DE102006006808A1 - Nanobiotechnologische Vorrichtung für Anatomiestrukturnachbildungen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung soll eine Nanobio-Vorrichtung, in der kultivierte Zellen auf einer hohen Ebene in einem Zustand, der dem in vivo-Zustand nahe kommt, organisiert sind, und ein Verfahren zur Verwendung der Nanobio-Vorrichtung für Anatomiestrukturnachbildungen bereitstellen. Die erfindungsgemäße Nanobio-Vorrichtung für Anatomiestrukturnachbildungen wird erhalten, indem ein Substrat mit einer biokompatiblen Substanz hergestellt wird und mehrere Arten von Zellen auf diesem in einer gewünschten Anordnung vorbereitet werden. Ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Herstellung einer Nanobio-Vorrichtung umfasst einen Schritt des Herstellens eines Substrats für eine Nanobio-Vorrichtung durch eine Mikromaschinenbearbeitungstechnik und einen Schritt des Vorbereitens mehrerer Arten kultivierter Zellen in einer gewünschten Anordnung auf dem Substrat unter Verwendung von Laseroptikpinzetten.

Description

• HINTERGRUND DER ERFINDUNG
• Gebiet der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Verschmelzung eines biotechnologischen und eines nanotechnologischen Verfahrens, das eine hochintegrierte Substratvorrichtung hervorbringt, und im Spezielleren bezieht sie sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer nanobiotechnologischen Vorrichtung, bei der eine Gruppe von Zellen nach einer durch Nachbilden einer bestimmten Anatomiestruktur gebildeten Regel in einer gleichmäßigen Anordnung, auch Array genannt, angeordnet werden.
• Auf dem Gebiet der Biotechnologie können in den letzten Jahren einzelne Zellen aufgrund der Verbesserung beim Lasereinfangverfahren und dergleichen frei kontrolliert werden, und es kann eine Form mit Abmessungen oder einer Auslegung, die einem beabsichtigten Gebrauch entsprechen, auf einem Substrat bearbeitet werden, da ein hoher Integrationsgrad oder ein hoher Geschwindigkeitsgrad der Substratvorrichtung aufgrund der jüngsten Entwicklung der Nanotechnologie gesteigert ist. Diese Technik hat einen Stand erreicht, auf dem eine nanobiotechnologische Vorrichtung oder Nanobio-Vorrichtung hergestellt werden soll, bei der eine Gruppe von Zellen nach einer durch Nachbilden einer bestimmten Anatomiestruktur erhaltenen Regel in einem Array angeordnet wird. Mit anderen Worten ist man gerade dabei, durch das organisierte Anordnen einer kultivierten, sich im Wesentlichen in einem in vivo-Zustand befindenden Zelle auf einer hochentwickelten Nanovorrichtung, was im verwandten Stand der Technik als schwierig erachtet wurde, aufgrund der Verschmelzung dieser Technologien in die Tat umzusetzen. In der Folge kann sie als effizientes Werkzeug nicht nur bei der Herstellung von Substanzen für die Regenerationsmedizin, sondern auch bei der Analyse interzellulärer Wirkung angenommen werden, was sich in vitro schwer lösen ließ. Andererseits wird eine umfassende Analyse wie die Transcriptomanalyse unter Verwendung eines DNA-Mikroarray-Verfahrens oder Proteoms unter Verwendung zweidimensionaler Elektrophorese und eines Massenspektrographen auf verschiedenen Gebieten der Medizinwissenschaft und Biologie genutzt, und eine Hochdurchsatz-Analyse zieht Aufmerksamkeit auf sich. Und zwar, weil nicht nur das Verständnis der Moleküle auf der individuellen Ebene, sondern auch ein umfassendes Verständnis der Mannigfaltigkeit des molekularen Mechanismus in einem Netzwerk von Zellen durch die Hochdurchsatz-Analyse als gesamte Genanordnung, über die jeder lebende Organismus verfügt, gebraucht wird, durch ein Genom-Projekt oder ein DNA-Projekt bekannt gemacht wird. Eine solche Tendenz der neuen Technologie ist dabei, sich zu einem Zeitalter der Analyse nicht nur durch Genexpression oder eine Interaktion von Proteinen, sondern auch auf einer Ebene lebender Zellen zu entwickeln, indem ein System aus einer nanobiotechnologischen Vorrichtung kombiniert mit dem Lösungsansatz des hohen Durchsatzes verwendet wird, und die Errichtung eines neuen Systems als Nachfolger eines biologischen Tests und einer Anwendung auf Medikamenten-Screening usw. nun auf einem vielversprechenden Stand sind.
• Die Regenerationsmedizin ist eines der Forschungsgebiete, das sich in jüngster Zeit höchster Aufmerksamkeit erfreut. Der Hauptgrund besteht darin, dass sie erwartungsgemäß als medizinische Praxis ein neues Jahrhundert einläuten wird, in dem der ernsthafte Mangel an inneren Transplantationsorganen gestillt wird. Allerdings befindet sie sich zum gegenwärtigen Zeitpunkt noch auf dem Stand der Zelltransplantationsbehandlung, und ist nicht imstande, innere Organe selbst neu zu bilden. Die Gründe, warum die Neubildung von inneren Organen noch nicht in die Tat umgesetzt werden kann, sind wie folgt. Innere Organe haben einen regelmäßigen, aber sehr komplizierten Aufbau insofern als sie aus einer Vielzahl von Zellen bestehen und ein Gefäßnetz zur Zufuhr von Nahrung und Sauerstoff in ihnen vorhanden ist. Deshalb ging man davon aus, dass, selbst wenn es möglich ist, einzelne Zellen bereitzustellen, es sehr schwierig sei, ein inneres Organ selbst aus diesen aufzubauen. Mit anderen Worten ist es mit der herkömmlichen Technologie extrem schwierig, einen organisierten Aufbau jedes inneren Organs durch Steuerung der Zellen anzuordnen und aufzubauen.
• Aufgrund der Innovation der Laserbearbeitungstechnik und der Entwicklung der Mikroherstellungstechnik auf dem Gebiet der Nanotechnologie in den jüngsten Jahren kann nun jedoch die Zelle selbst ausreichend von den Vorteilen der Nanotechnologie profitieren. Obwohl sie momentan immer noch weit von dem Stand entfernt ist, auf dem das innere Organ selbst neu gebildet werden kann, ist es dementsprechend nun möglich, Zellen wie gewünscht in einem Zustand von Abschnitten eines inneren Organs auf einem künstlichen Substrat anzuordnen. Deshalb lässt sich, wenn das Substrat mit den darauf angeordneten Zellen unter Verwendung dieser Technik aufgebaut werden kann, ein dreidimensionales inneres Organ herstellen, indem dieses schichtweise in mehreren Lagen aufgebaut wird. Falls darüber hinaus das Substrat mit einer biokompatiblen Substanz wie Kollagen oder Hyaluronsäure aufgebaut werden kann, kann eine abträgliche Reaktion im Hinblick auf die Zellen noch mehr reduziert werden, und von daher wird die Herstellung eines inneren Organs, das transplantiert werden kann, in der Zukunft auch in Kombination mit einer Gefäßneubildungstechnik möglich sein.
• Als gegenwärtig zu verwendende Quelle zum Aufbau eines inneren Organs wird über eine systemische Stammzelle wie eine Knochenmarkzelle oder eine Embryonalstammzelle (ES-Zelle) als eines von Beispielen nachgedacht. Obwohl die systemische Stammzelle ein Problem wie das der Zellfusion hat, besteht insofern ein Vorteil, als theoretisch keine immunologische Abstoßungsreaktion stattfinden kann, da sie von einem Erwachsenen entnommen werden kann und es sich um dessen eigene Stammzelle handelt, was einer der Faktoren ist, die für den Aufbau eines inneren Organs sprechen. Andererseits wird nun bei einem Problem bezüglich der Embryonalstammzellen ein Weg für den praktischen Einsatz auf dem Gebiet medizinischer Praxis erforscht, da nun ein Gen identifiziert ist, das mit der Entstehung eines teratoiden Tumors zusammenhängt, was ein Transplantationshindernis war, und, was die immunologische Abstoßungsreaktion betrifft, wird ein Embryocloning-Verfahren ermöglicht, um einen somatischen Zellkern eines Patienten in ein befruchtetes Ei einzupflanzen und Embryonalstammzellen herzustellen. Eine Weiterentwicklung der Forschung über solche Stammzellen, um den Grundstein für ein System zu legen, bei dem diese Stammzellen als Quelle (einzelne Zellen) zum Aufbau eines inneren Organs bereitgestellt werden können, ist für die Regeneration innerer Organe mittels Nanotechnologie erforderlich.
• [Druckschrift 1, hier handelt es sich um kein Patent] Oode K., Furuya T., Harada K., Kawaguchi S., Yamamoto K., Hirano T., Sasaki K., "The development of a cell array and its combination with laser-scanning cytometry allows a high-throughput analysis of nuclear DNA content" Am J Pathol. 157 (3), S. 723–728, Sep. 2000.
• [Druckschrift 2, hier handelt es sich um kein Patent] Teratani Ko., Ochiai Takahiro, "Stern Cell, ES cell – Mesenchymal Stem Cell" Regeneration Medicine, Bd. 3, Nr. 4, S. 126–133, 2004.
• ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
• Einer der Umstände, warum die Regeneration oder Neubildung innerer Organe noch nicht in die Tat umgesetzt wird, besteht darin, dass, wie vorstehend beschrieben, innere Organe aus einer Vielzahl von Zellen bestehen und dass sie mit der Entstehung eines regelmäßigen aber komplizierten Aufbaus wie dem Vorhandensein des Gefäßnetzes, um ihnen Nahrung und Sauerstoff als Lebensgrundlage zuzuführen, funktionieren, und es von daher schwierig ist, das innere Organ selbst in einem Array anzuordnen und aufzubauen, auch wenn die einzelnen Zellen hergestellt werden können. Eine Aufgabe, die von der Erfindung gelöst werden soll, besteht darin, eine nanobiotechnologische Vorrichtung bereitzustellen, um kultivierte Zellen auf einer hohen Entwicklungsebene, bei der es sich im Wesentlichen um einen in vivo-Zustand handelt, organisiert anzuordnen, und ein Verfahren zum Einsetzen der nanobiotechnologischen Vorrichtung für Anatomiestrukturnachbildungen vorzustellen.
• Eine erfindungsgemäße nanobiotechnologische Vorrichtung für Anatomiestrukturnachbildungen wird erhalten, indem ein Substrat mit einer biokompatiblen Substanz hergestellt wird und mehrere Zellarten darauf in einer gewünschten Anordnung vorbereitet werden.
• Ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen nanobiotechnologischen Vorrichtung umfasst einen Schritt, ein Substrat für die nanobiotechnologische Vorrichtung durch eine Mikromaschinenbearbeitungstechnik herzustellen, und einen Schritt, mehrere Arten kultivierter Zellen unter Verwendung eines Lasermanipulators in einer gewünschten Anordnung auf dem Substrat vorzubereiten.
• Ein weiteres Verfahren der Erfindung zur Herstellung einer nanobiotechnologischen Vorrichtung umfasst einen Schritt, eine Form für ein Substrat für eine nanobiotechnologische Vorrichtung mit einer Mikromaschinenbearbeitungstechnik herzustellen, einen Schritt, ein aus einer biokompatiblen Substanz bestehendes Substrat unter Verwendung der Form als Platte durch eine Drucktechnik herzustellen, und einen Schritt, mehrere Arten kultivierter Zellen unter Verwendung eines Lasermanipulators in einer gewünschten Anordnung auf dem Substrat vorzubereiten.
• Wenn die Mikromaschinentechnik einen gebündelten Ionenstrahl verwendet, entsteht eine Struktur durch Ausschneiden durch Ionenätzen, Abscheidung oder dergleichen. Wenn sie einen Femtosekundenlaser verwendet, wird eine dreidimensionale Struktur hergestellt, indem durch deren Bestrahlung oder durch Fokusabtastung wie Zweiphotonenabsorption unter Verwendung von UV-gehärtetem Harz ein Loch ausgestochen wird. Der Druck, der die Form als Platte verwendet, stellt sich als ein Verfahren dar, bei dem eine biokompatible Substanz wie Kollagen oder Hyaluronsäure aufgetragen wird, oder als ein Verfahren zur Herstellung eines Aufdrucks durch Aufpressen der biokompatiblen Substanz.
• Ein Verfahren zum Einsatz der nanobiotechnologischen Vorrichtung der Erfindung für Anatomiestrukturnachbildungen wird als Verfahren zu deren Einsatz als Probenträger für einen Medikamententoxizitätstest oder eine Substanz für neu gebildetes Gewebe vorgestellt.
• Da es sich bei der erfindungsgemäßen nanobiotechnologischen Vorrichtung für Anatomiestrukturnachbildungen um eine Vorrichtung handelt, bei der eine hochorganisierte Zellanordnung in einem lebenden Körper auf dem Substrat aus biokompatibler Substanz wie Kollagen oder Hyaluronsäure neu gebildet wird, kann ein Probenträger für verschiedene in vitro-Tests des in vivo-Zustands bereitgestellt werden.
• Da ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen nanobiotechnologischen Vorrichtung die Erfassung einzelner Zellen und deren Vorbereiten in einer gewünschten Anordnung auf dem Substrat aus biokompatibler Substanz ermöglicht, indem die Technik, die auf den Halbleiter- oder Mikromaschinengebieten gepflegt wird, oder eine Lasereinfangtechnik mit Laseroptikpinzetten oder dergleichen eingesetzt wird, kann eine hochorganisierte Zellanordnung im lebenden Körper neu gebildet werden.
• Ein Verfahren zum Einsetzen der erfindungsgemäßen nanobiotechnologischen Vorrichtung für Anatomiestrukturnachbildungen schlägt einen Gebrauch als Probenträger für Medikamententoxizitätstest oder die Substanz für Gewebeneubildung vor. Deshalb kann der Medikamententoxizitätstest auf eine andere Weise als bei einem Versuch am menschlichen Körper oder sogar ohne ein Tier zu verwenden durchgeführt werden, und es kann ein Ergebnis erhalten werden, das dem in vivo-Zustand nahe kommt. Es kann auch wirkungsvoll dazu eingesetzt werden, einen molekularen Mechanismus in interzellulärer Aktion darzustellen. Darüber hinaus lässt sich durch die Kultivierung von Zellen mit der nanobiotechnologischen Vorrichtung ein funktionierendes inneres Organ aufbauen, und von daher wird in der Zukunft die Entwicklung einer Technologie zum Aufbauen innerer Organe auf dem Gebiet der Regenerationsmedizin möglich.
• KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
• 1 ist eine das Konzept der Erfindung darstellende Zeichnung;
• 2 ist eine Konzeptzeichnung, die ein Substrat darstellt, das mit einem FIB (fokussierten Ionenstrahl) durch Ätzen bearbeitet wurde und daran angebrachte Zellen aufweist;
• 3 ist eine Abbildung eines durch Abscheidung bearbeiteten Substrats durch ein Ionenstrahl-Mikroskop gesehen;
• 4 ist eine Zeichnung, die ein Substrat zeigt, das auf Grundlage von Bilddaten als Versuchsprodukt hergestellt wurde;
• 5 ist ein Beispiel eines Versuchsprodukts eines Weinglases, das einen Präzisionsgrad einer FIB-Bearbeitung zeigt; die 6A–6B sind Schemazeichnungen einer Form für das mit dem FIB durch Ätzen bearbeitete Substrat und des Aufdruckvorgangs unter Verwendung der Form als Platte;
• 7 ist eine Zeichnung, die einen Zustand zeigt, bei dem HEK 293-Zellen aufeinanderfolgend auf dem Substrat angeordnet sind;
• 8 zeigt mikrofotografische Abbildungen, die zeigen, dass zwei Arten identifizierbarer Zellen auf dem Substrat in einer gewünschten gleichmäßigen Anordnung angeordnet werden können; und
• 9 ist eine erläuternde Ansicht, die die Herstellung einer hepatischen Nanovorrichtung und eine Anwendung von dieser zeigt.
• BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
• Nun werden mit Bezug auf die Konzeptzeichnung von 1 die Herstellung einer erfindungsgemäßen nanobiotechnologischen Vorrichtung oder Nanobio-Vorrichtung für Anatomiestrukturnachbildungen und ein Anwendungsbeispiel beschrieben. Verschiedene Arten lebender Zellen, die aus Tieren oder menschlichen Körpern entnommen werden, werden in einem herkömmlichen Verfahren kultiviert. Unter Einsatz von Nanotechnologie wird ein Substrat für die Nanobio-Vorrichtung hergestellt. Vorab kultivierte Zellen werden unter Verwendung eines Lasermanipulators am Substrat gesammelt und an vorbestimmten Positionen angeordnet, um eine Gewebe-Nanovorrichtung zu bilden. In diesem Fall können erfindungsgemäß mehrere Arten von Zellen in einem Array in einer Form angeordnet werden, die den Anatomieaufbau imitiert oder nachbildet, und die wie oben beschriebene Nanobio-Vorrichtung für Anatomiestrukturnachbildungen öffnet einen Weg zur Analyse des interzellulären Molekularmechanismus, oder dient als Basis material für die Innenorganaufbautechnologie auf dem Gebiet der Regenerationsmedizin oder als eine Anwendung auf einen Zell-Array mit hohem Durchsatz.
• Die erfindungsgemäße Nanobio-Vorrichtung für Anatomiestrukturnachbildungen wird durch Aufbauen eines Organs erhalten, indem die Zellen regelmäßig und in einer komplexen Struktur angeordnet werden, und dann muss, um selbige zu erhalten, Sauerstoff oder Nahrung in einer Atmosphäre zugeführt werden, die sich zum Überleben von Zellen eignet. Gegenwärtig ist es noch nicht gelungen, ein inneres Organ zu kultivieren, und somit wird ein Substrat (Kleinstaufbau) notwendig, das sich zum Anordnen von Zellen eignet, die kultiviert werden sollen. Als Grundlage der Erfindung hatten die Erfinder den Gedanken, eine Bearbeitungstechnik anzuwenden, die eine in einem Halbleiterverarbeitungsverfahren entwickelte fokussierte Ionenstrahlvorrichtung (FIB-Vorrichtung) zur Herstellung des Substrats einsetzt.
• Eine Leiterbahnbreite, die ein Hinweiszeichen für den Leistungsgrad eines Halbleiters ist, erreicht aufgrund der jüngsten Entwicklung in der Halbleitertechnologie fast einen Feinbearbeitungsgrad einiger Dutzend Nanometer in einem Bestrahlungsverfahren, das eine Lichtquelle mit kurzer Wellenlänge verwendet, wie etwa einen Elektronenstrahl oder Vakuum-Ultraviolettstrahlung. Auf dem Halbleitergebiet wird zur Bestrahlung eine "Maske" benötigt, bei der es sich um eine Übertragungsstruktur handelt, und die fokussierte Ionenstrahlvorrichtung wird zu deren Bearbeitung und Korrektur eingesetzt. Der FIB dient als Maskenkorrekturwerkzeug oder als Fehleranalysewerkzeug zum Ausschneiden verschiedener Vorrichtungen und um deren Querschnitte unter Einsatz seiner Verarbeitungsfunktion zu beobachten. Wir haben uns deshalb auf eine FIB-Vorrichtung konzentriert und schlagen die Herstellung einer Substratvorrichtung zum Kultivieren von Zellen unter Verwendung derselben als Vorrichtungsherstellungswerkzeug auf dem biologischen Gebiet vor.
• Bevor ein Verfahren zur Herstellung des Substrats beschrieben wird, wird kurz die fokussierte Ionenstrahlvorrichtung beschrieben. Beim FIB handelt es sich um eine Vorrichtung, die elektrisch Galliumionen aus einer Ionenquelle ableitet, diese durch eine elektrostatische Linse konvergiert und als Strahl auf ein Objekt abstrahlt. Eine Formenbeobachtung wie durch ein Rasterelektronenmikroskop (REM oder SEM – Scanning Electronic Microscope) wird durch Abtasten eines winzigen Bereichs auf dem Objekt mit dem Strahl ermöglicht, der in einer dünnen Form konvergiert. Diese Funktion wird als Rasterelektronenstrahlmikroskop (SIM – Scanning Ion Microscope) bezeichnet. Der Unterschied zwischen SIM und SEM besteht darin, dass SEM hauptsächlich zur Beobachtung eingesetzt wird, während SIM auch zur Bearbeitung zusätzlich zu Beobachtung verwendet wird und in der Lage ist, den Ionenstrahl auf eine gewünschte Stelle abzustrahlen und diese durch Zerstäubungsätzen auszuschneiden.
• Darüber hinaus tastet der FIB die Oberfläche des winzigen Bereichs auf dem Objekt mit einem Strahl ab, während gleichzeitig ein spezielles Gas wie Phenanthren C₄H₁₀ aufgesprüht wird, so dass sich in einer Verbindung vorhandene Bestandteile auf dem bestrahlten Bereich festsetzen. Deshalb kann der FIB bewirken, dass sich in der Verbindung vorhandene Bestandteile lokal an bestimmten Stellen auf der Oberfläche des Probenträgers festsetzen und ansammeln. Diese Ansammlung einer dünnen Schicht wird als ioneninduziertes Aufdampfen (CVD – Chemical Vapor Deposition) bezeichnet. Mit der Abscheidung lassen sich durch Ändern der Gasart verschiedene Arten von Schichten anlagern. Erfolgt die Abscheidung durch Aufsprühen von Phenanthren, sammelt sich eine amorphe, diamantartige Kohlenstoffschicht an. Der FIB hat die Aufgabe, eine gewünschte Form auf der Oberfläche des Probenträgers auszubilden, indem die Funktionen Beobachtung, Ätzen und Abscheidung kombiniert werden.
• Ein Vorteil, das FIB-Bearbeitungsverfahren zur Herstellung der Vorrichtung anzuwenden, besteht darin, dass der FIB insofern überlegener ist, als sich die gewünschte Feinformbearbeitung mit der vorstehend beschriebenen Schneidefunktion durch Ätzen und der Aufbaufunktion durch Abscheiden durchführen lässt, und sie insbesondere günstige Bedingungen erfüllt, indem sie die Kleinststruktur von unten nach oben aufbauen kann, so dass ein gewünschter Aufbau bereitgestellt werden kann, wobei mit den Bedürfnissen auf dem Gebiet der Biotechnologie Schritt gehalten wird.
• Bei der Nanobio-Vorrichtung handelt es sich um ein Substrat, das zur Anordnung von Zellen und zur Abbildung gedacht ist. Die Zellen sind weich und werden somit durch Schwerkraftwirkung am Substrat flachgedrückt. Deshalb ist sie so ausgelegt, dass sie die Veränderung der Form berücksichtigende Abmessungen hat und ist so eingerichtet, dass angrenzende Zellen nicht vollständig voneinander abgetrennt sind, sondern miteinander in Kontakt gelangen, um eine Wechselwirkung zu erzielen. Die Form muss dergestalt sein, dass die Zellen als eine Anlage aktiviert werden können, um so viel wie möglich des Inneren des lebenden Körpers abzubilden. 2 zeigt schematisch eine vorstehend beschriebene Ausführungsform.
• Eine Form eines Versuchsprodukts der Nanobio-Vorrichtung, die durch die Abscheidungsfunktion des FIBs hergestellt wurde, ist in 3 gezeigt. Die erforderliche Bearbeitungszeit betrug einschließlich der Beobachtung ca. zwei Stunden. Eine in der SIM-Abbildung von 3 gezeigte Wand wurde auf einem Siliziumsubstrat hergestellt, das für einen Halbleiter-Wafer in einem Abscheidungsprozess verwendet wurde. Die Wände wurden als Trennwände zum Anordnen von Leberzellen so ausgebildet, dass die Zellen miteinander, wenn die Zellen in allen Kammern angeordnet wurden, an dem Teil in Kontakt gelangen, der über den Wänden liegt. Aus dem Ergebnis des Versuchs konnte festgestellt werden, dass eine Probenträgergrundlage zur stabilen Anordnung der Leberzellen in einer kurzen Zeit hergestellt werden konnte.
• Anschließend ist eine Form eines Versuchsprodukts der Nanobio-Vorrichtung, die durch die Ätzfunktion des FIBs hergestellt wurde, in 4 gezeigt. Da sichtbares Licht zur Beobachtungsabbildung von lebenden Zellen verwendet wird, die durch eine fluoreszierende Beschichtung eingefärbt sind, eignet sich ein transparentes Substrat. Allerdings ermöglicht das diamantartige Kohlenstoffsubstrat oder das Siliziumsubstrat, das durch die in 4 gezeigte Abscheidung hergestellt wurde, keinen Lichtdurchlass. Deshalb wurde ein ITO-Substrat, bei dem es sich um ein transparentes, leitfähiges Substrat (ein mit Indiumoxid hergestelltes Substrat) handelte, ausgewählt, um eine mühelose Beobachtung durch ein optisches Mikroskop zuzulassen, und es wurde eine Ätzformbearbeitung am Substrat vorgenommen. Die Formbearbeitung erfolgte unter Verwendung einer speziellen Software auf Grundlage von Bilddaten zur Bearbeitung, und die Form einer erhaltenen Struktur wurde durch SIM-Schrägbildbeobachtung festgestellt, und die Lichtdurchlässigkeit wurde über die Beobachtung mit dem optischen Mikroskop festgestellt. Das ITO-Substrat kann eine Aufladungserscheinung (ein Aufladen) verhindern, das durch Abstrahlen eines geladenen SIM- oder SEM-Strahls im Vergleich mit dem Glassubstrat verursacht werden kann, und eine Verschlechterung der Bearbeitungsgenauigkeit kann vorteilhafter Weise in Grenzen gehalten werden.
• Um eine Herstellungsfertigkeit des FIBs zu zeigen, ist ein rotationssymmetrisches Glas gezeigt, bei dem es sich um eine Struktur handelt, die durch die Kombination von Ätzen und Abscheiden hergestellt wird. Das in 5 gezeigte rotationssymmetrische Glas wurde hergestellt, indem ein Grundmaterial mit dem diamantartigen Kohlenstoff vorab entsprechend dem Abscheidungsprozess auf einer Präzisionsdrehbühne hergestellt wurde, deren axiale Ablenkung minimiert war, und der Ätzprozesse durchgeführt wurde, indem der FIB genau von der Seite aufgestrahlt wurde, während selbige sich mit 200 U/min drehte. Es wurde auch eine Öffnung oben am Glas ausgebildet, indem dieses von oben mit dem FIB ausgeschnitten wurde. Der obere Abschnitt des Glases betrug im ϕ 2,7 μm, eine Öffnung des Glases betrug im ϕ 2 μm oder darunter, und von daher ist klar, dass es sich im Vergleich mit einer Organzelle um eine kleinere Struktur handelte. Wir bezeichnen diese Funktion als "nano turning machine" (Nano-Drehmaschine), bei der es sich um ein neuartiges Kleinststrukturherstellungswerkzeug handelt, das den FIB verwendet.
• Alternativ gibt es ein Verfahren zur Herstellung einer dreidimensionalen Struktur, wobei 3D-Daten als Bild hergenommen werden. Bei diesem Verfahren wird ein Erscheinungsmodell durch Abscheidung hergestellt und gleichzeitig wird Information über die Kontur eines menschlichen Chromosoms widergespiegelt, die durch ein Rasterkraftmikroskop (AFM – Atomic Force Microscope) o. dgl. ermittelt wird. Es werden Bilddaten in mehreren Abschnitten aus den AFM-Messdaten (3D-Information) in Nährlösung ermittelt, und die Abscheidung wird auf Grundlage der Abbildung ausgeführt, so dass ein dreidimensionaler Aufbau im selben Maßstab in der X-Y-Richtung hergestellt wird. Auf diese Weise ist die Herstellung der Kleinststruktur auf Grundlage der Bilddaten, wobei die Form darauf reflektiert wird, sowohl durch den Atz- als auch den Abscheidungsprozess möglich.
• Ein Substrat wird durch eine Aufdrucktechnik hergestellt, die diesmal eine Platte verwendet, die durch das FIB-Bearbeitungsverfahren ausgebildet wurde. Zukünftig wird eine Massenproduktion durch diese Aufdrucktechnik möglich. Die Aufdrucktechnik soll eine Platte mit rauer Oberfläche herstellen, indem die Feinbearbeitung auf ein gewünschtes Material als Form angewendet und mehrere Produkte wiederholt hergestellt werden. Es wird erwartet, dass die Nano-Aufdrucktechnik ein Bearbeitungsverfahren für zukünftige Generationen sein wird, die eine Bearbeitung in der Größenordnung von zehn Nanometern auch auf dem Halbleitergebiet ermöglicht. Gemäß einem Aufdruckverfahren wird bei der Erfindung, wie schematisch in den 6A–6B gezeigt ist, zuerst eine Form für eine Nanobio-Vorrichtung mit dem FIB hergestellt. Die Gestalt der in 6A gezeigten Form ist, was die Erhebungen und Vertiefungen betrifft, im Vergleich zu der für das in 6B gezeigte Substrat erforderlichen Form umgekehrt. Wie in 6C gezeigt ist, wird die Struktur von 6B dadurch erzielt, dass die in 6A gezeigte Struktur, die durch Anwenden des Ätzpxozesses mit dem FIB erhalten wird, als Negativplatte auf eine biokompatible Dünnschicht wie Kollagen übertragen wird. Das Substrat, das tatsächlich übertragen wurde, wurde mit dem AFM bezüglich der Formgenauigkeit überprüft, und es erwies sich, dass es über eine hohe Herstellungsfähigkeit verfügte. Obwohl der FIB eine höhere Leistung zur Herstellung von Strukturen im Mikrometerbereich hat, braucht ex lange, um einen breiten Bereich über einen Millimeter zu bearbeiten. Deshalb ist die Nano-Aufdrucktechnik für eine Massenproduktion effizienter als die mit dem FIB erfolgende Bearbeitung des Substrats selbst.
• Wenn die Herstellung des Substrats abgeschlossen ist, werden Zellen einzeln und nacheinander darauf angeordnet. Dieses Vorgehen erfolgt unter Verwendung der Lasereinfangtechnik. Eine Aufgabe, die bei diesem Vorgang notwendig ist, besteht darin, die kleinen Zellen einzeln und nacheinander zu erfassen und sie zu vorbestimmten Stellen auf dem Substrat zu bringen, und von daher wird ein Lasermanipulatorsystem verwendet, das als "Laseroptikpinzette" bezeichnet wird. Ein Prinzip des Einfangens von Licht unter Verwendung des LMT-Systems ist wie folgt. Wenn ein Laserstrahl gebündelt auf eine Feinsubstanz wie eine Zelle gestrahlt wird, wird er aufgrund des stofflichen Unterschieds gebrochen, und von daher verändert sich das kinetische Moment des Lichts. Wenn mehrere Laserstrahlen auf eine Feinsubstanz gestrahlt werden, wirkt das kombinierte kinetische Moment des Lichts auf die Feinsubstanz, und dabei entsteht eine Kraft zum Speichern des kinetischen Moments in der entgegengesetzten Richtung, und in der Folge wird die Feinsubstanz durch einen Brennpunkt eingefangen. Wenn ein Probenhaltertisch in diesem Zustand bewegt wird, findet auch eine relative Bewegung der erfassten Feinsubstanz statt. Wenn ein Behälter für die kultivierten Zellen und das Probensubstrat auf den Probenhaltertisch gestellt werden, lässt sich die erfindungsgemäß geforderte Bedienung durchführen. Diese Bedienung kann während der Beobachtung des leistungsfähigen optischen Mikroskops erfolgen, wobei vorausgesetzt wird, dass eine CCD-Kamera daran angebracht ist.
• Nun wird die Anwendung der Erfindung zur Darstellung der interzellulären Wirkung beschrieben, die durch die erfindungsgemäß hergestellte Nanobio-Vorrichtung ermöglicht wird. Da die Anordnung der Zellen auf dem Substrat beliebig möglich ist, geht man auch von deren Anwendung zur Darstellung der interzellulären Wirkung aus. Gegenwärtig wird über eine Reihe von Versuchen berichtet, bei denen der in vivo-Zustand in vitro nachgebildet werden kann, indem ein parallel kultiviertes System, das zwei oder mehr Zellarten umfasst, oder ein ex vivo-System verwendet wird, das auf Mikroplättchen kultiviertes Hirngewebe verwendet. Das von der Erfindung beabsichtigte Verfahren, das eine Nanovorrichtung für innere Organe verwendet, ermöglicht eine Neubildung der Zellanordnung, die auf einer hohen Entwicklungsebene im lebenden Körper organisiert sind, im Vergleich zum parallel kultivierten System besser, und da es sich vom Mikroplättchenkultivierungssystem unterscheidet, lassen sich nur die Zellen auswählen und anordnen, deren Funktion der Prüfer sehen möchte. Deshalb kann ein einfacheres System aufgebaut wer den, und von daher eignet es sich zur Beobachtung eines dynamischen Zustands oder der Funktion von Zellen. Da darüber hinaus die Zellen beliebig angeordnet werden können, ist es nun auch möglich, einen Zell-Array, der in einem tatsächlichen lebenden Körper nicht vorkommt, zur Durchführung eines Versuchs aufzubauen. Ein wichtiger Vorteil besteht darin, dass die interzellulären Wirkungen mindestes zweier Zellarten wie einer Leber- und einer Gefäßendothelzelle oder einer Leber- und einer Bindegewebszelle bei jedem Array geprüft werden können. Im Vergleich zum normale Kultivierungsverfahren ist es jedoch im gegenwärtigen Augenblick noch schwierig, eine große Anzahl von Zellen in kurzer Zeit mit diesem Verfahren zusammenzustellen, und es befindet sich momentan auf der Stufe, eine kleine Zellgruppenskala aufbauen zu können. Deshalb muss die Genexpression oder Zellfunktion für Einzelzellen über Bio-Bildgebung unter Verwendung eines Verfahrens mit extrem hoher Erfassungsempfindlichkeit ermittelt werden (wie etwa einem Reportergen-Assay unter Verwendung von Luciferase).
• Gegenwärtig zieht eine Analyse die Aufmerksamkeit auf sich, die einen hohen Durchsatz erzielt, die sich als eine DNA-Mikroarray-Analyse darstellt. Diese Analyse ermöglicht die gleichzeitige Erfassung einer großen Anzahl von Genexpressionsprofilen, indem mehrere Zehntausende DNA-Proben auf einem Chip bereitgestellt werden. Von diesem Verfahren wird berichtet, dass es für die Diagnose von Krebsgewebe (siehe Druckschrift 1, bei der es sich um kein Patent handelt) auf einem Forschungsgebiet der klinischen Medizin wirkungsvoll ist. Mit anderen Worten wird in Verbindung mit der Durchsatzverbesserung der Versuchsumfang reduziert, und es lässt sich eine gewaltige Datenmenge erzielen. Indem ein Funktionsanalysesystem entwickelt wird, das einen hohen Durchsatz auf Zellebene erzielt, indem die erfindungsgemäße Nanovorrichtung für innere Organe mit einem Lösungsansatz wie dem Zell-Array kombiniert wird, ist deshalb zu erwarten, dass ein wirksames Werkzeug zur Analyse der Auswirkung neu vorgestellter Medikamente oder von Genen erhalten wird. Anders ausgedrückt können viele Arten von Zellen (bestehende Zelllinien oder vorkultivierte Zellen) in vitro mit einem hohen Durchsatz in einem Zustand analysiert werden, der dem in vivo-Zustand näherkommt. Indem einzelne Zellen separat analysiert werden, wird dementsprechend Information über die Genexpression einschließlich Information über interzelluläre Wirkung erhalten werden können, wovon man annahm, dass sie kaum zu berücksichtigen sein könnte, und die sich als sehr wirkungsvolles Mittel auf dem Forschungsgebiet einsetzen lässt.
• Ein Zustand, bei dem die tatsächliche Anordnung von Zellen auf dem Substrat durch Manipulieren der Zellen einzeln und nacheinander durch das Verfahren der Erfin dung ermöglicht ist, ist in 7 gezeigt. Die in der oberen Stufe gezeigten mikrofotografischen Abbildungen zeigen die Sequenz, bei der Zellen einzeln und nacheinander unter Verwendung einer Laseroptikpinzette auf das Substrat übertragen werden, das mit Grenzwänden in einem Wabenmuster ausgebildet ist. Die Bilder auf der unteren Stufe sind eine Schemazeichnung, die dieselbe Sequenz zum leichten Verständnis zeigen. Die Länge des Maßstabs auf der unteren rechten Seite der mikrofotografischen Aufnahme beträgt 20 μm. Sie werden linear und einzeln und nacheinander angeordnet. Anschließend wurde, um festzustellen, ob durch Manipulieren der Zellen mehrere Arten von Zellen auf dem Nanovorrichtungssubstrat angeordnet werden können, ein Versuch durchgeführt, bei dem HEK293-Zellen angeordnet wurden, die typischerweise durch zwei Arten von Q-Dot (Quantum Dot-) Reagens (655 rot, 565 grün; QUANTUM DOT CORPORATION, SC BioSciences Corporation) markiert waren, um sie auf der Nanovorrichtung mit dem Lasermanipulator (Laseroptikpinzette) identifizieren zu können. Die Erscheinungsbilder während dieses Versuchs sind in 8 gezeigt. Ein Zustand einer normalen Kultur in einer Petrischale ist in 8 in A gezeigt, und ein Zustand der Anordnung auf dem Substrat für eine erfindungsgemäße Nanobio-Vorrichtung ist in 8 in B gezeigt. Wenn die beiden unterschiedlich durch Q-Dot eingefärbten Zellarten normal in der Petrischale kultiviert werden, sind die Zellen zufällig und unregelmäßig wie in A gezeigt angeordnet. Ein Zustand, bei dem die beiden Zellarten durch den Lasermanipulator manipuliert und erfasst und abwechselnd in einer Ringform auf das Substrat übertragen wurden, ist in 8 in B gezeigt. In B sind die oberen Abbildungen Phasenunterschiedsabbildungen und die unteren Abbildungen Fluoreszenzabbildungen. Die Länge des Maßstabs beträgt 30 μm. Obwohl sie etwas undeutlich sind, weil sie nicht in Farbe gezeigt werden können, wird klar sein, dass die rot eingefärbten und die grün eingefärbten Zellen in den Fluoreszenzfotografien nacheinander regelmäßig angeordnet sind. Die Zellen könnten wie in den Fotografien regelmäßig angeordnet werden. Dies bedeutet, dass die verschiedenen Arrays frei hergestellt werden können. Aus 8 wird klar, dass sich die Zellen in der normalen Kultur in der Petrischale zufällig bewegen, wie in den oberen und unteren Fotografien in A zu sehen ist, während sie in den Kammern der erfindungsgemäßen Substrate fixiert sind.
• Nun wird mit Bezug auf 9 eine hepatische Nanovorrichtung als Anwendungsbeispiel gezeigt. Die Erfinder bildeten eine Leberlappenstruktur einer Leber auf der Nanovorrichtung nach und sind dabei, die hepatische Nanovorrichtung herzustellen. Die Erfinder gehen nun daran, ein System herzustellen, bei dem ein Screening von Medika menten wie Krebsmitteln unter Verwendung der hepatischen Nanovorrichtung in einem Sicherheitstest für Medikamente mit hohem Durchsatz durchgeführt werden kann. In 9 sind mikrofotografische Abbildungen anaplastischer und hepatisierter Zellen für ES-Zellen einer Maus und die mesenchymalen Stammzellen eines Menschen auf der oberen linken Seite gezeigt. Der Begriff anaplastisch bedeutet, dass sich die Zellen in einem Zustand der Probennahme befinden, und der Begriff hepatisiert bedeutet, dass sie zu Leberzellen verarbeitet wurden. Das Array des Lebergewebes wird neu gebildet und unter Verwendung der mit dem Verfahren der Erfindung hepatisierten Zellen auf dem Substrat organisiert. Dieser Zustand ist als Gewebe-Nanovorrichtung auf der oberen rechten Seite der Zeichnung schematisch dargestellt.
• Es wird berichtet, dass dadurch, dass die dreidimensional kultivierten hepatischen Parenchymzellen in der Leberfunktion im Vergleich zu Zellen, die in einer Einzelschicht kultiviert werden, verbessert und langfristig gehalten werden. Es ist bekannt, dass die Leber aus mehreren Arten von Zellen wie etwa Gefäßendothelzellen und Epithelzellen des Gallentrakts zusätzlich zu den hepatischen Parenchymzellen besteht und die Leberfunktion durch das diese Zellen umschließende gemeinsame Kultivierungssystem verbessert wird. Auf eine weitere Verbesserung der Funktion der hepatischen Parenchymzellen abzielend kamen die Erfinder deshalb auf die Idee, andere Zellarten zusätzlich zu den hepatischen Parenchymzellen als Hauptbestandteil in der dem in vivo-Zustand nahekommenden Form auf dem Nanovorrichtungssubstrat anzuordnen. Und zwar gehen die Erfinder davon aus, dass die Funktion der hepatischen Parenchymzellen noch mehr verbessert werden kann, wenn die interzelluläre Wirkung wie im in vivo-Zustand hervorgerufen wird. Anders ausgedrückt, wenn einer Zelle in vitro eine Funktion verliehen werden kann, die ähnlich dem in vivo-Zustand ist, können Tierversuche mit Ratten oder dergleichen reduziert werden, was vom Standpunkt der Kostensenkung und dem ethischen Grundgedanken her sinnvoll ist. Die Erfinder hatten die Idee, ein Integrationsverfahren der hepatischen Nanovorrichtung in den dreidimensionalen Aufbau unter Verwendung eines stark biologisch abbaubaren Materials als Material für das Nanovorichtungssubstrat in die Tat umzusetzen.
• Das Verfahren zum künstlichen Kultivieren innerer Organe ist in der Erfindung aufgezeigt. Um die Erfindung zu bewerkstelligen, müssen hepatische Parenchymzellen und andere Arten von Zellen auf der Nanovorrichtung angeordnet werden, und es muss eine Anordnung bestimmt werden, bei der die Leberfunktion maximal verbessert ist. Was die eigentlich zu verwendenden Zellen betrifft, sind wir, das National Cancer Center Research Institute, Abteilung Metastasenforschung, erfolgreich in der differenzierten Einschleusung von ES-Zellen oder menschlichen myeloiden Stammzellen in die hepatischen Parenchymzellen (siehe Druckschrift 2, bei der es sich um kein Patent handelt). Falls die aus diesen Stammzellen gewonnenen hepatischen Parenchymzellen für die hepatische Nanovorrichtung verwendet werden können, lässt sich der Sicherheitstest für die Medikamente mit einem hohen Durchsatz bei einem minimalen Einsatz von Tierkörpern bewerkstelligen, und somit wird die Erfindung als Ausgangsmaterial in der klinischen Medizin insbesondere auf dem Gebiet der regenerativen Medizinwissenschaft oder in dem weiten Bereich der Pharmakologie und Biologie umschließenden Gebiete eingesetzt.

Claims (7)

1. Nanobio-Vorrichtung für Anatomiestrukturnachbildungen, die ein Substrat umfasst, das aus einer biokompatiblen Substanz und mehreren Arten von Zellen besteht, die darauf in einer gewünschten Anordnung angeordnet sind.
2. Verfahren zur Herstellung einer Nanobio-Vorrichtung, das einen Schritt des Herstellens eines Substrats für eine Nanobio-Vorrichtung durch eine Mikromaschinenbearbeitungstechnik, und einen Schritt des Anordnens mehrerer Arten kultivierter Zellen in einer gewünschten Anordnung auf dem Substrat unter Verwendung von Laseroptikpinzetten umfasst.
3. Verfahren zur Herstellung einer Nanobio-Vorrichtung nach Anspruch 2, wobei die Mikromaschinenbearbeitungstechnik zur Herstellung des Substrats durch einen fokussierten Ionenstrahlprozess vorgesehen ist.
4. Verfahren zur Herstellung einer Nanobio-Vorrichtung nach Anspruch 2, wobei die Mikromaschinenbearbeitungstechnik zur Herstellung des Substrats durch Fokusabtastung in einem lichthärtenden Harz unter Verwendung eines Femtosekundenlasers oder eine He-Cd-Lasers vorgesehen ist.
5. Verfahren zur Herstellung einer Nanobio-Vorrichtung, das einen Schritt des Herstellens einer Form für ein Substrat für die Nanobio-Vorrichtung nach einem der Bearbeitungsverfahren nach den Ansprüchen 2 bis 4, einen Schritt des Herstellens eines Substrats aus einer biokompatiblen Substanz durch eine Aufdrucktechnik unter Verwendung der Form als Platte, und einen Schritt des Anordnens einer Mehrzahl kultivierter Zellen auf dem Substrat in einer gewünschten Anordnung umfasst.
6. Verfahren zum Verwenden einer Nanobio-Vorrichtung für Anatomiestrukturnachbildungen durch Auftragen der biokompatiblen Substanz auf das Substrat, das durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4 hergestellt wurde, und Anordnen mehrerer Arten von Zellen auf diesem in einer gewünschten Anordnung als Probenträger für einen Medikamententoxizitätstest.
7. Verfahren zum Verwenden einer Nanobio-Vorrichtung für Anatomiestrukturnachbildungen durch Herstellen eines Substrats mit einer biokompatiblen Substanz im Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, und Anordnen mehrerer Arten von Zellen auf diesem als Material für sich neu bildendes Gewebe.