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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Mikrofluidchips
mit einer Probenteststruktur für
die quantitative Analyse ohne Verwendung eines Instruments.
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Viele
Anwendungen eines klinischen biochemischen Tests konzentrieren sich
auf den Nachweis der spezifischen biochemischen Substanzen oder Pathogene,
die die Gesundheit oder Krankheit eines Patienten oder die Wirkungen
einer medizinischen Behandlung widerspiegeln. Der Nachweis von biologischen
und chemischen Substanzen kann jedoch auch auf die Prüfung auf
Arzneimittelmißbrauch,
auf industrielle Herstellungsprozesse, auf die Erfassung von Umweltverschmutzung
und auf den Test von Pflanzen- und Tierproben angewendet werden.
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Die
Testprobe für
den Test hängt
von der Anwendung ab. Die Arzneimittelprüfung oder der Test von Tierproben
kann Fluide vom Menschen oder von Tieren verwenden, wie z. B. Blut,
Urin, Speichel oder Serum. Ein industrieller Herstellungsprozeß oder eine
Umwelterfassung kann flüssige
Proben vom Herstellungsprozeß und/oder
von der Umgebung verwenden. In der vorliegenden Erfindung wird die verwendete
Flüssigkeit
oder das verwendete Körperfluid
Testprobe genannt. Die unter Verwendung des Streifens oder Biochips
nachzuweisenden verschiedenen spezifischen Komponenten werden Analyten genannt.
Der Analyt in der Testprobe kann eine chemische Substanz, ein Protein,
ein Ligand, eine Nukleinsäure
oder ein pathogener Virus oder Bakterien sein.
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In
Abhängigkeit
von den für
den Test erforderlichen Ergebnissen sind zwei Arten von Anwendungen
möglich:
ein qualitativer Test oder ein quantitativer Test. Der qualitative
Test versucht einfach, die Existenz des Analyten festzustellen.
Wenn der Analyt in einer Menge über
einem speziellen Niveau vorhanden ist, wird entweder ein positives
oder negatives Ergebnis erhalten. Rezeptfreie Schwangerschaftsteststreifen
versuchen beispielsweise festzustellen, ob die Menge des menschlichen
Choriongonadotropins (hCG) in der Urinprobe über einem bestimmten Wert liegt.
Wenn das hCG beispielsweise über
25 mIU/ml liegt, wird das Testergebnis vom Streifen als positiv
betrachtet, ein qualitatives Ergebnis. Ein quantitativer Test bestimmt
die spezielle Menge des Analyten in der Testprobe. Bei einem Cholesterintest spiegelt
beispielsweise der erhaltene Zahlenwert die tatsächliche Konzentration von Cholesterin
im Blut in (mg/dl) wider.
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Biotests
werden unter Verwendung von flüssigen
Reagenzien oder unter Verwendung von trockenen Streifen durchgeführt. Wenn
ein flüssiges
Reagenz verwendet wird, ist häufig
ein großes
Instrument erforderlich, beispielsweise die Bioanalysatoren, die
für Blut-
und Urintests in großen
Krankenhäusern
verwendet werden. Tests mit trockenen Streifen können entweder allein oder mit
Unterstützung
eines tragbaren Instruments durchgeführt werden. Der vorstehend
erwähnte
Schwangerschaftstest verwendet einen Streifen, der Ergebnisse liefert,
die ohne Verwendung irgendeines Instruments direkt vom Streifen
abgelesen werden können.
Der Heimglucosetest ist andererseits ein Beispiel für einen
Test mit trockenem Streifen, der ein tragbares Meßgerät erfordert, um
die Ergebnisse abzulesen.
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Um
Analyten ohne Verwendung eines Instruments zu testen, ist eine Struktur
mit der Fähigkeit, quantitative
Ergebnisse zu liefern, erforderlich. Die Fähigkeit, Vor- und Nachverarbeitungsfunktionen
zu integrieren, wäre
ein am meisten erwünschtes
Merkmal ebenso wie die Verwendung einer vereinfachten Prozedur für nicht-professionelle
Benutzer.
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Die
WO99/46045 A1 beschreibt
die Entwicklung einer Probenströmungssteuerungsvorrichtung und
stellt Verteilerkanäle
und Einströmkanäle mit Querschnittsbereichen
einer solch geringen Größe und Querschnittsfläche dergestalt
bereit, dass der Flüssigkeitstransport
darin durch Kapillarkräfte
erfolgt.
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Die
WO93/22053 A1 offenbart
in
8,
9 Strömungswege, die verbreitet sind,
was im Normalfall ungünstig
ist. Es wird die Änderung
in den optischen Eigenschaften gemessen.
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Die
Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, die Verwendung
eines Mikrofluidchips mit einer Probenteststruktur für die quantitative
Analyse anzugeben, durch die eine quantitative Erfassung eines Analyten
ermöglicht
wird.
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Diese
Aufgabe wird durch die Verwendung eines Mikrofluidchips mit einer
Probenteststruktur gemäß Anspruch
1 gelöst,
wobei die Menge des Analyten durch die Länge des Teils des Mikrofluidkanals angegeben
wird, in dem der Analyt mit den immobilisierten Substanzen reagiert
hat.
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Der
Reaktionsstartpunkt der Probenteststruktur bezeichnet den Startpunkt
der Anordnung der immobilisierten Substanzen im Analyterfassungsbereich.
Die Art der verwendeten immobilisierten Substanzen hängt von
dem Analyten ab, der mit den immobilisierten Substanzen zur Reaktion
gebracht werden soll. Der Reaktionsmechanismus kann eine chemische
Reaktion oder eine Bindungspaarreaktion sein. Im Fall einer Bindungspaarreaktion
können
geeignete Paare von Analyten/immobilisierten Substanzen umfassen,
sind jedoch nicht begrenzt auf Antikörper/Antigene, Rezeptoren/Liganden,
Proteine/Nukleinsäuren,
Nukleinsäuren/Nukleinsäuren, Enzyme/Substrate
und/oder Inhibitoren, Kohlenhydrate (einschließlich Glycoproteinen und Glycolipiden)/Lectine,
Kohlenhydrate und andere Bindungspartner, Proteine/Proteine; und
Protein/kleine Moleküle.
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Die
immobilisierten Substanzen werden am Analytenerfassungsbereich angebracht,
bevor die Testprobe in den Analyterfassungsbereich gelangt. Die
Substanzen können
am Analyterfassungsbereich früh,
während
des Chipherstellungsprozesses, oder später, während des Benutzeranwendungsprozesses,
angebracht werden. Die an Magnetkügelchen befestigten immobilisierten
Substanzen können
beispielsweise unmittelbar, bevor die Analyten auf den Erfassungsbereich
aufgebracht werden, zum Analyterfassungsbereich geliefert werden.
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Durch
Steuern der Geschwindigkeit des Flusses der Probe und/oder Stören der
Probe im Analytenerfassungsbereich werden die Gelegenheiten für den Kontakt
zwischen dem Analyten und den immobilisierten Substanzen erhöht. Die
immobilisierten Substanzen im Mikrofluidkanal reagieren nacheinander
mit dem Analyten in der Probe. Wenn die Reaktion beendet ist, konzentrieren
sich die immobilisierten Substanzen, die mit dem Analyten reagiert haben,
am vorderen Abschnitt des Mikrofluidkanals. Diejenigen Substanzen,
die nicht mit dem Analyten reagiert haben, folgen in der Rückseite
des Kanals. Mit zweckmäßiger Markierung
entweder vor oder nach der Reaktion kann der Abschnitt des Kanals
mit der Reaktion identifiziert und seine Länge gemessen werden. Je länger die
Länge des
Mikrofluidkanals mit der Reaktion in diesem ist, desto höher ist
die Menge des Analyten in der Testprobe.
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In
der vorliegenden Erfindung stellt die Länge des zur Reaktion gebrachten
Mikrofluidkanals denjenigen Teil des Mikrofluidkanals dar, in dem
der Analyt mit den immobilisierten Substanzen reagiert hat. Die
Länge des
zur Reaktion gebrachten Mikrofluidkanals, in dem die Reaktion stattfindet,
beginnt ab dem Reaktionsstartpunkt im Mikrofluidkanal.
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Die
immobilisierten Substanzen sind in der Lage, mit einem festen Träger zu kombinieren,
der entweder ein Teil der Oberfläche
des Mikrofluidkanals sein kann oder an der Oberfläche des
Mikrofluidkanals befestigt sein kann. Der feste Träger wird beispielsweise
mit einer spezifischen funktionalen Gruppe teilweise oder vollständig modifiziert.
Der an der Oberfläche
des Mikrofluidkanals befestigte feste Träger kann aus Nitrocellulose,
Latex, Nylon, Polystyrol oder der Kombination davon ausgewählt sein. Ein
weiteres Beispiel eines an der Oberfläche des Mikrofluidkanals befestigten
festen Trägers
können
Kügelchen,
Teilchen, Magnetteilchen, Glasfaser oder die Kombination davon sein.
Der an der Oberfläche des
Mikrofluidkanals befestigte feste Träger kann auch eine Schicht
aus porösen
Materialien sein. Ein Beispiel von immobilisierten Substanzen und
eines festen Trägers
könnten
Antikörper
sein, die zumindest an einen Teil des Mikrofluidkanals mit den spezifischen
funktionalen Gruppen gebunden sind. Ein weiteres Beispiel von immobilisierten
Substanzen und eines festen Trägers
könnte
ein Antikörper
sein, der an porösen
Materialien innerhalb der Wände
des Mikrofluidkanals befestigt ist.
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Der
Analyterfassungsbereich besteht aus mindestens einer Art von immobilisierter
Substanz in der Testprobe, um mindestens eine Art von Analyt zu erfassen.
Jeder der Mikrofluidkanäle
ist beispielsweise mit einem Reaktionsstartpunkt versehen und eine Art
von immobilisierten Substanzen ist darin angeordnet. Zwei Mikrofluidkanäle sind
beispielsweise mit zwei Reaktionsstartpunkten versehen und in diesen sind
entweder dieselben oder verschiedene Arten von immobilisierten Substanzen
angeordnet, um die Mengen desselben Analyten zu vergleichen oder
die Mengen von zwei Arten von Analyten zu messen.
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In
der Teststruktur ist der Mikrofluidkanal gekrümmt. Eine Vielzahl von Formen
eines gekrümmten
Mikrofluidkanals können
verwendet werden, einschließlich,
jedoch nicht begrenzt auf spiral-, serpentinen-, zickzack-, bogenförmig und
dergleichen. Die gekrümmte
Form des Mikrofluidkanals erstreckt sich auf der Länge des Analyterfassungsbereichs,
ohne einen längeren
Chip zu erfordern. Die Querschnittsabmessung des Kanals kann quadratisch,
rechteckig, halbkreisförmig,
kreisförmig
usw. sein.
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Der
Analyterfassungsbereich kann mit einer Vielzahl von Mikrofluidkanälen parallel,
in Reihe oder der Kombination davon konstruiert sein.
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In
der vorliegenden Teststruktur kann die Fluidantriebsvorrichtung
eine aktive Fluidantriebsvorrichtung, eine passive Fluidantriebsvorrichtung
oder die Kombination davon sein. Eine aktive Fluidantriebsvorrichtung
ist eine gespeiste Vorrichtung zum Kontrollieren der Geschwindigkeit
des Flusses der Probe durch den Mikrofluidkanal. Die aktive Fluidantriebsvorrichtung
ist mit zumindest einem Teil des Analyterfassungsbereichs gekoppelt
und ist in der Lage, die Geschwindigkeit des Flusses über die
Zeit zu verändern,
so daß der
Analyt nacheinander mit den nicht-reaktiven immobilisierten Substanzen
im Mikrofluidkanal reagiert. In einem Beispiel ist die aktive Fluidantriebsvorrichtung
eine Pumpe. Die Pumpe kann eine Pumpe auf dem Chip wie z. B. die
Mikropumpe, die durch einen Photolithographieprozeß hergestellt
wird, oder eine Pumpe außerhalb
des Chips sein. Die Art von Pumpe kann eine Spritzenpumpe, eine
peristaltische Pumpe oder ein Mechanismus sein, der das Gas im Kanal
zusammenziehen kann, wobei er es durch elektrische Leistung, mechanische
Leistung, einen manuellen Vorgang, eine chemische Reaktion, die
einen Gasverbrauch verursacht, die physikalische Änderung
des Kammervolumens, Niederdruck- oder Hochdruckkammer-Anschluß usw. vorwärts schiebt.
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In
der vorliegenden Erfindung ist die passive Fluidantriebsvorrichtung
in der Lage, eine Kapillarwirkung zu erzeugen, um den Fluidfluß in dem
Mikrofluidkanal des Analytenerfassungsbereichs anzutreiben. Die
hydrophile/hydrophobe Eigenschaft der Mikrofluidkanalmaterialien
kann beispielsweise die automatische Vorwärtsgeschwindigkeit steuern,
so daß der
Analyt die Möglichkeit
hat, nacheinander mit den immobilisierten Substanzen zu reagieren,
die im Mikrofluidkanal aufgereiht sind. Die Vorwärtsgeschwindigkeit der Probe
in einem Mikrofluidkanal, der aus dem hydrophilsten Material besteht,
wäre beispielsweise
schneller als in jenem, der aus einem weniger hydrophilen Material
besteht.
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Der
Mikrofluidkanal des Analyterfassungsbereichs umfaßt ferner
ein passives Fluidmodulationselement, das in der Lage ist, die Geschwindigkeit
des Flusses einzustellen und/oder das Fluid im Mikrofluidkanal zu
stören,
um die Gelegenheit für
einen Kontakt zwischen dem Analyten und den immobilisierten Substanzen
zu erhöhen.
Passive Modulationselemente umfassen, sind jedoch nicht begrenzt
auf die lokale Modifikation der Abmessungen oder Formen des Mikrofluidkanals;
eine teilweise oder vollständige Modifikation
der inneren Oberfläche
eines Abschnitts des Mikrofluidkanals unter Verwendung von Materialien,
die aus hydrophilen Materialien, hydrophoben Materialien oder einer
Kombination davon ausgewählt
sind; versehen mit Vorsprüngen
oder Vertiefungen an der inneren Oberfläche des Mikrofluidkanals. Passive
Fluidmodulationselemente können
mit einer aktiven oder passiven Fluidantriebsvorrichtung verwendet
werden.
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Die
Materialien der Probenteststruktur für die vorliegende Erfindung
sind entweder hydrophil oder hydrophob. Eine Art von Struktur, die
bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ist aus oberen
und unteren Substraten konstruiert. Eine weitere ist aus einem Substrat
und einem Klebeband konstruiert. Eine weitere aus zwei oder mehr
Substraten.
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Die
Probenteststruktur des Mikrofluidchips für die quantitative Analyse
kann ferner einen Vorbehandlungsmechanismus umfassen, der sich zwischen
der Probeneinlaßöffnung und
dem Analyterfassungsbereich befindet, um die Modulation der in den
Analyterfassungsbereich gelangten Probe zu unterstützen. Ein
Vorbehandlungsmechanismus kann einen Mechanismus zum Markieren des
Analyten in der Testprobe beinhalten. Analytmarkierungsverfahren
umfassen, sind jedoch nicht begrenzt auf: Enzyme, Fluoreszenz, Lumineszenz,
Nanoteilchen oder andere Substanzen, die in der Lage sind, Anzeigefarben
zur Markierung zu präsentieren.
Ein weiterer Vorbehandlungsmechanismus kann einen Volumenkontrollmechanismus
zum Modulieren des Volumens der in den Analyterfassungsbereich gelangenden
Testprobe oder einen Mechanismus zum Modulieren der Konzentration
der in den Analyterfassungsbereich gelangenden Testprobe beinhalten.
Vorbehandlungsprozeduren können
beispielsweise die Verdünnung oder
Konzentration der Probe oder einen Probenbestandteils-Modulationsbereich,
das Beseitigen von Bestandteilen oder Zugeben weiterer Bestandteile zur
Probe, wie z. B. Entfernen von Blutkörperchen in einer ganzen Blutprobe,
oder ein Mischelement zum Mischen von Bestandteilen in der Probe
oder ein Entgasungselement zum Ausschließen von Luftblasen aus der
Probe umfassen.
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Die
Probenteststruktur kann ferner einen Nachbehandlungsmechanismus
umfassen, der mit zumindest einem Teil des Analyterfassungsbereichs verbunden
ist, um die Fähigkeit
vorzusehen oder zu verbessern, zur Reaktion gebrachte von nicht
zur Reaktion gebrachten immobilisierten Substanzen zu unterscheiden.
Ein Nachbehandlungsmechanismus könnte
ein Markierungsmechanismus zum Vorsehen von Materialien zum Markieren
der Substanzen, die reagiert haben, jedoch nach der Reaktion im
Kanal geblieben sind, sein. Ein weiterer Nachbehandlungsmechanismus
könnte
ein Mechanismus zum Waschen des Analyterfassungsbereichs nach der
Reaktion, um die Signalableseergebnisse zu verbessern, sein.
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Bei
der Teststruktur umfaßt
der Analyterfassungsbereich ferner mindestens eine beschriftete Skala
zum Definieren oder Berechnen der Menge des Analyten in der Testprobe.
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Die
vorliegende Erfindung beschreibt einen quantitativen Test für einen
Zielanalyten in einer Testprobe. Es umfaßt: Vorsehen einer Testprobe;
Einführen
der Testprobe in einen Mikrofluidkanaleingang, wobei der Mikrofluidkanal
mit einem Reaktionsstartpunkt versehen ist, der mit der Anordnung
einer Vielzahl von immobilisierten Substanzen an diesem beginnt,
wobei die immobilisierten Substanzen in der Lage sind, mit dem Analyten
zu reagieren; Steuern der Fließgeschwindigkeit
der Testprobe im Mikrofluidkanal, wobei die Länge des zur Reaktion gebrachten
Mikrofluidkanals die Analytenmenge widerspiegelt, nachdem der Analyt
mit den immobilisierten Substanzen reagiert hat.
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Die
Ausführung
des Tests umfasst ferner dass Markieren des Analyten: Enzyme, Fluoreszenz, Lumineszenz,
Nanoteilchen oder andere Substanzen, die in der Lage sind, Farben
anzuzeigen.
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Die
Struktur der Probenteststruktur im Mikrofluidchip für die quantitative
Analyse umfaßt:
eine Probeneinlaßöffnung,
um eine Testprobe einzugeben; einen Analyterfassungsbereich, der
mit der Probeneinlaßöffnung gekoppelt
ist und aus mindestens einem gekrümmten Mikrofluidkanal besteht,
in dem eine Vielzahl von immobilisierten Substanzen, die in der
Lage sind, mit dem Analyten zu reagieren, angeordnet sind; und eine
aktive Fluidantriebsvorrichtung, die in der Lage ist, die Geschwindigkeit
des Flusses der Testprobe durch den Analyterfassungsbereich zu steuern,
was ermöglicht,
daß die
Menge des Analyten durch die Länge
des Teils des Mikrofluidkanals angegeben wird, in dem der Analyt
mit den immobilisierten Substanzen reagiert hat.
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Die
Struktur umfasst einen Volumenkontrollmechanismus, der sich zwischen
der Probeneinlaßöffnung und
dem Analyterfassungsbereich befindet, um das Volumen der in den
Analyterfassungsbereich gelangenden Probe zu modulieren. Die bevorzugte Art
der vorliegenden Erfindung verwendet eine Pumpe als aktive Fluidantriebsvorrichtung.
Die bevorzugte Art der vorliegenden Erfindung beinhaltet ein passives
Fluidmodulationselement im Mikrofluidkanal des Analyterfassungsbereichs.
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Weitere
Aufgaben, Vorteile und neuen Merkmale der Erfindung werden aus der
folgenden Beschreibung sowie aus den zugehörigen Zeichnungen ersichtlich.
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Es
zeigen:
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1 ist
ein typischer Streifen und die vergrößerte Figur eines Teils des
Bildes.
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2 ist
eine praktische Art der quantitativen Analyse eines Analyten unter
Verwendung des Mikrofluidchips unter Verwendung einer aktiven Fluidantriebsvorrichtung.
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3a ist
die quantitative Analyse eines Analyten unter Verwendung des Mikrofluidchips,
welche die Beziehung der Fließgeschwindigkeit
als Funktion der Zeit der aktiven Fluidantriebsvorrichtung, wobei
Fluide mit derselben Geschwindigkeit angetrieben werden, zeigt.
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3b(A)–(D)
ist die quantitative Analyse eines Analyten unter Verwendung des
Mikrofluidchips, welche die Beziehung der Fließgeschwindigkeit als Funktion
der Zeit der aktiven Fluidantriebsvorrichtung, wobei Fluide mit
einer Vielzahl von Geschwindigkeiten angetrieben werden, zeigt.
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4a ist
eine praktische Art der quantitativen Analyse eines Analyten unter
Verwendung des Mikrofluidchips, wobei die Vielzahl von immobilisierten
Substanzen nicht-kontinuierlich angeordnet sind.
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4b ist
eine weitere praktische Art der quantitativen Analyse eines Analyten
unter Verwendung des Mikrofluidchips, wobei die Vielzahl von immobilisierten
Substanzen nicht-kontinuierlich angeordnet sind.
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5a ist
eine praktische Art der quantitativen Analyse eines Analyten unter
Verwendung des Mikrofluidchips, wobei die Vielzahl von passiven
Fluidmodulationselementen an willkürlichen Stellen im Mikrofluidkanal
angeordnet sind.
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5b ist
eine praktische Art der quantitativen Analyse eines Analyten unter
Verwendung des Mikrofluidchips, wobei die Vielzahl von passiven
Fluidmodulationselementen durch die speziellen Substanzen im teilweisen
oder vollständigen
Modulationsmikrofluidkanal ausgebildet sind.
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5c ist
eine praktische Art eines Fluidmodulationselements, das durch lokale
Modifikation an den Abmessungen oder Formen des Mikrofluidkanals
ausgebildet ist.
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5d ist
eine praktische Art eines Fluidmodulationselements, das durch Versehen
mit Vorsprüngen
oder Vertiefungen an der inneren Oberfläche des Mikrofluidkanals ausgebildet
ist.
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6a ist
ein Beispiel der Markierungsskala des Mikrofluidkanals bei der quantitativen
Analyse eines Analyten unter Verwendung des Mikrofluidchips.
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6b ist
ein weiteres Beispiel der Markierungsskala des Mikrofluidkanals
bei der quantitativen Analyse eines Analyten unter Verwendung des
Mikrofluidchips.
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7 ist
ein Beispiel der spezifischen Auslegung der Abmessung des Mikrofluidkanals,
um die Genauigkeit der Ablesung bei der quantitativen Analyse eines
Analyten unter Verwendung des Mikrofluidchips zu verbessern.
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8 ist
eine praktische Art des Analyterfassungsbereichs, der mit einer
Vielzahl von Mikrofluidkanälen
konstruiert ist, die seriell verbunden sind, bei der quantitativen
Analyse eines Analyten unter Verwendung des Mikrofluidchips.
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9 ist
eine praktische Art des Analyterfassungsbereichs, der mit einer
Vielzahl von Mikrofluidkanälen
konstruiert ist, die seriell und parallel verbunden sind, bei der
quantitativen Analyse eines Analyten unter Verwendung des Mikrofluidchips.
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10a ist eine praktische Art der quantitativen
Analyse eines Analyten unter Verwendung des Mikrofluidchips, wobei
ein Vorbehandlungsmechanismus mit diesem verbunden ist.
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10b ist eine praktische Art der quantitativen
Analyse eines Analyten unter Verwendung des Mikrofluidchips, wobei
ein Nachbehandlungsmechanismus mit diesem verbunden ist.
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10c ist eine praktische Art der quantitativen
Analyse eines Analyten unter Verwendung des Mikrofluidchips, wobei
sowohl ein Vorbehandlungsmechanismus als auch ein Nachbehandlungsmechanismus
mit diesem verbunden sind.
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10d ist eine weitere praktische Art der quantitativen
Analyse eines Analyten unter Verwendung des Mikrofluidchips, wobei
sowohl ein Vorbehandlungsmechanismus als auch ein Nachbehandlungsmechanismus
mit diesem verbunden sind.
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In
der vorliegenden Erfindung wird eine Analytenteststruktur verwendet,
die in der Lage ist, quantitative Tests ohne Verwendung eines Instruments durchzuführen. Wie
in 2 gezeigt, besteht die Struktur 1 aus:
einer Probeneinlaßöffnung 2 zum
Eingeben einer Testprobe; einem Analyterfassungsbereich 3 mit
mindestens einem Mikrofluidkanal 4, der mit der Probeneinlaßöffnung 2 gekoppelt
ist. Der Mikrofluidkanal 4 weist eine Vielzahl von immobilisierten
Substanzen 43 (in 2 als horizontale
Linien gezeigt) ab dem Reaktionsstartpunkt 41 auf. Die
immobilisierten Substanzen sind in der Lage, mit dem Analyten zu
reagieren. Die Menge der immobilisierten bzw. fixierten Substanzen übersteigt
häufig
die Menge des Analyten, die für
die Reaktion erforderlich sein kann. Die immobilisierten Substanzen
sind an einem festen Träger
(beispielsweise ist der feste Träger
ein Teil der Mikrofluidkanaloberfläche) und einer Fluidantriebsvorrichtung,
die in der Lage ist, die Geschwindigkeit des Flusses der Testprobe
im Analyterfassungsbereich 3 zu kontrollieren, angebracht.
Der Analyt reagiert mit den immobilisierten Substanzen 43 nacheinander
ab dem Reaktionsstartpunkt 41. Die immobilisierten Substanzen,
die reagieren, konzentrieren sich am vorderen Abschnitt des Mikrofluidkanals 4.
Die Länge
des Mikrofluidkanals, die reagiert hat (der Abschnitt mit kräftiger Farbe
in 2), spiegelt daher die Menge des Analyten wider.
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Der
Analyterfassungsbereich 3 umfaßt eine Skala 6 zum
Ablesen der Länge
des Kanals, die reagiert hat, oder der kalibrierten Menge des Analyten. Die
Skala kann Zahlen sein, die auf den Analyterfassungsbereich 3 gedruckt
oder an diesem angebracht sind, oder spezielle geometrische Merkmale
des Mikrofluidkanals sein, die dazu ausgelegt sind, die Pegel des
Analyten darzustellen.
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Die
Fluidantriebsvorrichtung kann entweder eine aktive Fluidantriebsvorrichtung,
eine passive Fluidantriebsvorrichtung oder die Kombination der beiden
sein. Eine aktive Fluidantriebsvorrichtung 51 ist eine
gespeiste Vorrichtung, die in der Lage ist, die Probe im Mikrofluidkanal
in einer Vielzahl von Muster anzutreiben, wie z. B. einer konsistent
langsamen Vorwärtsbewegung
(3a), einer abwechselnden Hin- und Herbewegung
(wobei der Vorwärtsschritt größer ist
als der Rückwärtsschritt,
so daß die
Gesamtwirkung eine Vorwärtsbewegung
ist) oder einer abwechselnden Stop-And-Go-Bewegung (3b(A)–(D)). Durch
Verlängern
der Probenhaltezeit und/oder durch Erzeugen einer Flußturbulenz existieren
ausreichend Gelegenheiten für
einen Kontakt zwischen dem Analyten und den immobilisierten Substanzen.
Fließmuster
an sich ermöglichen
sequentielle Reaktionen mit den immobilisierten Substanzen 43 ab
dem Reaktionsstartpunkt 41. Eine aktive Fluidantriebsvorrichtung 51 kann
eine Vorrichtung sein, die in der Lage ist, die Geschwindigkeit
des Fluidflusses über
die Zeit zu verändern,
beispielsweise eine Pumpe, die mit mindestens einem Teil des Analyterfassungsbereichs 3 gekoppelt
ist.
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In
einem Beispiel der Teststruktur ist eine Mulde zwischen dem Mikrofluidkanal
des Analyterfassungsbereichs und der aktiven Fluidantriebsvorrichtung
zum Sammeln von Flüssigkeitsabfall
vorgesehen. Die Pumpe wird abgeschaltet, nachdem die Testprobe ihre
Reaktion vollendet und in die Abfallsammelmulde fließt.
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In
einem weiteren Beispiel der Teststruktur sind eine Vielzahl von
immobilisierten Substanzen kontinuierlich (wie in 2 gezeigt)
oder unstetig (wie in den 4a, 4b gezeigt)
im Mikrofluidkanal angeordnet.
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In
einem weiteren Beispiel der Teststruktur treibt die passive Fluidantriebsvorrichtung
den Fluß durch
Kapillarwirkung innerhalb des Mikrofluidkanals an.
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Unter
Verwendung von Materialien mit den geeigneten hydrophilen/hydrophoben
Eigenschaften für
den Mikrofluidkanal kann die Fließgeschwindigkeit der Probe
kontrolliert werden, um eine sequentielle Reaktion zwischen dem
Analyten und den immobilisierten Substanzen zu ermöglichen.
Die Vorwärtsgeschwindigkeit
der Probe in einem Mikrofluidkanal, der aus dem hydrophilsten Material
besteht, ist beispielsweise schneller als jene in einem Mikrofluidkanal,
der aus einem weniger hydrophilen Material besteht.
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In
einem weiteren Beispiel besteht die Probenteststruktur aus zwei
Substraten. Eines der Substrate weist Muster von offenen Kanälen und
Mulden auf und das andere Substrat ist entweder flach oder weist
auch Muster auf. Das Verbinden der zwei Substrate bildet die Probenteststruktur,
die ermöglicht, daß Flüssigkeit
innerhalb der Kanäle
und Mulden fließt
und alle Arten von Aufgaben ausgeführt werden. Ein weiteres Beispiel
der Probenteststruktur besteht aus einem Substrat und einem Klebeband.
Ein weiteres ist aus zwei oder mehr Substraten konstruiert.
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Die
Materialien der Probenteststruktur für die vorliegende Erfindung
sind entweder hydrophil oder hydrophob. Strukturmaterialien können ausgewählt werden
aus, sind jedoch nicht begrenzt auf Polydimethylsiloxan (PDMS),
Polycarbonat (PC), zyklische Olefincopolymere (COC), Polystyrol
(PS), Polymethylmethacrylat (PMMA), Silikon, PU, PEEK-ABS, PP, PET,
PTFE, PVDF, POM, UPE, HOPE, PVC, Glass, Silizium oder eine Kombination
aus zwei oder mehreren von diesen.
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Die
Probenteststruktur im Mikrofluidchip für die quantitative Analyse
umfaßt
ferner ein oder mehrere passive Fluidmodulationselemente, die in
der Lage sind, die Geschwindigkeit des Flusses einzustellen und/oder
das Fluid im Mikrofluidkanal zu stören, um die Gelegenheit für einen
Kontakt zwischen dem Analyten und den immobilisierten Substanzen zu
erhöhen.
Die mehreren Fluidmodulationselemente 52 können an
einer beliebigen Stelle innerhalb des Mikrofluidkanals angeordnet
werden, wie in 5a gezeigt. 5b zeigt
ein weiteres Ausführungsbeispiel
des passiven Fluidmodulationselements. Das passive Fluidmodulationselement 52 ist
durch Modifizieren der Oberfläche
innerhalb des Mikrofluidkanals ausgebildet, wie der in 5b gezeigte
schraffierte Bereich. Spezifische funktionale Gruppen, hydrophile
und/oder hydrophobe Materialien sind mögliche Materialien, die zur
Oberflächenmodifikation verwendet
werden, so daß die
lokale Fließgeschwindigkeit
optimal eingestellt werden kann, während die Probe in verschiedene
Abschnitte des Analyterfassungsbereichs gelangt. 5C zeigt
ein weiteres Ausführungsbeispiel
des passiven Fluidmodulationselements 52, in dem eine lokale
Modifikation an den Abmessungen oder Formen des Mikrofluidkanals
angewendet wird, um die Fließgeschwindigkeit
einzustellen oder einen turbulenten Fluß zu fördern. 5d zeigt
ein weiteres Ausführungsbeispiel
des passiven Fluidmodulationselements 52, in dem Vorsprünge oder
Vertiefungen an der inneren Oberfläche des Mikrofluidkanals gestaltet
sind, auch um die Fließgeschwindigkeit
einzustellen oder einen turbulenten Fluß zu fördern, so daß die Kontaktgelegenheit
zwischen dem Analyten und den immobilisierten Substanzen erhöht wird.
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Um
die Menge des Analyten in der Probe zu bestimmen, umfasst der Analyterfassungsbereich 3 eine
Skala 6, um den Analyten zu quantifizieren. Die Skala kann
Zahlen sein, die auf den Analyterfassungsbereich 3 gedruckt
oder an diesem angebracht sind, oder spezielle geometrische Merkmale
des Mikrofluidkanals sein, die dazu ausgelegt sind, die Pegel des
Analyten darzustellen. Der Benutzer kann beispielsweise die Kanalbiegungsstelle
erkennen, an der der Kanal mit der Reaktion endet, und diese mit dem
Pegel der Analytkonzentration in Beziehung bringen. 6a zeigt
ein Ausführungsbeispiel
der Skala 6 nahe dem Analyterfassungsbereich 3,
durch die der Pegel von niedrig, mittel und hoch leicht abgeschätzt werden
kann. 6b zeigt einen Analyterfassungsbereich 3 mit
mehreren Biegungen und eine Skala mit einer feineren Auflösung, um
den Analyten zu quantifizieren.
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Die
Dicke der Mikrofluidkanäle
kann auch eingestellt werden, um die Ableseauflösung zu verbessern, wie in 7 gezeigt.
Ein dünner
Kanal ist bevorzugt, wenn eine höhere
Auflösung
beim Ablesen erforderlich ist, während
ein dicker bevorzugt ist, wenn die Auflösung kein Problem ist, aber
das Minimieren der Fläche
des Chips. In einem weiteren Ausführungsbeispiel der Mengenablesung
kann das geometrische Merkmal und/oder die beschriftete Skala allein
oder zusammen verwendet werden, um das Ablesen zu unterstützen.
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Die
Skala kann die Länge
des Kanals, die reagiert hat, angeben, dann kann die Ablesung in
die echte Menge des Analyten durch eine Nachschlagetabelle oder
eine Kalibrierungskurve umgewandelt werden. Oder die Skala kann
direkt die kalibrierte Menge des Analyten ohne manuelle Umwandlung angeben.
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8 zeigt
ein Beispiel der Probenteststruktur 1 im Mikrofluidchip
für die
quantitative Analyse, welche eine Probeneinlaßöffnung 2, einen Analyterfassungsbereich 3,
der aus einer Vielzahl von Mikrofluidkanälen, beispielsweise zwei Mikrofluidkanälen 4,
die in der Weise einer Reihenverbindung konstruiert sind, konstruiert
ist, und eine aktive Fluidantriebsvorrichtung 51, beispielsweise
eine Pumpe, umfaßt. Ein
Mikrofluidkanal ist mit einem Reaktionsstartpunkt versehen, der
dort beginnt, wo die immobilisierten Substanzen angeordnet sind.
An einem Mikrofluidkanal ist eine Art der immobilisierten Substanzen 43 angebracht.
Zwei Mikrofluidkanäle
sind beispielsweise mit zwei Reaktionsstartpunkten versehen und
an diesen können
dieselben oder verschiedene Arten von immobilisierten Substanzen
für die
Zwecke eines Tests mit mehreren Analyten, eines Vergleichs, einer Bezugnahme
oder einfach als Kontrolle angebracht sein.
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9 zeigt
ein Beispiel der Probenteststruktur 1 im Mikrofluidchip
für die
quantitative Analyse der vorliegenden Erfindung, welche eine Probeneinlaßöffnung 2,
einen Analyterfassungsbereich 3, der aus einer Vielzahl
von Mikrofluidkanälen,
beispielsweise vier Mikrofluidkanälen 4, die in der
Weise einer Reihen/Parallel-Verbindung
konstruiert sind, konstruiert ist, und eine aktive Fluidantriebsvorrichtung 51,
beispielsweise eine Pumpe, umfaßt.
Jeder Mikrofluidkanal ist mit einem Reaktionsstartpunkt versehen,
nach dem eine Art der immobilisierten Substanzen 43 angebracht
ist. In einem Zweig sind zwei Mikrofluidkanäle jeweils mit ihren eigenen
Reaktionsstartpunkten mit derselben oder einer unterschiedlichen
Art von immobilisierten Substanzen für einen Test mit mehreren Analyten,
zum Vergleich oder als Kontrolle angeordnet.
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In
einem weiteren Ausführungsbeispiel
der Probenteststruktur für
die quantitative Analyse umfaßt
die Struktur mehrere Probeneinlässe,
mindestens einen Analyterfassungsbereich und mindestens eine Fluidantriebsvorrichtung.
Dieselben oder verschiedene Arten von immobilisierten Substanzen können am
Mikrofluidkanal innerhalb des Analyterfassungsbereichs angebracht
sein.
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In
einem weiteren Ausführungsbeispiel
der Probenteststruktur können
die immobilisierten Substanzen, die im Mikrofluidkanal angeordnet
sind, aus der Liste von Antikörper,
Antigen, Nukleinsäure,
Ligand, Rezeptor, Enzymen, Peptid oder Protein oder anderen biologischen
oder chemischen Substanzen ausgewählt werden, sind jedoch nicht
darauf begrenzt, um sie auf die Art des zu erfassenden Analyten
abzustimmen.
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Wie
in den 10a, 10b, 10c und 10d gezeigt,
kann die Probenteststruktur ferner einen Vorbehandlungsmechanismus 61 oder
einen Nachbehandlungsmechanismus 71 umfassen. Ein Vorbehandlungsmechanismus 61 zum
Modulieren der Probenbedingung könnte
beispielsweise zwischen der Probeneinlaßöffnung 2 und dem Analyterfassungsbereich 3 angebracht
sein, wie in 10a gezeigt. Die Teststruktur
kann ferner einen Nachbehandlungsmechanismus 71 umfassen,
um die Identifikation des Analyten im Analyterfassungsbereich vorzusehen
oder zu verbessern, wie in 10b gezeigt.
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Die
Probenteststruktur kann eine Kombination eines Vorbehandlungsmechanismus 61 und
eines Nachbehandlungsmechanismus 71 umfassen, wie in den 10c und 10d gezeigt.
Der Vorbehandlungsmechanismus 61 kann einen Analytmarkierungsmechanismus
zum Markieren des Analyten der Probe umfassen. Verfahren zum Markieren
des Analyten umfassen Enzym, Fluoreszenz, Lumineszenz, Nanoteilchen
oder andere Substanzen, die mit einem Farbeffekt versehen sind.
Der Analyt kann beispielsweise mit Farbteilchen oder einen Antikörper bindenden
Farbteilchen konjugiert werden. Moleküle mit Färbefähigkeit können auch an den Analyten gebunden
werden. Der Vorbehandlungsmechanismus kann auch einen Volumenkontrollmechanismus,
um das in den Analyterfassungsbereich eingelassene Volumen zu kontrollieren;
oder einen Probenkonzentrations-Modulationsmechanismus zum Verdünnen oder Konzentrieren
der Probe; oder einen Probenzusammensetzungs-Modulationsmechanismus, um Probe zu
beseitigen, hinzuzufügen
oder deren Zusammensetzung zu ändern,
beispielsweise Entfernen oder Zerstören der Blutkörperchen
im Blut; oder ein Mischelement, um die Gleichmäßigkeit der Lösung zu
verbessern; oder ein Entgasungselement, um Luftblasen in der Probe
auszuschließen,
umfassen.
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Der
Nachbehandlungsmechanismus kann ein Waschmechanismus sein, um den
Analyterfassungsbereich nach der Reaktion zu waschen.
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In
einem weiteren Beispiel der Teststruktur kann auch ein Instrument
verwendet werden, um die Marker des Analyten zu lesen, ob sich die
Marker im sichtbaren Lichtspektrum befinden oder nicht. Dann kann
die Länge
des Kanals mit Reaktionen gemessen werden und der Analyt quantifiziert
werden. Der Vorteil der Anwendung eines Lesegeräts besteht darin, daß das verwendete
Lesegerät
nicht sehr empfindlich sein muß.
Da die zur Reaktion gebrachten immobilisierten Substanzen in einem
kompakten Bereich kondensieren, ist das Lesesignal des Bereichs hoch,
die Empfindlichkeitsanforderung des Leseinstruments ist nicht so
kritisch, wie es der Fall ist, wenn die vorliegende Erfindung nicht
angewendet wird.
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Die
folgenden Beispiele werden verwendet, um die Vorteile der vorliegenden
Erfindung weiter zu demonstrieren.
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Beispiel 1: Anwenden einer Geschwindigkeitskontrolle
auf einen quantitativen Test des Analyten
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In
diesem Beispiel wurden eine Photolithographie eines MEMS-Prozesses
und Polymermaterialen angewendet, um die Probenteststruktur herzustellen.
Zwei Proben mit verschiedenen Mengen des Analyten wurden unter Verwendung
der in der vorliegenden Erfindung dargestellten quantitativen Analytenteststruktur
getestet. Die Struktur war aus einem oberen und einem unteren Substrat
konstruiert. Das obere Substrat bestand aus einem hydrophoben Polymer,
auf dem ein dünner
Serpentinenkanal als Probenweg fungiert und zwei Mulden an seinen
zwei Enden als Probeneinlaßöffnung und
Abfallmulde fungieren. Das untere Substrat bestand aus Glas, an
das chemische Funktionsgruppen gepfropft waren. Die Anordnung der
zwei Substrate bildete die Probenteststruktur. Eine externe Pumpe
wurde an die Abfallmulde angeschlossen, um die Probe im Mikrofluidkanal
sowohl in der Breite als auch Tiefe 100 μm anzutreiben. Die Anordnung
des Chips ist ähnlich
zu der in 2 gezeigten, wobei jeder gerade
Abschnitt des U-förmigen
Kanals (L) 8 mm lang ist. EDTA-Pulver, das gerinnungshemmende Mittel,
wurde lose an der Probeneinlaßöffnung angeordnet.
Ab dem Reaktionsstartpunkt 41 wurde Ziegen-Anti-Maus-IgG,
5,6 mg/ml, immobilisiert, um den in ganzem Blut vermischten Analyten
Maus-IgG C zu erfassen. Der Analyt wurde mit kolloidalem Gold markiert,
um eine sichtbare rosa Farbe zu zeigen. Eine Probenfließgeschwindigkeit
von 0,8 mm/min wurde in diesem Fall angewendet, um eine ausreichende
Reaktion zu ermöglichen.
Zwei Chips wurden gleich verwendet, um zwei Proben zu testen: der
Chip 1 und Chip 2 empfingen dieselbe Konzentration der Probe Maus-IgG CGC,
OD540 = 50, jedoch mit unterschiedlichen Volumina – 1,5 μl bzw. 3 μl. Die Probe
wurde in die Einlaßmulde
gefüllt,
durch die Pumpe angetrieben und mit den immobilisierten Substanzen
an der Wand des Kanals zur Reaktion gebracht. Die Ergebnisse zeigten,
daß bei
der korrekten Fließgeschwindigkeitskontrolle
die immobilisierten Substanzen, die reagierten, hauptsächlich am
vorderen Abschnitt des Kanals angeordnet waren, während der
hintere Abschnitt des Kanals in der Farbe unverändert bleibt, da die Analyten
am vorderen Abschnitt verbraucht wurden. Durch Beobachten der Länge des
rosa Abschnitts, der reagierte, kann die Menge des Analyten kalibriert
werden.
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Nach
der Reaktion war die Länge
des Kanals, die reagierte, 88 mm +/– 4 mm auf dem Chip 1 und 160
mm +/– 8
mm auf dem Chip 2. Die Ergebnisse deuteten darauf hin, daß die Menge
des Analyten im Chip 1 die Hälfte
von jener des Chips 2 war, wie erwartet wurde. Die Ergebnisse zeigten,
daß das
Antreiben der Probe mit der zweckmäßigen Geschwindigkeit durch
einen dünnen,
langen und gekrümmten Mikrofluidkanal
die sequentielle Reaktion von immobilisierten Substanzen ermöglicht,
was die quantitative Messung des Analyten auf der Basis der Messung der
Länge des
Kanals, die reagierte, ermöglicht.
Kein Instrument war erforderlich, um die Ergebnisse in diesem Beispiel
zu lesen.
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Beispiel 2: Anwenden einer Geschwindigkeitskontrolle
und von lokalen Maßmodifikationen
auf einen quantitativen Test des Analyten
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In
diesem Beispiel waren die verwendeten Materialien und der auf die
Teststruktur angewendete Herstellungsprozeß dieselben wie jene in Beispiel
1. Dieses Beispiel unterscheidet sich jedoch vom vorangehenden darin,
daß lokale
Modifikationen an den Abmessungen des Kanals bestanden – eine Art
von passiven Fluidmodulationselementen wurde im vorliegenden Fall
eingeführt.
Im Analytenerfassungsbereich wurde der 300 um breite Kanal in der
Breite asymmetrisch auf 150 μm
in jedem Abstand von 2 mm verringert.
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Eine
Probenteststruktur im Mikrofluidchip modulierte in diesem Fall die
Reaktion durch Kontrollieren der Fließgeschwindigkeit und durch
Veränderungen
der geometrischen Formen des Mikrofluidkanals für die quantitative Analytenanalyse.
Ziegen-Anti-Maus-IgG,
5,6 mg/ml, wurde an der Wand des Kanals immobilisiert. Eine aktive
externe Pumpe wird verwendet, um die Probe anzutreiben, was veranlaßt, daß sie mit
12 mm/min, schneller als die in Beispiel 1, fließt. Zwei verschiedene Proben
wurden an zwei Chips derselben Art getestet. Der Chip 1 hatte 4 μl des markierten
Analyten Maus- IgG
CGC, OD540 = 50, während
der Chip 2 2 μl
des markierten Analyten Maus-IgG CGC, OD540 = 50, verdünnt in 2 μl Wasser,
hatte. Die Testprozedur war dieselbe wie in Beispiel 1. Die Länge des
rosa Kanals, die reagierte, für den
Chip 1 war 136 mm +/– 20
mm. Für
den Chip 2 war sie 72 mm +/– 16
mm. Das Verhältnis
der Längen der
zwei Chips entsprach dem Verhältnis
der Mengen des in die Chips gefüllten
Analyten.
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Beispiel 3: Anwenden einer Geschwindigkeitskontrolle
und von Modifikationen an der lokalen Abmessung und Form auf einen
quantitativen Test des Analyten
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In
diesem Beispiel waren die verwendeten Materialien, der angewendete
Herstellungsprozeß und
die abwechselnde Breite des Kanals (300 μm volle Breite, asymmetrisch
verschmälert
auf 150 μm) in
der Teststruktur dieselben wie jene in Beispiel 2. Der Fluß wurde
mit 12 mm/min wie in Beispiel 2 angetrieben.
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In
diesem Beispiel waren jedoch Vorsprünge im Analyterfassungsbereich
angeordnet, so daß ein lokaler
turbulenter Fluß die
Gelegenheit für
einen Kontakt zwischen dem Analyten und den immobilisierten Substanzen
verbesserte. Ziegen-Anti-Maus-IgG, 5,6 mg/ml, wurde an der Wand
des Kanals immobilisiert.
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Eine
aktive externe Pumpe wurde verwendet, um die Probe anzutreiben,
was veranlaßte,
daß sie
mit 12 mm/min, schneller als in Beispiel 1, floß. Zwei verschiedene Proben
wurden an zwei Chips derselben Art getestet. Der Chip 1 hatte 6 μl markierten
Analyten Maus-IgG CGC, OD540 = 50, während der Chip 2 3 μl markierten
Analyten Maus-IgG CGC, OD540 = 50, in 3 μl Wasser verdünnt, die
halbe Konzentration von jener im Chip 1, hatte. Die Testprozedur
war dieselbe wie in Beispiel 2. Die Länge des rosa Kanals, die reagierte,
für den
Chip 1 war 112 mm +/– 8
mm. Die Länge
des rosa Kanals, die reagierte, für den Chip 2 war 64 mm +/– 8 mm.
Das Verhältnis der
Längen
der zwei Chips entsprach dem Verhältnis der Mengen des in die
Chips gefüllten
Analyten. Schlußfolgerungen
können
aus diesen Beispielen gezogen werden, die darauf hindeuten, daß die Probenteststruktur
in der vorliegenden Erfindung die quantitative Messung von Analyt
in der Probe ermöglicht.
Kein Leseinstrument wurde in irgendeinem dieser drei Beispiele verwendet.