar angesehen werden müssen, da sie zu einer Immunreaktion gegen die Partikel führen.

Als Alternative stehen solide Kolloidpartikel ("Nanopartikel") zur Verfügung. Nanopartikel sind prinzipiell bekannt. Partikel im Mikrometer- und Submikrometerbereich aus hydrophoben Polymeren können prinzipiell durch feine Dispergierung des in einem unpolaren Lösungsmittel aufgenommenen Polymers produziert werden: Durch Entfernung des Lösungsmittels fällt das Polymer in Form von Partikeln, deren Durchmesser unter dem der Tröpfchen liegt, aus; eine Beladung mit hydrophoben Substanzen (in welche Kategorie die meisten Pharmaka fallen) kann durch einfachen Zusatz der Substanz zum unpolaren Lösungsmittel bewerkstelligt werden: Nach Entfernen des Lösungsmittels liegt die Wirksubstanz zu annähernd 100% mit dem Polymer assoziiert vor und bleibt, wenn die Partikel in eine wäßrige Phase eingebracht werden, durch Van-der-Waals-Kräfte und sterisches "Entrapment" nichtkovalent, aber längerfristig stabil an die Partikelmatrix gebunden. Essentiell ist hierbei, daß eine nachträgliche Koagulation der hydrophoben Partikel (deren große Kontaktfläche mit dem hydrophilen Medium energetisch ungünstig ist) verhindert wird, was beispielsweise durch Herstellung der Partikel in Anwesenheit einer amphiphilen Substanz, welche zwischen hydrophober Partikelmatrix und hydrophilem Medium vermittelt, geschehen kann.

Konventionelle Nanopartikel und deren Herstellung und Möglichkeiten einer Oberflächenvariation sind aus der WO 96/20698 bekannt, wobei das System hier insbesondere für den intravaskulären Einsatz, insbesondere bei der Restenose optimiert wurde. Die Patentanmeldung beschreibt polymolekulare Nanopartikel aus natürlichen oder synthetischen Polykondensaten mit einem überwiegend allgemein beschriebenen eigenschaftsmodifizierenden Oberflächenüberzug aus natürlichen oder synthetischen Makromolekülen.

Beispielhaft seien weiter die folgenden Dokumente genannt.

Die DE 198 10 965 A1 beschreibt polymolekulare Nanopartikel aus einem Polyelektrolytkomplex aus Polykationen und Polyanionen, der mit einem Vernetzungsmittel behandelt wird.

In der DE 198 39 515 A1 werden kolloidale Polymer- Wirkstoffassoziate mit einem eigenschaftsoptimierten verzweigten Polyolester zum Einsatz insbesondere an mucosalen Geweben beschrieben.

Die US 6,117,454 beschreibt insbesondere polymolekulare Nanopartikel, die durch einen Überzug aus Fettsäurederivaten zum Durchdringen der Blut-Hirnschranke geeignet sind.

In der US 5,840,674 werden fest über einen "Linker" kovalent gebundene Komplexe aus Wirkstoff und Mikropartikel insbesondere zum Einsatz gegen Mikroorganismen beschrieben.

Die US 5,641,515 beschreibt polymolekulare Nanopartikel aus Polycyanacrylat enthaltend Insulin, die das komplex gebundene Insulin kontrolliert freisetzen.

Die bisher bekannten Nanopartikel und Methoden zu deren Herstellung weisen häufig Probleme in der Stabilität und Herstellbarkeit wie auch im Grad und Umfang der Beladung auf und sind bisher nur sehr begrenzt einsetzbar. Insbesondere ist auch das Problem der gezielten Applikation des Wirkstoffes am gewünschten Wirkort und der Stabilität der Nanopartikel nach Gabe bis zum Erreichen des Wirkortes, das "Drug Targeting" nur unzureichend gelöst. Ein zentrales Problem besteht in der Oberflächenmodifikation von Nanopartikeln. Wie oben bereits angeführt, stellen konventionelle solid-nanopartikuläre Systeme (im Gegensatz zu Liposomen) aufgrund ihrer extrem hohen spezifischen Interphase zwischen hydro­ phober Partikelmatrix und hydrophilem Medium ein energetisch ungünstiges System dar, das in Abwesenheit von Stabilisatoren instabil ist: Durch Zusammenlagerung von Partikeln wird die energetisch ungünstige Berührungsfläche minimiert, eine Ausfällung des hydrophoben Partikelmaterials ist die Folge.

Aus diesem Grund benötigen konventionelle Nanopartikel einen Überzug, beispielsweise aus amphiphilen Molekülen, die die Grenzflächenenergie herabsetzen und auf diese Weise die Partikel stabilisieren. Dieser Überzug deckt die Partikelmatrix vollständig ab und entzieht sie so dem Zugang modifizierender Agentien. Eine Modifikation gerade der amphiphilen Moleküle führt aber andererseits zu einer drastischen Veränderung der physikalischen Eigenschaften und damit zu einer Destabilisierung des Überzugs. Aus diesem Grund ist es kaum möglich, konventionelle Nanopartikel so zu modifizieren, daß Bindung von Liganden und damit ein Einsatz im Gebiet des "drug targeting" möglich ist. Die bisher im Stand der Technik angebotenen Lösungen behandeln die Oberflächenmodifikation entweder nur generell oder so spezifisch an einem Problem ausgerichtet, daß eine generellere Anwendung nicht möglich ist oder die vorgelegte Lösung an sich schon nachteilig ist.

Aufgabe der Erfindung war es daher, Nanopartikel zur Verfügung zu stellen, die die geschilderten Nachteile nicht aufweisen und insbesondere in der Lage sind, eine spezifische Freisetzung am Wirkort zu erreichen.

Die Lösung dieser Aufgabe wird durch solide Partikel zum Transport hydrophober oder hydrophobisierter pharmazeutischer Wirkstoffe erreicht, die durch ein Verfahren mit folgenden Schritten herstellbar sind:

• a) Herstellung einer Lösung in einem oder einem Gemisch von organischen Lösungsmittel(n) enthaltend mindestens einen hydrophoben oder hydrophobisierten pharmazeutischen Wirkstoff, wasserunlösliches organisches Polymermaterial und amphiphiles organisches Polymermaterial sowie gegebenenfalls Ergänzungsstoffe,
• b) Behandlung der Lösung mit Ultraschall,
• c) Dialyse der Lösung gegen H₂O
• d) Trennung der entstehenden Partikel von der entstehenden wässrigen Lösung.

Die erfindungsgemäßen Partikel, sind besonders geeignete Formen, mit denen eine Verstärkung der Wirkung und Minimierung der Nebenwirkungen durch die kontrollierte und/oder räumlich spezifische Freisetzung des Effektormoleküls erreicht wird. Generell handelt es sich bei den von der Erfindung umfaßten Partikeln vorzugsweise um solide, kolloidale und/oder lipidfreie Partikelsysteme.

Dabei versteht man unter hydrophobisierten Wirkstoffen, ursprünglich hydrophilere Wirkstoffe, die durch chemische Modifikation hydrophober geworden sind. Ein Beispiel sind hydrophobe Resorptionsester hydrophiler Wirkstoffe.

Bei Herstellung der vorstehenden erfindungsgemäßen Nonopartikel ist es besonders bevorzugt, wenn das oder die organischen Lösungsmittel sich in Wasser im Verhältnis Lösungsmittel : Wasser zwischen 1 : 10 und 1 : 50, vorzugsweise zwischen 1 : 20 und 1 : 40, insbesondere zwischen 1 : 20 und 1 : 30 lösen und/oder vorzugsweise ausgewählt sind aus:
Methylenchlorid oder Benzylalkohol, vorzugsweise Benzylalkohol.

Dabei ist die Wahl des geeigneten Lösungsmittels aber keinesfalls auf Methylenchlorid oder Benzylalkohol beschränkt.

Weiter ist es bevorzugt, wenn bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Partikel das wasserunlösliche organische Polymermaterial zusammen mit dem oder den hydrophoben pharmazeutischen Wirkstoff(en) gelöst und das amphiphile organische Polymermaterial davon zunächst getrennt, gegebenenfalls mit dem oder den Ergänzungsstoff(en), gelöst wird und die Lösungen zur Herstellung der Lösung nach Schritt (a) erst dann gemischt werden.

Eine weitere bevorzugte Form der Herstellung der erfindungsgemäßen Partikel beinhaltet, daß das separat gelöste amphiphile organische Polymermaterial und/oder ein gegebenenfalls mitgelöster Ergänzungsstoff vor der Mischung mit dem unpolaren Polymermaterial in einer Konzentration von zwischen 10 und 45% (w/v), vorzugsweise zwischen 20 und 40% (w/v), insbesondere von 35% (w/v) vorliegt.

Genauso bevorzugt ist es, wenn das wasserunlösliche organische Polymermaterial vor dem Schritt (b) in einer Konzentration von zwischen 3 und 0,1% (w/v), vorzugsweise zwischen 2 und 0,5% (w/v), insbesondere von 1,7% (w/v) vorliegt.

Weiter bevorzugt ist es, wenn die erfindungsgemäßen Partikel nach einem Verfahren hergestellt werden; bei dem die Lösung in Schritt (b) zwischen 1 h und 15 h, vorzugsweise 4 h oder 5 h bis 10 h, insbesondere 5 h bis 6 h, mit Ultraschall behandelt wird. Dabei die Ultraschallbehandlung bevorzugt bei maximaler Leistung statt.

Genauso bevorzugt ist es, wenn das Konzentrationsverhältnis in % (w/v) zwischen dem wasserunlöslichen organischen Polymermaterial aus Schritt (a) und dem amphiphilen Polymermaterial aus Schritt (b) nach Abschluß von Schritt (b) zwischen 1 : 2 und 1 : 32, vorzugsweise zwischen 1 : 4 und 1 : 28, insbesondere zwischen 1 : 8 und 1 : 20, vorzugsweise zwischen 1 : 12 und 1 : 16, insbesondere 1 : 14 beträgt.

Bei Herstellung der vorstehenden erfindungsgemäßen Partikel ist es besonders bevorzugt, wenn das wasserunlösliche, organische Polymermaterial aus Schritt (a) ausgewählt ist aus
Polyestern, vorzugsweise Polymilchsäure (Polylaktid), Polyglykolid oder Polylaktid/Polyglykolid Copolymeren (PLGA), insbesondere reinem Polylaktid, reinem Polypropylenglykol, oder Polylaktid/Polyglykolid Copolymer (beispielsweise im Verhältnis 3 : 1).

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Partikel kann allerdings auch auf andere biokompatible, abbaubare synthetische Polymere wie z. B. entsprechende Polyanhydride, Polyaminosäuren, Polycyanoacrylate, Polyacrylamide oder Polyurethane zurückgegriffen werden.

Bei Herstellung der vorstehenden erfindungsgemäßen Partikel ist es bevorzugt, wenn das amphiphile organische Polymermaterial aus Schritt (a) ausgewählt ist aus
Polyvinylalkohol bzw. Derivaten des Polyvinylalkohols, vorzugsweise reinem Polyvinylalkohol, Estern aus Polyvinylalkohol und einer hydrophoben Carbonsäure (vorzugsweise Fettsäure) oder Coestern, bei denen jedes Molekül des Polyvinylalkohols mit mindestens einer hydrophoben Carbonsäure (vorzugsweise Fettsäure) und einer zweiten, davon verschiedenen Carbonsäure verestert ist.

Bei Herstellung der vorstehenden erfindungsgemäßen Partikel ist es besonders bevorzugt, wenn der oder die Ergänzungsstoffe ausgewählt ist/sind aus
Alkali- oder Erdalkalisalzen organischer Säuren, insbesondere Magnesiumsalzen, vorzugsweise Magnesiumacetat.

Ebenso bevorzugt ist es, wenn die Verfahrensschritte (a) bis (c) bei physiologischen Temperaturen, vorzugsweise zwischen 35 und 40°C, insbesondere bei 37°C stattfinden.

Ein weiterer, die Aufgabe der Erfindung erfüllender Gegenstand der Erfindung sind solide Partikel zum Transport hydrophober oder hydrophobisierter pharmazeutischer Wirkstoffe, die einen Kern aus organischem, wasserunlöslichen Polymermaterial und eine Außenschicht aus nichtkovalent an die Moleküle des Kerns gebundenen amphiphilen Polymermaterial enthalten und bei denen das amphiphile Polymermaterial ausgewählt ist aus
Polyvinylalkohol bzw. Estern des Polyvinylalkohols.

Dabei ist es besonders bevorzugt, daß die Partikel nichtkovalent gebundenen, hydrophoben oder hydrophobisierten pharmazeutischen Wirkstoff enthalten.

Ebenso bevorzugt ist es, wenn bei diesen erfindungsgemäßen Partikeln das amphiphile Polymermaterial ausgewählt ist aus
reinem Polyvinylalkohol, Estern aus Polyvinylalkohol und einer hydrophoben Carbonsäure (vorzugsweise Fettsäure) oder Coestern, bei denen jedes Molekül des Polyvinylalkohols mit mindestens einer hydrophoben Carbonsäure (vorzugsweise Fettsäure) und einer zweiten, davon verschiedenen Carbonsäure verestert ist.

Es ist für alle vorstehend genannten erfindungsgemäßen Partikel eine ausgewählte Ausführungsform, wenn das verwendete amphiphile organische Polymermaterial ausgewählt ist aus Coestern des Polyvinylallcohols, bei denen jedes Molekül des Polyvinylalkohols mit mindestens einer hydrophoben Carbonsäure (vorzugsweise Fettsäure) und einer zweiten, davon verschiedenen Carbonsäure verestert ist,
wobei die hydrophobe Carbonsäure vorzugsweise ausgewählt ist aus Fettsäuren einer Länge zwischen 10 und 24 C-Atomen, die vorzugsweise nicht oder nicht mit COOH, OH, SH oder NH₂, insbesondere nicht mit COOH oder OH substituiert sind, vorzugsweise ausgewählt ist aus C₁₀-C₁₆-Fettsäuren, insbesondere Laurinsäure,
wobei die zweite, davon verschiedene Carbonsäure ausgewählt ist aus Carbonsäuren, die vorzugsweise nicht mit COOH oder OH und vorzugsweise mit SH oder NH₂, vorzugsweise NH₂, substituiert sind, insbesondere Aminosäuren, vorzugsweise Alanin,
vorzugsweise ausgewählt ist aus Coestern, bei denen der Polyvinylalkohol mit mindestens einer Fettsäure und mindestens einer Aminosäure verestert ist, insbesondere Polyvinyllaurat-co- β-Alanat, vorzugsweise Polyvinyllaurat (25%)-co-β-Alanat(7%).

Für alle vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Partikel ist es eine bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung, wenn die Partikel Nanopartikel sind und/oder entsprechend in mindestens zwei Dimensionen eine Länge von zwischen 10 und 500 nm, vorzugsweise < 150 nm, insbesondere 50 bis 100 nm aufweisen.

Dabei versteht man unter Nanopartikel im engeren Sinne dieser Erfindung Partikel, die in jeder Dimension eine Länge unter 1 µm aufweisen, in einem weiteren Sinne Partikel, die in mindestens zwei Dimension eine Länge unter 1 µm aufweisen. Unter die engere Definition fallen insbesondere auch alle Partikel, die ein Volumen unter 1 µm³, vorzugsweise 0,01 µm³, insbesondere 0,0001 µm³, aufweisen. Bei Nanopartikeln handelt es sich um solide kolloidale Partikel.

Speziell oberflächenmodifizierte Partikel sind ein zentraler Gegenstand dieser Erfindung und lösen in hervorragender Weise die Aufgabe der Erfindung. Daher sind ein weiterer Gegenstand der Erfindung Partikel zum Transport pharmazeutischer Wirkstoffe, an die Linker-Moleküle, die eine amino- und/oder thiolreaktive, vorzugsweise eine aminoreaktive, Gruppierung aufweisen, kovalent über vorher (d. h. vor Modifikation durch Verknüpfung des Partikels mit den Linkern) auf der Oberfläche des Partikels frei vorliegende NH₂- oder SH-Gruppen, vorzugsweise NH₂-Gruppen, gebunden sind.

Dabei versteht man unter Linker-Molekülen Polymere, insbesondere unverzweigte Polymere, die die Eigenschaften, insbesondere die Oberflächeneigenschaften, des Partikels verändern, insbesondere aber zur sterisch günstigen Anbindung von anderen bioaktiven Verbindungen an die Partikel dienen oder gegebenenfalls auch die Partikel sterisch vor Abbau schützen.

Unter "reaktiver Gruppe" sind insbesondere im Stand der Technik bekannte Gruppen zu verstehen, die leicht an Amino-, Thiol- oder Hydroxygruppen binden, sowie Epoxy- oder Vinyl-Gruppen.

Dabei ist es besonders bevorzugt, wenn die Linker-Moleküle bifunktionell sind und neben einer amino- oder thiolreaktiven, vorzugsweise aminoreaktiven, Gruppierung an einem anderen Ende des Moleküls auch eine weitere, anders reaktive funktionelle Gruppierung, vorzugsweise eine thiolreaktive Gruppierung, aufweisen.

Ebenso bevorzugt ist es, wenn die Linker-Moleküle eine Mischung bifunktioneller Moleküle - wie oben beschrieben - und monofunktioneller Moleküle, die nur entweder die aminoreaktive oder die thiolreaktive, vorzugsweise die aminoreaktive, Gruppierung tragen, sind.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand der Erfindung sind Partikel zum Transport pharmazeutischer Wirkstoffe, bei denen auf der Oberfläche des Partikels eine Mischung aus zwei Arten Linker-Molekülen vorliegt, die an einem Ende des Linker-Moleküls über eine reaktive Gruppierung kovalent an die Oberfläche des Partikels gebunden sind, wobei die eine Art der Linker-Moleküle (bifunktionell) an mindestens einem anderen Ende des Moleküls eine weitere reaktive Gruppierung trägt, während die andere Art der Linker-Moleküle (monofunktionell) an keinem anderen Ende des Moleküls weitere reaktive Gruppierungen trägt.

Beide vorgenannte Gruppen an Partikeln sind sehr günstig, da damit sperrige Reste wie Antikörper an den bifunktionellen Resten ungehindert angelagert werden können, während die monofunktionellen Linker einen Abbau sterisch hindern. Diese Partikel werden auch als Akanthoshären bezeichnet.

Dabei ist es wieder besonders bevorzugt, wenn an der Oberfläche der beiden vorgenannten Partikel-Arten (Akanthosphären) deutlich mehr, vorzugsweise mindestens 100% mehr, monofunktionelle als bifunktionelle Moleküle kovalent gebunden sind.

Insbesondere bevorzugt ist es, wenn die Linker-Moleküle Polyglykolide sind, vorzugsweise Polyethylenglykol-Derivate, insbesondere NHS-Ester-Polyethylenglykol oder NHS- Ester/Vinylsulfon-Polyethylenglykol.

Bevorzugt ist es auch, wenn die mit Linkern versehenen erfindungsgemäßen Partikel Nanopartikel sind.

Weiter ist es bevorzugt, wenn es sich bei den Partikeln um bisher in den vorstehenden Abschnitten ohne Erwähnung von Linkern beschriebene erfindungsgemäße Partikel handelt.

Es ist bevorzugt, wenn an die bifunktionellen Linker-Moleküle bioaktive Makromoleküle oder "Sucher"-Moleküle, ausgewählt aus Peptiden, Proteinen; vorzugsweise Antikörpern, Antikörperfragmenten oder Antikörperderivaten mit zielbindenden Eigenschaften wie "Single-chain"-Antikörpern; Hormonen, Zuckern, vorzugsweise Glykosiden; synthetischen oder natürlichen Rezeptor- Liganden; Proteinen oder Peptiden mit einer freien Cysteingruppe oder Thiozuckern, angekoppelt sind, angekoppelt werden oder vor der Oberflächenmodifikation angekoppelt wurden.

Unter dem Begriff "Sucher"-Molekül im Sinne dieser Erfindung versteht man allgemein an die erfindungsgemäßen Partikel ankoppelbare Verbindungen, die in der Lage sind, mit hoher Affinität an die biologischen Ziele der Wirkstoffe, als da wären Proteine, Peptide, Polysaccharide, Oligosaccharide, Lipoproteine, Glykoproteine oder andere biologische Moleküle, die entweder in gesundem Gewebe (physiologisch) oder in oder nahe krankem Gewebe (pathologisch) exprimiert werden, zu binden. "Sucher"- Moleküle können beispielsweise Peptide, Proteine, beispielsweise Antikörper, Antikörperfragmente oder Antikörperderivate mit zielbindenden Eigenschaften wie "Single-chain"-Antikörper; Hormone, Zucker, beispielsweise Glykoside; synthetische oder natürliche Rezeptor-Liganden sein. Besonders bevorzugt sind Antikörper, -derivate, -fragmente und Glykoside.

Es ist weiter bevorzugt, wenn an die bifunktionellen Linker-Moleküle bioaktive Makromoleküle oder allgemein "Sucher"-Moleküle, vorzugsweise Antikörper, Antikörperfragmente oder Antikörperderivate mit zielbindenden Eigenschaften wie z. B. "Single­ chain"-Antikörper, insbesondere mit freier Cysteingruppe, angekoppelt sind, angekoppelt werden oder vor der Oberflächenmodifikation angekoppelt wurden. Das gilt insbesondere für Partikel, deren Beschichtung deutlich mehr monofunktionelle als bifunktionelle Moleküle enthält.

Bevorzugt ist es auch, wenn an die bifunktionellen Linker-Moleküle bioaktive Mikromoleküle oder "Sucher"-Moleküle, vorzugsweise Zucker, insbesondere Thiozucker, Hormone oder Proteine, insbesondere mit freier Cysteingruppe, angekoppelt sind, angekoppelt werden oder vor der Oberflächenmodifikation angekoppelt wurden. Das gilt insbesondere für Partikel, deren Beschichtung überwiegend oder vollständig aus bifunktionellen Molekülen besteht.

Bevorzugt ist es weiter, wenn an den erfindungsgemäßen Partikel nach Bindung der bioaktiven Mikromoleküle oder "Sucher"-Moleküle noch freie reaktive Gruppen abgesättigt werden, vorzugsweise mit Cystein.

Generell erfolgt eine gegebenenfalls anschließende Reinigung oder Isolierung vorzugsweise über eine Dialyse vorzugsweise mit selektiven Ausschlußmembranen.

Für alle erfindungsgemäßen Partikel ist es bevorzugt, wenn der zu transportierende pharmazeutische Wirkstoff ein synthetischer oder natürlicher Wirkstoff, ein Protein, Peptid, Lipid, Zucker oder Nukleinsäure bzw. ein niedermolekularer organischer oder hochmolekularer organischer Wirkstoff, beispielsweise ein Hormon, eine antineoplastische Substanz, ein Antibiotikum, Antimykotikum, Parasitzid, Virustatikum oder Antihelmintikum, eine cardiovaskulär­ aktive Substanz; eine zentralwirksame Substanz, insbesondere ein Analgetikum, Antidepressivum oder Antiepileptikum; ist.

Generell ist es eine bevorzugte Ausführungsform aller erfindungsgemäßen Partikel, wenn das Partikel direkt oder über einen Linker, vorzugsweise über bifunktionelle Polyethylenglykol- Moleküle, verknüpft ist mit einem "Sucher"-Molekül ausgewählt aus:
Peptiden, Proteinen; vorzugsweise Antikörpern, Antikörperfragmenten oder Antikörperderivaten mit zielbindenden Eigenschaften wie "Single-chain"- Antikörpern; Hormonen, Zuckern, vorzugsweise Glykosiden; synthetischen oder natürlichen Rezeptor- Liganden; Proteinen oder Peptiden mit einer freien Cysteingruppe oder Thiozuckern.

Gerade die Verwendung der bifunktionellen Polyethylenglykol- Moleküle zur Oberflächenmodifikation von Partikeln zum Transport pharmazeutischer Wirkstoffe ist ein wichtiger Teil dieser Erfindung. Daher ist ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung die Verwendung von reinen bifunktionellen Polyethylenglykol-Molekülen, vorzugsweise NHS-Ester/Vinylsulfon-Polyethylenglykol; oder Mischungen aus bifunktionellen und monofunktionellen Polyethylenglykol-Molekülen, vorzugsweise NHS-Ester"- Polyethylenglykol mit NHS-Ester/Vinylsulfon-Polyethylenglykol; zur Herstellung von oberflächensubstituierten soliden Partikeln zum Transport pharmazeutischer Wirkstoffe.

Dabei ist es besonders bevorzugt, wenn über die bifunktionellen Polyethylenglykol-Moleküle "Sucher"-Moleküle ausgewählt aus
Peptiden, Proteinen; vorzugsweise Antikörpern, Antikörperfragmenten oder Antikörperderivaten mit zielbindenden Eigenschaften wie z. B. single-chain- Antikörpern; Hormonen, Zuckern, vorzugsweise Glykosiden; synthetischen oder natürlichen Rezeptor- Liganden; Proteinen oder Peptiden mit einer freien Cysteingruppe oder Thiozuckern an die Partikel gebunden werden, vorzugsweise bei Verwendung von reinen bifunktionellen Polyethylenglykol- Molekülen Gylykoside, insbesondere Thiozucker; bei Verwendung von Mischungen aus bifunktionellen und monofunktionellen Polyethylenglykol-Molekülen Antikörper, Antikörperfragmenten oder Antikörperderivaten mit zielbindenden Eigenschaften wie z. B. single-chain-Antikörpern, vorzugsweise Antikörper mit freier Cysteingruppe.

Auch die Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer Partikel sind ein wichtiger Teil der Erfindung. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Partikels, insbesondere der zweiten beschriebenen Art der Partikel mit PLGA (Polylaktid/Polyglykolid); das folgende Schritte aufweist:

• a) Herstellung einer Lösung in einem oder in einem Gemisch von organischen Lösungsmittel(n) enthaltend mindestens einen hydrophoben pharmazeutischen Wirkstoff, wasserunlösliches, organisches Polymermaterial und amphiphiles organisches Polymermaterial,
• b) (b Behandlung der Lösung mit Ultraschall,
• c) Dialyse der Lösung gegen H₂O
• d) Trennung der entstehenden Partikel von der entstehenden wässrigen Lösung.

Die erfindungsgemäßen Partikel sind besonders geeignete Formen zur Verstärkung der gewünschten Effekte bekannter Wirkstoffe und zur Minimierung systemischer Nebenwirkungen durch die kontrollierte und/oder räumlich spezifische Freisetzung des Effektormoleküls erreicht wird. Damit sind sie geeignet und vorgesehen in Therapeutika verschiedenster Art eingesetzt zu werden. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind daher Arzneimittel, die erfindungsgemäße Partikel sowie gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe enthalten.

Prinzipiell können die erfindungsgemäßen Arzneimittel als flüssige Arzneiformen in Form von Aerosolen, Injektionslösungen, Tropfen oder Säfte oder als halbfeste Arzneiformen in Form von Granulaten, Tabletten, Pellets oder Kapseln verabreicht werden.

Geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe sind z. B. Lösungs- oder Verdünnungsmittel, Stabilisatoren, Suspensionsvermittler, Puffersubstanzen, Konservierungsmittel, sowie Farbstoffe, Füllstoffe, und/oder Bindemittel. Die Auswahl der Hilfsstoffe sowie die einzusetzenden Mengen derselben hängt davon ab, ob das Arzneimittel z. B. inhalativ, oral, peroral, parenteral, intravasal, intravenös, intraperitoneal, rektal, subkutan oder intramuskulär appliziert werden soll. Für orale Applikationen eignen sich Zubereitungen in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln, Granulaten oder Suspensionen wie Tropfen, Säften und Sirupen, für andere Applikationen Suspensionen sowie leicht rekonstituierbare Trockenzubereitungen.

Wie oben ausgeführt, sind die erfindungsgemäßen Partikel besonders geeignete Formen mit denen eine Verstärkung der Wirkung und Minimierung der Nebenwirkungen durch die kontrollierte und/oder räumlich spezifische Freisetzung des Effektormoleküls erreicht wird, so daß eine generelle Verwendbarkeit dieser Partikel zur Herstellung von Therapeutika vorliegt und sie sind natürlich generell für eine unbeschränkte Zahl von Indikationen geeignet. Ohne die Verwendung der erfindungsgemäßen Partikel darauf beschränken zu wollen, bietet sich deren Verwendung für besondere Indikationen an. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher die Verwendung der erfindungsgemäßen Partikel zur Herstellung eines Arzneimittel zur Krebsbehandlung, zur Behandlung von Infektionskrankheiten und Parasitosen, zur Behandlung von Krankheiten und Symptomen mit zentralnervöser Ursache, zur Verwendung in der Gentherapie oder für genomisches Targeting. Weiter ist beispielsweise der Einsatz beim Targeting von Cytostatika auf Tumorzellen, beim Transport von therapeutisch nutzbaren Substanzen durch die Blut-Hirn-Schranke und bei der Behandlung von schweren Infektionen (namentlich durch Eukaryonten) auch bevorzugt.

Weitere Anwendungsmöglichkeiten umfassen z. B. den Transfer von pflanzlichen Alkaloiden mit mikrobicider Wirkung in Trypanosomen und von Antioxydantien und antünflammatorischen Verbindungen [Vitamin E, Gallsäure, N-Acetyl-L-Cystein, 2,6-bis(tert-butyl)-4- Mercaptophenol, Ibuprofen und Gentisinsäure] bei (degenerativen) Gehirnerkrankungen, den Transfer von Substanzen in Hepatozyten, primär für die Behandlung von Neoplasmen, auch die Erhöhung der Wirkung von Primaquin auf die in den Leberzellen überdauernden Plasmodium-Hypnozoiten.

Unter den möglichen Anwendungen für die erfindungsgemäßen Partikel sind besonders weiter zu nennen:

• - Transport von sonst nicht gehirngängigen Pharmaka (z. B. Cytostatika, Psychopharmaka, Schmerzmittel, M' Alzheimer- Therapeutika) mit antikörper-konjugierten Trägern durch die Blut- Hirn-Schranke
• - Zielgerichtetes Einbringen von Pharmaka (z. B. Virustatika, Cytostatika, Plasmodizide) mit glykosid-konjugierten Trägern in Hepatozyten
• - Orale Verabreichung von sonst nur parenteral verfügbaren Pharmaka durch Targeting auf Darmepithelien
• - Erhöhung der Wirkung von antiparasitischen Therapeutika durch Targeting auf parasiten-spezifische Oberflächenmoleküle.

Ein weiterer Gegenstand des Verfahrens ist auch die Behandlung eines Menschen oder Tieres, der oder das diese Behandlung benötigt, mit oder unter Verwendung der erfindungsgemäßen Partikel. Besonders geeignet ist diese Behandlung bei den vorgenannten Indikationen und Anwendungsarten.

Im folgenden Abschnitt wird die Erfindung weiter durch Beispiele erläutert, ohne sie darauf zu beschränken.

Beispiele und Abbildungen Abbildungen

Abb. 1 zeigt schematisch den generellen Aufbau und die Gestalt von erfindungsgemäßen Partikeln, einfachen Partikeln, einfachen Stealth-Partikeln, zielsuchenden Aktinosphären und zielsuchenden Akanthosphären.

Abb. 2 zeigt die Einheitlichkeit in der Größenverteilung erfindungsgemäß hergestellter Partikel nach Beispiel 1.

Beispiele Allgemeine Bemerkungen

Die nachfolgend ausgeführten Beispiele beschreiben von der Erfindung umfaßte Partikel, insbesondere Nanopartikel, in denen die Möglichkeit realisiert ist, Wirksubstanzen in kolloidale Trägerpartikel einzulagern. Diese können gegebenenfalls beispielsweise mit Antikörpern gegen oder natürlichen Liganden für charakteristische Molekularstrukturen des Ziels oder anderen "Suchermolekülen" verknüpft. Optional können die Nanopartikel beispielsweise zugleich durch inerte Beschichtung ihrer Oberfläche gegen das Immunsystem geschützt werden. Generell handelt es sich bei den hier beispielhaft beschriebenen, von der Erfindung umfaßten Partikel um kolloidale, lipidfreie Partikelsysteme. Einige der hier beschriebenen, von der Erfindung umfaßten Partikel werden nachfolgend mit den allgemeinen Begriffen Aktinosphären und Akanthosphären bezeichnet (s. Abb. 1). Diese Bezeichnungen werden, da sie strukturelle Konzepte und nicht sterische Grundformen bezeichnen, unabhängig von der tatsächlichen Geometrie beibehalten.

Beispiel 1 Allgemeine Nanopartikel

Es handelt sich hier um Partikel im Größenbereich zwischen 10 nm und 500 nm mit einem kompakten Innenteil aus organischem wasserunlöslichem Polymermaterial, das mit einer Schicht aus einem amphiphilen organischen Polymer überzogen ist, das aufgrund seiner Eigenschaften nichtkovalent, aber fest an die wasserunlösliche Partikelmatrix gebunden ist und die Partikel sowohl gegen das wäßrige Milieu stabilisiert als auch vor dem Zusammenkleben und der sich daraus ergebenden Flocculation schützt. Ferner ist das amphiphile organische Polymer mit reaktionsfähigen funktionellen Gruppen versehen, die es ermöglichen, weitere Komponenten daran chemisch anzukoppeln.

Als Material für die Herstellung der Nanopartikel dieses Beispiels wurde Polymilchsäure (Polylaktid, PLA) gewählt. Vorhandene Literatur über die Herstellung von Partikeln im Größenbereich von 1-10 µm (zu anderen Zwecken verwendet) belegt die Eignung dieser Substanz, die gegenüber den meisten anderen Polymeren den Vorteil der biologischen Abbaubarkeit hat. Ferner ist es möglich, PLA mit hydrophileren Endgruppen zu versehen, welche sich dann während der Herstellung an der Grenzschicht zum wäßrigen Medium orientieren und entweder selbst als niedermolekulare Zielsucher fungieren oder als Ankerpunkt für proteinöse Zielsucher verwendet werden können.

Die Herstellung von Nanopartikeln wurde anhand der Substanz RG752 (Fa. Boehringer Ingelheim), eines Block-Copolymers aus 75% Polylaktid und 25% Polyglykolid mit einem MW von durchschnittlich 12 kDA, etabliert und auf das reine Polylaktid R202H (Boehringer) und Polypropylenglykol 26000 (Sigma; bei Raumtemperatur flüssig) erfolgreich angewendet. Das jeweilige Polymer wird - ggf. in Anwesenheit der darin zu transportierenden Substanz - in Benzylalkohol gelöst (Endkonzentration 5%) und diese Lösung mit dem doppelte Volumen eines hochosmotischen Schutzkolloids (35% Polyvinylalkohol und 35% Magnesiumacetat) vermischt. Durch mehrstündige Ultraschallbehandlung wird das gelöste Polymer feinst dispergiert. Durch Dialyse des entstehenden milchigen Produktes gegen einen großen Überschuß an Wasser werden Magnesiumazetat und Benzylalkohol (in Wasser 1 : 25 löslich) sowie überschüssiger Polyvinylalkohol entfernt, so daß eine wäßrige Suspension von polyvinylalkoholbeschichteten Nanopartikeln zurückbleibt.

Evaluation des Herstellungsprozesses erfolgte nach dem Prinzip der "quasielastischen Lichtbrechung" (QELS) in einem Zetasizer-Gerät (Zetasizer 3000 HS, Fa. Malvern). Es konnte gezeigt werden, daß nach der einfachen Vermischung von gelöstem Polymer und Schutzkolloid (Rührer, Vortex) noch Flüssigpartikel im Mikrometerbereich vorliegen, die erst unter der Ultraschallbehandlung in Nanopartikel übergehen. In Übereinstimmung mit dem Modell, wonach der Polyvinylalkohol die Grenzflächen stabilisiert, ist die Polyvinylalkoholkonzentration der ausschlaggebende Faktor für den Durchmesser der entstehenden Nanopartikel: 10% Polyvinylalkohol führte zur Bildung von Partikeln im Bereich von 300-400 nm, 35% zu Partikeln von 50-100 nm. (Die kritische Größe für kolloidale Systeme liegt bei ~150 nm; Partikel unterhalb dieser Größe können prinzipiell d. h. bei Verknüpfung mit geeigneten Suchmolekülen, die Blut-Hirnschranke durchqueren.) Die Temperatur wurde bei allen Versuchen weitgehend im physiologischen Bereich, bzw. zwischen 25° und 45°C gehalten.

Die Dauer der Ultraschallbehandlung hat keinen erkennbaren Einfluß auf die Partikelgröße, wohl aber auf die Ausbeute an brauchbaren Partikeln: Nach einer Behandlung von 15 min sind rund 90% der gezählten Partikel, die zusammen jedoch nur ~1% der gesamten Polylaktidmasse ausmachen, im gewünschten Größenbereich, während der Rest aus Mikropartikeln besteht; nach 1 h Beschallung umfaßt die Nanopartikel-Fraktion ∼10% der Masse; nach 5-6 h sind zwischen 70% und 99% des gesamten Polylaktids in Nanopartikel umgesetzt. Der Rest liegt in zwei weitgehend diskreten Mikropartikelfraktionen vor, einer kleineren mit einem Durchmesser von einem halben bis ganzen und einer größeren mit einem Durchmesser von mehreren Mikrometern, was einen zweiphasigen Verlauf des Dispersionsprozesses widerspiegeln könnte. Nach ca. 15-18 h begannen Zersetzung (an der Verfärbung erkennbar) und Verklumpung, bis schließlich nach 24 h das gesamte Reaktionsgemisch zu einer wachsartigen Masse degeneriert war.

Bei manchen Messungen trat ein sekundärer Peak im Bereich von 250-300 nm auf; durch Verdünnungsversuche konnte jedoch gezeigt werden, daß es sich hierbei lediglich um Aggregate der relativen hydrophoben Partikel handelte. Höhere Partikeldichten führen überdies bei allen getesteten Substanzen zu einem scheinbaren Durchmesser der Einzelpartikel, der um 20-30% über dem realen Durchmesser liegt, da offenbar Interaktionen der Partikel deren als Grundlage für die QUELS-Messung dienende Bewegung hemmen. Erwartungsgemäß waren beide Manifestationen dieser Aggregationstendenz bei den stärker hydrophoben Substanzen R202H und Polypropylenglykol sowohl bei hoher als auch bei geringer Verdünnung erheblich deutlicher ausgeprägt als bei den korrespondierenden Proben von Nanopartikeln aus dem glykolidhaltigen Copolymer RG752.

Nachfolgend die Ergebnisse einer typische Messung (1 Vol. 5% RG752 in Benzylalkohol mit 2 Vol. 35% Magnesiumazetat/35% Polyvinylalkohol für 6 Stunden bei maximaler Leistung und 42°C beschallt, danach für 48 Stunden gegen 600 Vol. Wasser dialysiert

[Ausschlußgröße der Membran 25-30 kDa, nach 24 Stunden Erneuern des Dialysewassers]; Proben vor der Messung jeweils 1 : 36 mit Wasser verdünnt):

Die nach der Filtration beobachtete Größenverteilung ist mit der einer guten Präparation von Liposomen vergleichbar, der Vorteil liegt in der ungleich höheren Verpackungseffizienz.

Durch Verknüpfung des als Schutzkolloid verwendeten Polyvinylalkohols mit verschiedenen organischen Säuren konnten die Oberflächeneigenschaften der Partikel verändert werden. Hierbei erwies sich eine Hydrophobisierung des Polyvinylalcohols, dessen Wasserlöslichkeit an der oberen Grenze für eine Beschichtungssubstanz liegt, als essentiell, da die ausschließliche Einführung reaktiver Gruppen die Hydrophilie des Polyvinylalkohols in solchem Maße steigerte, daß derselbe einfach in Lösung ging und es zu keiner Partikelbildung mehr kam. Dies konnte durch partielle Veresterung mit Fettsäuren auf dem Weg über die Säurechloride erreicht werden. Das so erhaltene Polyvinyllaurat (20%) zeigte Partikelbindungseigenschaften, die denen des ursprünglichen Polyvinylalkohols überlegen waren: Bei vergleichbaren Mengen Schutzkolloid wurden mit Polyvinyllaurat in wesentlich kürzerer Beschallungszeit und mit höherer Ausbeute etwas kleinere Partikel gebildet.

Im nächsten Schritt wurde Polyvinylalkohol mit unterschiedlichen Mengen von Laurylchlorid und β-Alanylchlorid gleichzeitig umgesetzt, so daß Polyvinyllaurat(25%)-co-β-alanat(7%) entstand. Diese Substanz war von ihren Partikelbildungseigenschaften her mit Polyvinyllaurat vergleichbar, aber stellte große Mengen von kovalent gebundenen primären Aminogruppen zur Verfügung. Aufgrund der lockeren Oberflächenstruktur, die einen Ausgleich der Ladungen von NH₄ ⁺-Gruppen durch dazwischengelagertes Acetat erlaubt, war kein Oberflächenpotential zu beobachten, doch war die Existenz der an supermolekulare Strukturen gebundenen Aminogruppen mit chemischen Mitteln eindeutig nachzuweisen.

Beispiel 2 Herstellung der Aktinosphären und Akanthosphären a) Allgemeine Anmerkungen

Sowohl in Aktinosphären als auch in Akanthosphären bestehen die weiteren Komponenten aus einem bifunktionalen Polyethylenglykolmolekül, das am einen Ende eine aminoreaktive Gruppe trägt, am anderen Ende eine davon verschiedene Gruppe mit anderer Reaktivität. Durch dieses bifunktionale Polyethylenglykol werden einerseits die Partikel durch sterische Blockade der Oberfläche mit einem inerten Molekül dem Zugriff des Immunsystems entzogen (Ähnliches wurde im Zusammenhang mit Liposomen unter der Bezeichnung "Stealth-Technik" erprobt) und überdies weiter stabilisiert, zum anderen wird die Möglichkeit geboten, weitere Moleküle, die die eigentliche Zielspezifität vermitteln, in räumlich günstiger und flexibler Position an die Partikel anzufügen. Bei diesen Molekülen kann es sich um Mikromoleküle handeln, z. B. Zucker, in welchem Fall eine ausschließliche Verwendung des bifunktionalen Polyethylenglykols möglich ist (Aktinosphären), oder um Makromoleküle wie etwa Antikörper (Akanthosphären), in welchem Fall es aus sterischen Gründen ratsam ist, nur einen kleinen Teil der funktionalen Gruppen auf der Partikeloberfläche mit bifunktionalem Polyethylenglykol umzusetzen und den übrigen durch monofunktionales Polyethylenglykol, das dann alleine der physikalischen und immunologischen Stabilisierung der Partikel dient, abzusättigen.

Weiterhin empfiehlt es sich, nach dem Umsetzen der Nanopartikel- PEG-Konjugate mit den "Sucher"-Molekülen eventuell noch freie Kopplungsgruppen an den distalen Enden der PEG-Stacheln mit einem hohen molaren Überschuß eines geeigneten Reaktionspartners abzusättigen, im Fall von Vinylsulfon z. B. Cystein. Auf diese Weise wird verhindert, daß im Organismus diese Kopplungsgruppen mit körpereigenen Molekülen (z. B. Serumproteinen) reagieren und somit die Zielspezifität verfälscht wird.

b) konkrete Durchführung anschließend an Beispiel 1

Anschließend an die Herstellung der Nanopartikel gemäß Beispiel 1 wurden diese mit Polyethylenglykol auf der Oberfläche modifiziert. Durch Reaktion der mit Polyvinyllaurat(25%)-co-β-alanat(7%) beschichteten Partikel mit NHS-Ester/Fluorescin-Polyethylenglykol im neutralen bis schwach basischen Milieu, gefolgt von Abtrennung des ungebundenen Polyethylenglykols durch Dialyse der Partikelsuspension gegen Wasser, wurden "Proto-Aktinosphären" erhalten, deren Eigenschaften anhand der Fluoreszenz und der physikalischen Eigenschaften der Polyethylenglykolmoleküle untersucht werden konnten. Es konnte gezeigt werden, daß eine kovalent gebundene Schicht aus fluoreszenzmarkiertem Polyethylenglykol die Oberfläche der Nanopartikel in hoher molekularer Dichte ("self-quenching" der Fluoreszenz) und mit einer Dicke von 10-15 nm (hydratisiert) bedeckt, wie in der Schemazeichnung zu "Aktinosphären" dargestellt (Abb. 1). Die Partikelbildungseigenschaften des Polyvinyllaurat-co-β-alanats waren denen unmodifizierten Polyvinylalkohols deutlich überlegen.

Durch Umsetzen der mit Polyvinyllaurat(25%)-co-β-alanat(7%) beschichteten Partikel mit NHS-Ester/Vinylsulfon-Polyethylenglykol im schwach basischen Milieu und anschließende Aufreinigung durch Dialyse gegen Wasser können dementsprechend Partikel erhalten werden, die am distalen, weitgehend frei beweglichen Ende der kovalent an die Partikeloberfläche gebundenen Polyethylenglykol- "Stacheln" thiolreaktive Gruppen tragen.

Bei Verwendung der langsam reagierenden, relativ wasserstabilen Vinylsulfongruppe als distale Reaktionsgruppe der PEG-Stacheln ist es möglich, diese thiophilen Partikel für alle Anwendungen in einem vereinheitlichten Standardverfahren herzustellen und erst nach der Aufreinigung mit den geeigneten "Suchermolekülen" zu verbinden, welche beliebiger chemischer Natur sein können und lediglich eine Sulfhydrylgruppe besitzen müssen, so daß Aktinosphären und Akanthosphären hergestellt werden können. Bei Akanthosphären ist eine einfache Inprozeßkontrolle des letzten Verknüpfungsschrittes durch Zugabe von fluoreszenzmarkierten oder selber fluoreszierenden Proteinen (GFP) oder durch Western-Blot von Stichproben möglich, bei Aktinosphären durch Nachweis in der Dünnschichtchromatographie.

Beispiel 3 Wirksamkeiten und Eigenschaften von Nanopartikeln hergestellt nach Beispiel 1 oder 2

Die Beladung der Nanopartikel wurde mittels des relativ hydrophoben, zur Anfärbung von Zellmembranen verwendbaren Fluoreszenzfarbstoffes 4-Di-10ASP aus der Gruppe der Dialkylaminostyrole (Fa. Molecular Probes Inc.) getestet und entsprach den auf den gemessenen Größenverteilungen basierenden Erwartungen: Etwa 90% des eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffes wurden ordnungsgemäß in Nanopartikel verpackt. (In wäßriger Lösung interferierten uncharakterisierte physikalische Effekte in inverser Abhängigkeit vom Verdünnungsgrad mit der Fluoreszenz, der 4-Di-10ASP-Gehalt konnte daher erst nach Auflösen der Partikel in einem Überschuß eines Methanol-Chloroform-Gemischs fluorimetrisch bestimmt werden.)

Die strukturelle Stabilität der Partikel erwies sich als bemerkenswert hoch: ohne Zugabe von erhaltenden Substanzen o. ä. konnte nach einer achtwöchigen Lagerung bei Raumtemperatur ohne weiteren Zusatz stabilisierender Substanzen keine signifikante Veränderung der Größenverteilung oder 4-Di-10ASP-Beladung festgestellt werden.

Bei über die funktionalen Oberflächengruppen kovalent mit "Stacheln" aus Polyethylenglykol (MW 3400) verknüpften Nanopartikeln, an deren distalen Enden wiederum Antikörper oder andere für das Targeting verwendbare Moleküle angefügt werden können, wurde eine Verringerung der unerwünschten Aufnahme der Partikel durch das retikuloendotheliale System am Rattenmodell gezeigt.

Beispiel 4 Wirksamkeit von Akanthosphären

Partikel zum Transport pharmazeutischer Wirkstoffe mit einem Volumen < 1 µm³ beladen mit tritiummarkiertem Daunomycin wurden über ihre oberflächenständigen Aminogruppen entweder mit monofunktionalem Polyethylenglykol (PEG) verknüpft oder über bifunktionales (NHS-Ester-/Vinylsulfon-)PEG mit einem mittleren Molekulargewicht von 3400 Da mit Cysteinresten verschiedener "Sucher"-Proteine gekoppelt:

• - humanes Transferrin in verschiedenen Konzentrationen,
• - Rinderserumalbumin und
• - single-chain-Antikörper gegen den Transferrinrezeptor.

Abschließend wurden freie Kopplungsgruppen mit Cystein abgesättigt. Es wurde auch eine Fraktion der Partikel ohne "Sucher"- Molekül hergestellt.

Die Akanthosphären wurden mit Parasiten vom Typ des parasitischen Einzellers Trypanosoma brucei brucei inkubiert und Bindung sowie Cytotoxizität bestimmt.

Die Ergebnisse der Bindungs- und Cytotoxizitätsstudien zeigen eine Korrelation zwischen Cytotoxizität und Bindung. Und die mit "Sucher"-Proteinen versehenen Akanthosphären verringerten die Zelldichte der Parasiten deutlich im Vergleich zu Kontrollen, d. h., es wurde ein ausgeprägter cytotoxischer Effekt beobachtet. In Abwesenheit von "Sucher"-Proteinen hingegen waren bei gleicher Daunomycinkonzentration weder Bindung noch Cytotoxizität zu beobachten.

Claims (27)

1. Solide Partikel zum Transport hydrophober oder hydrophobisierter pharmazeutischer Wirkstoffe, herstellbar durch ein Verfahren mit folgenden Schritten:

• a) Herstellung einer Lösung in einem oder einem Gemisch von organischen Lösungsmittel(n) enthaltend mindestens einen hydrophoben oder hydrophobisierten pharmazeutischen Wirkstoffes, wasserunlösliches organisches Polymermaterial und amphiphiles organisches Polymermaterial sowie gegebenenfalls Ergänzungsstoffe,
• b) Behandlung der Lösung mit Ultraschall,
• c) Dialyse der Lösung gegen H₂O
• d) Trennung der entstehenden Partikel von der entstehenden wässrigen Lösung.

2. Partikel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das oder die organischen Lösungsmittel sich in Wasser im Verhältnis Lösungsmittel : Wasser zwischen 1 : 10 und 1 : 50, vorzugsweise zwischen 1 : 20 und 1 : 40, insbesondere zwischen 1 : 20 und 1 : 30 lösen, und/oder vorzugsweise ausgewählt sind aus:
Methylenchlorid oder Benzylalkohol, vorzugsweise Benzylalkohol,
und/oder
daß das wasserunlösliche organische Polymermaterial vor dem Schritt (b) in einer Konzentration von zwischen 3 und 0,1% (w/v), vorzugsweise zwischen 2 und 0,5% (w/v), insbesondere von 1,7% (w/v) vorliegt,
und/oder
daß die Lösung in Schritt (b) zwischen 1 h und 15 h, vorzugsweise 4 h oder 5 h bis 10 h, insbesondere 5 h bis 6 h, mit Ultraschall behandelt wird,
und/oder
daß das Konzentrationsverhältnis in % (w/v) zwischen dem wasserunlöslichen organischen Polymermaterial aus Schritt (a) und dem amphiphilen Polymermaterial aus Schritt (b) nach Abschluß von Schritt (b) zwischen 1 : 2 und 1 : 32, vorzugsweise zwischen 1 : 4 und 1 : 28, insbesondere zwischen 1 : 8 und 1 : 20, vorzugsweise zwischen 1 : 12 und 1 : 16, insbesondere 1 : 14 beträgt,
und/oder
daß die Verfahrensschritte (a) bis (c) bei physiologischen Temperaturen, vorzugsweise zwischen 35 und 40°C, insbesondere bei 37°C stattfinden,
und/oder
daß das wasserunlösliche organische Polymermaterial zusammen mit dem oder den hydrophoben pharmazeutischen Wirkstoff(en) gelöst und das amphiphile organische Polymermaterial davon zunächst getrennt, gegebenenfalls mit dem oder den Ergänzungsstoff(en), gelöst wird und die Lösungen zur Herstellung der Lösung nach Schritt (a) erst dann gemischt werden, wobei es bevorzugt ist,
daß das separat gelöste amphiphile organische Polymermaterial und/oder ein gegebenenfalls mitgelöster Ergänzungsstoff vor der Mischung mit dem unpolaren Polymermaterial in einer Konzentration von zwischen 10 und 45% (w/v), vorzugsweise zwischen 20 und 40% (w/v), insbesondere von 35% (w/v) vorliegt.

3. Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das wasserunlösliche, organische Polymermaterial aus Schritt (a) ausgewählt ist aus
Polyestern, vorzugsweise Polymilchsäure (Polylaktid), Polyglykolid oder Polylaktid/Polyglykolid Copolymeren (PLGA), insbesondere reinem Polylaktid, reinem Polypropylenglykol, oder Polylaktid/Polyglykolid Copolymer (bevorzugt im Verhältnis 3 : 1)
und/oder
daß das amphiphile organische Polymermaterial aus Schritt (a) ausgewählt ist aus
Polyvinylalkohol bzw. Derivaten des Polyvinylalkohols, vorzugsweise reinem Polyvinylalkohol, Estern aus Polyvinylalkohol und einer hydrophoben Carbonsäure (vorzugsweise Fettsäure) oder Coestern, bei denen jedes Molekül des Polyvinylalkohols mit mindestens einer hydrophoben Carbonsäure (vorzugsweise Fettsäure) und einer zweiten, davon verschiedenen Carbonsäure verestert ist,
und/oder
daß der oder die Ergänzungsstoffe ausgewählt ist/sind aus
Alkali- oder Erdalkalisalzen organischer Säuren, insbesondere Magnesiumsalzen, vorzugsweise Magnesiumacetat.

4. Solide Partikel zum Transport hydrophober oder hydrophobisierter pharmazeutischer Wirkstoffe, enthaltend einen Kern aus organischem wasserunlöslichen Polymermaterial und eine Außenschicht aus nichtkovalent an die Moleküle des Kerns gebundenen amphiphilen Polymermaterial, dadurch gekennzeichnet, daß das amphiphile Polymermaterial ausgewählt ist aus
Polyvinylalkohol bzw. Estern des Polyvinylalkohols.

5. Partikel gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Partikel nichtkovalent gebundenen, hydrophoben oder hydrophobisierten pharmazeutischen Wirkstoff enthalten.

6. Partikel gemäß einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß das amphiphile Polymermaterial ausgewählt ist aus
reinem Polyvinylalkohol, Estern aus Polyvinylalkohol und einer hydrophoben Carbonsäure (vorzugsweise Fettsäure) oder Coestern, bei denen jedes Molekül des Polyvinylalkohols mit mindestens einer hydrophoben Carbonsäure (vorzugsweise Fettsäure) und einer zweiten, davon verschiedenen Carbonsäure verestert ist.

7. Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das amphiphile Polymermaterial
ausgewählt ist aus Coestern des Polyvinylalkohols, bei denen jedes Molekül des Polyvinylalkohols mit mindestens einer hydrophoben Carbonsäure (vorzugsweise Fettsäure) und einer zweiten, davon verschiedenen Carbonsäure verestert ist,
wobei die hydrophobe Carbonsäure vorzugsweise ausgewählt ist aus Fettsäuren einer Länge zwischen 10 und 24 C-Atomen, die vorzugsweise nicht oder nicht mit COOH, OH, SH oder NH₂, insbesondere nicht mit COOH oder OH substituiert sind, vorzugsweise ausgewählt ist aus C₁₀-C₁₆-Fettsäuren, insbesondere Laurinsäure, und/oder
wobei die zweite, davon verschiedene Carbonsäure ausgewählt ist aus Carbonsäuren, die vorzugsweise nicht mit COOH oder OH und vorzugsweise mit SH oder NH₂, insbesondere NH₂, substituiert sind, insbesondere Aminosäuren, vorzugsweise Alanin,
vorzugsweise ausgewählt ist aus Coestern, bei denen der Polyvinylalkohol mit mindestens einer Fettsäure und mindestens einer Aminosäure verestert ist, insbesondere Polyvinyllaurat-co-β-Alanat, vorzugsweise Polyvinyllaurat (25%)-co-β-Alanat(7%).

8. Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Partikel Nanopartikel sind und/oder in mindestens zwei Dimensionen eine Länge von zwischen 10 und 500 nm, vorzugsweise < 150 nm, insbesondere 50 bis 100 nm aufweisen.

9. Partikel zum Transport pharmazeutischer Wirkstoffe, dadurch gekennzeichnet, daß Linker-Moleküle, die eine amino- und/oder thiolreaktive, vorzugsweise eine aminoreaktive, Gruppierung aufweisen, kovalent über vorher auf der Oberfläche des Partikels frei vorliegende NH₂- oder SH- Gruppen, vorzugsweise NH₂-Gruppen, an die Partikel gebunden sind.

10. Partikel gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Linker-Moleküle bifunktionell sind und neben einer amino- oder thiolreaktiven, vorzugsweise aminoreaktiven, Gruppierung an einem anderen Ende des Moleküls auch eine weitere, anders reaktive funktionelle Gruppierung, vorzugsweise eine thiolreaktive Gruppierung, aufweisen.

11. Partikel gemäß einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Linker-Moleküle eine Mischung bifunktioneller Moleküle gemäß Anspruch 10 und monofunktioneller Moleküle, die nur entweder die aminoreaktive oder die thiolreaktive, vorzugsweise die aminoreaktive, Gruppierung tragen, sind.

12. Partikel zum Transport pharmazeutischer Wirkstoffe, dadurch gekennzeichnet, daß auf der Oberfläche des Partikels eine Mischung aus zwei Arten Linker-Molekülen vorliegt, die an einem Ende des Linker-Moleküls über eine reaktive Gruppierung kovalent an die Oberfläche des Partikels gebunden sind, wobei die eine Art der Linker-Moleküle (bifunktionell) an mindestens einem anderen Ende des Moleküls eine weitere reaktive Gruppierung trägt, während die andere Art der Linker- Moleküle (monofunktionell) an keinem anderen Ende des Moleküls weitere reaktive Gruppierungen trägt.

13. Partikel gemäß einem der Ansprüche 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß an der Oberfläche der Partikel deutlich mehr, vorzugsweise mindestens 100% mehr, monofunktionelle als bifunktionelle Linker-Moleküle kovalent gebunden sind.

14. Partikel gemäß einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Linker-Moleküle Polyglykolide sind, vorzugsweise Polyethylenglykol-Derivate, insbesondere NHS- Ester-Polyethylenglykol oder NHS-Ester/Vinylsulfon- Polyethylenglykol.

15. Partikel gemäß einem der Ansprüche 9 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Partikel Nanopartikel sind.

16. Partikel gemäß einem der Ansprüche 9 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Partikel einem der Ansprüche 1 bis 8 entsprechen.

17. Partikel gemäß einem der Ansprüche 9 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß an die bifunktionellen Linker-Moleküle bioaktive Makromoleküle oder "Sucher"-Moleküle, ausgewählt aus Peptiden, Proteinen; vorzugsweise Antikörpern, Antikörperfragmenten oder Antikörperderivaten mit zielbindenden Eigenschaften wie "Single-chain"-Antikörpern; Hormonen, Zuckern, vorzugsweise Glykosiden; synthetischen oder natürlichen Rezeptor-Liganden; Proteinen oder Peptiden mit einer freien Cysteingruppe oder Thiozuckern, angekoppelt sind, angekoppelt werden oder vor der Oberflächenmodifikation angekoppelt wurden.

18. Partikel gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß an die bifunktionellen Linker-Moleküle bioaktive Makromoleküle oder "Sucher"-Moleküle, vorzugsweise Antikörper, Antikörperfragmente oder Antikörperderivate mit zielbindenden Eigenschaften wie "Single-chain"-Antikörper, insbesondere mit freier Cysteingruppe, angekoppelt sind, angekoppelt werden oder vor der Oberflächenmodifikation angekoppelt wurden.

19. Partikel gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß an die bifunktionellen Moleküle der Beschichtung bioaktive Mikromoleküle oder "Sucher"-Moleküle, vorzugsweise Zucker, insbesondere Thiozucker; Peptide oder Hormone, insbesondere mit freier Cysteingruppe, angekoppelt sind, angekoppelt werden oder vor der Oberflächenmodifikation angekoppelt wurden.

20. Partikel gemäß einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß nach Bindung der bioaktiven Mikromoleküle oder "Sucher"-Moleküle noch freie reaktive Gruppen abgesättigt werden, vorzugsweise mit Cystein.

21. Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß der zu transportierende Wirkstoff ein synthetischer oder natürlicher Wirkstoff, ein Protein, Peptid, Lipid, Zucker oder Nukleinsäure bzw. ein niedermolekularer organischer oder hochmolekularer organischer Wirkstoff, beispielsweise ein Hormon, eine antineoplastische Substanz, ein Antibiotikum, Antimykotikum, Parasitizid, Virustatikum oder Antihelmintikum, eine cardiovaskulär-aktive Substanz; eine zentralwirksame Substanz, insbesondere ein Analgetikum, Antidepressivum oder Antiepileptikum; ist.

22. Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß er direkt oder über einen Linker; vorzugsweise über bifunktionelle Polyethylenglykol-Moleküle; verknüpft ist mit einem "Sucher"-Molekül ausgewählt aus:
Peptiden, Proteinen; vorzugsweise Antikörpern, Antikörperfragmenten oder Antikörperderivaten mit zielbindenden Eigenschaften wie "Single-chain"- Antikörpern; Hormonen, Zuckern, vorzugsweise Glykosiden; synthetischen oder natürlichen Rezeptor- Liganden; Proteinen oder Peptiden mit einer freien Cysteingruppe oder Thiozuckern.

23. Verwendung von reinen bifunktionellen Polyethylenglykol- Molekülen; vorzugsweise NHS-Ester/Vinylsulfon- Polyethylenglykol; oder Mischungen aus bifunktionellen und monofunktionellen Polyethylenglykol-Molekülen; vorzugsweise NHS-Ester-Polyethylenglykol mit NHS- Ester/Vinylsulfon-Polyethylenglykol; zur Herstellung von oberflächenmodifizierten soliden Partikeln zum Transport pharmazeutischer Wirkstoffe.

24. Verwendung gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß über die bifunktionellen Polyethylenglykol-Moleküle "Sucher"-Moleküle ausgewählt aus
Peptiden, Proteinen; vorzugsweise Antikörpern, Antikörperfragmenten oder Antikörperderivaten mit zielbindenden Eigenschaften wie "Single-chain"- Antikörpern; Hormonen, Zuckern, vorzugsweise Glykosiden; synthetischen oder natürlichen Rezeptor- Liganden; Proteinen oder Peptiden mit einer freien Cysteingruppe oder Thiozuckern
an die Partikel gebunden werden, vorzugsweise bei Verwendung von reinen bifunktionellen Polyethylenglykol- Molekülen Glykoside, insbesondere Thiozucker; bei Verwendung von Mischungen aus bifunktionellen und monofunktionellen Polyethylenglykol-Molekülen Antikörper, Antikörperfragmente oder Antikörperderivate mit zielbindenden Eigenschaften wie "Single-chain"-Antikörper, vorzugsweise solche mit freier Cysteingruppe.

25. Verfahren zur Herstellung eines Partikels gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6, gekennzeichnet durch folgende Schritte:

• a) Herstellung einer Lösung in einem oder in einem Gemisch von organischen Lösungsmittel(n) enthaltend mindestens einen hydrophoben pharmazeutischen Wirkstoff, wasserunlösliches, organisches Polymermaterial und amphiphiles organisches Polymermaterial,
• b) Behandlung der Lösung mit Ultraschall,
• c) Dialyse der Lösung gegen H₂O
• d) Trennung der entstehenden Partikel von der entstehenden wässrigen Lösung.

26. Arzneimittel enthaltend Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 22 sowie gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe.

27. Verwendung von Partikeln gemäß einem der Ansprüche 1 bis 22 zur Herstellung eines Arzneimittel zur Krebsbehandlung, zur Behandlung von Infektionskrankheiten und Parsitosen, zur Behandlung von Krankheiten und Symptomen mit zentralnervöser Ursache, zur Verwendung in der Gentherapie oder für genomisches Targeting.