DE102006026191A1

DE102006026191A1 - Vorrichtung und Substanz zur Isolierung von mesenchymalen Stammzellen (MSC)

Info

Publication number: DE102006026191A1
Application number: DE102006026191A
Authority: DE
Inventors: Hans-Peter Dr. Wendel; Ketai Guo; Richard Dr. Schäfer
Original assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen; Universitätsklinikum Tübingen
Current assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen; Universitätsklinikum Tübingen
Priority date: 2006-05-26
Filing date: 2006-05-26
Publication date: 2007-11-29
Also published as: US20090186356A1; WO2007137679A3; EP2027255A2; WO2007137679A2

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung mit zumindest einer mit biologischem Gewebe und/oder Flüssigkeit in Kontakt kommenden Oberfläche, welche zumindest teilweise mit einer Substanz beschichtet ist, die die Bindung von mesenchymalen Stammzellen (MSC) vermittelt, ein Verfahren zur Bindung und/oder Isolierung von MSC aus biologischem Gewebe und/oder Flüssigkeit, ein Nukleinsäuremolekül, das selektiv und hochspezifisch an MSC bindet, die Verwendung des Nukleinsäuremoleküls zur Bindung und/oder Isolierung von MSC aus biologischem Gewebe und/oder Flüssigkeit, sowie ein Verfahren zur Herstellung einer eingangs genannten Vorrichtung.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung mit zumindest einer mit biologischem Gewebe und/oder Flüssigkeit in Kontakt kommenden Oberfläche, welche zumindest teilweise mit einer Substanz beschichtet ist, die die Bindung von mesenchymalen Stammzellen (MSC) vermittelt, ein Verfahren zur Bindung und/oder Isolierung von MSC aus biologischem Gewebe und/oder Flüssigkeit, ein Nucleinsäuremolekül, das selektiv und hochspezifisch an MSC bindet, die Verwendung des Nucleinsäuremoleküls zur Bindung und/oder Isolierung von MSC aus biologischem Gewebe und/oder Flüssigkeit, sowie ein Verfahren zur Herstellung einer eingangs genannten Vorrichtung.
Vorrichtungen zur Bindung von MSC sowie Verfahren zur Bindung und/oder Isolierung von MSC aus biologischem Gewebe und/oder Flüssigkeit sind im Stand der Technik allgemein bekannt.
Stammzellen sind undifferenzierte Zellen, welche die Fähigkeit besitzen, sich selbst zu erneuern und in unterschiedliche Effektorzellen zu differenzieren. Auf Grund dieser Eigenschaften gehören sie zu den vielversprechendsten Forschungsobjekten der biomedizinischen Forschung und nähren die Hoffnung, in Zukunft im Rahmen der so genannten Stammzelltherapie Gewebe bzw. ganze Organe regenerieren zu können.
Je nach Herkunft werden embryonale Stammzellen und adulte Stammzellen voneinander unterschieden.
Embryonale Stammzellen werden aus der inneren Zellmasse des Blastocysten-Stadiums eines Säugetier- oder eines menschlichen Embryos gewonnen. Sie können sich unbegrenzt teilen und sich theoretisch zu jedem Zelltyp der ca. 200 Gewebearten des Menschen entwickeln. Bei der Gewinnung embryonaler Stammzellen aus dem Blastocysten im Rahmen der Stammzellforschung kommt es häufig zu ethischen Konflikten, da der Tod des Embryos in Kauf genommen werden muss.
Hierzu im Gegensatz ist die Forschung an adulten Stammzellen ethisch völlig unbedenklich, da diese aus adulten Organismen gewonnen werden können. Adulte Stammzellen wurden bisher in mindestens 20 Geweben des Menschen entdeckt. Ihre Aufgabe ist es, für die entsprechenden Gewebe Ersatzzellen zu bilden. Im Vergleich zu embryonalen Stammzellen galten sie bisher als begrenzt teilungs- und entwicklungsfähig: Es wurde angenommen, dass adulte Stammzellen eines bestimmten Gewebes keine Zelltypen eines anderen Gewebes bilden können. In letzter Zeit häufen sich jedoch die Erkenntnisse, dass auch adulte Stammzellen über ein wesentlich höheres Entwicklungspotenzial verfügen, als bisher angenommen. So wird mittlerweile in Fachkreisen weitgehend die Auffassung vertreten, dass auch adulte Stammzellen verschiedenste Differenzierungswege einschlagen können.
Zu den adulten Stammzellen zählen auch die so genannten mesenchymalen Stammzellen (MSC). MSC finden sich in einer Vielzahl von Geweben und Organen, wie der Leber, der Niere, der Placenta, im Fettgewebe, im Nabelschnurblut, sowie im Knochenmark. MSC werden im Allgemeinen als multipotente CD29⁺, CD44⁺, DC90⁺, CD11b^–, CD34^–, sowie CD45^– Vorläuferzellen charakterisiert, die auf Grund ihres mesenchymalen Differenzierungspotenzials und ihrer guten In-vitro-Expansionseigenschaften eine attraktive Zellpopulation für den Ersatz mesenchymaler Gewebe im Rahmen des sog. Tissue-Engineerings darstellen. MSC lassen sich in vitro in Knorpel, Knochen, Sehnen und Fettzellen differenzieren. Dreidimensional auf unterschiedlichen Trägersubstanzen kultiviert wurden MSC bereits in vielen Studien im Klein- und Großtiermodell erfolgreich zum Ersatz mesenchymaler Gewebe eingesetzt. Auch eine klinische Anwendung von MSC am Menschen wurde bereits in Pilotstudien erfolgreich erprobt.
Die Isolation von MSC aus einer biologischen Probe basiert bis heute auf dem Selektionsfaktor der Kunststoffadhärenz, d.h. auf ihrer Fähigkeit an bestimmte Kunststoffoberflächen adhärieren zu können, und auf für MSC charakteristischen Medienbedingungen; vgl. Pittenger et al. (1999), Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells, Science 284, Seiten 143-147, Reyes (2001), Purification and ex vivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor cells, Blood 98, Seiten 2615-2625.
Ein Nachteil dieser Methode aus dem Stand der Technik besteht darin, dass unterschiedliche MSC-Populationen gewonnen werden. Derartige MSC-Zellen zeigen folglich unterschiedliche biologische Charakteristika, z.B. bezüglich ihres Proliferationsverhaltens und ihrer Matrixsynthese; vgl. Niemeyer et al. (2003), Vergleich zweier Isolationsverfahren zur Gewinnung humaner mesenchymaler Stammzellen aus Knochenmark, Z. Orthop. 141, Seite 129. Über die Kunststoffadhärenz gewonnene MSC sind deshalb für das Tissue-Engineering nur wenig geeignet, da hier besonders hohe Anforderungen an die Homogenität der MSC-Populationen und Reproduzierbarkeit der MSC-Gewinnung gestellt werden.
Ein weiterer Nachteil des derzeit durchgeführten Verfahrens zur Isolierung von MSC über Kunststoffadhärenz besteht darin, dass dieses sehr zeitaufwändig ist und zumindest zwei Wochen in Anspruch nimmt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Bindung und/oder Isolierung von MSC aus biologischem Gewebe und/oder Flüssigkeit bereitzustellen, die bzw. das die vorstehend genannten Nachteile aus dem Stand der Technik überwindet.
Die Aufgabe wird durch eine eingangs genannte Vorrichtung gelöst, die mit Aptameren beschichtet ist. Die Aufgabe wird ferner durch ein Verfahren gelöst, das folgende Schritte aufweist: (1) Bereitstellen von MSC enthaltendem biologischem Gewebe und/oder MSC enthaltender Flüssigkeit, (2) In Kontakt bringen des Gewebes und/oder der Flüssigkeit mit einer an MSC bindenden Substanz, (3) Inkubation für eine Zeitspanne, die die Bindung der MSC an die Substanz gestattet, und ggf. (4) Isolierung der an die Substanz gebundenen MSC, wobei die Substanz ein Aptamer ist.
Die der Erfindung zu Grunde liegende Aufgabe wird hiermit vollkommen gelöst. Die Erfinder haben überraschenderweise festgestellt, dass Fängermoleküle in Form von Aptameren bereitgestellt werden können, die selektiv und hochspezifisch an MSC binden. Diese Erkenntnis war insbesondere deshalb überraschend, da bis heute zuverlässige MSC-Marker fehlen. So wurde vor einigen Jahren STRO-1 als vielversprechendes Oberflächenantigen zur Identifizierung der MSC diskutiert, inzwischen jedoch wurde seine Bedeutung wieder relativiert; vgl. Dennis et al., The STRO-1+ marrow cell Population is multipotential, Cells Tissues Organs 170, Seite 7-82. Auch das kürzlich als MSC-Marker beschriebene Antigen W8B2 von unbekannter Identität zeigt eine heterogene Expression auf MSC-Populationen; vgl. Vogel et al. (2003), Heterogenity among human bone marrow-derived mesenchymal stem cells and neuroprogenitor cells, Haematologica 88, Seiten 126-133.
Aus diesem Grunde sind bis heute weder Antikörper noch Aptamere bekannt, die selektiv und hochspezifisch MSC binden. So sind in der DE 102 58 924 A1 zwar Aptamere erwähnt, die an Stammzellen binden sollen, offenbart werden jedoch lediglich solche, die ausschließlich endotheliale Vorläuferzellen (EPC) binden, nicht aber MSC.
Aus der US 6,287,765 B1 und WO 03/065881 A2 sind Vorrichtung mit nicht näher angegebener Zweckbestimmung bekannt, die Nucleinsäuremoleküle mit nicht näher beschriebenen Charakteristika aufweisen, über die biologisches Material eingefangen werden soll.
Im Stand der Technik ist darüber hinaus eine Vielzahl von Vorrichtungen beschrieben, die mit Peptiden, wie Rezeptoren oder Antikörpern, beschichtet sind, die biologisches Material einfangen sollen.
Aptamere sind hochaffine RNA- oder DNA-Oligo- bzw. Polynucleotide, d.h. Nucleinsäuremoleküle, die auf Grund ihrer spezifischen räumlichen Struktur eine hohe Affinität zu einem Zielmolekül aufweisen. Aptamere haben in der Regel eine Länge von bis zu 100 Nucleotiden, die zwar vergleichbare Antigen-Bindungseigenschaften wie Antikörperfragmente aufweisen, jedoch häufig wesentlich spezifischer und deutlich stabiler sind. Mit ihrer relativ großen und flexiblen Oberfläche können sie potenziell mit noch mehr Zielmolekülen hochspezifisch und selektiv interagieren. Aptamere, wenn diese in einen Organismus eingebracht werden, zeigen kaum immunogene oder toxische Effekte, hingegen jedoch eine rasche Clearance.
Mittels „SELEX" (Systemic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) können große Mengen von Aptameren unterschiedlichster Sequenzen und Sekundärstrukturen enzymatisch erzeugt wer den. Aus dieser Menge werden anschließend solche Aptamere mit hoher Affinität zu einem Zielmolekül, wie bspw. MSC, herausgesucht und angereichert. Die Primärstruktur dieses Aptamers lässt sich mittels im Stand der Technik bekannter Sequenzierverfahren aufklären, so dass diese daraufhin in vitro synthetisiert werden können. Ein beispielhaftes Verfahren zur Gewinnung von Aptameren ist bspw. beschrieben in der DE 100 19 154 A1 , die durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung ist.
Erfindungsgemäß kommen als Vorrichtungen solche zur extrakorporalen Verwendung als auch Implantate in Frage.
Eine extrakorporale Vorrichtung, die erfindungsgemäß mit den Aptameren beschichtet ist, kann dabei mit biologischem Gewebe oder Flüssigkeit in Kontakt gebracht werden, das bzw. die auf das Vorhandensein von MSC untersucht werden soll. Ferner kann zur gezielten Isolierung von MSC eine solche Vorrichtung mit Geweben oder Flüssigkeiten in Kontakt gebracht werden, von denen bekannt ist, dass diese MSC enthalten. Beispiele für solche MSC-enthaltenden biologischen Gewebe oder Flüssigkeiten sind Knochenmark, peripheres Blut oder Aphereseblut. Nach dem In-Kontakt-bringen der Vorrichtung mit dem Gewebe bzw. der Flüssigkeit erfolgt eine so dass die MSC, sofern vorhanden, an die Aptamere binden. Nach der Inkubation wird die Vorrichtung mit den über die Aptamere gebundenen MSC von dem Gewebe oder der Flüssigkeit separiert. Dabei ist von Vorteil, dass die gebundenen MSC von den Aptameren nicht zwingend getrennt werden müssen, da, je nach Lagerungsbedingungen, die Aptamere innerhalb kürzerer Zeit, bspw. innerhalb von 2 Tagen, vollständig degradiert sind.
Vor diesem Hintergrund kann es sich bei der Vorrichtung um einen einfachen aptamerbeschichteten Träger, aber auch um einen Schlauch, eine Pumpe, einen Oxygenator, einen Katheter, einen Gefäßzugang, ein Aufbewahrungssystem für Blutkomponenten handeln.
Vorteilhaft an einer Aptamerbeschichtung ist ferner, dass diese stabil und sterilisierbar ist, wodurch eine kostengünstige Herstellung möglich der Vorrichtung ist. Hierzu im Gegensatz verlieren Peptide durch die Sterilisation häufig ihre Aktivität.
Erfindungsgemäß umfasst biologisches Gewebe und/oder Flüssigkeit jegliches biologisches Material tierischen oder humanen Ursprungs bzw jegliche Flüssigkeit, das bzw. die auf das Vorhandensein von MSC untersucht werden soll. Dabei kann es sich um ein Gewebeverband, eine Zellsuspension oder um Organe, Organteile oder um Organismen handeln. Beispiele für biologische Gewebe und Flüssigkeiten sind Knochenmarksgewebe, Knochenmarkszellen, Knorpelzellen, Knochenzellen, Fettgewebe, Fettzellen, Lebergewebe, Leberzellen, Placentagewebe, Plaventazellen, peripheres Blut, Nabelschnurblut, Aphereseblut.
Es versteht sich, dass eine Bindung und/oder Isolierung von MSC aus biologischem Gewebe und/oder Flüssigkeit auch mit solchen Aptameren möglich ist, die nicht an die Oberfläche der erfindungsgemäßen Vorrichtung gebunden sind, d.h. die in freier Form zu dem Gewebe oder der Flüssigkeit hinzu gegeben und ggf. anschließend über im Stand der Technik bekannte Verfahren wieder isoliert werden. Vor diesem Hintergrund betrifft ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Nucleinsäuremolekül bzw. ein Aptamer, das selektiv und hochspezifisch an MSC bindet, sowie dessen Verwendung zur Bindung und/oder Isolierung von MSC. „Selektiv" und „hochspezifisch" bedeutet in diesem Zusammenhang, dass das erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül bzw. Aptamer zielgerichtet an MSC bindet und Wechselwirkungen mit anderen Strukturen weitgehend bis vollständig unterbleiben bzw. sich im Rahmen üblicher Kreuzreaktivitäten bewegen.
Dabei ist es bevorzugt, wenn das Aptamer ein Nucleinsäuremolekül ist, das zumindest eine der Sequenzen SEQ ID-Nr. 1 bis SEQ ID-Nr. 20 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll aufweist.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass bereits die Primärstruktur eines solchen Aptamers bereitgestellt wird, das hochspezifisch und selektiv an MSC bindet. Die Durchführung eines SELEX-Verfahrens ist damit nicht mehr zwingend erforderlich. Das gewünschte Aptamer kann vielmehr mittels einfacher und zeitsparender Syntheseverfahren direkt hergestellt werden.
Es versteht sich, dass ein solch erfindungsgemäßes sequenzspezifisches Aptamer auch dann noch hochspezifisch und selektiv MSC bindet, wenn dieses neben einer der Nucleotidsequenzen SEQ ID-Nr. 1 bis SEQ ID-Nr. 20 an ihrem 5'- bzw. 3'-Ende ein oder mehrere weitere Nucleotide aufweist. Gleiches gilt für den Fall, in dem in den nicht-funktionellen Bereichen des Aptamers eines oder mehrere Nucleotide ersetzt sind oder fehlen. Die Selektivität und Spezifität des Aptamer bleibt bei dieser Ausführungsform deshalb erhalten, da das Ersetzen bzw. der Austausch außerhalb der sog. „hair pin loops" oder „bulgs" erfolgt, bei denen es sich um die funktionellen Bereiche eines Aptamers handelt. Diese Bereiche nehmen die Sekundärstrukturen ein, die für die Bindung der Zielstruktur verantwortlich sind. Bei einer Übereinstimmung der Nucleotidsequenzen innerhalb dieser funktionellen Bereiche können zwei Aptamere, die sich in ihrer Nucleotidsequenz in nicht-funktionellen Abschnitten voneinander unterscheiden, an die gleiche Zielstruktur binden. Vor diesem Hintergrund ist von dieser Ausführungsform erfindungsgemäß auch ein solches Aptamer umfasst, das die funktionellen Abschnitte aus den Nucleotidsequenzen SEQ ID-Nr. 1 bis SEQ ID-Nr. 20 aufweist, das in den nicht-funktionellen Abschnitten aber durch Nucleotidaustausche oder Deletionen modifiziert ist. Ein derart modifiziertes Aptamer ist in seiner Fähigkeit, an MSC zu binden, nicht bzw. nicht wesentlich verändert.
Die in Rede stehenden sequenzspezifischen Aptamere können ferner mittels geeigneter Techniken modifiziert werden, so dass sie geschützt sind und im biologischen Milieu ihre Wirksamkeit nicht verlieren, bspw. nicht von Nucleasen verdaut werden. Schutzmechanismen, die für diesen Zweck geeignet sind, sind im Stand der Technik hinreichend bekannt und schließen bspw. LNA(locked nucleic acids)-Technologien mit Furanose [siehe bspw. Wahlestedt et al. (2000), Patent and non toxic antisense oligonucleotides containing locked nucleic acids, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (10), Seiten 5633 bis 5638)], oder die Spiegelmer^®-Technologie der Firma Noxxon, Berlin, Deutschland, mit ein.
Ferner ist es bevorzugt, wenn das Aptamer einen detektierbaren und/oder selektierbaren Marker aufweist.
Mit dieser Maßnahme können MSC besonders leicht detektiert und selektiert werden. Erfindungsgemäß wird unter einem Marker eine jede Verbindung verstanden, mittels derer eine Lokalisierung und Identifizierung des Aptamers in vitro, in vivo oder in situ möglich ist. Hierzu zählen Farbindikatoren mit fluoreszierenden, phosphoreszierenden oder chemilumineszierenden Eigenschaften, wie Fluoroceinisothiocyanat (FITC), Rhodamin, AMPPD, CSPD, radioaktive Indikatoren, wie ³²P, ³⁵S, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁴C, ³H, nicht-radioaktive Indikatoren, wie Biotin oder Dioxigenin, alkalische Phosphatase, Meerrettich-Peroxidase, etc.
Bei Verwendung eines fluoreszenzmarkierten Aptamers kann das erfindungsgemäße Verfahren im Rahmen der etablierten fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) eingesetzt werden. Mittels FACS lassen sich MSC besonders gut aus einer Zellsuspension isolieren. Dazu wird die MSC enthaltende Zellsuspension mit den fluoreszenzmarkierten Aptameren inkubiert. Dabei binden die Aptamere an die MSC. Die Zellsuspension wird dann durch eine dünne Kanüle geführt, deren Strahl am Ende durch Vibration in einzelne Tropen aufgelöst wird. Wenn ein Tropfen eine MSC enthält, an die das Aptamer gebunden hat, wird der Fluoreszenzmarker durch einen Laserstrahl zur Fluoreszenz angeregt. Diese Fluoreszenz kann mit einem Lichtdetektor gemessen und zur Auftrennung und damit zur Isolierung der MSC benutzt werden. Dazu werden die gebundenen MSC mittels eines elektrischen Impulses je nach Fluoreszenzintensität aufgeladen und beim Passieren eines elektrischen Feldes entsprechend abgelenkt und sortiert.
Als selektierbare Marker kommen magnetische Partikel in Frage, die vorzugsweise sehr klein in der Größenordnung von 50 nm sind. Diese lassen sich über im Stand der Technik bekannte Verfahren an die Aptamere koppeln. Derartige magnetische Aptamere lassen sich ebenfalls zur Isolierung von MSC nutzen, und zwar im Rahmen der sog. magnetischen Zellsortierung (MACS). Dazu werden die magnetischen Aptamere zu der Zellsuspension gegeben. Nach einer Inkubation haben die Aptamere an die MSC gebunden. Das Zellgemisch wird über eine Säule aufgetrennt, deren ferromagnetische Matrix aus Metallkugeln oder -drähten besteht. Hierzu wird die Säule in ein homogenes Magnetfeld gebracht, in dem die MSC, an die die magnetischen Aptamere gebunden sind, an der Matrixoberfläche festgehalten werden. Die übrigen Zellen und Bestandteile des Gemisches werden aus der Säule ausgewaschen. Nach Entfernen des Magnetfeldes können die separierten MSC ebenfalls aus der Matrix gespült werden. Diese Methode erlaubt eine schnelle Separation von MSC ohne große mechanische Beeinträchtigung mit einem hohen Anreicherungsgrad, d.h, auch eine sehr kleine Population von MSC kann fast rein isoliert werden.
Nach einer bevorzugten Weiterbildung ist die erfindungsgemäße Vorrichtung ein Implantat.
Erfindungsgemäß handelt es sich hierbei um eine Vorrichtung, die auf bestimmte Zeit oder auf Dauer in den menschlichen oder tierischen Körper eingesetzt wird. Hier kommen in Frage künstliche Herzklappen, künstliche Hüft- oder Kniegelenke, Herzschrittmacher, Zahnimplantate, Platten und Schrauben, Gefäßprothesen, Conduits, Katheter, künstliche Blasen, die prinzipiell aus allen Polymerkunststoffen, Metallen, Legierungen, Textilien, Naturstoffen (Chitosan), Bakterienzellulose, etc. oder auch aus anderen dauerhaften oder degradierbaren Materialien bestehen können.
Weiterhin werden in der Gefäßchirurgie häufig Prothesen, bspw. in Form von Stents, eingesetzt, wobei diese aus verschiedenen Kunststoffen oder Materialien angefertigt werden. Im Zusammenhang mit Stents, aber auch mit sonstigen Gefäßprothesen, – zugängen, Ports oder Conduits kann es von Vorteil sein, wenn nicht notwendigerweise alle Oberflächen mit dem erfindungsgemäßen Aptamer beschichtet sind, sondern nur bestimmte Flächen, wie bspw. die innere Oberfläche, die mit Blut in Kontakt kommen soll. Außerdem kann es gewünscht sein, dass die Oberfläche(n) lokal mit unterschiedlichen erfindungsgemäßen Aptameren beschichtet sind, so dass unterschiedliche MSC-Populationen gebunden werden.
Die Erfindung ermöglicht auf vorteilhafte Art und Weise die Besiedelung der Implantate mit körpereigenen MSC. Dadurch wird einerseits sichergestellt, dass an dem Implantat eine autologe funktionelle Grenzfläche generiert wird, die vom Körper nicht mehr als fremd erkannt wird, und das Implantat die funktionellen physiologischen Eigenschaften des jeweiligen Einsatzortes oder Organs, bspw. als Knochenersatz, Dentalimplantat etc., übernehmen.
Die Besiedelung der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit MSC kann intrakorporal, extrakorporal oder auch in einem separaten Bioreaktor erfolgen, in dem das biologische Gewebe und/die Flüssigkeit enthalten ist.
Als Implantate kommen auch sog. Patches bzw. Folien in Frage, die mit MSC beschichtet werden sollen. Ein solches Patch besteht bspw. aus Poly-N-Isopropylacrylamid (PIPAAm), wie in Miyahara et al. (2005), Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction, Nature Medicine, Online Publication, Seiten 1 bis 7, beschrieben. Die dortigen Autoren beschreiben die Transplantation von mit MSC besiedelten Patches in ein myocardinfarktgeschädigtes Herz, das durch die eingebrachten MCS eine erstaunlich gute Regeneration zeigte. Die Autoren mussten jedoch das Patch erst mit zuvor isolierten MSC besiedeln, und erst die besiedelten Patches wurden dann in den Patienten implantiert. Dank der vorliegenden Erfindung kann nun ein aptamerbeschichteter Patch direkt in das Herz eingebracht werden, wobei die Affinität der Aptamere anschließend selbst für die Besiedelung mit MSC sorgt. Das Vorrätighalten von mit MSC besiedelten Patches und das entsprechend aufwändige vorherige Isolieren und Besiedeln der Patches mit MSC ist nicht mehr erforderlich. Einem bedürftigen Patienten kann dadurch schneller geholfen werden.
Bei einer weiteren Ausführungsform ist es bevorzugt, wenn als Oberfläche für die erfindungsgemäße Vorrichtung ein Material eingesetzt wird, das aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus: Polytetrafluorethylen, Polystyrol, Polyurethan, Polyester, Polylactid, Polygykolsäure, Polysulfon, Polypropylen, Polyethylen, Polycarbonat, Polyvinylchlorid, Polyvinyldifluorid, Polymethylmethacrylat, Hypoxylapatit, Isopropylacryamid, Texin oder Copolymere davon, Nylon, silanisiertes Glas, Keramik, Metalle, insbesondere Titan, oder Mischungen davon.
Derartige Materialien haben sich in den Fachgebieten, bspw. im Tissue-Engineering bewährt, und werden in verschiedenen Ausführungsformen eingesetzt. Die Form der Oberfläche kann dabei beliebig ausgewählt sein.
Dabei ist es bevorzugt, wenn die Aptamere entweder direkt und/oder über ein Linkermolekül an der Oberfläche der erfindungsgemäßen Vorrichtung angebracht sind.
Unter „Linkermolekül" oder „Linker" ist hierbei jede Substanz zu verstehen, mit der ein Aptamer auf der Oberfläche angebracht werden kann. Aptamere können prinzipiell – wie alle Nucleotide (bspw. nach Kopplung mit Amino- oder Biotingruppen) – über geeignete Linkermoleküle oder Spacer an die Oberfläche der Vorrichtung angebracht werden. Verfahren zur Immobilisierung von Oligonucleotiden sind bspw. beschrieben in „Immobilisierung von Oligonucelotiden an aminofunktionalisierte Silizium-Wafer" (U. Haker, Chem. Diss., Hamburg, 2000), wobei hier u.a. 1,4-Phenylendiisothiocyanat eingesetzt wird. In der Dissertation „Miniaturisierte Affinitätsanalytik – Ortsaufgelöste Oberflächenmodifikationen, Assays und Detektion" (I. Stemmler, Chem. Diss., Tübingen, 1999) und in der Veröffentlichung von Hermanson et al., „Immobilized affinity ligand techniques" (Academic Press, San Diego, 1992) und „Bioconjugate Techniques" (academic Press, San Diego, 1996) sind weitere wichtige kovalente Verfahren zur Oberflächenmodifikation dargestellt. So können bspw. als funktioneller Anker SiO₂, TiO₂, -COOH, HfO₂, -Au, -Ag, N-Hydroxysuccinimid, -NH2, Epoxid, Maleinimid, Säurehydrazid, Hydrazid, Azid, Diazirin, Benzophenon, u.a., mit verschiedenen Reaktionspartnern bei Kupplungen eingesetzt werden.
Eine weitere geeignete Substanz zur Anbringung eines Aptamers auf die Oberfläche einer erfindungsgemäßen Vorrichtung ist ein Hydrogel, das von der Firma Schott, Mainz, Deutschland unter der Bezeichnung Nexterion^® vertrieben wird, an die dann bspw. aminomodifizierte Aptamere kovalent gebunden werden. Vorteil haft ist auch eine Beschichtung der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit einem blutverträglichen Hydrogel, z.B. aus der Gruppe der PEGs oder Star-PEGs, die bspw. eine freie Carboxylgruppe aufweisen, an die dann bspw. ein aminomodifiziertes Aptamer kovalent gebunden werden kann. Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass andere Blutzelle, z.B. Thrombocyten, oder Plasmaproteine, z.B. Fibrinogen, nicht an die Oberfläche binden können und somit die Bindungsstellen der Aptamere für MSC nicht überlagern bzw. „zuclotten".
Eine weitere Methode zur Immobilisierung von Oligonucleotiden auf Oberflächen stellt das Photolinking dar. Dabei wird das NH₂-gekoppelte Oligonucleotid (Aptamer) zunächst mit einem so genannten Photolinker-Molekül versehen (z.B. Anthraquinone), welches später unter UV-Aktivierung photochemische Reaktionen mit einer Kunststoffoberfläche eingehen kann und das Oligonucleotid somit kovalent an die Oberfläche bindet. Kits und Substanzen zur Durchführung dieses Verfahrens sind bspw. unter der Bezeichnung AQ-Link^TM und DNA Immobilizer^TM von der Firma Exiqon (Vedbaek, Dänemark) kommerziell erhältlich.
Bevorzugt ist allerdings, wenn das Linkermolekül N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat ist.
Von der Substanz N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat konnte gezeigt werden, dass sie bereits bei der Immobilisierung eines Regulators des Komplementsystems auf bestimmten Oberflächen von Biomaterialien eingesetzt werden konnte (siehe Andersson et al. "Binding of a model regulator of complement activation (RCA) to a biomaterial surface: surface-bound factor H inhibits complement activation", Biomaterials 22: 2435-2443, 2001). Mit der Verwendung dieses Linkers war die biologische Aktivität des Regulators nicht beeinträchtigt.
In einer weiteren Ausführungsform kann die erfindungsgemäße Vorrichtung zusätzlich mit Wachstumsfaktoren beschichtet sein.
Diese Ausführungsform hat den Vorteil, dass die gebundenen MSC mittels spezifischer Wachstumsfaktoren in die gewünschte Richtung differenziert werden können und dadurch die Funktionalität der erfindungsgemäßen Vorrichtung nochmals verbessert wird.
Dabei ist es bevorzugt, wenn die Wachstumsfaktoren ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: "Platelet derived Growth Factor" (PDGF), "Vascular Endothelial Growth Factor" (VEGF), "Colony Stimulating Factor" (CSF), "Epidermal Growth Factor" (EGF), „Nerve Growth Factor" (NGF), „Fibroblast Growth Factor (FGF) und/oder Wachstumsfaktoren aus der „Transforming Growth Factor"(TGF)-Superfamilie. Wachstumsfaktoren aus der Reihe der TGF-Superfamilie sind bspw. BMPs (bone morphogenetic proteins) wie BMP-2 und BMP-7.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass bereits geeignete Wachstumsfaktoren bereitgestellt werden. Im Falle der Verwendung von BMP wird eine Differenzierung der gebundenen MSC in Osteocyten bewirkt, was ein Verwachsen eines erfindungsgemäßen Knochenersatzimplantates begünstigt.
Die Erfindung betrifft weiter ein Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung mit zumindest einer mit biologischem Gewebe und/oder Flüssigkeit in Kontakt kommenden Oberfläche, welche zumindest teilweise mit einer Substanz beschichtet ist, die die Bindung von mesenchymalen Stammzellen (MSC) vermittelt, das folgende Schritte aufweist: (1) Bereitstellen von Nucleinsäuremolekülen, und (2) Binden der Nucleinsäuremoleküle aus Schritt (1) an die Oberfläche einer Vorrichtung, wobei die Nucleinsäuremoleküle vorstehend beschriebene Aptamere aufweisen.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, die rein illustrativ sind und die Tragweite der Erfindung nicht einschränken. Hieraus ergeben sich weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung. Bezug genommen wird auf die beiliegenden Figuren:
1 zeigt Teilabbildung (A) die Charakterisierung und Identifizierung von adulten MSCs (aMSC); 'AB' zeigt eine osteogenetische Färbung von aMSC gemäß Von Kossa in 100facher Vergrößerung, 'A' zeigt die Kontrolle; 'CD' zeigt eine Färbung auf osteogenetische alkalische Phosphatase und Hematoxylin von aMSC in 200facher Vergrößerung, 'C' stellt die Kontrolle dar; 'EF' ist eine adipogenetische Färbung von aMSC mit Red Oil und Hematoxylin in 400facher Vergrößerung, E stellt die Kontrolle dar. Teilabbildung (B) zeigt die Epitop-Identifizierung von aMSC. Die adulten Schweine-aMSC sind CD29⁺, CD44⁺, CD90⁺, SL-Klasse I⁺, SLA- Klasse II DQ^–, SLA-Klasse II DR^– (die Kurve 1 stellt die Isotypenkontrolle dar).
2 zeigt die Bindung eines ausgewählten Aptamers (G-8) an aMSC mittels FACS; in Teilabbildung (A) zeigt die Kurve 2 mit FITC-G-8 inkubierte Schweine-aMSC, die Kurve 1 stellt die Maus P19-Zellen, inkubiert mit FITC-G-8, dar. In Teilabbildung (B) zeigt die Kurve 2 Schweine-aMSC, inkubiert mit FITC-G-8, die Kurve 1 stellt die Ratten-aMSC dar, inkubiert mit FITC-G-8. In Teilabbildung (C) zeigt die Kurve 2 Schweine-aMSC, inkubiert mit FITC-G-8, die Kurve 1 zeigt humane aMSC, inkubiert mit FITC-G-8. Teillabbildung (D) zeigt ein FACS-Assay mit Gesamtknochenmark. Teilabbildung 1 zeigt die Bindung des Aptamers G-8 an Knochenmark, die Teilabbildung 2 zeigt die Bindung des Aptamers G-8 mit peripherem Blut (die Kurve 1 stellt das mit Zellen inkubierte Aptamer G-8 dar; die Kurve 2 stellt die Zellkontrolle dar).
3 zeigt in Teilabbildung (A) die Aptamer-basierende Zellsortierung. Die Zellen, die an das biotinylierte Aptamer binden, können zusammen mit Anti-Biotin-Mikrokugeln (rechts) separiert werden und wachsen gut auf Kulturschalen, während die alleinigen Mikrokugeln nicht an die Zellen binden. Die Zellen wurden durch den Magnetfilter gewaschen und keine Zellen befanden sich auf den Magnetsäulen, resultierend in einer kleineren Menge von Zellen auf den Kulturschalen (links) (x100). Die Teilabbildung (B) zeigt die Ober flächenbindung von aMSC an Aptamer-beschichtete Platten. Nach einstündiger Inkubation wurde von der Aptamer-beschichteten Kulturplatte eine große Anzahl von aMSC eingefangen (rechts); die Kulturplatte, die mit der Bibliothek beschichtet wurde, fing lediglich sehr wenige aMSC ein (links) (x100). Die Teilabbildung (C) zeigt aus Knochenmark eingefangene aMSC. Die linke Aufnahme zeigt die Kontrolle, alleinige Kugeln, die mit Gesamtknochenmark inkubiert wurden, wobei nur sehr wenige Zellen auf der Kulturschale wuchsen. Die rechte Aufnahme zeigt Gesamtknochenmark, das mit dem Aptamer inkubiert wurde (fixiert an die magnetischen Mikrokugeln), wobei wesentlich mehr Zellen angesammelt wurden und wuchsen (x100).
4 zeigt die Phänotyp-Identifizierung der isolierten aMSC. Teilabbildung (A) zeigt die Subpopulation R1 der isolierten aMSC, gefärbt mit PE-markierten Antikörpern unmittelbar nach der Isolierung. Die gezeigten Ergebnisse waren CD4^–, CD8^–, CD29^–, CD44⁺, CD90^–; die Subpopulation R2 der isolierten aMSC wurde mit PE-markierten Antikörpern unmittelbar nach der Isolierung gefärbt. Das Ergebnis zeigte CD4^–, CD8^–, CD29^–, CD44⁺, CD90⁺. Die Kurve 1 zeigt die Isotypenkontrolle. Teilabbildung (B) zeigt, dass nach zwei Wochen der Kultivierung die isolierten aMSC mit PE-markierten Antikörpern gefärbt wurden. Die Zellen waren CD29⁺, CD44⁺, CD45^– und CD90⁺, wobei die Kurve 1 die Isotypenkontrolle darstellt.
5 zeigt die adipogenetische und osteogenetische Differenzierung der Aptamer-isolierten Schweine-aMSC Passage 0: (A) adipogenetische Differenzierung nach 14tägiger Behandlung mit Hydrocortison, Isobutylmethylxanthin und Indomethacin. Färbung mit oil red O, Hematoxylin-Gegenfärbung (x100). (B) Kontrolle (Normalmedium; Färbung mit Oil red 0, Hematoxylin-Gegenfärbung (x100)). (C) Osteogenetische Differenzierung nach 14tägiger Behandlung mit Dexamethason, Ascorbinsäure und β-Glycerolphosphat. Färbung auf alkalische Phosphatase, Hematoxylin-Gegenfärbung (x100). (D) Kontrolle (Normalmedium; Färbung auf alkalischer Phosphatase, Hematoxylin-Gegenfärbung (x100)).
6 zeigt die Plasmastabilität. Analyse der Stabilität des Aptamers G-8 in humanem Blutplasma durch Agarosegel-Elektrophorese. Zu verschiedenen Zeiten zwischen 0 Stunden bis 6 Stunden wurden Proben entnommen. Das Ergebnis zeigt, dass das Aptamer zumindest 6 Stunden einer Degradierung standhalten kann.
7 zeigt die adipogenetische (A) und osteogenetische (B) Differenzierung der Aptamer-isolierten Schweine-aMSC (Passage 0) gegenüber dem Kunststoffadhärenz-Verfahren zur Isolierung von aMSC (Passage 0). Mononucleare Zellen wurden aus frischem Gesamtknochenmark durch Dichtegradienten-Zentrifugation isoliert und bei einer Dichte von 500 Zellen/Well ausplattiert (a+c). Nach 24 Stunden wurde das Medium ausgetauscht, um nicht-adhärente Zellen zu entfernen. Dann wurde adi pogenetisches oder osteogenetisches oder normales Medium hinzu gegeben. Aptamer-isolierte aMSC wurden bei einer Dichte von 500 Zellen pro Well ausplattiert (b+d). Nach 24 Stunden wurde das Medium ausgetauscht und adipogenetisches oder osteogenetisches oder normales Medium wurde hinzu gegeben. Nach 5 Wochen, nachdem die Aptamer-isolierten Zellen Konfluenz erreicht hatten, wurde die Färbung durchgeführt: (A) (adipogenetische Differenzierung): a: Gesamtknochenmark – 24 Stunden Adhärenz, adipogenetisches Medium; b: Aptamer-isolierte aMSC – 24 Stunden Adhärenz, adipogenetisches Medium; c: Gesamtknochenmark – 24 Stunden Adhärenz, Kontrolle (normales Medium); d: Aptamer-isolierte aMSC – 24 Stunden Adhärenz, Kontrolle (normales Medium). Färbung mit oil red 0, Hematoxylin-Gegenfärbung. (B) (osteogenetische Differenzierung): a: Gesamtknochenmark – 24 Stunden Adhärenz, osteogenetisches Medium; b: Aptamer-isolierte aMSC – 24 Stunden Adhärenz, osteogenetisches Medium; c: Gesamtknochenmark – 24 Stunden Adhärenz, Kontrolle (normales Medium); d: Aptamer-isolierte aMSC – 24 Stunden Adhärenz, Kontrolle (normales Medium). Färbung auf alkalische Phosphatase, Hematoxylin-Gegenfärbung. In den Wells a und c wurde kein Zellwachstum festgestellt (Kunststoffadhärenz-Verfahren zur Isolierung von aMSC), während Aptamer-isolierte Zellen (b und d) gut wuchsen und adipogenetische (A, b) und osteogenetische (B, b) Differenzierung zeigten.
Beispiel
1. Materialien und Methoden
1.1 aMSC-Isolierung und -Kultivierung
Frisches Knochenmark wurde unter sterilen Bedingungen aus dem Schweinefemur extrahiert. Die Tiere (Schweine, deutsche Landrasse, 50 kg, männlich) wurden gemäß den Tierschutzauflagen der Universität Tübingen gehalten und behandelt. Schweine-aMSC wurden gemäß bekannten Modifizierungsverfahren isoliert; vgl. Ponomarev et al. (2003), Preliminary results of enhanced osteogenesie by Fibrogammin and mesenchymal stem cells on chronOS cylinders, European Cells and Materials 5, Seite 80. Kurz gesagt, es wurden mononucleare Zellen (MNC) aus Knochenmarkaspirat durch Zentrifugation über einen Ficoll-Histopaque-Layer isoliert (30 min, 300g, Dichte 1,077). Nach der Zentrifugation wurden die Zellen unter Standardkultivierungsbedingungen mit Nieder-Glucose-Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium (DMEM; Gibcol), versetzt mit 10%igem fötalem Kälberserum, Penicillin (50 U/ml) und Streptomycin (50 μg/ml), kultiviert. Das Medium wurde nach 24 Stunden und anschließend zweimal pro Woche ausgetauscht. Nachdem die Zellen 80% Konfluenz erreicht hatten, wurden diese durch 0,25%ige Trypsin-EDTA-Lösung abgelöst und erneut für die Präparation von SELEX und Differenzierungspotenzialbewertungen ausplattiert.
Auf gleiche Art und Weise wurden Ratten- und humane aMSC für Spezifitätstests (FACS mit Aptamer) isoliert und charakterisiert. Die Tiere (Sprague Dawley-Ratten) wurden gemäß den Tierschutzbestimmungen der Universität Tübingen gehalten und behan delt. Das humane Knochenmark wurde während orthopädischer Operationen entnommen und durch das lokale Ethikkomitee der Universität Tübingen gemäß der Erklärung von Helsinki genehmigt. Die Maus-P19-Zellen wurden von ATCC (Manassas, VR, Vereinigte Staaten von Amerika) bezogen.
1.2 aMSC-Charakteristika
Das Potenzial von aMSC, in adipogenetische und osteogenetische Linien zu differenzieren, wurde wie folgt getestet. Zur osteogenetischen Differenzierung wurden die aMSC in einem osteogenetischen Kultivierungsmedium kultiviert, das 0,2 mM L-Ascorbinsäure, 2-Phosphat-Magnesiumsalz n-Hydrat und 0,01 μM Dexamethason (Dex) (Sigma-Aldrich Co.), 10 mM β-Glycerophosphat enthielt. Nach 21 Tagen wurden die subkultivierten Zellschichten mit phosphatgepufferter Saline PBS gewaschen und mit 4% Paraformaldehyd fixiert und gemäß dem alkalischen Phosphatase-Färbekit (Sigma Kit #85) gefärbt. Nach fünfwöchiger Subkultivierung wurde die Ablagerung von mineralisierter Knochenmatrix durch von-Kossa-Färbung identifiziert. Die Zellschichten wurden mit 4% Paraformaldehyd fixiert, mit 2% Silbernitratlösung (w/v) für 10 Minuten im Dunkeln inkubiert, gründlich mit deionisiertem Wasser gewaschen und anschließend für 15 Minuten gegenüber UV-Licht exponiert. Zur adipogenetischen Differenzierung wurden die aMSC mit Wachstumsmedium stimuliert, das versetzt war mit 0,5 μM Hydrocortison, 0,5 mM 3-Isobutyl-1-methylxynthin und 60 μM Indomethacin (Sigma-Aldrich), und zwar für 3 Wochen mit einem zweimal pro Woche erfolgenden Mediumaustausch. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen, mit 10% Formalin für 10 Minuten fixiert, mit destilliertem Wasser gewaschen, mit 60% Isopropanol gespült und mit einer 3%igen oil red O-Lösung (Sigma-Aldrich) in 60% Isopropanol bedeckt. Nach 10 Minuten wurden die Kulturen kurz in 60%igem Isopropanol gespült und gründlich mit destilliertem Wasser gewaschen und bei Raumtemperatur trocknen gelassen. Die Oberflächenmarkeridentifizierung mit den kultivierten MSC erfolgte durch FITC-markierte monoklonale Antikörper gegen CD29, CD44, CD45, CD90, SLA-Klasse I, SLA-Klasse DQ und SLA DR (Becton Dickinson, Deutschland, Heidelberg). Zur Kontrolle der Isotypen wurden nicht-spezifische Maus-IgG anstelle des primären Antikörpers verwendet.
1.3 Selektion der Aptamerbindung an aMSC
1.3.1 DNA-Bibliothek und Primer
Die DNA-Oligonucleotid-Bibliothek enthält eine 40 Nucleotid lange, zentrale, randomisierte Sequenz, flankiert durch Primerstellen an jeder Seite (für die Schweine-MSC-Aptamere: 5'-GAATTCAGTCGGACAGCG-N40-GATGGACGRATATCGTCTCCC-3'; für die humanen MSC-Aptamere: 5'-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N50-TTCGACATGAGGCCCGAAAC-3'). Die Größe der Bibliothek beträgt etwa 10¹⁵. Der FITC-markierte Vorwärts-Primer (5'-C₁₂-FITC-GAATTCAGTCGGACAGCG-3' und der Biotin-markierte Rückwärts-Primer (5'-Bio-GGGAGACGATATTCGTCCATC-3') wurden in der PCR verwendet, um doppelsträngige DNA zu erhalten und die einzelsträngige DNA durch Streptavidin-beschichtete magnetische Kugeln (M-280-Dynabeads, Dynal, Hamburg, Deutschland) abzutrennen. Die Bibliothek und sämtliche Primer wurden von Operon Technologies (Köln, Deutschland) synthetisiert.
1.3.2 SELEX-Verfahren
Die Selektion von DNA-Aptameren gegen Schweine-aMSC wurde wie folgt durchgeführt. 4 nmol ssDNA-Pools wurden in Selektionspuffer enthaltend 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl₂ und 0,1 % NaN3 für 10 Minuten bei 80°C Hitze denaturiert und dann bei 0°C für 10 Minuten renaturiert. Um die Hintergrundbindung zu reduzieren, wurde ein fünffacher molarer Überschuss von Hefe tRNA (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) und Rinderserumalbumin (BSA, Sigma-Aldrich, München, Deutschland) hinzu gegeben. Die mesenchymalen Stammzellen (Passage 2, 10⁶ Zellen für die erste Runde und 10⁵ Zellen für die weiteren Runden) wurden mit der ssDNA bei 37°C für 30 Minuten in dem Selektionspuffer inkubiert. Die Partitionierung von gebundenen und ungebundenen ssDNA-Sequenzen erfolgte durch Zentrifugation. Nach Zentrifugation und dreimaligem Waschen mit 1 ml Selektionspuffer (mit 0,2 % BSA) wurde zellgebundene ssDNA durch PCR amplifiziert (Master Mix von Promega, Mannheim, Deutschland). FITC- und Biotin-markierte Primer wurden zur PCR-Amplifizierung verwendet (25 Zyklen von 1 min bei 94°C, 1 min bei 48°C und 1 min bei 72°C, gefolgt von 10 min bei 72°C). Für die FACS-Analyse wurde FITC-markierte ssDNA wie oben beschrieben präpariert. Unter Verwendung von unmodifizierten Primern wurden aus der zehnten Runde der Selektion erhaltene Aptamere PCR-amplifiziert und in Escherichia coli unter Verwendung des TA-Klonierungskits (Invitrogen) kloniert. Plasmide von individuellen Klonen wurden durch das Plasmid-Extraktionskit (Qiagen, Düsseldorf, Deutschland) isoliert und die Inserts wurden PCR-amplifiziert und mit ABI PRISM^® 377 DNA-Sequencer (Applied Biosystems, Darmstadt, Deutschland) sequenziert. Individuelle FITC- Aptamere wurden präpariert, um die Affinitätsbindungstests durchzuführen.
Die Selektion von DNA-Aptameren gegen humane aMSC wurde entsprechend durchgeführt.
1.4 Aptamerbindung an MSC
1.4.1 FACS-Assay zur Aptamerbindungsaffinität gegenüber aMSC
200 pmol des FITC-markierten Aptamers wurden mit 10⁵ aMSC bei 37°C für 30 min inkubiert, dreimal gewaschen und mit FACS analysiert (BD, Heidelberg, Deutschland), die gleiche Menge von Maus-P19-Zellen, Ratten-MSC, die mit dem Aptamer inkubiert wurde, wurde in der Kontrolle verwendet. Die Sekundärstruktur des Aptamers wurde durch DNASYS-Software (Version 2,5; Hitachi Software Engineering Co) analysiert.
1.4.2 Aptamerbindung an aMSC
Biotinylierte Aptamere wurden durch OPERON synthetisiert und mit 10⁵ aMSC für 30 min bei 37°C inkubiert, dreimal gewaschen und mit Anti-Biotin-Mikrokugeln (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland) für 15 min bei 0°C inkubiert. Die gleiche Anzahl von aMSC ohne Aptamer wurde mit Anti-Biotin-Mikrokugeln inkubiert und diente als Negativkontrolle. Die Mischung wurde dreimal gewaschen und durch eine Magnetsäule gefiltert. Anschließend wurde die Säule von dem Magnethalter entfernt und die Kugeln wurden in Zellkultivierungsmedium gegeben.
1.4.3 Aptamerbindung an aMSC in Gesamtknochenmarksblut
FACS: 10 ml frisches Knochenmarksblut wurden mit Ammoniumchlorid lysiert und mit FITC-markiertem Aptamer (200 pmol) für 30 min bei 37°C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen wurden die Zellen mittels FACS analysiert. Die gleiche Menge von peripherem Blut wurde identisch behandelt, um als Kontrolle zu dienen.
Einfangexperiment: 20 ml frisches Knochenmark wurde mit Ammoniumchlorid lysiert und mit PBS (2% FBS, 1 mM EDTA) resuspendiert. FcR-blockierender Antikörper und 1 nmol Aptamer wurden für 30 min zu der Knochenmarkslösung bei Raumtemperatur hinzu gegeben. EasySep-Biotin-Selektionscocktail (cellsystems, St. Katharinen, Deutschland) wurde hinzu gegeben und für 15 min inkubiert. Anschließend wurden EasySep magnetische Nanopartikel hinzu gegeben und für 10 min inkubiert. Die Mischung wurde in den Magneten gegeben und für 5 min bei Seite gestellt. Der Überstand wurde herausgezogen und die magnetisch markierten Zellen wurden zweimal mit Puffer gewaschen und weiterkultiviert.
1.5 Aptamer-vermittelte aMSC-Adhäsion an eine feste Oberfläche
Eine 12-Well-Zellkultivierungsplatte (Greiner, Nürtingen, Deutschland) wurde mit Streptavidin über Nacht bei 4°C beschichtet, anschließend mit PBS-T (0,05% Tween-20) mehrere Male gewaschen. Das biotinylierte Aptamer und die biotinylierte Bibliothek (Kontrolle) (1 nmol) wurden zu den verschiedenen Wells hinzu gegeben und bei 30°C für 4 Stunden inkubiert. Die Platte wurde mit PBS-T gewaschen und mit aMSC bei 37°C für 30 min bei langsamem Schütteln inkubiert. Anschließend wurde das Medium von der Platte entfernt und die nicht-adhärenten Zellen wurden verworfen. Die Zelladhäsion wurde unter einem Inversmikroskop (Zeiss Axiovert 135, Zeiss, Oberkochen, Deutschland) beobachtet.
1.6 FITC-Aptamer-vermittelte aMSC-Isolierung
20 ml Knochenmark wurden lysiert, um die roten Blutzellen zu entfernen. 4 nmol FITC-markiertes Aptamer wurden mit dem Knochenmark für 30 min bei 37°C inkubiert, gefolgt von 3 Waschschritten, und die Knochenmarkszellen wurden mittels FACS analysiert. Die FITC-positiven Zellen wurden isoliert und für weitere Analysen gesammelt.
1.7 Charakterisierung der sortierten aMSC
1.7.1 Phänotyp-Identifizierung der isolierten aMSC
20 ml Blut mit Gesamtknochenmark aus einem erwachsenen Schwein wurden lysiert, um die roten Blutzellen zu entfernen. Das FITC-markierte Aptamer wurde hinzu gegeben und für 30 min bei 37°C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen wurden die Zellen unter sterilen Bedingungen mittels Hochgeschwindigkeits-FACS analysiert (FACS-Sort; Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland) und die FITC-positiven Zellen wurden isoliert und in PBS gesammelt. Einige der isolierten Zellen wurden das zweite Mal durch PE-markiertes CD4, CD8, CD29, CD44, CD45 und CD90 analysiert; der Rest der isolierten Zellen wurde für zwei Wochen kultiviert und durch PE-markierte Antikörper CD29, CD44, CD45 und CD90 (Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland) analysiert.
1.7.2 Differenzierung der isolierten aMSC
Die isolierten aMSC wurden in osteogenetischem Kultivierungsmedium und adipogenetischem Kultivierungsmedium kultiviert. Die Färbung auf alkalische Phosphatase und die Oil red-Färbung wurden durchgeführt, wie beschrieben.
1.8 Vergleich der Effizienz der aMSC-Isolierung mittels konventioneller Kunststoffadhärenz und der erfindungsgemäßen Aptamer-basierenden MSC-Isolierung
Um die Effizienz einer aMSC-Isolierung zu evaluieren, wurden das adipogenetische und osteogenetische Differenzierungspotenzial und die Menge der isolierten Zellen miteinander verglichen. Mononucleare Zellen wurden aus frischem Gesamtknochenmark des Schweins durch Dichtegradienten-Zentrifugation isoliert und mit einer Dichte von 500 Zellen/Well ausplattiert. Nach 24 Stunden wurde das Medium ausgetauscht, um nicht-adhärente Zellen zu entfernen. Anschließend wurde adipogenetisches oder osteogenetisches oder normales Medium hinzu gegeben. Aptamerisolierte aMSC wurden mit derselben Dichte (500 Zellen/Well) ausplattiert. Nach 24 Stunden wurde das Medium getauscht und adipogenetisches oder osteogenetisches oder normales Medium wurde hinzu gegeben. Nach 5 Wochen, nachdem die Aptamer-isolierten Zellen Konfluenz erreicht hatten, wurde das adipogenetische und osteogenetische Anfärbeverfahren gestartet.
1.9 Plasmastabilität
Frisches humanes Plasma wurde durch 20minütige Zentrifugation (3000 g) von Gesamtblut präpariert. 8 nmol des Aptamers wurden bei 37°C in einem Endvolumen von 0,5 ml von frisch präpariertem, heparinisiertem, humanem Plasma inkubiert. Proben von 50 μl wurden nach 0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3 und 6 Stunden entnommen. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 10 μl von Ladepuffer und anschließender Lagerung auf Eis beendet. Volllängen- und verdaute Oligonucleotide wurden auf einem 2%igen Agarosegel separiert und photodokumentiert.
2. Ergebnisse
2.1 aMSC-Isolierung und Charakteristiken
Schweine- und humane aMSC wurden erfolgreich aus Knochenmark über Gradientenzentrifugation isoliert, in einer Monolayer-Kultur expandiert und auf das osteogenetische Differenzierungspotenzial evaluiert. Fibroblastenzellen mit bipolarer bis polygonaler Spindel wurden 4 Tage nach dem ersten Ausplattieren beobachtet. Die Zellen erreichten nach 12 Tagen der Kultivierung die Konfluenz. Nach der ersten Passagierung zeigten die Zellen einen uniformen Monolayer. Die in osteogenetischem Medium kultivierten aMSC zeigten sich nach 8 Tagen bzw. 28 Tagen ALP-positiv und Von-Kossa-positiv (Calciummineralpräzipitation). Die in adipogenetischem Differenzierungsmedium kultivierten aMSC zeigten sich positiv für eine red oil-Färbung, wohingegen sämtliche Kontrollen negativ waren (1(A)). Die Oberflächenmarkerfärbung zeigte, dass die adhärenten Zellen CD29⁺, CD44⁺, CD45^–, CD90⁺, SLA-Klasse I⁺, SLA-DQ^– und SLA-DR^– waren (1(B)).
2.2 Selektion von Aptameren mit hoher Affinität für MSC
Aus Schweine- und humanem Knochenmark gewonnene aMSC wurden als Target zur in vitro-Selektion von Aptameren aus einem randomisierten Pool von DNA-Molekülen verwendet. Die Ausgangsbibliothek bestand aus 79-mer einzelsträngigen DNA-Molekülen, die randomisierte 40-Nucleotid-Inserts enthielten. Diese Bibliothek wurde auf eine Anzahl von kultivierten Zellen in der gleichen Passage angewendet, wodurch nicht-spezifische Interaktion minimiert wird. Um die Anreicherung von spezifischen zellbindenden Aptameren während der Selektion zu verfolgen, wurden SELEX-Pools der zweiten und der folgenden Runden durch FACS nach der Inkubation mit aMSC analysiert. In jeder Selektionsrunde wurde die Konzentration von Kompetitor-DNA erhöht, um auf einen Aptamerpool mit höherer Affinität und höherer Spezifität zu selektieren. Die Analyse von Fluoreszenz-markierten Pools in aufeinander folgenden Zyklen der Selektion zeigte einen Shift von dem Histogramm der zweiten Runde in Richtung höherer Fluoreszenzintensität. Nach 10 Runden der Selektion zeigte die Fluoreszenz des Pools keine weitere Zunahme, der Pool wurde dann kloniert und sequenziert.
Sequenzen aus 20 Klonen wurden erhalten, deren Inserts wurden analysiert und in mutmaßliche Familien durch Ausrichtung von Konsensus-Motiven einsortiert. Die Motive wurden mittels Computerunterstützter Suchmaschinen identifiziert. Die nachfolgende Tabelle 1 zeigt die Nucleotidsequenzen der 20 Aptamere, die entweder über die Selektion gegen Schweine-MSC oder humane MSC erhalten wurden und spezifisch sind für MSC.
Tabelle 1: Sequenzspezifische Aptamere gegen MSC
2.3 Bindung von Aptameren an aMSC
FACS-Tests: Die Fluoreszenz einer Bindung eines exemplarischen Aptamers, das die Nucleotidsequenz SEQ ID-Nr. 6 aufweist (G-8) an aMSC ist in den 2(A) bis 2(C) dargestellt, in denen die spezifische Bindung der Aptamere an aMSC gezeigt ist.
Isolierungsexperiment: aMSC, die an das biotinylierte Aptamer gebunden haben, können unter Verwendung von Anti-Biotin- Mikrokugeln isoliert und angereichert werden. Über das biotinylierte Aptamer können aMSC fixiert werden, wenn diese durch eine Magnetsäule filtriert werden. wie in 3(A) gezeigt, können die Anti-Biotin-Mikrokugeln („Mikrobeads") allein keine aMSC isolieren, so dass es keine in der Kulturschale wachsenden Zellen beobachtet werden (linke Aufnahme, Negativkontrolle). Die Anti-Biotin-Mikrokugeln mit dem auf der Oberfläche fixierten biotinylierten Aptamer können an aMSC binden, so dass wachsende Zellen detektiert werden können (rechte Aufnahme). Dieses Ergebnis zeigt, dass das Aptamer in der Lage ist, MSC aus der Zelllösung zu isolieren.
2.4 Bindung von Aptameren an aMSC in Gesamtknochenmark
FACS-Assay: Das Aptamer G-8 zeigt nahezu keine Bindung an periphere Blutzellen im Vergleich mit Gesamtknochenmark (1(B)).
Einfangexperiment: Mit dem EasySep-Biotin-Selektionskit können aMSC aus Gesamtknochenmark mit biotinyliertem Aptamer markiert und direkt isoliert werden. Wie in 3(B) (links) gezeigt, gab es ohne Aptamer-Beschichtung keine spezifische Bindung zwischen den Kugeln und aMSC, was in einem lediglich sehr geringen Zellwachstum auf der Kultivierungsplatte resultiert. Die rechte Aufnahme demonstriert, dass aMSC mit Aptamer-markierten Kugeln eingefangen werden können und gut auf Kultivierungsplatten wachsen (3(B)).
2.5 Aptamer-vermittelte aMSC-Adhäsion auf einer festen Oberfläche
Das biotinylierte Aptamer wurde auf einer Streptavidin-beschichteten Platte immobilisiert, gefolgt von einer Zugabe von aMSC zu der Oberfläche. Im Vergleich mit der Platte ohne Aptamerbeschichtung adhärierten an der Aptamer-beschichteten Platte mehr Zellen in kürzerer Zeit. Das Ergebnis zeigt, dass das Aptamer sehr gut an das Target binden kann, wenn es auf einer festen Oberfläche immobilisiert ist (3(C)).
2.6 Charakterisierung der isolierten aMSC
2.6.1 Phänotypische Identifizierung der isolierten aMSC
Mononucleare Zellen aus Knochenmark wurden mit dem FITC-markierten Aptamer G-8 durch Hochgeschwindigkeits-FACS gesammelt und mit PE-markierten Antikörpern analysiert. Das Ergebnis zeigt zwei Subpopulationen von isolierten Zellen. Die erste Subpopulation (R1) enthaltend kleine granuläre Zellen war CD4^– (82,2 %), CD8^– (80,5 %), CD29^– (70,7 %), CD44⁺ (90,9 %), CD45⁺ (86,4 %) und CD90^– (77,6 %). Die zweite Subpopulation (R2) enthaltend kleine und nicht-granuläre Zellen war CD4^– (98,9), CD8^– (98,9 %), CD29^– (83,7 %), CD44⁺ (87,7 %), CD45⁺ (99,2 %) und CD90⁺ (91,8 %). Die isolierten Zellen wurden für 14 Tage (Passage 0) kultiviert und auch mit PE-markierten Antikörpern gefärbt. Die Ergebnisse zeigten, dass diese CD29⁺ (98,0), CD44⁺ (99,6 %), CD90⁺ (99,5) und CD45^– (87,6 %) waren, was übereinstimmt mit zuvor beschriebenen Markern von aMSC in Kultur (4). Im Gegensatz zu den frisch isolierten Zellen konnte keine definierte Subpopulation ausfindig gemacht werden und die kul tivierten Zellen regelten CD29 hoch und verloren das CD45-Antigen.
2.6.2 Differenzierung der isolierten aMSC
Die adipogenetische und osteogenetische Differenzierung der Aptamer-isolierten Schweine-aMSC in Passage 0 zeigte, dass die isolierten aMSC ein hohes Potenzial zur Differenzierung in Adipocyten und Osteoblasten haben (5).
2.7 Effizienz der aMSC-Isolierung
Es konnte kein Zellwachstum in den Wells festgestellt werden, in denen mononucleare Zellen aus Gesamtknochenmark ausplattiert wurden (ursprünglich ausplattiert: 500 Zellen/Well; konventionelles Verfahren der Kunststoffadhärenz über 24 Stunden zur Isolierung von aMSC, 7(A)a; 7(B)c), wohingegen Aptamer-isolierte Zellen gut wuchsen und adipogenetische (7(A)b) und osteogenetische (7(B)b) Differenzierung zeigten (ursprünglich ausplattiert: 500 Zellen/Well; Mediumsaustausch nach 24 Stunden).
Dieses Ergebnis demonstriert, dass das erfindungsgemäße Verfahren zur Isolierung von MSC dem bislang im Stand der Technik durchgeführten Verfahren, bei dem die Isolierung der MSC über Kunststoffadhärenz erfolgt, deutlich überlegen ist.
2.8 Plasmastabilität
Für klinische oder therapeutische Anwendungen sollten die Aptamere gegen die schnelle Degradierung durch Exo- und Endonuclea sen resistent sein. Humanes Plasma enthält hauptsächlich eine hohe 3'-Exonuclease-Aktivität. In humanem Blutplasma konnte das G-8-Aptamer einer Degradierung durch Nucleasen über 6 Stunden widerstehen, was über Agarosegelanalyse detektiert wurde (6), weshalb keine zusätzliche Modifizierung erforderlich war, um die Stabilität nochmals zu erhöhen.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Vorrichtung mit zumindest einer mit biologischem Gewebe und/oder Flüssigkeit in Kontakt kommenden Oberfläche, welche zumindest teilweise mit einer Substanz beschichtet ist, die die Bindung von mesenchymalen Stammzellen (MSC) vermittelt, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz ein Aptamer ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Aptamer ein Nucleinsäuremolekül ist, das zumindest eine der Sequenzen SEQ ID-Nr. 1 bis SEQ ID-Nr. 20 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung ein Implantat ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche ein Material aufweist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Polytetrafluorethylen, Polystyrol, Polyurethan, Polyester, Polylactid, Polygykolsäure, Polysulfon, Polypropylen, Polyethylen, Polycarbonat, Polyvinylchlorid, Polyvinyldifluorid, Polymethylmethacrylat, Hypoxylapatit, Isopropylacryamid, Texin oder Copolymere davon, Nylon, silanisiertes Glas, Keramik, Metalle, insbesondere Titan, oder Mischungen davon.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Aptamere direkt und/oder über ein Linkermolekül an der Oberfläche angebracht sind.
Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Linkermolekül N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzlich Wachstumsfaktoren aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Wachstumsfaktoren ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: "Platelet derived Growth Factor" (PDGF), "Vascular Endothelial Growth Factor" (VEGF), "Colony Stimulating Factor" (CSF), "Epidermal Growth Factor" (EGF), „Nerve Growth Factor" (NGF), „Fibroblast Growth Factor (FGF) und/oder Wachstumsfaktoren aus der „Transforming Growth Factor"(TGF)-Superfamilie.
Verfahren zur Bindung und/oder Isolierung von mesenchymalen Stammzellen (MSC) aus biologischem Gewebe und/oder Flüssigkeit, das folgende Schritte aufweist: (1) Bereitstellen von MSC enthaltendem biologischem Gewebe und/oder MSC enthaltender biologischer Flüssigkeit, (2) In Kontakt bringen des Gewebes und/oder der Flüssigkeit mit einer an MSC bindenden Substanz, (3) Inkubation für eine Zeitspanne, die die Bindung der MSC an die Substanz gestattet, und ggf. (4) Isolierung der an die Substanz gebundenen MSC, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz ein Aptamer ist.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Aptamer ein Nucleinsäuremolekül ist, das zumindest eine der Sequenzen SEQ ID-Nr. 1 bis SEQ ID-Nr. 20 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll aufweist.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Aptamer einen detektierbaren und/oder selektierbaren Marker aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass es im Rahmen einer fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) und/oder magnetischen Zellsortierung (MACS) durchgeführt wird.
Nucleinsäuremolekül, das derart gestaltet ist, dass es selektiv und hochspezifisch an mesenchymale Stammzellen (MSC) bindet.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das es zumindest eine der Sequenzen SEQ ID-Nr. 1 bis SEQ ID-Nr. 20 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll aufweist.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass es einen detektierbaren und/oder selektierbaren Marker aufweist.
Verwendung eines Nucleinsäuremoleküls zur Bindung und/oder Isolierung von mesenchymalen Stammzellen (MSC) aus biologischem Gewebe und/oder Flüssigkeit.
Verwendung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Nucleinsäuremolekül das Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 13 bis 15 ist.
Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung mit zumindest einer mit biologischem Gewebe und/oder Flüssigkeit in Kontakt kommenden Oberfläche, welche zumindest teilweise mit einer Substanz beschichtet ist, die die Bindung von mesenchymalen Stammzellen (MSC) vermittelt, das folgende Schritte aufweist: (1) Bereitstellen von Nucleinsäuremolekülen, und (2) Binden der Nucleinsäuremoleküle aus Schritt (1) an die Oberfläche einer Vorrichtung, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleinsäuremoleküle das Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 13 bis 15 aufweisen.