DE60123293T2

DE60123293T2 - Menschliche, aus nabelschnurblut stammende uneingeschränkte somatische stammzellen (ussc)

Info

Publication number: DE60123293T2
Application number: DE60123293T
Authority: DE
Inventors: Peter Wernet
Original assignee: KOURION THERAPEUTICS AG
Current assignee: KOURION THERAPEUTICS AG
Priority date: 2000-11-03
Filing date: 2001-11-03
Publication date: 2007-05-10
Anticipated expiration: 2021-11-04
Also published as: HK1071771A1; CA2426987C; US7560280B2; SK5242003A3; EA008619B1; EP1404815A2; JP2004521617A; US20020164794A1; PL362293A1; AU2002229533B2; JP2008179642A; CN1553951A; JP4805960B2; CN100480375C; ATE340255T1; EE200300205A; WO2002036751A3; NO20031999L; US7556801B2; ES2272563T3

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung einer somatischen Stammzelle oder einer Menge von Stammzellen zur Herstellung eines Medikaments.
Obwohl Stammzellen permanent selbstersetzend sind, haben sie im Allgemeinen einen langsamen Zyklus. Herkömmlicherweise wird angenommen, dass diese Zellen zu einer vorübergehenden Verstärkung der Zellpopulation mit begrenzter Selbsterneuerungskapazität führt, so dass die Zahl der differenzierten Zellen vorübergehend zunimmt. Bisher bestand die Herausforderung darin, Stammzellen im erwachsenen Menschen zu lokalisieren, und daher werden in der vorhandenen Literatur mehrere Surrogatmarker (z.B. Koloniebildungstests für den hämatopoetischen Zellstammbaum) eingesetzt.
Mehrere US-Patente, zum Beispiel US 5,486,359 , 5,591,625, 5,736,396, 5,811,094, 5,827,740, 5,837,539, 5,908,782, 5,908,784, 5,942,225, 5,965,436, 6,010,696, 6,022,540, 6,087,113, 5,858,390, 5,804,446, 5,846,796, 5,654,186, 6,054,121, 5,827,735, 5,906,934, beschäftigen sich mit mesenchymalen Stammzellen (MSC), die zu mehreren Vorläuferzellen, zum Beispiel Muskelvorläuferzellen, Bindegewebszellvorläufer oder ovalen Zellen, differenziert werden können. Muskelvorläuferzellen differenzieren sich weiter zu Herz- und Skelettzellen sowie Zellen der glatten Muskulatur, während die Bindegewebszellvorläufer zu Knochen-, Knorpel- sowie Fettzellen differenzieren können. Ovale Zellen können zu Leber- oder Pankreaszellen differenzieren (Grompe et al., 2001).
Erices A. et al. ("Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood", British Journal of Haematology (2000), 109, 5. 235-242) offenbaren, dass aus Nabelschnurblut abgeleitete mononukleäre Zellen, wenn man sie kultiviert, adhärente Zellen ergeben, die entweder einen osteoklasten- oder einen mesenchymartigen Phänotyp aufweisen. Letztere weisen eine fibroblastenartige Morphologie auf und exprimieren mehrere, mit mesenchymalen Vorläuferzellen zusammenhängende Antigene (SH2, SH3, SH4, ASMA, MAB 1470, CD13, CD29 und CD49e).
Die Anwesenheit von nichthämatopoetischen Stammzellen im Nabelschnurblut wird noch diskutiert (Mayani et al., 2000, Mareschi et al., 2001). Die Deutsche Patentanmeldung DE 198 03 267 A1 war die erste, die Osteoblasten-Vorläufer und Knochenbildung aus menschlichem Nabelschnurblut beschrieb.
Die Verwendung dieser mesenchymalen Vorläuferzellen des Standes der Technik ist jedoch häufig eingeschränkt, da sie zu weit entwickelt sind, um geeignete Werkzeuge zur Erzeugung von Organen oder Geweben zu sein. Mit anderen Worten, sie scheinen bereits zu weit festgelegt und spezialisiert zu sein, um ein funktionsfähiges regenerierendes Organ oder Gewebe zu ergeben.
Es ist daher ein Ziel der Erfindung, die Verwendung einer Stammzelle, die zu verschiedenen Vorläuferzellen, wie mesenchymalen Zellen, neuralen Zellen, Blutzellen oder Endothelzellen, differenzieren kann, zur Herstellung eines Medikaments anzugeben.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, die Verwendung einer Stammzelle, die die Nachteile embryonaler Stammzellen nicht aufweist, zur Herstellung eines Medikaments anzugeben.
Es hat sich gezeigt, dass die oben angesprochenen Ziele mit einer neu identifizierten somatischen Stammzelle erreicht werden können. Die somatische Stammzelle der Erfindung ist von menschlichem Nabelschnurblut, Plazentablut und/oder Blut von einem Neugeborenen abgeleitet, wobei die somatische Stammzelle von mesenchymalen Stamm- oder Vorläuferzellen, Stamm- oder Vorläuferzellen des hämatopoetischen Zellstammbaums, neuralen Stamm- oder Vorläuferzellen oder endothelialen Stamm- oder Leber-Vorläuferzellen verschie den ist, aber zu diesen differenzieren kann. Diese Zellen stellen den Vorläufer des hämatopoetischen Zellstammbaums, der mesenchymalen Stammzellen sowie der neuralen Stammzellen dar. Diese einzigartige multifunktionelle Fähigkeit und die Technologie zum Expandieren dieser von Nabelschnurblut (CB) abgeleiteten unrestringierten somatischen Stammzellen (USSC), entweder als solche somatischen Stammzellen oder als festgelegte Zellen unter unterschiedlichen Differenzierungsvorschriften, erlaubt die genaue Charakterisierung, Standardisierung und Verwendung zur Herstellung und Ausführung einer Stammzelltherapie in der regenerativen Medizin.
1 zeigt eine Mikrophotographie von USSC-Primärkulturzellen, die mit geringer Dichte ausgestrichen wurden.
2 zeigt eine Mikrophotographie einer konfluenten USSC-Kultur.
3 zeigt eine FACS-Analyse für das CD45-Antigen im Verlauf einer in-vitro-Kultur.
4 zeigt eine FACS-Analyse für den embryonalen Marker SSEA4.
5 zeigt eine FACS-Analyse für HLA-Klasse I (A, B, C), HLA DR und CD14.
6 zeigt eine FACS-Kinetik für den Oberflächenmarker CD34.
7 zeigt eine Mikrophotographie von USSC-Zellen nach neuronaler Induktion.
8 zeigt durch Anfärbung mit Anti-Nestin, dass USSCs der Erfindung den Marker neuraler Stammzellen Nestin exprimieren.
9 zeigt USSCs, die Zellen des neuronalen Zellstammbaums erzeugen.
10 zeigt USSCs, die Zellen des glialen Zellstammbaums erzeugen.
11 zeigt die Bildung von mineralisierten Knötchen nach osteogener Induktion und nach Anfärbung mit Alizarinrot (B).
12 zeigt die Alcianblaufärbung einer von USSC abgeleiteten Pellet-Kultur.
13 zeigt die Anfärbung (grün) für Collagen Typ II bei USSC-Kulturen nach chondrogener Differenzierung.
14 zeigt die adipogene Differenzierung von USSC-Kulturen, wie sie durch Ölrot-Anfärbung nachgewiesen wird.
15 zeigt Mikrophotographien von USSC-Kulturen vor und nach der myogenen Differenzierung.
16 zeigt die Immunocytochemie für langsam wirkendes Myosin nach Azacytidin-Behandlung.
17 zeigt den Ovalzellenphänotyp von USSC-Derivaten.
18 zeigt das Überleben und die Integration von USSC-Kulturen nach Injektion in SCID-Mausleberparenchym.
Die somatischen Stammzellen der Erfindung können nach mehreren Verfahren isoliert und gereinigt werden, die die Schritte der Dichtegradientenisolierung, der Kultur von adhärenten Zellen und der Subkultur unter Anwendung von Wachstumsfaktoren, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, umfassen. Nachdem eine konfluente Zellschicht etabliert wurde, wird das Isolierungsverfahren zur Ableitung von Zellen dieser Erfindung routinemäßig anhand der Morphologie (Fibroblastoid-Morphologie) und anhand von Phänotypanalysen unter Verwendung von Antikörpern gegen die Oberflächenantigene CD13 (positiv), CD14 (negativ), CD45 (negativ) und CD29 (positiv; siehe Beispiel 2) gesteuert.
Die somatische Stammzelle der Erfindung reagiert negativ mit Markern, die spezifisch für den hämatopoetischen Zellstammbaum sind, wie CD45, und unterscheidet sich damit von hämatopoetischen Stammzellen, die ebenfalls aus plazentalem Nabelschnurblut isoliert werden können. CD14 ist ein weiteres Oberflächenantigen, das auf USSCs nicht nachgewiesen werden kann. Weiterhin ist die Stammzelle dieser Erfindung durch eine Gruppe von Antigenen charakterisiert, die auf der Zelloberfläche vorhanden sind, wie CD13, CD29, CD44 und CD49e. USSC-Präparate sind weiterhin durch die Anwesenheit von mRNA-Transcripten für bestimmte Rezeptormoleküle, wie Epidermis-Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGF-R), Blutplättchen-Wachstumsfaktor-Rezeptor α (PDGF-RA) und insulinartiger-Wachstumsfaktor-Rezeptor (IGF-R), charakterisiert. Diese Zellen exprimieren typischerweise auch Transcriptionsfaktoren, wie YB1 (Y-Box-Transcriptionsfaktor 1), Runx1 (Runt-Related Transcriptionsfaktor 1) und AML1C (Akute-Myeloide-Leukämie-1-Transcriptionsfaktor), was durch RT-PCR nachgewiesen wurde. USSC-Präparate sind jedoch typischerweise negativ in Bezug auf Transcripte für den chondrogenen Transcriptionsfaktor Cart-1 und neurale Marker, wie Neurofilament, Synaptophysin, Tyrosin-Hydroxylase (TH) und gliales fibrilläres saures Protein (GFAP).
Tabelle 1: Analyse der Transcriptionsmuster von USSCs durch RT-PCR
RT-PCR-Ergebnisse, die mit vorausgesagten Oligonucleotidprimern und mRNAs aus USSCs und mRNAs der positiven Kontrolle aus anderen Geweben, wie Knochen, Knorpel, Hirn oder mononukleären Nabelschnurzellen, erhalten wurden.
Die RNA-Expression von USSC-Präparaten und von Knochenmark abgeleiteten MSCs (Caplan, 1991) wurde direkt miteinander verglichen, indem man quantitative Affymetrix-GeneChip^TM-Microarrays verwendete. Das Transcript des Fibulin-2-Gens (Genbank-Nr. X82494) wurde in USSCs in hohen Expressionsniveaus, aber nicht in MSCs nachgewiesen. Die Fibulin-2-Produktion wurde schon früher in Fibroblasten nachgewiesen (Pan et al., 1993). Eine Northern-Blot-Analyse der mRNA aus verschiedenen humanen Geweben zeigt ein reichlich vorhandenes 4,5-kb-Transcript in Herz-, Plazenta- und Eierstockgewebe (Zhang et al., 1994). Das Protein wurde unter Verwendung von polyklonalen Antikörpern auf lichtmikroskopischem Niveau in humanen Embryonen in Schwangerschaftswoche 4-10 lokalisiert. Fibulin-2 wurde primär innerhalb des Neuroepithels, der Spinalganglien und der peripheren Nerven nachgewiesen (Miosge et al., 1996).
Im Ratten-Tiermodell werden Rattenleber-Myofibroblasten (rMF) mit Fibulin-2 colokalisiert. Diese Zellen befanden sich im Portalfeld, den Wänden von zentralen Venen und nur gelegentlich im Parenchym. In frühen Stadien der Fibrose wurden rMF innerhalb der sich entwickelnden Narben nachgewiesen. In fortgeschrittenen Stadien der Fibrose machten rMF die Mehrzahl der Zellen aus, die sich innerhalb der Narbe befanden (Knittel et al., 1999). In einem anderen Tiermodell wird Maus-Fibulin-2-Protein während der epithelial-mesenchymalen Transformation in der Endokardkissenmatrix während der embryonalen Herz entwicklung exprimiert. Fibulin-2 wird auch von den Vorläuferzellen der glatten Muskulatur von sich entwickelnden Aortenbogengefäßen und den koronaren Endothelzellen, die von Neuralleistenzellen bzw. Epikardzellen abstammen, synthetisiert (Tsuda et al., 2001).
Die Transcripte des Hyaluronan-Synthase-Gens (D84424), des Fibromodulin-Gens (U05291) und des Transcripts 1NFLS (W03846) wurden in USSCs nicht, aber in MSCs in großen Mengen nachgewiesen. Eine Northern-Blot-Analyse wies darauf hin, dass die Hyaluronan-Synthase in humanen Geweben ubiquitär exprimiert wird (Itano und Kimata, 1996). Das Produkt dieses Enzyms, Hyaluronan, hat eine Vielzahl von Funktionen, einschließlich der Raumausfüllung, der Schmierung von Gelenken und der Bereitstellung einer Matrix, durch die Zellen wandern können (Hall et al., 1995). Fibromodulin ist ein Vertreter einer Familie von kleinen interstitiellen Proteoglycanen. Das Protein hat eine weite Gewebeverteilung, wobei das reichhaltigste Vorkommen in Gelenkknorpel, Sehnen und Bändern beobachtet wird (Sztrolovics et al., 1994). Das Transcript 1NFLS wurde aus humaner fetaler Leber kloniert.
Das CD24-Gen (L33930) wird in den USSCs auf sehr niedrigem Niveau exprimiert im Vergleich zum Expressionsniveau in den MSCs. CD24 wird in vielen Zellen des B-Stammbaums und auf reifen Granulocyten exprimiert (Van der Schoot et al., 1989).
Im Vergleich zu MSCs sind die somatischen Zellen dieser Erfindung unterschiedlich aufgrund der Gewebequelle, aus der sie isoliert werden. Weiterhin sind USSCs dadurch gekennzeichnet, dass sie kein humanes Leukocyten-Antigen Klasse I (HLA-Klasse I) exprimieren. Im Gegensatz zu den somatischen Stammzellen dieser Erfindung exprimieren die zuvor beschriebenen MSCs, die aus Knochenmark und Muskelgewebe isoliert werden, sehr hohe Niveaus an HLA-Klasse-I-Antigen auf ihrer Zelloberfläche. Die Zelle dieser Erfindung exprimiert auch das stadiumspezifische frühe Antigen 4 (SSEA4) (siehe 4).
Typischerweise zeigt die somatische Stammzelle der Erfindung die Form einer Fibroblastoidzelle und vermehrt sich adhärent.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die somatische Stammzelle der Erfindung (USSC) in einer Vielzahl oder in Gemischen vorhanden, die Vorläufer anderer somatischer Stammzellen darstellen, zum Beispiel des hämatopoetischen Zellstammbaums, der vorzugsweise AC133 und CDS34 exprimiert, von somatischen Stammzellen, die mesenchymale Vorläufer sind, somatischen Stammzellen, die neuronale Vorläufer sind, oder Kombinationen davon. Diese Ausführungsform ist vorteilhaft, da sie auf der Basis der Fähigkeit zur Differenzierung zu anderen verschiedenen somatischen Stammzellen oder der Gegenwart solcher somatischer Stammzellen als bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ein hohes regeneratives Potential umfasst. Vorzugsweise werden die somatischen Stammzellen, die mesenchymale Vorläufer sind, oder die somatischen Stammzellen, die neuronale Vorläufer sind, durch Differenzierung aus einer Stammzelle der Erfindung produziert.
Je nach der Art der Krankheit ist eine lokale und/oder systemische Verabreichung der USSCs geeignet. Die USSCs können direkt oder zusammen mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Adjuvantien angewendet werden. Es kann vorteilhaft sein, weitere Substanzen hinzuzufügen, die die Heilung von Krankheiten fördern.
Grundsätzlich können die für die Anwendung von MSCs bekannten Verfahren bei der Anwendung von USSCs entsprechend angewendet werden. Weiterhin ist die Anwendung von Stammzellen zum Beispiel beschrieben in B.E. Strauer et al., "Intrakoronare, humane autologe Stammzelltransplantation zur Myokardregeneration nach Herzinfarkt", Dtsch med Wochenschr 2001; 126: 932-938; Quarto R. et al. "Repair of Large Bone Defects with the Use of Autologous Bone Marrow Stromal Cells", N Engl J Med 2001; 344: 385-386; Vacanti C.A., "Brief Report: Replacement of an Avulsed Phalanx with Tissue-Engineered Bone" N Engl J Med 2001; 344: 1511-1514, 17. Mai 2001; Hentz V.R., "Tissue Engineering for Reconstruction of the Thumb", N Engl J Med 2001; 344: 1547-1548; Brittberg M., "Treatment of Deep Cartilage Defects in the Knee with Autologous Chondrocyte Transplantation", N Engl J Med 1994; 331: 889-895, 6. Okt. 1994; Freed C.R., "Transplantation of Embryonic Dopamine Neurons for Severe Parkinson's Disease", N Engi J Med 2001; 344: 710-719; Shin'oka T., "Transplantation of a Tissue-Engineered Pulmonary Artery", N Engl J Med 2001; 344: 532-533; Shapiro A.M.J., Islet Transplantation in Seven Patients with Type 1 Diabetes Mellitus Using a Glucocorticoid-Free Immunosuppressive Regimen, N Engl J Med 2000; 343: 230-238.
Die Stammzellen der Erfindung werden weiterhin ausführlicher beschrieben.
Die Stammzellen der Erfindung sind adhärente Zellen mit der Form von Fibroblastoidzellen und zwei oder drei Nucleoli (siehe 1), die nach Trypsin-EDTA-Behandlung und erneutem Aussäen unter geeigneten Kulturbedingungen (Beispiel 1) erhalten werden und schnell bis zur Konfluenz mit einer langgestreckten Morphologie expandieren (2). 1 zeigt eine Mikrophotographie einer primären USSC-Kultur. Die in geringer Dichte ausgestrichenen Zellen zeigen die Fibroblastoidmorphologie von USSCs. Diese Zellen können leicht über mehr als 14 Kulturpassagen gezüchtet werden. 2 zeigt eine Mikrophotographie einer konfluenten USSC-Kultur. Die USSC-Schicht mit fast konfluenten Zellen zeigt eine parallele Orientierung von Zellen.
Der Oberflächenmarker-Phänotyp der primären adhärenten Zellschicht sowie alle Derivate davon in anschließenden Passagen sind und bleiben negativ in Bezug auf den CD45-Marker. 3 zeigt eine FACS-Analyse für das CD45-Antigen im Verlauf einer in-vitro-Kultur. CD45, ein charakteristisches Markerantigen für eine hämatopoetische Zelle ist bei USSCs aus späteren Passagen fast nicht nachweisbar (3 an den Tagen 48, 54, 82).
Nach einer in-vitro-Kultur unter Verwendung von Verfahren A (Beispiel 1) werden USSC-Präparate positiv in Bezug auf das stadiumspezifische frühe Antigen 4 (SSEA4) und zeigen die homogene Expression dieses embryonalen Markers. 4 zeigt eine FACS-Analyse für den embryonalen Marker SSEA4.
Nach Verfahren A expandierte Zellen (Beispiel 1) zeigen eine starke Expression des stadiumspezifischen frühen Antigens 4 (SSEA4). Gleichzeitig sind USSC-Kulturen negativ in Bezug auf die Expression von HLA-Klasse-I-Oberflächenantigen (5A) und die Expression von NLA-DR-Antigen (5B) und sind CD14-negativ (5C). 5 zeigt eine FACS-Analyse für HLA-Klasse I (A, B, C), HLA DR und CD14. USSC-Kulturen der Erfindung nach der Expansion in vitro sind negativ in Bezug auf HLA-Klasse-I-Antigene (Bild A). Diese Zellen sind auch negativ in Bezug auf die Oberflächenantigene HLA-DR (Bild B) und CD14 (Bild C), die für antigenpräsentierende Zellen (HLA-DR) und Monocyten (CD14) charakteristisch sind.
6 zeigt eine FACS-Kinetik für den Oberflächenmarker CD34. Die USSCs wurden über 10 Passagen in H5100/PEI gezüchtet. Während dieser Kulturzeit wurde eine signifikante Erhöhung der Expression von CD34-Antigen beobachtet. In bezug auf den Marker CD34 von hämatopoetischen Stammzellen zeigt 6, dass in Passage 3 bis zum 54. Tag keine CD34-positiven Zellen nachgewiesen werden können. Dagegen tritt in der siebten Passage am Tag 82 eine neue CD34-positive Subpopulation auf. Wenn solche CD34- und/oder FIK1-positiven Vorläufer andererseits mit cytokinkonditioniertem Medium, das für die hämatopoetische Differenzierung spezifisch war, kultiviert wurden, entwickelten sich die typischen gemischten oder hämatopoetischen Kolonien für Vorläufer roter und weißer Blutkörperchen (CFU-GM und BFU-E), die mit CD45-positiven hämatopoetischen Vorläuferzellen vergleichbar sind (Beispiel 9).
Wenn andererseits in Bezug auf CD14 abgereicherte mononukleäre Zellen des Nabelschnurbluts in glucosereichem Medium kultiviert werden, zeigen sie die typischen Merkmale von neuralen Stammzellen. 7 zeigt eine Mikrophotographie von USSC-Zellen nach neuronaler Induktion. USSCs der Erfindung, die in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit hoher Glucosekonzentration kultiviert wurden, zeigen eine astrocytenartige Morphologie. 7 zeigt ein Beispiel für solche kultivierten Zellen, die eine gliale Morphologie zeigen und nach 13 Tagen in Kultur erhalten wurden (Beispiel 6). Nachdem sie mit PEI expandiert wurden, exprimieren USSCs den Marker neuraler Stammzellen Nestin. Eine erste Beobachtung weist darauf hin, dass die Nestinfärbung weniger ausgeprägt ist, nachdem die Zellen mit neuralen Induktionsmitteln wie Retinoidsäure (RA), basischem Fibroblastenwachstumsfaktor bFGF und Nervenwachstumsfaktor β (NGF-β) stimuliert wurden (McKay, 1997).
Im Einzelnen zeigt 8 USSCs der Erfindung, die den Marker neuraler Stammzellen Nestin exprimieren. (A) USSCs wurden 7 Tage lang in H5100/PEI-Medium inkubiert und einer Standard-Anti-Nestin-Immunhistochemie unterzogen. (B) Zellen wurden 7 Tage lang in H5100/PEI inkubiert, und dann folgten 9 Tage Induktion in H5100 mit RA, bFGF und NGF. Man beachte, dass die Nestinfärbung im Vergleich zu Zellen, die unter den Bedingungen in (A) gezüchtet wurden, reduziert ist.
Die weitere Analyse dieser Zellen zeigt auch die Expression von Proteinen, die für neurale Zellen charakteristisch sind, wie γ-Aminobuttersäure (GABA, 9B), Tyrosin-Hydroxylase (9B), Synaptophysin (9D), Neurofilament (9F), oder von typischen Glia-Antigenen, wie Galactocerebrosid (GalC, 10B) und gliales fibrilläres saures Protein (GFAP, 10D). 9 zeigt USSCs der Erfindung, die Zellen des neuronalen Zellstammbaums erzeugen. USSCs der Erfindung wurden 7 Tage lang in H5100/PEI gezüchtet und 27 Tage lang auf H5100 gehalten, das RA, bFGF und NGF enthielt. Nach Standardfixierungsvorschriften wurden neuronal-spezifische Antikörper angewendet. (A, C, D) Phasenkontrastphotos, (B, D, F) Fluoreszenzphotos derselben Präparate wie in A, C, D. Das DNA-Färbemittel DAPI (blau) wird verwendet, um den Zellkern anzufärben. (B) Doppelimmunfluoreszenzphoto bei Verwendung von Anti-GABA (rot) und Anti-Tyrosin-Hydroxylase (TH, grün). (D) Anti-Synaptophysin-Färbung (grün). (F) Eine neuronspezifische Anti-Neurofilament-Färbung ist gezeigt (rot). Ein Cocktail von Antikörpern gegen verschiedene Untertypen von Neurofilament wurde verwendet. 10 zeigt USSCs der Erfindung, die Zellen des glialen Zellstammbaums erzeugen. Die Zellen wurden denselben Zellkulturbedingungen unterzogen, wie sie in 9 gezeigt sind. DAPI ist blau. (A, C) Darstellung von Phasenkontrastphotos. (B) Dieselben Zellen wie in (A), die einer Anti-GalC-Immunfärbung unterzogen wurden (rot). (D) Dieselbe Zelle wie in (C), die mit dem Anti-Gliales-Fibrilläres-Saures-Protein(GFAP)-Antikörper angefärbt sind (rot).
Wenn die oben beschriebenen universellen Stammzellen jedoch aus einer der Expansionspassagen entnommen und unter DAG (Dexamethason, Ascorbinsäure, β-Glycerinphosphat) enthaltenden Kulturbedingungen oder in fibronektinhaltigem Medium induziert werden, wird eine Differenzierung entlang des osteogenen Zellstammbaums induziert (Beispiel 3). Wie in Tabelle 2 gezeigt ist, werden knochenspezifische Markergene (Alkalische Phosphatase, Osteocalcin, Collagen Typ I) leicht induziert und sind durch RT-PCR nachweisbar.
Tabelle 2: RT-PCR-Analyse während der osteogenen Differenzierung von USSCs.
Alle drei Markergene der osteogenen Differenzierung zeigen am 7. Tag der DAG-Induktion eine erhöhte mRNA-Expression. β-Actin dient als positive Kontrolle.
11 zeigt die Bildung von mineralisierten Knötchen nach osteogener Induktion und nach Anfärbung mit Alizarinrot (B). Die osteogene Differenzierung von fast konfluenten USSC-Schichten wurde durch die Zugabe von Dexamethason, Ascorbinsäure und β-Glycerinphosphat zum Kulturmedium H5100 induziert. Am 10. Tag der Stimulierung treten charakteristische Knochenknötchen auf (11A). Die Mineralabscheidung dieser Knötchen kann durch Anfärben mit Alizarinrot nachgewiesen werden (11B). Unter diesen osteogenen Induktionsbedingungen unterliegen die Zellen der Erfindung einer vollständigen osteogenen Differenzierung, was durch die Anhäufung von mineralisiertem Knochen in eigenen Knötchen (11A), die mit Alizarinrot angefärbt werden können (11B), nachgewiesen wird. Alternativ dazu kann auch die Anhäufung von Hydroxyapatit in der Zellkultur nach sechs Tagen durch von-Kossa-Färbung nachgewiesen werden.
Aus diesen Ergebnissen geht hervor, dass Nabelschnurblut eine bisher noch nicht nachgewiesene sehr frühe Stammzelle enthält, die zu großen Mengen expandiert werden kann. Außerdem kann bei dieser Zelle eine Differenzierung zu MSCs und von dort aus zu Osteoblasten induziert werden, wie bereits in 11A gezeigt ist. Nach einer vollständigen Induktion mit DAG kann eine weitere Differenzierung zu mineralisierten Knochenknötchen erhalten werden, wie in 11B mit Alizarinrotfärbung gezeigt ist.
Die Vielseitigkeit der Zellen dieser Erfindung ist noch größer, was durch die chondrogene Differenzierung nach Kultivierung in DMEM mit hoher Glucosekonzentration, das Dexamethason, Prolin, Natriumpyruvat, ITS + Premix und TGF-β1 enthält, gezeigt wird (Johnstone et al., 1998). Am Tag 0 und 14 dieser Differenzierungsexperimente wurden Zellen geerntet und durch RT-PCR analysiert (Tabelle 3, Beispiel 4).
Tabelle 3: RT-PCR-Analyse während der chondrogenen Differenzierung von USSCs
Am Tag 14 der chondrogenen Stimulation werden drei charakteristische Markergene einer im Gange befindlichen Chondrogenese exprimiert.
Die Ergebnisse dieser Studien zeigen eindeutig die Hochregulierung von Cart-1, eines spezifischen chondrogenen Transcriptionsfaktors, 14 Tage nach der chondrogenen Stimulierung. Weiterhin wurden auch mRNA-Transcripte für zwei typische extrazelluläre Knorpelproteine (Collagen Typ II und Chondroadherin) hochreguliert. Weiterhin erzeugten die Zellen dieser Erfindung eindeutig extrazelluläre Proteoglycanmoleküle, die für die chondrocytische Differenzierung typisch sind, wie durch Alcianblaufärbung gezeigt wird. 12 zeigt die Alcianblaufärbung einer von USSC abgeleiteten Pellet-Kultur. USSCs wurden unter Sedimentationskultur in einem chondrogenen Differenzierungsmedium gezüchtet. Nach 6 Tagen in Induktionsmedium sind keine signifikanten Mengen an Proteoglycanen (PG) als charakteristische Marker der chondrogenen Differenzierung mehr durch Alcianblaufärbung nachweisbar (Bild A). Dagegen sind PGs leicht nachweisbar, wie durch die blau/grüne Farbe angezeigt wird (Bild B).
Weiterhin konnte die Anwesenheit des knorpelspezifischen Collagen Typ II auf dem Proteinniveau nachgewiesen werden. 13: Färbung auf Collagen Typ II (grün) bei USSC-Kulturen nach chondrogener Differenzierung.
USSCs wurden in einem chondrogenen Differenzierungsmedium kultiviert. Die Expression des extrazellulären Matrixproteins Collagen Typ II am 14. Tag wurde durch Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung eines primären Anti-Collagen-Typ-II-Antikörpers und eines sekundären FITC-Anti-Maus-Antikörpers nachgewiesen (13B).
Die weitere Vielseitigkeit der unrestringierten Stammzelle wird hier anhand der Differenzierung solcher zuvor unter der PEI-Kontrolle expandierter Kulturen zu Fettzellen mit höheren Konzentrationen an Dexamethason gezeigt (Beispiel 5).
14 zeigt Fettzellen, die mit Ölrot (Sigma) spezifisch angefärbt werden können. Adipocyten sind durch eine große Menge an intrazellulären Vesikeln und eine spezifische Rotfärbung mit Ölrot gekennzeichnet.
Weiterhin zeigen USSCs, wenn die 24 h lang in H5100 mit 10 μM 5'-Azacytidin und anschließend mit 100 ng/ml bFGF kultiviert werden, starke Anzeichen einer Muskeldifferenzierung. Eine Änderung der Zellmorphologie geht mit der Expression von langsam wirkendem Myosin einher (15 und 16).
Außerdem wird bei späteren Passagen regelmäßig das Auftreten und die Vermehrung von typischen ovalen Zellen beobachtet (17), wenn PEI-induzierte USSCs aus der CD34-positiven Subpopulation subkloniert werden, was in 6 gezeigt ist (Beispiel 8). Diese Zellen exprimieren in unterschiedlichem Ausmaß das Enzym Dipeptidyl-Peptidase IV, was bedeutet, dass solche ovalen Zellen weiter zu Leberzellen differenzieren können.
In-vitro-expandierte USSCs überleben und überdauern nach einer Injektion in regenerierende Lebern von SCID-Mäusen mit 50%-iger partieller Hepatektomie sowie nichthepatektomisierte Lebern, während von Nabelschnurblut abgeleitete mononukleäre Zellen auch dann nicht nachgewiesen werden können, wenn 25-mal höhere Zellzahlen transplantiert werden. 18 zeigt das Überleben und die Integration von USSC-Kulturen nach der Injektion in SCID-Maus-Leberparenchym. 18A: Eine rote Fluoreszenz 7 Tage nach der Transplantation zeigt das Überleben und die Integration von humanen PKH26-markierten USSCs der Erfindung in das Mauslebergewebe an (ohne Hepatektomie). Dagegen war nach der Transplantation von aus Nabelschnurblut stammenden mononukleären Zellen (MNCs) keine rote Fluoreszenz, die die Integration von humanen MNCs anzeigen würde, nachweisbar. 18B: Kryoschnitt von Mauslebergewebe, das A entspricht: Durchlicht-Mikrophotographie von Mauslebergewebe mit integrierten humanen USSCs.
Da die Vorläufer von Leberzellen und β-Inselzellen des Pankreas identisch sind, können solche von CB abgeleiteten ovalen Zellen auch zu insulinproduzierenden β-Inselzellen differenziert werden, was sie zu nützlichen Werkzeugen für die Zelltherapie bei Diabetikern oder bei Patienten mit Leberversagen macht.
Außer diesen offensichtlichen klinischen Anwendungen können beliebige der wohlcharakterisierten und unter standardisierten Bedingungen expandierten Stammzellkomponenten und ihrer Nachkommen verwendet werden, um Wirkungen und molekulare sowie zelluläre Auswirkungen von neu entwickelten pharmakologischen Mitteln zu überwachen und zu definieren und somit auch an die Stelle bestimmter Tierversuche zu treten.
Diese gut standardisierten Stammzellen und differenzierten Zellen, die aus den hier beschriebenen humanen Nabelschnurblutkulturen stammen, können also als wertvolles Testreagens für die pharmazeutische Industrie und Biomaterialindustrie verwendet werden.
USSC-Präparate entwickelten unter geeigneten Kulturbedingungen mehrfache Kolonien von verschiedenen hämatopoetischen Zellstammbäumen, was beweist, dass diese Zellen zur Hämatopoese führen können.
In einem zweckmäßig konditionierten Kulturmedium mit definierten Konzentrationen von VEGF, Fit 3L, SCGF (Stammzellen-Wachstumsfaktor) und in Methylcellulose entwickeln solche Zellen gemischte Kolonien mit Zellen, die auch positiv in Bezug auf die Marker FLK1 und AC133, Tie1 und Tie2 sind. Nach weiterer Differenzierung entwickelte sich ein Markerprofil, das für Endothelzellen charakteristisch war, die negativ in Bezug auf AC133 und positiv in Bezug auf CD31, CD54, vWF und VE-Catherin sind.
Die offensichtliche Nützlichkeit solcher Endothelzellen für die in-vitro-Zucht von autologen und allogenen Blutgefäßen für die Therapie von Gefäßkrankheiten wird hier beansprucht.
Gleichzeitig ist klar, dass all diese in vitro erzeugten und homogen expandierten Vorläufer und deren differenzierte Zellen auf klonaler Ebene als äußerst wichtige Werkzeuge für die Definition der Rolle spezifischer Gene und ihrer Produkte in der Zellbiologie und bei allen folgenden medizinischen Anwendungen auf der Grundlage von zell- oder molekülvermittelten Therapien dienen werden.
Bereits eine kleine Zahl dieses einzigartigen Zelltyps ist ausreichend, um eine große Zahl von adhärent wachsenden USSCs der Erfindung und die stärker differenzierte Mesenchymstammzelle für die Produktion von medizinisch anwendbaren regenerativen Zelltypen zu erzeugen.
Ein völlig neuer Aspekt dieses Wissens ist die Tatsache, dass sich solche Vorläufer asymmetrisch zu zwei oder mehr unterschiedliche differenzierenden Zelltypen entwickeln können. Dies zeigt ein neues biologisches Prinzip der Cokomponentenregulation bei der funktionell orientierten Zellregeneration, die sogar in vitro stattfindet.
Die Konsequenz dieser Erfindung ist, dass auf Stammzellen beruhende Therapeutika nach diesem Prinzip hergestellt werden müssen und nicht nur aus einem klonalen Zelltyp bestehen.
Beispiel 1
Sammlung von Nabelschnurblut (CB)
Die Sammlung von Nabelschnurblut in den Entbindungsstationen erfolgte mit Einverständniserklärung der Mutter. Nach der Geburt des Babys, wobei sich die Plazenta noch in der Gebärmutter befand, wurde die Nabelschnur doppelt abgeklemmt und in einer Entfernung von 7-10 cm vom Nabel durchschnitten. Nach einer Desinfektion der Nabelschnur wurde die Nabelvene punktiert, und CB wurde in Sammelbeutel aufgefangen, die Citrat/Phosphat/Dextrose (CPD) als Antikoagulans enthielten.
Isolierung von mononukleären Zellen aus Nabelschnurblut
Nabelschnurblut wurde vorsichtig auf Ficoll-Lösung (Dichte 1,077 g/cm³) geladen. Eine Dichtegradientenzentrifugation wurde durchgeführt (450 g, Raumtemperatur, 25 min). Die mononukleären Zellen (MNC) der Interphase wurden aufgefangen und zweimal in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH 7,3 (PBS), gewaschen.
Erzeugung von adhärenten Schichten mit Fibroblastoid-Morphologie Mononukleäre Zellen wurden in einer Dichte von etwa 5 × 10³ Zellen/cm² in T25-Kulturkolben (Nunclon) ausgestrichen [A.), B.), C.)]. Vier verschiedene Kulturverfahren wurden verwendet, um das Wachstum von adhärenten Stammzellen einzuleiten:

A.) Aus CB stammende MNCs wurden anfangs in Myelocult-H5100-Medium (StemCell Technologies, Vancouver/Kanada), das 10^–7 M Dexamethason enthielt, kultiviert.
B.) Aus CB stammende MNCs wurden anfangs in Mesencult (StemCell Technologies, Vancouver/Kanada), das 10^–7 M Dexamethason enthielt, kultiviert.
C.) Aus CB stammende MNCs wurden anfangs in DMEM mit wenig Glucose (Bio-Whittaker) mit 30% FCS, das 10^–7 M Dexamethason enthielt, kultiviert.
D.) Aus CB stammende MNCs wurden in einer Dichte von 5 × 10⁶/ml in 10 ml Myelocult-H5100-Medium (StemCell Technologies, Vancouver/Kanada) in 50-ml-Kulturkolben (Nunclon) ohne Dexamethason ausgestrichen.

Alle Kulturen wurden bei 37 °C in 5% CO₂ in einer vollbefeuchteten Atmosphäre inkubiert und einmal pro Woche gefüttert, indem man das vollständige Medium mit den nichtadhärenten Zellen entfernte und 10 ml frisches Medium hinzufügte. Nach mehreren Zeitpunkten wurden die adhärenten spindelförmigen Zellen durch 2 min Behandlung mit 0,05% Trypsin und 0,53 mM EDTA entfernt, mit 50% Serum enthaltendem Medium gespült, durch Zentrifugation mit 780 × g gewonnen und mittels Durchflusscytometrie oder RT-PCR analysiert. Nach zwei bis drei Wochen treten adhärente Zellen mit Fibroblastoid-Morphologie in etwa 30% aller Zellkulturen auf.
Kulturbedingungen für die Expansion von USSCs der Erfindung
USSCs der Erfindung können in H5100-Medium, das 10 ng/ml IGF I (insulinartiger Wachstumsfaktor I), 10 ng/ml PDGF-BB (Blutplättchen-Wachstumsfaktor-BB) und 10 ng/ml rh-Human-EGF (rekombinanter humaner Epidermis-Wachstumsfaktor) enthält (PEI-Medium), in einer Dichte im Bereich von 1 × 10⁴ und 1 × 10⁵ Zellen/ml expandiert werden (Expansionsverfahren A). Alternativ dazu können USSC-Präparate auch im Anfangswachstumsmedium A, B und C expandiert werden.
Beispiel 2
Immunophänotypbestimmung der Zellen durch Cytofluorometrie
Um den Immunophänotyp von USSCs zu bestimmen, wurden Zellen mit FITCkonjugiertem Anti-CD45 (Becton Dickinson, Coulter), PE-konjugiertem Anti-CD14 (PharMingen, Coulter), Anti-SSEA-4 (MC-813-70), markiert mit Ziegen-F(ab')₂-Anti-Maus-IgG+IgM-(N+L)-FITC (Coulter), Anti-CD10-PE (CALLA, PharMingen), Anti-HLA-Klasse I (Coulter), markiert mit Ziegen-F(ab')₂-Anti-Maus-IgG+IgM-(H+L)-FITC, Anti-CD13-PE (Becton Dickinson, Coulter), Anti-CD29 (Coulter), Anti-CD44 (Coulter), Anti-CD49e (Coulter), Anti-CD90 (Coulter), Anti-HLA-Klasse-II-FITC (Coulter) angefärbt. Die Zellen wurden unter Verwendung eines EPICS XL (Coulter) oder eines FACS-Analysators (Becton Dickinson) analysiert.
Beispiel 3
Nachweis des osteogenen Differenzierungspotentials von USSCs
USSCs, die erhalten wurden, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, wurden in einem Standardmedium kultiviert, bis sie 70% Konfluenz erreichten. Die osteogene Differenzierung dieser Zellen wurde durch die Zugabe von 10^–7 M Dexamethason, 50 μg/ml Ascorbinsäure und 10 mM β-Glycerinphosphat induziert (Bruder et al., 1994, Jaiswal et al., 1997). Am 10. Tag nach der Stimulie rung zeigten die Zellen Calciumphosphatablagerungen, die zu Knochenknötchen führten. Mineralisierte Knochenknötchen wurden wie folgt durch Anfärbung mit Alizarinrot nachgewiesen: Die adhärenten Zellen in Kultur wurden zweimal mit PBS, pH 7,3, gewaschen und eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit 5 ml 0,1% Alizarinrotlösung gefärbt und anschließend mit 0,1% Essigsäure und absolutem Ethanol sowie PBS behandelt. Alizarinrot- und von-Kossa-Färbung von Calcium beweisen das Mineralisierungspotential dieser Zellen (Stanford et al., 1995, Rungby et al., 1993). Die osteogene Differenzierung wurde auch durch RT-PCR unter Verwendung der knochenspezifischen Differenzierungsmarker Osteocalcin (OC), Osteopontin (OP), knochenspezifische Alkalische Phosphatase (AP), Knochensialoprotein (BSP), Blutplättchen-Wachstumsfaktor-Rezeptor α (PDGF-Ra), Epidermiswachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) und Collagen Typ I nachgewiesen.
Beispiel 4
Nachweis des chondrogenen Differenzierungspotentials von USSCs
Für die chondrogene Differenzierung wurden 2 × 10⁵ adhärente Stammzellen in Sedimentationskultur in 15 ml Polypropylenröhrchen gegeben. DMEM mit hoher Glucosekonzentration, das Dexamethason, Prolin, Natriumpyruvat, ITS + Premix sowie TGF-β1 enthielt, wurde als Zellkulturmedium verwendet (Johnstone et al., 1998, Yoo et al., 1998). Am 7., 14. und 22. Tag wurden Zellfraktionen durch RT-PCR in Bezug auf die knorpelspezifischen Genprodukte Cart-1, Collagen Typ II und Chondroadherin analysiert. Außerdem wurden die USSCs in Sedimentationskulturen verwendet. Nach zwei Wochen wurden Dewax-Schnitte 15 min lang bei Raumtemperatur mit 4% Paraformaldehyd fixiert und in Ethanol gewaschen. Die Schnitte wurden 5 min lang in 1% Alcianblau/3% Essigsäure, pH 2,5 (Sigma), angefärbt und in destilliertem Wasser gewaschen. Sie zeigen eindeutig eine positive Anfärbung spezifischer Proteoglycane, was durch Alcianblau-Färbung bewiesen wird (12) (Chao, G. et al., 1993). Nach einer chondrogenen Induktionszeit von 14 Tagen wurden die Zellen gemäß einer Standardvorschrift fixiert und durch Fluoreszenzmikroskopie analysiert (Rosenbaum et al., 1998), was die Anwesenheit einer Collagen-Typ-II-spezifischen extrazellulären Matrix beweist (13B).
Beispiel 5
Nachweis des adipogenen Differenzierungspotentials von USSCs
USSCs wurden in H5100 kultiviert, das 10^–6 M Dexamethason, 50 μg/ml Ascorbinsäure und 10 mM β-Glycerinphosphat enthielt, was zu einer partiellen Differenzierung von USSCs zu Adipocyten führt, was durch Ölrotfärbung nachgewiesen wurde (Ramirez Zacarias et al., 1992).
Beispiel 6
Nachweis des neurogenen Differenzierungspotentials von USSCs
Zellisolierung und Kulturbedingungen für Gliazellen
Mononukleäre Zellen aus Nabelschnurblut, die gemäß der obigen Beschreibung erhalten wurden, wurden durch ein CD14/Magnetic-Activated-Cell-Sorting-(MACS)-Isolierungssystem unter Verwendung von VS+-Trennsäulen nach den Anweisungen des Herstellers (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach) in Bezug auf CD14-positive Zellen abgereichert. Die in Bezug auf CD14 abgereicherten mononukleären Zellen wurden in einer Dichte von 2 × 106 Zellen/ml in 10 ml High Glucose Medium (Dulbeccos MEM mit 4500 g/l Glucose) in T25-Kulturkolben (Nunclon) kultiviert und bei 37 °C in 5% CO₂ in einer vollbefeuchteten Atmosphäre inkubiert. Nach 10-15 Tagen in Kultur wurden gliaförmige Zellen nachgewiesen.
Differenzierung zu neuralen Zellen
A) Zellen wurden 7 Tage lang entweder in H5100-Medium allein oder in Gegenwart von 40 pg/ml PDGFB, 10 pg/ml EGF, 10 pg/ml IGF-1 expandiert. Die Zellen wurden trypsinisiert und in einer Dichte von etwa 3,5 × 10³ Zellen/cm² in 24- Napf-Kulturschalen auf Deckgläschen, die mit Poly-D-lysin (PDL) und Laminin beschichtet waren (PDL/lam), ausgestrichen. Anschließend wurde die neuronale Differenzierung durch Zugabe von Induktionsmitteln, wie all-trans-Retinoidsäure (10^–5 M), bFGF (20 ng/ml) und NGF-β (50 ng/ml) eingeleitet.
Fluoreszenzmikroskopie
Nach der Induktionszeit (27 Tage) wurden die Zellen nach einer Standardvorschrift (Rosenbaum et al., 1998) fixiert und mit Antikörpern gegen neurale spezifische Antigene angefärbt. Proben wurden mit Hilfe von Fluoreszenz- und Durchlichtmikroskopie analysiert.
Beispiel 7
Nachweis des Differenzierungspotentials im myocytischen Zellstammbaum
1 × 10⁴ USSCs wurden in H5100-Medium (StemCell Technology), das mit 10 ng/ml PDGFBB, 10 ng/ml EGF, 10 ng/ml IGF ergänzt war, bei 37 °C und 5% CO₂ kultiviert, bis sie etwa 70% Konfluenz erreichten. Danach wurden die Zellen 24 h lang mit 10 μM 5'-Azacytidin (Sigma) inkubiert, zweimal mit PBS gewaschen und in H5100-Medium, das mit 100 ng/ml bFGF (Sigma) ergänzt war, kultiviert. Nach 1 Woche in Differenzierungsmedium änderte sich die Morphologie der Zellen (15). Nach 10 Tagen wurden die Zellen trypsinisiert und zur Immunfärbung auf einen Fibronektin-beschichteten Glaskammer-Objektträger übertragen.
Immunhistochemie
Zellen wurden 15 min lang mit 5% Formaldehyd/PBS fixiert und zweimal in PBS, pH 7,3, gewaschen. Unter Verwendung einer Standardvorschrift wurden die Zellen mit einem Anti-Skelett-Myosin(langsam)-spezifischen primären Antikörper (Klon NOQ7.5.4D, 1:400) (in Grün gezeigt) und mit primärem Anti-CD13-Antikörper (in Rot gezeigt) oder einem monoklonalen primären Anti-Skelett- Myosin-Antikörper (Klon MY-32, 1:4000) inkubiert. Die Färbung war bei USSCs, die unter den obigen Kulturbedingungen kultiviert wurden, positiv (16).
Beispiel 8
Humane USSC-Zellen sowie aus Nabelschnurblut stammende mononukleäre Zellen (MNC) wurden mit dem PKH26 RED Fluorescent Cell Linker Kit (Sigma, PKH26-GL) markiert. 2 × 10⁵ USSCs und 5 × 10⁶ MNCs wurden in das Leberparenchym von SCID-Mäusen mit und ohne 50% Hepatektomie injiziert. 7 Tage nach der Transplantation wurde bei den hepatektomisierten Tieren eine vollständige Leberregeneration erreicht. Das Lebergewebe wurde durch Fluoreszenzmikroskopie anhand von Kryoschnitten in Bezug auf die Anwesenheit von rot markierten humanen Zellen analysiert (18).
Beispiel 9
Nachweis des Differenzierungspotentials von USSC zum hämatopoetischen Zellstammbaum
Drei verschiedene USSC-Präparate (USSC^KCB55 in DMEM-Medium, das 30% FCS enthält, USSC^KCB12 in H5100-Medium, das Dexamethason enthält, USSC^KCB13 in MesenCult-Medium, das Dexamethason enthält, und USSC^GK12 in H5100-Medium, das PEI enthält), die längere Zeit (Passage 5 bis 8) in einem geeigneten Expansionsmedium wuchsen, wurden in 250 μl (2 × 10⁴ bis 2 × 10⁵ Zellen) Zellsuspension in dreifachen Parallelansätzen in 24-Napf-Platten in hämatopoesespezifischem Kulturmedium (Methocult 4434) ausgesät. Kolonien von mehr als 50 Zellen wurden gezählt und im Einklang mit etablierten Kriterien als abgeleitet von Granulocyten/Makrophagen (CFU-GM), frühen Erythroiden (BFU-E) oder multipotenten (CFU-GEMM) Vorläuferzellen klassifiziert. Die Koloniebildung in verschiedenen Kulturen war ab 1 Woche Beobachtung und unter Differenzierungsbedingungen noch bis zu 3 Wochen lang sichtbar. USSC-Präparate entwickelten mehrfache Kolonien von verschiedenen Zellstammbäumen, was beweist, dass diese Zellen zu einer Hämatopoese führen können.
Beispiel 10
Molekulare Verfahren zur Analyse von unrestringierten somatischen Stammzellen und den daraus folgenden Differenzierungsprodukten
PCR-Primer für die Amplifikation von spezifischen cDNA-Sequenzen aus Osteocalcin, Osteopontin, Knochensialoprotein, Alkalischer Phosphatase, PDGFRα und EGF-Rezeptor wurden aus unterschiedlichen jeweiligen Exons ausgewählt, um die in Bezug auf die Größe der jeweils erzeugten DNA-Fragmente unterscheiden zu können.
Durch Klonieren in den pCRL1-Vektor (Invitrogen/USA) und anschließende Transformation des E.-coli-Stamms TOP 10F wurden die jeweiligen spezifischen cDNA-Klone erhalten und durch zyklische Sequenzierung mit einem automatischen Sequencer (Applied Biosystems) charakterisiert.
RT-PCR-Reaktionen wurden in einem zweistufigen Verfahren durchgeführt. Zuerst werden 200 ng Gesamt-RNA der Zellen 1 h lang bei 50 °C einer reversen Transcription mit 10 E AMV-Reverser-Transcriptase (Promega, Mannheim), 1,5 pmol 3'-genspezifischen Primern, 1 mM dNTPs und dem gelieferten Puffer (Promega, Mannheim) in einem Volumen von 20 μl unterzogen. Die PCR-Reaktion wurde mit 2 μl der cDNA mit 1 E HotStarTaq-DNA-Polymerase, Puffer und Q-Lösung (Qiagen, Hilden), 1,5 mM dNTPs und 20 pmol 3'- und 5'-genspezifischem Primer durchgeführt. Die PCR-Reaktion wurde mit einem Einleitungsschritt von 15 min bei 95 °C, 37 Zyklen von 30 s bei 94 °C, 30 s bei 56 °C, 1 min bei 68 °C und einem letzten Polymerisationsschritt von 5 min bei 68 °C durchgeführt.
Tabelle 4: PCR-Primer für die Amplifikation von spezifischen cDNA-Sequenzen
Die Tabelle zeigt die 5'- und 3'-Primersequenzen der untersuchten Gene und die erwartete Länge des PCR-Fragments in bp
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Abkürzungen

DAG

osteogenes Differenzierungsmedium, das Dexamethason, Ascorbinsäure und β-Glycerinphosphat enthält

HLA

Human-Leukocyten-Antigen

MSC

mesenchymale Stammzelle

PEI

Medium, das PDGF-BB, EGF und IGF enthält

SSEA4

stadiumspezifisches frühes Antigen 4

USSC

unrestringierte somatische Stammzelle

PG

Proteoglycane

Claims

Verwendung von unrestringierten somatischen Stammzellen (USSC) zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Gefäßkrankheit, Herzkrankheit oder Krankheit der glatten Muskulatur, Leberkrankheit, Diabetes mellitus Typ 1, neuralen Krankheit, Parkinson-Krankheit oder hämatologischen Krankheiten, wobei die USSCs aus Nabelschnurblut, Plazentablut oder Blutproben von Neugeborenen isoliert werden und: (i) negativ bezüglich CD45- und CD14-Oberflächenantigenen sind; (ii) positiv bezüglich CD13-, CD29-, CD44- und CD49e-Antigenen sind; (iii) YB1, AML-1, RUNX-1 und Fibulin-2 exprimieren; und (iv) Hyaluron-Synthase, Fibromodulin und 1NFLS nicht exprimieren.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Medikament weiterhin in vitro differenzierte Nachkommen der USSCs umfasst.