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Die
Erfindung betrifft eine Anordnung zur Aufbereitung einer Mehrzahl
von Proben für
eine Analyse, welche eine Anordnung, mikrofluidische Vorrichtungen
zur Aufnahme von Proben und Mittel zum Bewegen der mikrofluidischen
Vorrichtungen in der Anordnung aufweist. Die Erfindung betrifft
ferner ein Verfahren zur Aufbereitung einer Mehrzahl von Proben
für eine
Analyse.
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In
der biotechnologischen Analytik wurden in den letzten Jahren Hochdurchsatzverfahren
(high throughput screnning, HTS) entwickelt, um in kurzer Zeit eine
große
Menge von Proben aufarbeiten zu können. Dabei kamen vorwiegend
Lochplattenformate zum Einsatz, z.B. 96-Lochplatten oder 384-Lochplatten,
wobei jedes Loch bzw. jede Vertiefung in einer Platte ein Reaktionsgefäß darstellt.
Der Nachteil solcher Verfahren liegt darin, dass Flüssigkeiten
von Vorratsgefäßen zur
Platte oder von Platte zu Platte überpipettiert werden müssen, was
mechanisch aufwendig ist und Kontaminationsrisiken birgt.
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Es
wurden daneben auch vollintegrierte mikrofluidische Analysevorrichtungen
entwickelt, wobei anstatt von Reaktionsgefäßen Prozesskammern verwendet
werden, welche über
Leitungen bzw. Kanäle verbunden
sind, wie z.B. in
DE
101 11 457 A1 beschrieben. Diese Vorrichtungen können vollständig eingekapselt
in einer Cartridge, einem kartenartigen Flachgebilde, enthalten
sein, wobei in der Vorrichtung Prozesskammern zur Probenaufbereitung,
Amplifikation von Analyten, z.B. Nukleinsäuren, und zur Detektion von
Analyten, z.B. in Form von Biochips mit Nukleinsäure-Mikroarrays, vorgesehen
sind. Analysevorrichtungen dieser Art haben den Vorteil, dass die
Analyse vollständig
in der gekapselten Analysevorrichtung ablaufen kann, so dass Kontaminationsrisiken
oder Bedienungsfehler weitgehend ausgeschlossen sind.
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Derartige
Vorrichtungen können
zur Analyse von Nukleinsäuren,
z.B. DNA-Sequenzen oder RNA-Sequenzen, Proteinen und anderen Biomolekülen verwendet
werden. Selbst komplexe Assay-Abläufe können in einer derartigen Analysevorrichtung in
mikrofluidischen Anordnungen von Prozesskammern und Verbindungskanälen kontaminations-
und fehlerfrei durchgeführt
werden. Ein Nachteil dieser Systeme ist jedoch der geringe Probendurchsatz, d.h.
die geringe Anzahl durchführbarer
Assays pro Zeit. Insbesondere bei Nukleinsäure-basierten Systemen, welche
eine Amplifikation der DNA oder RNA erfordern, ist eine Gesamtdauer
des Assays von einer Stunde und mehr keine Ausnahme. Allgemein wird
dabei zunächst
die Probe manuell in die Analysevorrichtung eingebracht, und diese
dann in ein Steuer- bzw. Auslesegerät eingeschoben, in welchem
die Prozessschritte automatisch abgearbeitet werden. Am Ende des
Assays wird die Analysevorrichtung manuell aus dem Steuergerät entfernt.
Dieser Prozessablauf erfordert die regelmäßige manuelle Intervention
durch das Bedienpersonal und schränkt den Durchsatz signifikant
ein.
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Theoretisch
können
vollintegrierte Diagnostiksysteme für komplexe Assays mit vielen
biologischen Fragestellungen (z.B. Multiparameterstudien wie die
Cytochrom P 450 Analyse oder CFTR) auch in Zentrallabors zum Einsatz
kommen. Dabei ist jedoch der geringe Durchsatz von großem Nachteil
und führt
zu prohibitiv hohen Kosten. Bei etablierten Hochdurchsatzverfahren,
z.B. die oben beschriebenen Verfahren auf Lochplattenformaten, ist
die Aufbereitung der Proben zur Analyse aufwendig. Diese Aufbereitung
kann jedoch in mikrofluidischen Vorrichtungen mit vergleichsweise
geringem Aufwand durchgeführt
werden, z.B. durch Aufschluss der Probe, Binden der Analyten an
magnetische Substrate, sogenannte Magnetbeads, Fixieren des Substrat-Analyten-Komplexes
durch ein externes Magnetfeld in der Analysevorrichtung und Entfernen
von unerwünschten
Probebestandteilen durch Überspülen der
fixierten Substrat-Analyten-Komplexe
mit einer Waschflüssigkeit,
so wie z.B. in
DE
101 11 520 B4 beschrieben. Derartige Verfahren sind bisher
allerdings nicht hochdurchsatzfähig.
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Aufgabenstellung
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Angesichts
der oben geschilderten Nachteile des Stands der Technik ist es die
Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Anordnung und ein Verfahren
zur Aufbereitung einer Mehrzahl von Proben für eine Analyse bereitzustellen,
welche(s) in einer vollintegrierten Analysevorrichtung durchgeführt werden kann
und gleichzeitig für
die Verarbeitung hoher Probenzahlen geeignet ist.
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Beschreibung der Erfindung
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Erfindungsgemäß wird die
Aufgabe gelöst durch
eine Anordnung zur Aufbereitung einer Mehrzahl von Proben für eine Analyse
gemäß Anspruch
1 und durch ein Verfahren gemäß Anspruch
11.
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Die
erfindungsgemäße Anordnung
zur Aufbereitung einer Mehrzahl von Proben für eine Analyse weist folgende
Merkmale auf:
- a) eine Aufnahme für eine mikrofluidische
Vorrichtung; und
- b) Mittel zum Bewegen der mikrofluidischen Vorrichtung in der
Anordnung entlang mindestens einer vorgegebenen Bewegungsrichtung;
wobei
die Anordnung mindestens ein Magazin zur Bevorratung einer Mehrzahl
von mikrofluidischen Vorrichtungen aufweist.
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Vorzugsweise
weist die Anordnung eine Einrichtung zum Bewegen von in der mikrofluidischen Vorrichtung
vorgesehenen Mitteln zum Binden von wenigstens einem biologischen
Molekül
relativ zu der mikrofluidischen Vorrichtung auf. Diese Einrichtung umfasst
bevorzugt einen Magnetfelderzeuger.
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Der
Begriff „mikrofluidische
Vorrichtung" bezieht
sich auf eine Vorrichtung, in welcher Fluidvolumina im Mikroliter-Bereich manipuliert
werden können,
z.B. mikrofluidische Cartridges, wie sie in der Technik allgemein
bekannt sind.
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Bevorzugt
weist die erfindungsgemäße Anordnung
ferner Mittel zur Amplifikation des biologischen Moleküls in der
mikrofluidischen Vorrichtung auf.
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Ferner
umfasst die erfindungsgemäße Anordnung
Mittel zur Detektion des biologischen Moleküls.
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Die
erfindungsgemäße Anordnung,
umfasst ferner bevorzugt eine Einrichtung zum Einbringen einer Probe
in eine mikrofluidische Vorrichtung.
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Gemäß einem
bevorzugten Aspekt der Erfindung umfasst die Anordnung einen Behälter zum Sammeln
verbrauchter mikrofluidischer Vorrichtungen.
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Gemäß einem
bevorzugten Aspekt der Erfindung umfasst die Anordnung ein stapelartiges
Magazin, in welchem die mikrofluidischen Vorrichtungen stapelbar
sind.
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Gemäß einem
alternativen Aspekt der Erfindung umfasst die Anordnung ein trommelartiges
Magazin, in welchem die mikrofluidischen Vorrichtungen auf einer
Rolle aufrollbar sind.
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Gemäß einem
weiteren bevorzugten Aspekt der Erfindung umfasst die Anordnung
Mittel zum Erfassen einer Kodierung einer mikrofluidischen Vorrichtung.
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Erfindungsgemäß wird eine
Probe, welche vermutlich zu untersuchende biologische Moleküle enthält, in die
mikrofluidische Vorrichtung eingebracht, wobei in der mikrofluidischen
Vorrichtung das zu untersuchende biologische Molekül durch
das Mittel zum Binden gebunden wird und somit eine Aufbereitung der
Probe ermöglicht
wird. Aus dem Magazin kann eine weitere mikrofluidische Vorrichtung
nachgeführt
werden, und mit der nächsten
Probe gefüllt werden.
Alternativ können
mehrere mikrofluidische Vorrichtungen vor Einbringen in die Anordnung
mit den Proben befüllt
werden. Die mikrofluidischen Vorrichtungen werden entlang der mindestens
einen vorgegebenen Bewegungsrichtung durch die Anordnung transportiert
und die Proben können
auf diese Weise automatisiert nacheinander abgearbeitet werden.
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Vorzugsweise
sind die Mittel zum Binden des wenigstens einen biologischen Moleküls als ein
Substrat ausgeführt,
welches mit dem zu untersuchenden biologischen Molekül zu einem
Substrat-Molekül-Komplex
verbindbar ist.
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Gemäß einem
Aspekt der vorliegenden Erfindung weist das Substrat eine proteinbindende
Eigenschaft auf, welche vorzugsweise als Antikörper ausgeführt sein kann, welcher auf
das biologische Molekül
gerichtet ist.
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Gemäß einem
alternativen Aspekt der vorliegenden Erfindung weist das Substrat
eine Nukleinsäure-bindende
Eigenschaft auf, wobei die Nukleinsäure-bindende Eigenschaft vorzugsweise
nicht sequenzspezifisch, z.B. als Silan oder als Sonden-Oligonukleotid (sequenzspezifisch)
ausgeführt
ist.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung weist das Substrat sowohl
mindestens eine Protein-bindende Eigenschaft als auch mindestens
eine Nukleinsäure-bindende
Eigenschaft auf.
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Bevorzugt
umfassen die Mittel zum Binden von wenigstens einem biologischen
Molekül
wenigstens ein magnetisches Element, z.B. Magnetbead, welches durch
ein Magnetfeld bewegt und/oder fixiert werden kann.
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Bevorzugt
weist die Anordnung Mittel zur Amplifikation des Moleküls auf.
Dies kann z.B., falls das Molekül
eine Nuklein säure
ist, eine Amplifikationskammer in der mikrofluidischen Vorrichtung
umfassen, in welcher eine Amplifikationsreaktion, z.B. die Polymerase
Kettenreaktion (PCR) oder ein vergleichbares Amplifikationsverfahren
stattfinden kann. In der Anordnung können zur Durchführung einer derartigen
Reaktion Heiz- und/oder
Kühlelemente, z.B.
Peltierelemente, vorgesehen sein.
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Ferner
weist die erfindungsgemäße Anordnung
vorzugsweise Mittel zur Detektion des Moleküls auf. Die Detektion kann
z.B. durch magnetische, optische, fluoreszenzoptische, elektrochemische,
gravimetrische und andere geeignete Verfahren erfolgen. In der mikrofluidischen
Vorrichtung ist dazu eine Detektionskammer vorgesehen, welche z.B.
ein Nukleinsäure-Mikroarray aufweisen
kann, auf welchem Sonden-Oligonukleotide zum Nachweis von Nukleinsäure-Molekülen vorgesehen
sind. Besonders bevorzugt ist eine elektrochemische Detektion. Dazu
ist in der mikrofluidischen Vorrichtung ein elektrochemischer Sensor,
z.B. in Form von Elektroden vorgesehen. In der Anordnung sind Mittel
zu Messen von Strömen
und/oder Spannungen vorgesehen. Ein entsprechendes Messverfahren,
das hierbei verwendbar ist, ist z.B. in
DE 101 26 341 A1 beschrieben.
Gemäß einem
alternativen Aspekt ist eine magnetische Detektion bevorzugt. Dazu
kann in der Anordnung ein magnetoresistiver Sensor vorgesehen sein.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst die mikrofluidische
Vorrichtung mindestens eine Prozesskammer, in welcher zumindest
vorübergehend
die Mittel zum Binden von wenigstens einem biologischen Molekül enthalten
sind. Die mindestens eine Prozesskammer kann als eine Aufbereitungskammer
zur Verwendung der Mittel zum Binden des wenigstens einen biologischen
Moleküls,
als Amplifikationskammer zur Verwendung der Mittel zur Amplifikation
des wenigstens einen biologischen Moleküls und/oder als Detektionskammer
zur Detektion des wenigstens einen biologischen Moleküls ausgebildet
sein. Bevorzugt können
eine Mehrzahl von Prozesskammern vorgesehen sein, die entlang einer
Reaktionsstrecke angeordnet sind und durch Leitungen zumindest zeitweise ver bindbar
sind. Die Leitungen können
als mikrofluidische Kanäle
mit daran angebrachten Ventilen ausgeführt sein. Die Ventile können als
einfache elastische Quetschventile oder magnetsteuerbare Ventile ausgeführt sein,
um die verschiedenen Prozesskammern voneinander fluidisch zu trennen.
Die Ventile können
auch auf andere dem Fachmann bekannte Arten ausgeführt sein.
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Gemäß einem
bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung können in einer mikrofluidischen Vorrichtung
eine Mehrzahl von Gruppen von Prozesskammern vorgesehen sein, wobei
die Prozesskammern in einer Gruppe bevorzugt jeweils entlang einer
Reaktionsstrecke angeordnet sind und die Prozesskammern einer Gruppe
entlang der jeweiligen Reaktionsstrecke zumindest zeitweise durch
Leitungen fluidisch verbindbar sind. Auf diese Weise können mehrere
Probenstrecken z.B. parallel auf der mikrofluidischen Vorrichtung
realisiert werden. An einem Ende der jeweiligen Reaktionsstrecken
können sich
parallel angeordnete Probenports befinden, welche durch Septen versiegelt
sein können.
Am anderen Ende können
als Detektionsmittel z.B. entsprechend mehrere parallel angeordnete
Mikroarrays oder alternativ auch ein für die einzelnen Reaktionsstrecken
gemeinsamer Mikroarray zum Nachweis der Zielmoleküle in sämtlichen
aufgebrachten biologischen Proben vorgesehen sein. Die Probenports können entlang
der Reaktionsstrecke über
verschiedene Prozesskammern (z.B. Aufbereitungs-, Wasch- und Amplifikationskammern)
und Leitungen mit den Mikroarrays verbunden sein. Eine derartige
mikrofluidische Vorrichtung kann als einmal verwendbares Element
in der erfindungsgemäßen Anordnung
verwendet werden. Das einmal verwendbare Element kann als längliche
Vorrichtung ausgebildet sein, z.B. in Form einer Cartridge, d.h.
einen kartenartigen Flachgebilde. Bevorzugt sind die Kammern und
Leitungen entlang der Reaktionsstrecke in der länglichen Vorrichtung entlang
der mindestens einen Bewegungsrichtung ausgerichtet, mit welcher
die längliche
Vorrichtung durch das Steuergerät
transportiert wird. Es wird angemerkt, dass in der in diesem Absatz
beschriebenen mikrofluidischen Vorrichtung mit einer Mehrzahl von
paralle len Reaktionsstrecken eine von der restlichen Anordnung unabhängige eigenständige Erfindung
gesehen wird, welche ebenfalls die eingangs gestellte Aufgabe löst.
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Ferner
ist bei der Anordnung bevorzugt ein Behälter zum Sammeln der verbrauchten
mikrofluidischen Vorrichtungen vorgesehen.
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Die
mikrofluidischen Vorrichtungen können nach
einmaliger Verwendung verworfen und entsorgt werden. Es ist aber
auch denkbar, dass sie, z.B. nach einer Reinigung oder Regeneration
erneut verwendet werden können.
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Die
Anordnung kann ein stapelartiges Magazin aufweisen, in welchem die
mikrofluidischen Vorrichtungen gestapelt sind. Alternativ kann beispielsweise
auch ein trommelartiges Magazin vorgesehen sein, in welchem die
mikrofluidischen Vorrichtungen auf einer Rolle aufgerollt sind.
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Vorzugsweise
weist die Anordnung eine Einrichtung zum Einbringen einer Probe
in eine mikrofluidische Vorrichtung auf. Diese kann beispielsweise als
automatisierte Pipettiervorrichtung ausgestaltet sein, welche eine
Probe in die mikrofluidische Vorrichtung hineinpipettieren kann.
Falls auf der mikrofluidischen Vorrichtung mehrere parallele Reaktionsstrecken
zur parallelen Verarbeitung von Proben vorgesehen sind, weist die
Einrichtung zum Einbringen einer Probe in die mikrofluidische Vorrichtung
vorzugsweise eine entsprechende Anzahl von Kanälen auf, um die entsprechende
Probenanzahl in einem Arbeitsschritt einzubringen.
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In
dem Steuergerät
sind Mittel zum Bewegen oder Transportieren der mikrofluidischen
Vorrichtung entlang mindestens einer vorgegebenen Bewegungsrichtung
vorgesehen, diese Transportmittel können z.B. in Form von einem
Transportband ausgeführt
sein.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung sind ferner Mittel zum
Bewegen des Substratmolekülkomplexes
relativ zu der mikrofluidischen Vorrichtung vorgesehen, welche vorzugsweise
einen Magnetfelderzeuger umfassen. Durch Bewegen der mikrofluidischen
Vorrichtung relativ zu dem Magnetfelderzeuger, bzw. durch Bewegen
des Magnetfelderzeugers relativ zu der mikrofluidische Vorrichtung,
kann der Substrat-Molekül-Komplex, welcher
Magnetbeads aufweist, relativ zu der mikrofluidischen Vorrichtung,
also z.B. entlang des Reaktionsweges durch die Prozesskammern, bewegt
werden. Dabei werden die Magnetbeads im Magnetfeld des Magnetfelderzeugers
festgehalten, während
die mikrofluidische Vorrichtung relativ zu dem Magnetfelderzeuger
(oder umgekehrt) bewegt wird.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung weisen die mikrofluidischen
Vorrichtung eine Markierung auf, durch welche sie kodiert werden
können.
Auf diese Weise ist es möglich, eine
Zuordnung zwischen aufgebrachter Probe und dem einmal verwendbaren
Element zu erfassen. Dazu sind vorzugsweise Mittel zur Erfassung
der Markierung in der Anordnung vorgesehen. Die Markierung kann
eine übliche,
dem Fachmann bekannte Art der Markierung umfassen, z.B. einen Barcode, ein
RFID, oder ähnliches.
In der Anordnung sind dann vorzugsweise entsprechende Mittel zum
Auslesen der Markierung vorhanden. Ferner kann die Anordnung über Schnittstellen
an ein Datenverarbeitungssystem angeschlossen sein, über welches
die mikrofluidischen Vorrichtungen anhand der Markierung registriert
werden und ausgelesen Daten gespeichert werden. Bevorzugt können einmal
verwendete mikrofluidische Vorrichtungen über das Datenverarbeitungssystem
entwertet werden, um ein mehrfaches Lesen auszuschließen.
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Bei
der Aufbereitung einer Mehrzahl von Proben für eine Analyse wird folgendermaßen vorgegangen:
Es
wird eine Anordnung bereitgestellt, welches ein Magazin zur Bevorratung
einer Mehrzahl von mikrofluidischen Vorrichtungen aufweist. Die
mikrofluidischen Vorrichtungen enthalten jeweils Mittel zum Binden
von wenigstens einem biologischen Molekül, wobei die Mittel zum Binden
des wenigstens einen biologischen Moleküls relativ zu der mikrofluidischen Vorrichtung
bewegbar sind.
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Eine
Probe, welche vermutlich zu untersuchende biologische Moleküle enthält, wird
in die mikrofluidische Vorrichtung eingebracht. Optional kann die
Probe zunächst
in der mikrofluidischen Vorrichtung aufgeschlossen werden, z.B.
durch Verwendung eines Lysepuffers. Das zu untersuchende biologische
Molekül
wird durch die Mittel zum Binden des biologischen Moleküls gebunden.
Vorzugsweise sind die Mittel zum Binden des wenigstens einen biologischen
Moleküls
als Substrat ausgeführt,
welcher mit dem Molekül
zu einem Substrat-Molekül-Komplex verbindbar
ist. Das Mittel zum Binden des wenigstens einen biologischen Moleküls, bzw.
der Substrat-Molekül-Komplex
kann nun in der mikrofluidischen Vorrichtung, z.B. einem vorgegebenem
Reaktionsablauf entsprechend, bewegt werden.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung kann der Substrat-Molekül-Komplex
nach dem Binden des Moleküls
vom Rest der Probe getrennt werden. Dies kann geschehen, indem der
Substrat-Molekül-Komplex
relativ zu dem restlichen Probevolumen bewegt wird, z.B. durch magnetisches
Fixieren des Substrat-Molekül-Komplexes und
Wegspülen
der Probe.
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In
der Anordnung können
Mittel zum Pumpen vom Fluiden in die mikrofluidische Vorrichtung und/oder
aus der mikrofluidischen Vorrichtung vorgesehen sein. Diese können z.B.
als Leitungen, Kanäle, mit
entsprechenden Befüllungs-
oder Entnahmeeinrichtungen, unter Verwendung von entsprechenden Fluidtransportsystemen,
z.B. Kolbenpumpen, Peristaltikpumpen und anderen dem Fachmann bekannten
Pumpen ausgeführt
sein.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung kann das Molekül im Lauf
des Verfahrens auch wieder von dem Substrat getrennt werden, z.B.
durch Auftrennen der Substrat- Molekül-Komplexbindung,
z.B. durch Erwärmung, Änderung
der Salzkonzentration oder ähnliche.
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Gemäß einem
bevorzugten Aspekt der Erfindung weist das Verfahren einen zusätzlichen
Schritt des Amplifizierens des Moleküls mit einer Amplifikationsreaktion
auf. Ferner weist das Verfahren bevorzugt den zusätzlichen
Schritt des Detektierens des Moleküls auf.
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Das
Mittel zum Binden des wenigstens einen Moleküls wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
bevorzugt entlang einer Reaktionsstrecke in der mikrofluidischen
Vorrichtung bewegt, welche in mindestens eine Prozesskammer führt.
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Bevorzugt
sind entlang der Reaktionsstrecke mehrere Prozesskammern angeordnet.
Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden bei dem Verfahren
in der mikrofluidischen Vorrichtung mehrere Proben gleichzeitig
in einer entsprechenden Anzahl von Reaktionsstrecken aufbereitet,
die in der mikrofluidischen Vorrichtung im Wesentlichen parallel
angeordnet sind.
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Bevorzugt
werden die mikrofluidischen Vorrichtungen aus dem Magazin nachgeführt, durchlaufen
die Anordnung entlang der mindestens einen vorgegebenen Bewegungsrichtung
und werden dann von der Anordnung ausgeworfen oder in einen Behälter zum
Sammeln von verbrauchten mikrofluidischen Vorrichtungen transportiert.
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Die
Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Aufbereitung einer Mehrzahl
von Proben für
eine Analyse, welches die folgenden Schritte aufweist:
- a) Bevorraten einer Anordnung mit einer Mehrzahl von mikrofluidischen
Vorrichtungen, wobei die Anordnung mindestens ein Magazin zur Bevorratung mit
mikrofluidischen Vorrichtungen aufweist und wobei die mikrofluidischen
Vorrichtungen jeweils Mittel zum Binden von wenigstens einem biologischen
Molekül
enthalten;
- b) Einbringen einer ersten Probe, enthaltend mindestens ein
zu untersuchendes biologisches Molekül, in eine der mikrofluidischen
Vorrichtungen;
- c) Binden des zu untersuchenden biologischen Moleküls durch
die Mittel zum Binden von wenigstens einem biologischen Molekül; und
- d) Wiederholen der Schritte b)–c) mit den weiteren Proben,
bis alle aufzubereitenden Proben aufbereitet sind;
wobei
die mikrofluidische Vorrichtung mit der eingebrachten Probe in der
Anordnung entlang mindestens einer vorgegebenen Bewegungsrichtung
bewegt wird.
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Dabei
sind die Mittel zum Binden des wenigstens einen biologischen Moleküls bevorzugt
relativ zu der mikrofluidischen Vorrichtung bewegbar.
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Bevorzugt
erfolgt das Einbringen der Proben, enthaltend zu untersuchende biologische
Moleküle,
in die jeweiligen mikrofluidischen Vorrichtungen vor dem Bevorraten
der Anordnung mit mikrofluidischen Vorrichtungen.
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Gemäß einem
bevorzugten Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Mittel
zum Binden des wenigsten einen biologischen Moleküls als ein
Substrat ausgeführt,
das mit dem Molekül
zu einem Substrat-Molekül-Komplex
verbindbar ist.
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Bevorzugt
wird nach dem Binden des Moleküls
an das Substrat der Substrat-Molekül-Komplex von der restlichen
Probe getrennt.
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Gemäß einem
bevorzugten Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Trennung
des Substrat-Molekül-Komplex
von der restlichen Probe durch Bewegen des Substrat-Molekül-Komplexes
relativ zu der restlichen Probe erreicht.
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Gemäß einem
bevorzugten Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens umfassen die
Mittel zum Binden des wenigsten einen biologischen Moleküls wenigsten
ein magnetisches Element.
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Gemäß einem
bevorzugten Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Magnetfeld
zum Bewegen der Mittel zum Binden des wenigstens einen biologischen
Moleküls
relativ zu der mikrofluidischen Vorrichtung verwendet.
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Gemäß einem
bevorzugten Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens weist das erfindungsgemäße Verfahren
den zusätzlichen
Schritt des Amplifizierens des biologischen Moleküls mit einer
Amplifikationsreaktion auf.
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Gemäß einem
bevorzugten Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens weist das erfindungsgemäße Verfahren
den zusätzlichen
Schritt des Detektierens des biologischen Moleküls auf.
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Gemäß einem
bevorzugten Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das biologische
Molekül
magnetisch, elektrochemisch oder optisch detektiert.
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Gemäß einem
bevorzugten Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Mittel
zum Binden des wenigstens einen Moleküls entlang einer Reaktionsstrecke
in der mikrofluidischen Vorrichtung bewegt, welche in mindestens
eine Prozesskammer führt.
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Gemäß einem
bevorzugten Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Mittel
zum Binden des wenigstens einen Moleküls entlang einer Reaktionsstrecke
in der mikrofluidischen Vorrichtung durch mehrere Prozesskammern
bewegt.
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Gemäß einem
bevorzugten Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Reaktionsstrecke im
Wesentlichen entlang der mindestens einen vorgegebenen Bewegungsrichtung
in der Anordnung ausgerichtet.
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Gemäß einem
bevorzugten Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens werden dabei
in dem mindestens einmal verwendbaren Element mehrere Proben gleichzeitig
in einer entsprechenden Anzahl von Reaktionsstrecken aufbereitet,
die in der mikrofluidischen Vorrichtung im wesentlichen Parallel
angeordnet sind.
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Bevorzugt
werden die mikrofluidischen Vorrichtungen aus dem Magazin nachgeführt, durchlaufen
die Anordnung entlang der mindestens einen vorgegebenen Bewegungsrichtung
und werden dann von der Anordnung ausgeworfen oder in einen Behälter zum
Sammeln verbrauchter mikrofluidischen Vorrichtungen transportiert.
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Ausführungsbeispiel
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Weitere
Aspekte, Eigenschaften und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden
verdeutlicht anhand der folgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen
und den angehängten
Zeichnungen, in denen zeigen:
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1 eine
schematische Darstellung einer ersten Ausführungsform einer mikrofluidischen
Vorrichtung zur Aufnahme einer Probe der erfindungsgemäßen Anordnung;
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2 eine
zweite Ausführungsform
einer mikrofluidischen Vorrichtung der erfindungsgemäßen Anordnung;
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3 eine
dritte Ausführungsform
der mikrofluidischen Vorrichtung der erfindungsgemäßen Anordnung;
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4 eine
erste Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Anordnung
in einem ersten Betriebszustand;
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5 eine
erste Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Anordnung
in einem zweiten Betriebszustand;
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6 eine
erste Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Anordnung
in einem dritten Betriebszustand; und
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7 eine
zweite Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Anordnung.
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In 1 ist
schematisch eine mikrofluidische Vorrichtung, welche in der erfindungsgemäßen Anordnung
verwendet wird, in Form einer Cartridge 1 dargestellt.
Diese ist als kartenartiges Flachgebilde ausgebildet und kann z.B.
als Kunststoff-Spritzgußteil hergestellt
werden, wobei darin vorhandene Vertiefungen in Form von Kammern
und Kanälen
ausgestaltet sind. In die Cartridge können für die späteren Prozesse und Reaktionen
notwendige Reagenzien, z.B. in Form von Trockenreagenzien, eingebracht werden,
z.B. durch Aufspotten in den entsprechenden Kammern. Durch Versiegeln
der nach oben offenen Cartridge, z.B. mit einer Kunststofffolie,
wird eine geschlossene mikrofluidische Vorrichtung mit darin befindlichen
Prozesskammern und Leitungen geschaffen. Die Cartridge 1 umfasst
eine Aufbereitungskammer 3, eine Aufschlusskammer 5,
eine Waschkammer 7, eine Amplifikationskammer 9 und eine
Detektionskammer 11. Die Aufbereitungskammer 3 umfasst
eine Einfüllöffnung 13, über die
beispielsweise mittels einer Spritze oder Pipette die zu untersuchende
Probe in die Aufbereitungskammer 3 eingebracht werden kann.
Die Prozesskammern 5, 7, 9, 11 sind über einen
Mikrokanal 15 mit einer Öffnung 17 verbunden, über welche
in an sich bekannter Weise Wasser oder Puffer in die Prozesskammern
eingebracht werden kann. Die Einfüllöffnung 13 und/oder Öffnung 17 können mit
einem Septum verschlossen sein, um Sterilität zu gewährleisten und/oder Kontaminationen
und Verschleppungen zu verhindern. Außer der Aufbereitungskammer 3 weist
jede Prozesskammer 5, 7, 9, 11 eine
Entlüftungsöffnung 19 auf, welche
beispielsweise mit einer gasdurchlässigen Membran verschlossen
ist. So kann sichergestellt werden, dass Gas die Prozesskammern
verlassen kann, nicht jedoch Flüssigkeit.
In der Aufbereitungskammer ist ein Lysereagenz 31, z.B.
in trockener Form, vorge lagert. Durch das Einbringen der (flüssigen)
Probe, z.B. Blut oder eine andere Probenflüssigkeit, wird das Lysereagenz
gelöst.
Biologische Strukturen, z.B. Zellen, Bakterien, Viren, werden durch
das gelöste
Lysereagenz lysiert und setzen darin enthaltene biologische Moleküle frei.
Die Probe wird nun, z.B. durch Nachspülen mit Puffer, von der Kammer 3 über die
Leitung 23 in die Kammer 5 verdrängt. In
der Kammer 5 sind Magnetbeads 21 in trockenem
Zustand vorgelagert, durch Überführen der
Probe in die Kammer 5 werden die Magnetbeads 21 suspensiert und
in der Probe verteilt. Auf den Magnetbeads sind Sonden-Oligonukleotide
vorgesehen, welche gesuchte Zielmoleküle, z.B. zu den Sonden-Oligonukleotiden
komplementäre
Nukleinsäuren,
binden, so dass ein Substrat-Molekülkomplex gebildet wird, wobei
die Magnetbeads das Substrat darstellen. Alternativ können auf
den Magnetbeads auch Antikörper vorgesehen
sein, welche bestimmte Zielproteine oder Nukleinsäuren binden.
Die Antikörper
können polyklonale
oder monoklonale Antikörper
sein. Alternativ können
auf den Magnetbeads auch Mittel vorgesehen sein, welche Nukleinsäuren unspezifisch binden,
z.B. Silane, randomisierte Oligonukleotide oder ähnliches. Weiterhin ist denkbar,
dass auf den Beads andere Substanzen aufgebracht sind, welche bestimmte
biologische Moleküle
oder Strukturen, z.B. Kohlehydrate, Lipopolysaccharide und ähnliches binden.
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Gemäß einer
alternativen Ausführungsform können die
Magnet-Beads auch
in der Kammer 3 vorgesehen sein, und Bindungseigenschaften
aufweisen (z.B. Antikörper,
Polysaccharide, und ähnliches), welche
bestimmte biologische Strukturen in der Probe, z.B. bestimmte Zellen,
Bakterien oder Viren, spezifisch binden.
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Die
Prozesskammern sind untereinander gemäß der Reihenfolge der ablaufenden
Prozessschritte durch Mikrokanäle 23, 25, 27 und 29 verbunden, welche
derart dimensioniert sind, dass ein störender Flüssigkeitsaustausch zwischen
den Prozesskammern während
der Aufbereitung und Analyse weitgehend unterbunden wird und keinen
störenden
Einfluss hat. Die Mikrokanäle 23, 25, 27 und 29 sind
andererseits ausreichend groß,
um Magnet-Beads 21 mit
angebundenen Strukturen bzw. Molekülen passieren zu lassen. Der
Durchmesser der Mikrokanäle 23, 25, 27 und 29 ist
typischerweise in der Größenordnung
mehrerer μm.
Alternativ ist es bei größerer Dimensionierung
der Mikrokanäle
auch möglich,
in den Mikrokanälen 23, 25, 27, 29 Ventile
vorzusehen, um die einzelnen Prozesskammern 3, 5, 7, 9, 11 während des
Verfahrensablaufs fluidisch voneinander zu trennen. In der Kammer 5 kann
der Aufschluss der biologischen Strukturen vervollständigt werden
und durch Nachspülen
mit Waschlösung
oder Puffer können
ungebundene Probenbestandteile von dem an das Substrat (d.h. die
Magnet-Beads) gebundenen Molekülen
getrennt werden.
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Um
eventuell noch vorhandene Zellreste und andere Verunreinigungen
zu beseitigen, ist eine weitere Waschkammer 7 vorgesehen.
Die Komplexe aus Magnet-Beads 21 und Nukleinsäuren (oder
im Fall einer Protein-bindenden Eigenschaft der Magnet-Beads aus
Magnet-Beads und Proteinen), werden durch den Mikrokanal 25 in
die Waschkammer 7 bewegt. In der Waschkammer 7 können z.B.
chaotrope Salze 35 gelagert sein, die zunächst in
trockener Form vorliegen und durch das Füllen der Waschkammer 7 in
Lösung
gehen.
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Für komplexe
Aufbereitungs- und Analyseverfahren können zusätzliche Kammern vorgesehen sein.
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Die
an die Magnet-Beads 21 gebundenen DNA-Moleküle liegen
in der Probe üblicherweise
in einer sehr geringen Ausgangskonzentration vor, so dass zum Nachweis
eine Amplifikation der Nukleinsäuren
stattfinden muss. Zu diesem Zweck werden die Magnet-Beads 21 in
eine Amplifikationskammer 9 bewegt, die über den
Mikrokanal 27 mit der Waschkammer 7 verbunden
ist. In der Amplifikationskammer 9 kann eine Amplifikation
stattfinden, beispielsweise durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
oder ein anderes geeignetes Amplifikationsverfahren. Die für die Amplifikationsreaktion
notwendigen Reagenzien 37 können in der Kammer 9,
z.B. in trockener Form vorgelagert sein. In der Anordnung befindet sich
ein Peltier-Element, durch welches sich Temperaturzyklen für die PCR-Reaktion
in der Amplifikationskammer 9 durchführen lassen. Alternativ können auch
andere, dem Fachmann bekannte Heiz- und/oder Kühlelemente vorhanden sein,
z.B. ein Widerstandsheizelement oder eine Wasserkühlung. Der Aufbau
der Anordnung ist schematisch in 4 bis 7 gezeigt,
welche im Folgenden noch ausführlich
diskutiert werden.
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Bei
der Temperaturerhöhung
kommt es im Allgemeinen zu einer Ablösung der DNA-Moleküle von den
Magnet-Beads 21. Somit sind die Nukleinsäuren dann
für eine
Amplifikationsreaktion und eine spätere Nachweisreaktion freigesetzt.
Es ist alternativ auch möglich,
die Nukleinsäuren
unter Verwendung der auf den Beads aufgebrachten Oligonukleotiden
als Primer für
die PCR-Reaktion
direkt auf den Oligonukleotiden zu amplifizieren. Dazu kann beispielsweise
zusätzlich
noch ein entsprechender Primer für
den Gegenstrang in der Amplifikationskammer vorgesehen sein, so
dass die amplifizierten Nukleinsäuren
dann über
die Sonden-Oligonukleotide an einem Ende an die Magnet-Beads gebunden sind.
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Zum
Nachweis der DNA können
die an die Magnet-Beads 21 gebundenen Nukleinsäuren durch einen
Mikrokanal 29 in eine Detektionskammer 11 bewegt
werden. In der Detektionskammer 11 sind spezifische Oligonukleotide
einer Detektionseinrichtung immobilisiert. Die amplifizierten Nukleinsäuren, welche
an einem Ende an den Magnet-Beads immobilisiert sind, hybridisieren
mit den Sonden-Oligonukleotiden auf dem Mikro-Array und werden dadurch immobilisiert.
Die Detektion der gesuchten Nukleinsäure-Moleküle geschieht durch den Nachweis
der immobilisierten Magnet-Beads an derjenigen Stelle der Detektionseinrichtung 39,
an welcher die komplementären
Oligonukleotide angeordnet sind. Dazu umfasst die Detektionseinrichtung 39 einen
Sensor, der das Vorhandensein der Magnet-Beads 21 an Hand
deren magnetischen Eigenschaften nachweisen kann, z.B. ein magnetoresistiver
Sensor.
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Alternativ
ist es möglich,
die amplifizierten und an die Sonden-Oligonukleotide des Mikro-Arrays hybridisierten
Nukleinsäuren
optisch, z.B. durch Fluoreszenzfarbstoffe, elektrochemisch, z.B.
durch Redoxcycling, oder auf andere Weise nachzuweisen.
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In 2 ist
eine weitere Ausführungsform
einer mikrofluidischen Vorrichtung der erfindungsgemäßen Anordnung
in Form einer Cartridge 1' dargestellt.
Die Cartridge 1' weist
vier Gruppen von Prozesskammern 2, 4, 6, 8 auf,
die jeweils entlang von 4 Reaktionswegen 10, 12, 14, 16 angeordnet. Über entsprechende
Einfüllöffnungen 13 werden
Proben in die Cartridge eingebracht und durchlaufen entlang der
Reaktionswege 10, 12, 14, 16,
die jeweiligen Prozesskammern 2, 4, 6, 8.
An dieser Stelle wird angemerkt, dass in 2 und 3 aus
Zwecken der Übersichtlichkeit
nur die Prozesskammer entlang des Reaktionswegs 10 mit
den Bezugszeichen 2, 4, 6 bzw. 8 bezeichnet
sind, damit sollen ebenfalls die entsprechenden Prozesskammern entlang
der Reaktionswege 12, 14, 16 bezeichnet
sein. In der Detektionskammer 8 ist eine Detektionseinrichtung 39 der oben
beschriebenen Art vorgesehen. Auf diese Weise können in der Cartridge 1' vier Proben
parallel aufbereitet und analysiert werden. Es ist auch denkbar, dass
auf einer Cartridge zwei, drei, oder 5 und mehr, z.B. 10 oder 20
Probenstrecken bzw. Reaktionswege angeordnet sind.
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Der
Begriff „Reaktionsweg" bezeichnet den Weg,
welche die Probe bzw. die zu untersuchenden biologischen Moleküle im Verfahrensablauf
durch die Vorrichtung nehmen.
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In 3 ist
eine weitere alternative Ausführungsform
einer mikrofluidischen Vorrichtung in Form einer Cartridge 1'' gezeigt. In dieser Ausführungsform
sind ebenfalls 4 Gruppen von Reaktionskammern 2, 4, 6 entlang
von vier Reaktionswegen 10, 12, 14, 16 angeordnet,
so dass vier Proben parallel verarbeite werden können. Die Proben werden entlang der
Reaktionswege 10, 12, 14, 16 durch
die jeweiligen Prozesskammern 2, 4, 6 geleitet
und werden dann in eine gemeinsame Detektionskammer 18 geleitet,
in welcher eine gemeinsame Detektionseinrichtung 39' vorgesehen
ist.
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In 4 bis 6 ist
eine erfindungsgemäße Anordnung 100 in
verschiedenen Betriebszuständen
dargestellt, welche mikrofluidische Vorrichtungen 101, 101', 101'', 101a, 101b, 101c, 101d enthält. In einem
Magazin 103, welches stapelartig ausgeführt ist, ist eine Mehrzahl
von mikrofluidischen Vorrichtungen 101 gestapelt. Diese
können
vor Einbringen in das Magazin 103 bereits mit Proben befüllt werden.
Durch öffnen
eines Öffnungselements 105 und
Vortrieb der Transporteinrichtungen 107, 109 wird
die mikrofluidische Vorrichtung 101' aus dem Magazin 103 befördert. Im
Vorliegenden Beispiel ist in der Anordnung 100 durch die
als Transportbänder 107, 109 ausgebildete
Transporteinrichtung eine zentrale Transportstrecke für die mikrofluidischen Vorrichtungen 101, 101' definiert,
welcher eine Aufnahme der Anordnung 100 für die mikrofluidischen Vorrichtungen 101, 101' bildet. Entlang
dieser Transportstrecke sind Mittel zum Fixieren der Magnetbeads 121 (z.B.
in Form eines Elektromagneten) und Detektionsmittel 123 vorgesehen.
Dieser Vorgang wird durch die Steuerung 111, 117, 119 koordiniert. Eine
mikrofluidische Vorrichtung 101'',
welches bereits vorher verarbeitet wurde, wurde in den Sammelbehälter 131 transportiert.
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5 zeigt
die erfindungsgemäße Anordnung
in einem weiteren Betriebszustand, welcher zeitlich auf den Betriebszustand
gemäß 4 folgt. Die
mikrofluidische Vorrichtung 101' wird von den Transportvorrichtungen 107, 109 unter
einen Magnetfelderzeuger 121 bewegt. Der Magnetfelderzeuger 121 kann
als Permanentmagnet oder als Elektromagnet ausgebildet sein. Die
in der als Cartridge ausgebildeten Vorrichtung 101' vorgesehenen
Prozesskammern 102, 104, 106, 108 können durch
die Transportvorrichtung 107, 109 unter dem Magnetfelderzeuger 121 hindurch
bewegt werden. Durch selektives Anwenden des Magnetfeldes wird der
Substrat-Molekülkomplex
unter dem Magnetfelderzeuger fixiert, während sich die mikrofluidische
Vorrichtung 101' weiter
bewegt. Dadurch werden die vom Sub strat gebundenen Moleküle nacheinander
durch die Prozesskammer 102, 104, 106, 108 hindurch
bewegt. Alternativ kann aber auch ein beweglicher Magnetfelderzeuger
vorgesehen werden, welcher bei einer unbewegten Cartridge die an
Magnetbeads gebundene Probe relativ zur Cartridge bewegt. Falls
ein Elektromagnet verwendet wird, kann die Steuerung des Magnetfeldes
(z.B. ein/aus) durch die Steuerung 111 erfolgen. Die mikrofluidische
Vorrichtung 101' wird
durch die Transportvorrichtung 109 weiter nach rechts bewegt.
Das Öffnungselement 105 ist
nun wieder geschlossen. Nachdem die mikrofluidische Vorrichtung 101' unter dem Magneten 121 hindurch
bewegt wurde, befindet sich nun die Detektionskammer 108 unter
einem Sensor 123 (6), welcher
die Signale von der in der Detektionskammer 108 Detektionseinrichtung
auslesen kann, um das Vorhandensein oder die Konzentration von zu
untersuchenden biologischen Molekülen, z.B. Nukleinsäuren, zu erfassen.
Die erfassten Signale können
zu der Steuerung 111 geleitet werden und dort einer Datenverarbeitung
zugeführt
werden. Nach erfolgter Erfassung der Signale kann die mikrofluidische
Vorrichtung 101' in
den Sammelbehälter 131 transportiert
werden. Nun kann sich der gesamte Verfahrensablauf mit der nächsten,
im Magazin befindlichen mikrofluidischen Vorrichtung 101 wiederholen,
bis alle Proben abgearbeitet sind. Auf diese Weise kann nach Beschickung der
mikrofluidischen Vorrichtungen 101 mit den Proben und Einbringen
der mikrofluidischen Vorrichtungen in 101 in das Magazin 103 die
gesamte Probenzahl abgearbeitet werden, ohne dass eine weitere Intervention
seitens des Bedienpersonals notwendig wäre. Somit kann die gesamte
Analyse der Proben automatisiert ablaufen.
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In 7 ist
eine alternative Ausführungsform der
erfindungsgemäßen Anordnung
gezeigt. In dem Magazin 103' sind
unbefüllte
einmal verwendbare, als Cartridge ausgestaltete mikrofluidische
Vorrichtungen 101 in aufgerollter Form bevorratet. Die
mikrofluidische Vorrichtungen können
z.B. an einem flexiblen Trägerband
aufgerollt sein. Zur Analyse der Proben wird zunächst eine mikrofluidische Vorrichtung 101a von
der Trommel 104 abgerollt und durch die Transporteinrichtung 107 zu
einer Einrichtung zum Einbringen der Proben 113 transportiert.
Diese Einrichtung kann z.B. in Form eines beweglichen Pipetierarms
ausgestaltet sein. Die Proben werden in die mikrofluidische Vorrichtung 101a eingebracht. Das
gesamte Verfahren läuft
fließbandartig
ab während
die Proben in die mikrofluidische Vorrichtung 101a eingebracht
werden, wird die mikrofluidische Vorrichtung 101b unter
den Magneten 121 gefahren, so dass die Lyse- und Waschschritte
in den entsprechenden Prozesskammern durchgeführt werden. Die mikrofluidische
Vorrichtung 101c befindet sich bereits unter den Sensor 123,
wo die Auslesung der Signale der Detektionseinrichtung in der mikrofluidischen
Vorrichtung 101c folgt. Die mikrofluidische Vorrichtung 101d wird
in den Sammelbehälter 131 transportiert,
in welchem bereits eine verbrauchte mikrofluidische Vorrichtung 101e vorhanden
ist.
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In
der dargestellten Weise kann eine hohe Anzahl von Proben automatisiert
verarbeitet werden, wobei das Risiko von Kontaminationen oder Bedienungsfehlern
minimiert ist. Insbesondere durch Verwendung von Cartridges, auf
welchem mehrere Proben parallel verarbeitet werden können, kann
auf diese Weise ein hoher Probendurchsatz erreicht werden.
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Es
wird betont, dass die verwendeten Beispiele lediglich beispielhaft
und veranschaulichend sind. Insbesondere bezüglich der Anordnung von Komponenten,
der Bewegungsrichtung der Cartridge durch die Anordnung, die z.B.
auch kreisförmig
sein könnte,
und der Abfolge von Leitungen und Prozesskammern in der Cartridge
sind vielerlei Variationen denkbar.