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Hintergrund der Erfindung
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Biochemisch
aktive Substanzen, insbesondere niedermolekulare Substanzen, haben
während
der letzten Jahre zunehmende Bedeutung als analytische Spezies bekommen.
Kurze Peptidsequenzen, die immundominante, lineare Epitope von Proteinantigenen
substituieren, finden Anwendung als immobilisierte Sonden in miniaturisierten
und parallelisierten immunologischen Analysetechniken. In vergleichbaren
Formaten werden immobilisierte Peptide für die hochparallele Identifizierung
von Enzymsubstraten und Inhibitoren sowie für die Ermittlung potentieller
Proteinliganden in der Wirkstoffforschung verwendet. Der Einsatz
von DNA- und RNA-Sonden in verschiedensten Anwendungen gewinnt ebenfalls
zunehmend an Bedeutung. Kohlenhydrate werden in immobilisierter
Form für
Studien kohlenhydratvermittelter molekularer Abläufe verwendet, niedermolekulare
organische Substanzen aus kombinatorischen Chemiebibliotheken werden
in Mikroarray-Formaten für
die Selektion von Proteinliganden und pharmazeutischen Wirkstoffen
eingesetzt.
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In
vielen Anwendungen können
diese Moleküle,
z. B. Peptide und Kohlenhydrate, aus Makromolekülen abgeleitet werden und die
biochemische Funktion ihres Herkunftsmoleküls ersetzen. Besondere Vorteile niedermolekularer
Substanzen für
den Einsatz in der Bioanalytik ergeben sich aus den folgenden Umständen: (i)
Anders als Makromoleküle,
z. B. Proteine, lassen sich viele dieser Substanzen mit etablierten
Verfahren synthetisch und besonders wirtschaftlich herstellen. (ii)
Niedermolekulare Substanzen erweisen sich häufig als chemisch und physikalisch
besonders resistent gegenüber äußeren Einflüssen. (iii)
Durch die synthetische Herstellung lassen sich die Moleküle definiert
mit ungewöhnlichen
oder nicht natürlichen
Resten versehen, die im weiteren Verlauf bestimmte Funktionen, z.
B. bei der gerichteten Kopplung oder der biochemischen Aktivität, übernehmen.
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In
vielen Anwendungen solcher niedermolekularen Substanzen ist deren
Kopplung als Liganden an makromolekulare Strukturen, z. B. an Trägerproteine
oder immobilisierende Oberflächen,
vorteilhaft. Die Kopplung der Liganden an Trägermoleküle führt zu einer räumlichen
Struktur und folglich zu einer Vergrößerung der Oberfläche, auf
der die Liganden präsentiert
werden können.
Darüber
hinaus können
die Trägermoleküle als Vermittler
oder Verstärker
der biologischen Funktion des Liganden eine Rolle spielen. Eine
solches Beispiel ist die Kopplung von niedermolekularen Antigenen,
sog. Haptenen, an Trägermoleküle zur Erhöhung der
Antigenität
aus dem Bereich der molekularen Immunologie. Die Immobilisierung
von niedermolekularen Molekülen,
z. B. Analyten oder spezifischen Bindungspartnern dafür, an Oberflächen bietet
z. B. Vorteile bei der Abtrennung von nicht umgesetzten Reaktanden,
Verunreinigungen oder Lösungsmitteln.
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Die
Kopplung niedermolekularer Substanzen an Träger oder immobilisierende Oberflächen, insbesondere
für deren
Einsatz als biologische Sonden, geschieht vorzugsweise selektiv
und gerichtet. Im Fall von niedermolekularen Liganden mit biologischer
Aktivität,
z. B. Peptiden und Kohlenhydraten, trägt in der Regel ein hoher Anteil
der funktionellen Gruppen des Liganden zu dessen biologischer Aktivität bei. Aus
diesem Grund führt
die ungerichtete Kopplung solcher Moleküle häufig zu einer Modifikation
der funktionellen Gruppen und zwangsläufig zu einer Beeinflussung
bis hin zum Verlust der biologischen Aktivität. Die gerichtete Kopplung über selektive
Rektionsmechanismen vermeidet dieses Problem: Ligand und Trägermatrix
besitzen wechselseitig reaktive, bioorthogonale Linkerfunktionen
oder werden synthetisch mit diesen ausgestattet, die im nächsten Schritt
selektiv miteinander reagieren können
und zu stabilen Konjugaten oder Komplexen führen. Als bioorthogonal werden
solche Funktionen bezeichnet, die sich unreaktiv gegenüber den übrigen Funktionen der
(bio)chemischen Umgebung verhalten. Die nativen funktionellen Gruppen
der biologischen Moleküle
bleiben daher bei einer solchen Reaktion unbeeinflusst.
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Die
im Stand der Technik bekannten Analyseverfahren, bei denen niedermolekulare
Analyten als Liganden an Trägermoleküle gekoppelt
oder auf Oberflächen
immobilisiert werden, weisen trotz der oben genannten Vorteile dieser
Kopplungstechniken immer noch gewisse Nachteile auf. Beispielsweise
ist die Bindungskapazität
der Trägermatrices
oft nicht sehr hoch und damit die Sensitivität des jeweiligen Analyseverfahrens
nicht befriedigend. Ferner ist die direkte Kopplung von niedermolekularen
Liganden auf planaren Oberflächen
häufig
mit einer sterischen Behinderung, d. h. einer eingeschränkten Zugänglichkeit
der Liganden für die
Moleküle
in der zu analysierenden Flüssigphase
verbunden. Resultat sind niedrigere Sensitivitäten, bzw. es wird eine Verlängerung
der Analysedauer notwendig, die unter bestimmten Umständen die
sterische Hinderung kompensieren kann.
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WO 00/32813 A1 offenbart
einen Liposomen-Träger
mit nur einer Kopplungsfunktion, bei dem die Vernetzung der Träger und
die Kopplung der Liganden über
die gleiche Biotin-Funktion erfolgt.
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WO 2005/003394 A2 beschreibt
ein Netzwerk aus Trägern
mit einer Nukleinsäure-Kopplungsfunktion, welche
zur Bindung eines Haptens verwendet wird, wobei die Nukleinsäure-Kopplungsfunktion
verbraucht und eine Hapten-Kopplungsfunktion installiert wird.
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Sanchez
et al. (C. R. Chimie 6 (2003), 1131–1151) offenbaren Nanopartikel
als Träger
von polymerisierbaren Funktionen F oder A– die
kovalent (F) oder ionisch (A–) an den Träger gebunden
sind. Die Polymerisationsreaktion erfolgt nach Zugabe weiterer Polymerbausteine,
die jedoch in ihrer Reaktivität
keinen Unterschied zwischen der Polymerisierungsfunktion F und A– machen.
Diese Funktionen können
daher nicht selektiv adressiert werden.
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US 6 800 728 B2 beschreibt
verschiedene Kopplungsgruppen, die für die Reaktion mit einem elektrophilen
Kopplungspartner geeignet sind.
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Der
vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, neue verbesserte
Träger
für den
breiten Einsatz in der Analytik, insbesondere Bioanalytik, bereitzustellen,
mit denen die Handhabung, Kosteneffizienz und Analysesensitivität von solchen
herkömmlichen
Verfahren und Assays zur Analyse von chemischen Substanzen, insbesondere
von niedermolekularen Substanzen mit biochemischer Aktivität, erleichtert
bzw. erhöht
werden kann. Eine damit verbundene Aufgabe ist die Bereitstellung
eines besonders vorteilhaften Verfahrens zur Herstellung solcher
Träger.
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Diese
Aufgaben werden erfindungsgemäß gelöst durch
die Bereitstellung der vernetzbaren bzw. vernetzten multifunktionellen
Träger
mit den Merkmalen der Ansprüche
1–12, deren
Verwendung in der Analytik nach den Ansprüchen 13–21 und die Verfahren zur Herstellung
dieser Träger
nach den Ansprüchen
22–26.
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Beschreibung der Erfindung
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Ein
erfindungsgemäßer Träger besitzt
mindesten zwei verschiedene, zu einander nicht komplementäre selektive
Kopplungs- oder
Linkerfunktionen, die nicht mit dem gleichen Kopplungspartner reagieren
können, wobei
eine erste Kopplungsfunktion zur Kopplung an einen Liganden, vorzugsweise
einen niedermolekularen Liganden, vorgesehen ist und mindestens
eine weitere, davon verschiedene Kopplungsfunktion zur Bindung an
eine immobilisierende Oberfläche
und/oder zur Vernetzung der Träger
untereinander vorgesehen ist.
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Die
Verwendung der erfindungsgemäßen Träger bietet
folgende Vorteile:
Sobald ein Träger mit den benötigten Linkerfunktionen
vorliegt, sind im weiteren Verlauf der Kopplungsreaktionen weder
sequentielle Aktivierungsschritte noch Reinigungsschritte notwendig,
da aufgrund der Selektivität und
Orthogonalität
der Linkerfunktionen alle Reaktanden nebeneinander vorliegen können. Trotz
der Multivalenz des Trägers
besteht keine Gefahr einer unkontrollierten Polymerisationsreaktion.
Die Kopplung von Trägern
und Liganden erfolgt gerichtet über
wechselseitig reaktionsspezifische (komplementäre) Linkergruppen, so dass
keine der nativen funktionellen Gruppen des Liganden durch die Bindung
beeinflusst wird. Nach der Kopplung von Träger und Ligand ist keine Reinigung
der Produkte von überschüssigen Liganden
notwendig, da sich die Linkerfunktion des Liganden unreaktiv gegenüber der
Linkerfunktion der immobilisierenden Oberfläche verhält. Die ungereinigte Produktlösung kann
direkt auf die Oberfläche
appliziert werden und gestaltet sich dadurch verlustfrei und effizient.
Die Oberflächenbindung
findet nur zwischen den Linkerfunktionen der Träger und der Oberfläche statt.
In der Folge werden überschüssige Liganden
bei weiteren Verfahrensschritten einfach weggewaschen.
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Die
niedermolekularen Liganden werden an einen makromolekularen Träger gekoppelt,
wodurch (i) die präsentierende
Oberfläche
vergrößert wird,
(ii) die präsentierende
Oberfläche
eine räumliche
Struktur erhält
und (iii) sich die biochemische Aktivität der Liganden verstärken kann.
Diese Kopplung kann frei in Lösung und
mit einem Überschuss
des Liganden durchgeführt
werden, da die weiteren Linkerfunktionen des Trägers unreaktiv gegenüber der
Linkerfunktion des Liganden sind (siehe oben). Die Kopplung in Lösung läuft in der Regel
schneller und effizienter als auf der Oberfläche ab und ist daher gegenüber der
ebenfalls möglichen
Verfahrensvariante einer Oberflächenreaktion
bevorzugt.
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Ein
besonderer Vorteil der erfindungsgemäßen Träger beruht auf ihrer Vernetzbarkeit
zu dreidimensionalen räumlichen
Strukturen. Diese Vernetzung kann typischerweise durch die Zugabe
von bifunktionellen oder multifunktionellen Vernetzungsreagenzien
oder durch die Mischung von zwei oder mehr verschiedenen Trägerspezies
mit komplementären
Kopplungsfunktionen initiiert werden. Durch die Vernetzung kommt
es zu einer Stabilisierung der gekoppelten Träger und zur Ausbildung eines
dreidimensionalen Netzwerkes mit einem sehr hohen Anteil an Ligandenmolekülen. In
einer speziellen Ausführungsform
sind an der Vernetzung auch oberflächengebundene Träger beteiligt.
Auch hier kommt es zu einer Stabilisierung von oberflächengebundenen
Trägern
und zur Ausbildung eines dreidimensionalen Netzwerks durch Konjugation
von Trägern
in der Flüssigphase
mit denen auf der Oberfläche.
In beiden Fällen
ist die Folge eine erhöhte
Stabilität
und eine erhöhte
Bindungskapazität
der Matrices, welche Effekte wiederum die Analysesensitivität der Assays
erhöhen, in
denen diese Träger
und Matrices eingesetzt werden. Der Begriff „Matrix” wird hier im Sinne einer
dreidimensionalen Struktur mit der Kapazität zur biologischen bzw. biochemischen
Wechselwirkung mit Molekülen
verwendet. Die Oberflächenbindung
einer solchen Matrix ist ein weniger häufiger Fall, aber z. B. in
der Chiptechnologie erforderlich. Wie hier verwendet, bezeichnet
der Begriff „Oberfläche”, an den
die erfindungsgemäßen Träger gebunden
werden können,
eine Oberfläche,
welche den daran gebundenen Träger
immobilisiert, d. h. zu einem Bestandteil einer festen Phase macht.
Die erfindungsgemäßen makromolekularen
Träger
selbst, auch in Form von Partikeln oder Beads, die solubilisiert
oder dispergiert/-suspendiert
in einer Flüssigphase
vorliegen, stellen keine Oberfläche
in diesem Sinne dar.
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Aufgrund
des Verzichts auf Reinigung und Aktivierung gestaltet sich die Reaktion äußerst sparsam und
effizient. Besondere Attraktivität
erhält
die Methode aus der Möglichkeit,
dass Oberflächenbindung
und Vernetzung in situ durchgeführt
werden können
(z. B. im Mikrovolumen). Diese Verfahrenführung verspricht höchste Effizienz
bei minimalen Verbrauchsmengen.
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Die
erfindungsgemäßen selektiven
Kopplungen zwischen Ligand und Träger, Oberfläche und Träger oder zwischen zwei Trägermolekülen können sowohl
kovalenter als auch affiner Natur sein.
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Bei
einer Affinitätskopplung
oder Affinitätsbindung
entsteht eine nicht-kovalente Bindung zwischen zwei Mitgliedern
eines spezifischen Bindungspaares. Einige typische nicht-beschränkende Beispiele
hierfür sind
Biotin/Avidin, Biotin/-Streptavidin,
Antikörper/Antigen,
Rezeptor/Ligand, Lektin/-Saccharid,
DNA/DNA, RNA/RNA, DNA/RNA etc. Weitere geeignete Beispiele sind
dem Fachmann bekannt oder unschwer in der Literatur zu finden. Ein
bevorzugtes und etabliertes System für die affine Kopplung ist die
Biotin-Avidin-Affinität. Avidin
und seine bakteriellen Analoga (z. B. Streptavidin) binden hochspezifisch
Biotin über
Wasserstoffbrücken.
Die Stabilität
der Bindung kommt der einer kovalenten Kopplung sehr nahe.
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Alternativ
kann die Kopplung auf einer kovalenten Bindung zwischen einer spezifischen
reaktiven Gruppe auf dem Träger
und einer damit reaktionsfähigen
komplementären
Gruppe auf dem Liganden oder der Oberfläche oder einem anderen Träger oder
einem Vernetzungsreagenz beruhen.
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Vorzugsweise
handelt es sich bei diesen kovalenten Kopplungsreaktionen um sogenannte
chemoselektive Ligationen. Als chemoselektive Ligationen werden
hochselektive, in vivo kompatible kovalente chemische Reaktionen
bezeichnet. Bei diesem Reaktionstyp werden vorzugsweise Moleküle, z. B.
Biomoleküle, über wechselseitig
reaktive Linkerfunktionen konjugiert. Die Reaktivität der Gruppen
verhält
sich orthogonal zu der Reaktivität
anderer funktioneller Gruppen in den koppelnden Molekülen oder
von anderen Molekülen
in der Umgebung. Die chemoselektive Ligation erlaubt daher auch
die gerichtete kovalente Kopplung ungeschützter niedermolekularer Substanzen
an Trägermatrices
in wässrigen
Lösungsmitteln
und unter physiologischen Bedingungen. Einige nicht-beschränkende Beispiele
für Reaktionstypen,
die hier erfindungsgemäß eingesetzt werden
können,
sind die Reaktion zwischen einer Aminofunktion oder Sulfhydrylfunktion
und einer, vorzugsweise aktivierten, Carboxyfunktion, die Reaktion
von Hydraziden oder Hydrazinen mit elektrophilen Gruppen, z. B.
Carbonylen oder Epoxiden (vgl. Mahal et al., 1997, Science, 276,
1125–1128),
die Reaktion von elektrophilen Gruppen, z. B. Carbonylen, mit Aminooxygruppen,
Thiosemicarbaziden oder Beta-Aminothiolen oder von Thiocarboxylaten
mit Alpha-Halogen-Carbonylen, oder eine Staudinger-Ligation (Nilsson
et al., 2000, Org Lett, 2, 1939–1941)
oder eine 1,3-dipolare Cycloaddition von Aziden und Alkinen (Kolb
et al., 2001, Angew Chem, 113, 2056–2075). Weitere geeignete Reaktionen
können
unschwer vom Fachmann ermittelt werden.
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Als
Kopplungsfunktionen können
entweder natürliche
Funktionen der vorgesehenen Kopplungspartner verwendet werden oder
diese Kopplungspartner (Oberfläche,
Träger,
Liganden) werden in Standard-Konjugationsverfahren über Linker
mit geeigneten Funktionen versehen (vgl. 2A und 2B). Solche Linker werden in der Regel
bifunktionell sein, wobei eine funktionelle Gruppe des Linkers mit
einer funktionellen Gruppe des zu modifizierenden Kopplungspartners
reagieren kann und die zweite funktionelle Gruppe die gewünschte Kopplungsfunktion
bereitstellt. In Abhängigkeit
von den natürlichen
funktionellen Gruppen der Kopplungspartner (bei Peptiden/-Proteinen z. B. Amino-,
Sulfhydryl-, Carboxyfunktionen der Aminosäureseitenketten), die eine
damit reaktionsfähige
Gruppe des Linkermoleküls
erforderlich machen (z. B. eine aktivierte Carboxyfunktion zur Reaktion
mit einer Amino- oder Sulfhydrylfunktion und umgekehrt), und der
Art der gewünschten
Kopplungsfunktionen, z. B. solche, die eine der oben speziell genannten
kovalenten oder nicht-kovalenten Kopplungsreaktionen ermöglichen,
ergibt sich somit ein sehr breites Spektrum an Variationsmöglichkeiten
für solche Linker.
Ein Vielzahl geeig neter Linkerfunktionen, sowohl für kovalente
Kopplungen als auch Affinitätskopplungen,
sind im Handel erhältlich
oder können
im Bedarfsfall unschwer mit chemischen Standardverfahren gewissermaßen maßgeschneidert
hergestellt werden. Einige nicht-beschränkende Beispiele sind die Modifizierung eines
Trägers
oder Liganden mit einer Biotingruppe und die gerichtete Kopplung
an einen Kopplungspartner mit einer Avidingruppierung und/oder die
Einführung
einer Hydrazidgruppierung zur Kopplung mit z. B. einer Aldehydgruppierung.
Natürliche
Kopplungsfunktionen können
nur verwendet werden, wenn die erforderliche Selektivität, d. h.
ausschließliche
Reaktivität
mit dem vorgesehenen Kopplungspartner, gegeben ist.
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Niedermolekulare
Liganden werden in der Regel nur eine Kopplungs- oder Linkerfunktion
aufweisen, während
die Träger
mit einer Mehrzahl/Vielzahl jeder Linkerfunktion versehen sind.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
werden die erfindungsgemäßen Träger zu dreidimensionalen räumlichen
Strukturen vernetzt. Diese Vernetzung kann durch die Zugabe von
bifunktionellen oder multifunktionellen Vernetzungsreagenzien oder
durch die Mischung von zwei oder mehr verschiedenen Trägerspezies mit
komplementären
Kopplungsfunktionen initiiert werden. Durch die Vernetzung kommt
es zu einer Stabilisierung der gekoppelten Träger und zur Ausbildung eines
dreidimensionalen Netzwerkes mit einem sehr hohen Anteil an Ligandenmolekülen. In
einer speziellen Ausführungsform
sind an der Vernetzung auch oberflächengebundene Träger beteiligt.
Auch hier kommt es zu einer Stabilisierung von oberflächengebundenen
Trägern und
zur Ausbildung eines dreidimensionalen Netzwerks durch Konjugation
von Trägern
in der Flüssigphase mit
denen auf der Oberfläche.
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Die
Vernetzungsreagenzien können
homofunktionell sein, wenn gleiche Linkerfunktionen miteinander verbunden
werden sollen, oder heterofunktionell, wenn sich die Linkerfunktionen
in ihrer Reaktivität
unterscheiden. Geeignete Vernetzungsreagenzien sind im Stand der
Technik bekannt und im Handel erhältlich. Einige nicht-beschränkende Beispiele
hierfür
sind Glutaraldehyd und andere Bis-Aldehyde, sowie Bis-Epoxide und
Bis-NHS-Ester. Die Ermittlung weiterer geeigneter Reagenzien in
Abhängigkeit
von den gegebenen Kopplungsfunktionen liegt im Rahmen der Fähigkeiten
und Kenntnisse eines Durchschnittsfachmanns auf diesem Gebiet.
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Zur
Vernetzung der Träger
untereinander kann die gleiche Kopplungsfunktion, die zur Bindung
der Träger
an eine immobilisierende Oberfläche
verwendet wurde, oder eine weitere unabhängige Kopplungsfunktion eingesetzt
werden. Auf jeden Fall sollte zur Vernetzung eine Kopplungsfunktion
verwendet werden, welche von der für die Kopplung der Liganden
verwendeten Kopplungsfunktion verschieden ist.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
geschieht die Vernetzung in situ, d. h. zum Beispiel im Verlauf eines
Verfahrens zur Untersuchung eines Analyten, z. B. einer niedermolekularen
Substanz. Dies ist besonders vorteilhaft, da keine separaten Synthese-
und Aufarbeitungsschritte nötig
sind und die Vernetzungsreaktion besonders schnell und unter geringem
Materialverbrauch, z. B. im Mikromaßstab, stattfinden kann.
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Als
erfindungsgemäße Träger kommen
alle multifunktionellen und vorzugsweise vernetzbaren Moleküle in Frage,
die groß genug
sind, um als Träger
zu fungieren. Typische nicht-beschränkende Beispiele hierfür sind Proteine,
Polysaccharide oder andere organische oder anorganische Polymere.
Geeignete Polymere sind beispielsweise Polyalkylenglycole, z. B.
Polyethylenglycol, Polymilchsäure,
Polyalginat, Polyglycolsäure,
Polyalkylenimine, z. B. Polyethylenimin, Poly-L-Lysin, Polysaccharide,
z. B. Cellulose, Dextran, Polysilane, Polysiloxane, Polyphosphate,
Latex, Poly(meth)acrylate, Polystyrol und andere Kunststoffe. Die
Träger
werden häufig
in Form von Partikeln, insbesondere Nanopartikeln (z. B. aus Latex
oder koagulierten Proteinen), oder Beads (z. B. aus Latex, Chitosan,
Polystyrol oder einem anderen geeigneten Polymer) eingesetzt.
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Grundsätzlich sind
alle herkömmlicherweise
verwendeten Trägermoleküle geeignet,
die über
die erfindungsgemäß erforderlichen
Kopplungsfunktionen verfügen
oder sich damit versehen lassen. Gewünschten- oder erforderlichenfalls
können
die Träger
zusätzlich
eine nachweisbare Gruppierung, beispielsweise eine Fluoreszenzmarkierung,
Enzymmarkierung oder radiaktive Markierung enthalten. Partikel oder
Beads können
z. B. einen magnetischen oder paramagnetischen Bestandteil enthalten.
In der Regel wird das Trägermolekül mindestens
etwa das vierfache Volumen des Liganden einnehmen, damit es zu einer
deutlichen Vergrößerung der
ligandenpräsentierenden
Oberfläche
kommt. Aufgrund der erfindungsgemäß möglichen Vernetzung der Träger kann
die gewünschte
Oberflächenvergrößerung jedoch
auch indirekt durch die Vernetzung erfolgen, so dass auch geringere
Größenverhältnisse
möglich
sind, bei denen der Träger
im wesentlichen nur noch die Funktion eines verbindenden Bausteins
im räumlichen
Netzwerk übernimmt.
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Als
Liganden für
die erfindungsgemäßen Träger kommen
grundsätzlich
Moleküle
aller Stoffklassen in Frage, die über die erforderliche Kopplungsfunktion
verfügen
oder sich damit versehen lassen. Einige nicht-beschränkende Beispiele
hierfür sind
Proteine, Peptide, Nukleinsäuren,
Kohlenhydrate, Steroide oder andere organische oder anorganische
Substanzen.
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Vorzugsweise
handelt es sich dabei um niedermolekulare Substanzen mit einem typischen
Größenbereich
zwischen 200 und 5000 Dalton, bevorzugter zwischen 500 und 2500
Dalton. Die niedermolekularen Substanzen können beispielsweise organische
Substanzen aus einer kombinatorischen chemischen Bibliothek oder
Peptide aus einer Peptidbibliothek sein.
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Vorzugsweise
handelt es sich bei den Liganden um biologisch/-biochemisch aktive Moleküle, die
eine biologische und/oder biochemische Funktion in vivo oder in
vitro ausüben
können.
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Ein
Haupteinsatzgebiet der erfindungsgemäßen Träger ist die Analytik, insbesondere
Bioanalytik. Als Analyseverfahren in denen diese Träger Anwendung
finden können,
kommen beispielsweise alle Verfahren des Standes der Technik in
Frage, bei denen untersuchte Analyten oder Sonden als Liganden an
Träger
gekoppelt oder an Oberflächen
immobilisiert werden. Vorzugsweise handelt es sich dabei um Verfahren,
in denen niedermolekulare Liganden eingesetzt werden. Der Begriff „Analyt”, wie hier
verwendet, bezeichnet das Zielmolekül des Analyseverfahrens, das
Gegenstück
dazu ist die Sonde. Die niedermolekularen Liganden können also
als Sonden fungieren, wenn sie dazu dienen, bestimmte Zielmoleküle (z. B.
Antikörper)
in einer komplexen Analyselösung
(z. B. Serum) nachzuweisen. Die Liganden können aber auch der Analyt selbst
sein, wenn z. B. unter einer großen Anzahl immobilisierter
Liganden einer gefunden werden soll, der an ein bestimmtes Protein
binden soll (z. B. ein Rezeptor, Stichwort Wirkstoffscreening).
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Einige
nicht-beschränkende
Beispiele geeigneter typischer Analyseverfahren sind Nukleinsäure-Assays,
Protein-Assays, Immunoassays, enzymatische Assays, Rezeptorbindungs-Assays,
ELISA-Assays, RIA-Assays, elektrophoretische und chromatographische
Assays, einschließlich
HPLC, Northernblots, Southernblots, Westernblots, kolorimetrische
Assays, mikroskopische und spektroskopische Nachweismethoden, Assays
unter Anwendung von Biochip- oder Mikroarray-Technologie oder Verwendung
von Beads.
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Figurenbeschreibung
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1 demonstriert
das Prinzip der gerichteten Kopplung von verschiedenen Kopplungspartnern über selektive
Reaktionsmechanismen, jedoch ohne Vernetzung. Ligand und Kopplungspartner
(hier eine Oberfläche)
besitzen wechselseitig reaktive (komplementäre) Linkerfunktionen (A und
B), die selektiv miteinander reagieren und zu stabilen Kopplungsprodukten
führen.
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2 ist
eine schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Träger und deren Verwendung zur in
situ-Herstellung eines dreidimensionalen Netzwerks aus niedermolekularen
Liganden und Trägern,
die teilweise auf einer Oberfläche
immobilisiert sind.
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2A Ein Träger wird mit zwei entgegengesetzt
reaktiven, bioorthogonalen Linkerfunktionen (L-1A, L-2A) ausgestattet.
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2B Ein zu koppelnder niedermolekularer
Ligand wird mit einem Linker ausgestattet, der zu einer der Linkerfunktionen
des Trägers
den komplementären
Reaktionspartner bildet (L-1B).
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2C Die Liganden werden in einer Reaktion
an die Träger
gekoppelt, bei der die Kopplung selektiv über die komplementären Linkerfunktionen
einer der bioorthogonalen Reaktionen abläuft (L-1A und L-1B).
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2D Die Konjugate aus Träger und
Ligand werden auf eine immobilisierende Oberfläche appliziert und die Konjugate über die
zweite Linkerfunktion des Trägers
(L-2A), zu der die Oberfläche
den komplementären
Reaktionspartner besitzt (L-2B), an die Oberfläche gebunden.
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2E Anschließend werden freie Linkerfunktionen
des zweiten Typs (L-2A) der Träger über geeignete
bi- oder multifunktionale Vernetzungsreagenzien (durch ein X gekennzeichnet)
konjugiert, so dass sich dreidimensionale Netzwerke zwischen oberflächengebundenen
Trägern
und Trägern
in der darüber
liegenden Flüssigphase
(z. B. in einem Mikrospot) ausbilden.
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3 Schematischer
Ablauf der in Beispiel 1 beschriebenen Konzeptstudie. Streptavidin
wird über EDC-Aktivierung
mit Hydrazidfunktionen modifiziert, die neben der Biotin-Affinität die zweite
selektive Kopplungsfunktion darstellen. Biotinylierte Peptidliganden
werden in einer Flüssigphasenreaktion
gerichtet an Streptavidin gekoppelt und die Reaktionsgemische direkt
auf Aldehydoberflächen
gedruckt. Unter chemoselektiven Reaktionsbedingungen werden die
Peptid-Streptavidinkomplexe über die
Hydrazidfunktionen definiert an die Oberfläche gebunden. In der Folge
werden durch Zusatz des homobifunktionellen Vernetzers Glutaraldehyd
dreidimensionale Konjugate aus oberflächengebundenem SAHz und SAHz
in der Flüssigphase
generiert.
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4 Ergebnisse
des Konzeptstudie. Die Fluoreszenzbilder zeigen einen beispielhaften
Detailausschnitt des Peptid- Microarrays
nach der Antikörperanalyse
in Falschfarbendarstellung. Der Farbverlaufsbalken am rechten Bildrand
gibt die Übertragung
der Fluoreszenzintensität
(von schwarz=keine Fluoreszenz nach weiß=Sättigung) in Farbstufen an.
Das linke Bild zeigt die Fluoreszenzintensität im Cy3 Kanal (Laserpower 10%,
Gain 400) und entspricht der gebundenen Proteinmenge auf der Oberfläche. Das
rechte Bild zeigt die Fluoreszenzintensität im Cy5 Kanal (Laserpower
20%, Gain 400) und entspricht der Menge gebundener Antikörper aus
der Analyselösung.
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Das
folgende Ausführungsbeispiel
dient zur näheren
Erläuterung
der vorliegenden Erfindung, ohne dieselbe jedoch darauf zu beschränken.
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BEISPIEL 1
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Das
Konzept der vorliegenden Erfindung wird bei der Herstellung eines
Peptid-Microarrays für
die Antikörperdiagnostik
erprobt. Bei dieser Technik dienen synthetische Peptide als Ersatz
für Proteinantigene.
Im vorliegenden Fall bildet Streptavidin das Trägermolekül für die Peptidliganden. Die Biotin-Avidin-Affinität bildet demnach
die erste selektive Linkerfunktion, während die zweite Funktion,
ein Hydrazidlinker, durch eine chemische Modifizierung eingeführt wird.
Der folgende Versuchsablauf ist schematisch in 3 zusammengefasst.
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Fluoreszenzmarkiertes
Streptavidin (2 mg/mL in 100 mM Phosphatpuffer pH 6,0 + 150 mM NaCl)
wird über
EDC-Aktivierung (32 mg/mL EDC) mit Adipinsäuredihydrazid (32 mg/mL) modifiziert
(12 h Reaktionszeit bei +4°C).
Streptavidin-Hydrazid
(SAHz) und unmodifiziertes Streptavidin zur Kontrolle werden für die Kopplung
von jeweils drei verschiedenen biotinylierten Peptidantigenen (Pol,
Hel, Con, vgl. Tab. 1) verwendet. Tab. 1: Peptidbezeichnung, Modifikation
und Aminosäuresequenz
| Peptidbezeichnung | Sequenz
(N → c) |
| Pol | Biotin-DKDDAFYIVKRCI |
| Hel | Biotin-IVFTDDKLSNMRI |
| Con | Biotin-NKTSLPTNIAFEL |
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Die
Kopplung findet in Lösung
mit einem 10fachen molaren Überschuss
der Peptide gegenüber
der eingesetzten SAHz-Menge statt (12 h, +4°C). Die Protein-Peptid-Komplexe
(0,2 mg/mL in MES Puffer pH 4,7) werden ohne weiteren Reinigungsschritt
mit einem piezoelektrisch gesteuerten Dispensiersystem (sciFLEX Arrayer,
Scienion AG, Berlin, Deutschland) ortsaufgelöst auf aldehyd-voraktivierte
Glasobjektträger
(Schott Nexterion Slide AL, Schott Nexterion AG, Jena, Deutschland)
gedruckt. Nach einer kurzen Inkubationszeit (2 h) wird in jeden
Mikrospot die Vernetzungsreagenz Glutaraldehydlösung dispensiert (350 pL, Endkonzentration
0,5% w/v). Die Objektträger
werden über
Nacht inkubiert und anschließend
gewaschen und geblockt.
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Für die Antikörperanalyse
werden die monoklonalen Anti-Peptid-Antikörper (Pol-mAk, Hel-mAk und Con-mAk,
je 1 μg/mL
in PBS, pH 7,4) auf den bedruckten Flächen der Objektträger inkubiert
(2 h, Raumtemperatur). Die Objektträger werden gewaschen und anschließend mit
fluoreszenzmarkiertem Sekundärantikörper inkubiert
(Cy5-Antimaus-Ziegenantikörper,
10 μg/mL
in PBS, pH 7,4, 1 h, Raumtemperatur). Nach erneutem Waschen werden
die Objektträger
getrocknet und im Fluoreszenzscanner (GenePix Professional 4200A, Molecular
Devices Corporation, Sunnyvale, CA, USA) ausgelesen.
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Die
Auswertung des Versuchs zeigt, dass die Verwendung der erfindungsgemäßen Träger zu deutlich besseren
Ergebnissen führt.
Es werden etwa 10-fach größere Mengen
des hydrazidaktivierten Streptavidins im Vergleich zum unmodifizierten
Streptavidin auf der Aldehydoberfläche gebunden (4).
Die Antikörperanalyse
macht deutlich, dass die höhere
Streptavidinmenge gleichzeitig durch die größere Anzahl der Peptidliganden
im Mikrospot zu höheren
Bindungskapazitäten
und Analysesensitivitäten
führt und
zeigt, dass die Peptidliganden von den Vernetzungsreaktionen unbeeinflusst
bleiben und ihre biochemische Funktionalität behalten.