DE102005047301B4

DE102005047301B4 - Verfahren zum Nachweis der Virenabreicherung für die Validierung von Filtern und Filtrationsprozessen

Info

Publication number: DE102005047301B4
Application number: DE102005047301A
Authority: DE
Inventors: Hartmut Dr. Hennig; Oscar-Werner Dr. Reif; Klaus Tarrach; Robert Dr. Zeidler
Original assignee: Sartorius Stedim Biotech GmbH
Current assignee: Sartorius Stedim Biotech GmbH
Priority date: 2005-09-30
Filing date: 2005-09-30
Publication date: 2009-04-16
Anticipated expiration: 2025-10-01
Also published as: DE102005047301A1; US20080213753A1; WO2007039069A1

Abstract

Verfahren zum Nachweis der Virenabreicherung für die Validierung von Filtern, Filtrationsprozessen, physikalischen und chemischen Inaktivierungsmethoden oder von adsorptiven Abreicherungsmethoden unter vorgegebenen Prozessbedingungen, die im Kleinmaßstab nachgestellt werden, wobei:
– in einem ersten Schritt Viren in geeigneten Zelllinien angezüchtet werden,
– in einem zweiten Schritt nach einem Zellaufschluss eine Virusssuspension gewonnen wird,
– in einem dritten Schritt die gewonnene Virussuspension einer zu untersuchenden Proteinlösung zugesetzt und
– in einem vierten Schritt die virushaltige Proteinlösung durch den zu validierenden Filter filtriert und anschließend die Virusabreicherung analysiert wird,
dadurch gekennzeichnet,
dass nach dem zweiten Schritt die Virussuspension zunächst über einen Membranadsorber prozessiert wird, dass die Viren an den Membranadsorber gebunden und Kontaminationen mit Hilfe eines Waschpuffers entfernt werden und
dass die gebundenen, gereinigten Viren von der Membranadsorberfläche eluiert und im dritten Schritt als konzentrierte Virussuspension der zu untersuchenden Proteinlösung zugesetzt werden.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis der Virenabreicherung für die Validierung von, Filtrationsprozessen, physikalischen und chemischen Inaktivierungsmethoden oder von adsorptiven Abreicherungsmethoden unter vorgegebenen Prozessbedingungen, die im Kleinmaßstab nachgestellt werden, wobei:

– in einem ersten Schritt Viren in geeigneten Zelllinien angezüchtet werden,
– in einem zweiten Schritt nach einem Zellaufschluss eine Virusssuspension gewonnen wird,
– in einem dritten Schritt die gewonnene Virussuspension einer zu untersuchenden Proteinlösung zugesetzt und
– in einem vierten Schritt die virushaltige Proteinlösung durch den zu validierenden Filter filtriert und anschließend die Virusabreicherung analysiert wird.

Nach dem Stand der Technik wird ein Nachweis der Abreicherung von Viren durch Filtration und anderen Technologien in Validierungsstudien erbracht. Validierungsstudien werden in der Regel durch qualifizierte Viruslabore durchgeführt, die gemäß der gesetzlichen Forderungen nach GLP (Good Laboratory Practice) arbeiten. Das grundsätzliche Prozedere zum Design und zur Durchführung von Validierungsstudien ist in dem CPMP Dokument der europäischen Behörde EMEA beschrieben (CPMP: „Note for Guidance an Virus Validation Studies: The Design, Contribution and Interpretation of Studies Validating the Inactivation and Removal of Viruses", February 1996 (CPMP/BWP/268/95)).
Unter Validierung versteht sich in diesem Zusammenhang das systematische Abprüfen der ausgewählten Technologien zur Virusabreicherung oder Virusinaktivierung, wie z. B. der Filtration, im Hinblick auf die Fragestellung, ob diese Technologie in der Lage ist, unter den gegebenen Prozessbedingungen des Anwenders, die im Viruslabor im Kleinmaßstab (scale down) nachzustellen sind, Viren in dem Maß abzureichern oder zu inaktivieren, wie es seitens der Behörden empfohlen und auch gefordert wird.
Die besonderen Anforderungen an die Auswahl, den Einsatz und die erwarteten Abreicherungsraten (Logarithmische Abreicherungsraten, auch kurz LRV genannt) der Viren sind im ICH-Q5A-Dokument und der EMEA-Richtlinie dargestellt und erläutert. (ICH Q5A. "Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived from Cell Lines of Human or Animal Origin". Federal Register, Vol. 63, No. 185, 1998) und (CPMP: „Note for Guidance an Virus Validation Studies: The Design, Contribution and Interpretation of Studies Validating the Inactivation and Removal of Viruses". February 1996, CPMP/BWP/268/95).
Validierungsstudien mit dem Ziel der Bestimmung der tatsächlichen Virusabreicherungsrate bestimmter Technologien werden auch „Spiking Studien" genannt, weil dem Produkt, in der Regel einer therapeutischen Proteinlösung, im Rahmen dieser Studie Viren zugesetzt (gespiked) werden, die dann von der jeweiligen, zu validierenden Technologie zu einem bestimmten Maße abzureichern oder zu inaktivieren sind.
Über die geforderte Höhe der Gesamtabreicherung aller in dem Prozess eingesetzten Technologien entscheidet eine Risikoabschätzung seitens des Kunden und eine abschließende Beurteilung durch die jeweilige Bundesbehörde, bei der die Zulassung bzw. die Unterlagen der Virus-Validierungsstudie eingereicht werden. Gesamtabreicherungsraten über einen kompletten Virusabreicherungsprozess („Virus Clearance") können in einem Bereich von 12 log₁₀ bis 24 log₁₀ Stufen liegen und für einzelne Technologien in einem Bereich von 3 log₁₀ bis 7 log₁₀ Stufen liegen.
Die Anzucht der Viren durch die hierfür zuständigen Viruslabore erfolgt in geeigneten Zelllinien, die mit den jeweiligen spezifischen Viren infiziert werden und ggf. durch Aufschluss der Zellen sowie aus dem Zellkulturüberstand gewonnen werden. Diese Zellkulturen sind für einen Virus oder mehrere Viren spezifisch und werden von den Viruslaboren von bestimmten, hierfür autorisierten Quellen bezogen.
Die als 1 beigefügte Tabelle zeigt exemplarische Zelllinien, die für die Kultivierung von in Studien verwendeten Viren eingesetzt werden.
2 zeigt eine Tabelle einer Auflistung von Viren, die für die Prozessvalidierung von Plasma-Derivaten Verwendung finden.
3 zeigt eine Tabelle einer Auflistung von Viren für den Einsatz in Studien mit rekombinanten Proteinen.
Die Viruskonzentration aus einem Zellkulturüberstand nach der Anzucht und dem Zellaufschluss (beispielsweise durch Schockgefrieren und Wiederauftauen der Lösung) liegen in einem Bereich von 10⁶/m1 bis 10⁹/ml.
Im Rahmen des „Spiken" werden diese Virussuspensionen den entsprechenden Proteinlösungen zugesetzt, wobei der Zusatz der Virussuspension auf max. 10 Vol.% begrenzt ist. (CPMP: „Note for Guidance an Virus Validation Studies: The Design, Contribution and Interpretation of Studies Validating the Inactivation and Removal of Viruses". February 1996, CPMP/BWP/268/95).
Nach dem Zusatz der Viren zu dem Produkt werden in der Regel Virustiter von 10⁶/ml bis zu 10⁸/ml erreicht. Diese Lösung wird dann mit der entsprechenden Technologie zur Virusabreicherung oder Virusinaktivierung behandelt.
Für die Filtration als Beispieltechnologie zur Virusabreicherung (Größenausschlussprinzip, Virus wird auf Grund seiner Größe zurückgehalten und die therapeutische Proteinlösung fließt durch die Membran hindurch) werden in den Studien bestimmte Volumina an virushaltiger Proteinlösung (die Proteinkonzentration der Lösung unterliegt den Vorgaben des Herstellers und muss identisch zu dem Prozessmaßstab stehen, typische Proteinkonzentrationen können im Bereich von 10 μg/ml bis 50 mg/ml Lösung liegen) durch den Virusfilter filtriert.
Die Menge an zu filtrierender virushaltiger Lösung muss identisch zu dem Volumen der Prozessfiltration sein. Diese wird durch das Herunterskalieren der Prozessmengen auf den Labormaßstab des Virusfilters erreicht. Typische Filtrationsmengen liegen in einem Bereich von 4 ml/cm² bis 60 ml/cm² Virusfilterfläche.
Nach Filtration der Testlösung durch den zu validierenden Filter wird die Virusabreicherung analysiert. Der Standard-Nachweistest ist der TCID50-infectivity-Test, der in den zitierten Richtlinien beschrieben ist:

– Kärber G. Beitrag zur kollektiven Behandlung Pharmakologischer Reihenversuche. Arch Exp Path Pharmakol 1931; 162:480–483.)
– Bundesgesundheitsamt und Paul-Ehrlich-Institut, Bundesamt für Sera und Impfstoffe [PEI]. Bekanntmachung über die Zulassung von Arzneimitteln: Anforderungen an Validierungsstudien zum Nachweis der Virussicherheit von Arzneimitteln aus menschlichem Blut oder Plasma, 1994 May. Vorhanden von: Bundesanzeiger, Nr. 84.

In diesen Dokumenten ist sowohl der Test als auch die Auswertemethodik beschrieben. Neben dem TCID50-Test gibt es ggf. ELISA-Tests und molekularbiologische Methoden (PCR, Polymeraseketten-Reaktion) für den Nachweis von Viren.
Nachteilig bei dem bekannten Verfahren ist, dass die Zugabe von Virusüberstand, das „Spiken", die zu testende Produktlösung dahingehend verändert, dass Bestandteile in die Proteinlösung eingebracht werden, die im tatsächlichen Prozessmaßstab nicht vorhanden sind.
Neben vielen biochemischen Stoffen aus dem „spike" besitzen vor allem Host-Cell-Proteine und Nukleinsäuren, Zellbruchstücke und Anzuchthilfsstoffe wie Kälberserum Nachteile hinsichtlich der Validierungsstudie.
Ein weiterer Nachteil für die Filtration oder beispielsweise die chromatographische Aufreinigung innerhalb einer Validierungsstudie besteht in einer erheblich schlechteren Filtrierbarkeit der virushaltigen Lösung oder aber in Problemen in dem Chromatographieprozess selber. Des Weiteren können die zusätzlich eingebrachten Komponenten (Nukleinsäuren, Kälberserum, Salze) Verfahren zur Virenquantifizierung (z. B. ELISA bzw. PCR) beeinflussen. Weiterhin gibt es Viren, die sich auf Grund ihrer natürlichen Situation nur bis zu einer bestimmten Konzentration im Zellkulturüberstand anziehen lassen. Wenn dann im Rahmen der Validierungsstudie bis zu 10% eines solchen Überstandes zugesetzt wird, kommt es regelmäßig zu einer vorzeitigen Verblockung des Filters, so dass die vorgesehene Menge an Volumen pro Flächeneinheit nicht filtriert werden kann. Als unmittelbare Konsequenz dessen wird dann im Rahmen einer Virus-Validierungsstudie der Spike-Zusatz soweit reduziert, dass die Lösung mit dem vorgegebenen Volumen über die entsprechende Fläche des Virusfilters filtriert werden kann.
Dieses kann im Extremfall dazu führen, dass der dynamische Bereich der möglichen Virusabreicherung (Dynamischer Bereich Ausgangstiter minus Nachweisgrenze) nicht mehr ausreicht, um die gewünschte oder erforderliche Virusabreicherung einer bestimmten Technologie überhaupt zeigen zu können. Wenn dieses der Fall ist, bleibt als einzige Alternative die Wahl einer höheren Filterfläche, was im Prozessmaßstab zu erheblich höheren Filtrationskosten führt.
Aus der DE 10 2004 004 043 A1 ist ein Verfahren zur Aufreinigung und/oder Isolierung von in einer Lösung oder Suspension enthaltenen hochmolekularen Verbindungen mittels Affinitätschromatografie unter Verwendung von Metallionenenthaltender Membranen bekannt.
Die EP 0 514 421 B2 beschreibt ein Verfahren zur Validierung der Virus-Abreicherungsfähigkeit von Filtern. Dabei wird bei der EP 0 514 421 B2 an der Prozessfiltereinheit und nicht an einer Filtereinheit im Kleinmaßstab geprüft. Bei diesem bekannten Verfahren wird nicht der „Originalvirus" verwendet, sondern die Abreicherungsrate der Prozessfiltereinheit wird mithilfe eines speziellen Testvirus bestimmt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren anzugeben, welches die oben genannten Nachteile vermeidet.
Diese Aufgabe wird in Verbindung mit dem Oberbegriff des Anspruches 1 dadurch gelöst, dass nach dem zweiten Schritt die Virussuspension zunächst über einen Membranadsorber prozessiert wird, dass die Viren an den Membranadsorber gebunden und unerwünschte Bestandteile mit Hilfe eines Waschpuffers entfernt werden und dass die gebundenen Viren von der Membranadsorberfläche eluiert und im dritten Schritt als gereinigte, konzentrierte Virussuspension der zu untersuchenden Proteinlösung zugesetzt werden.
Die Aufbereitung der Virussuspension, d. h. die Bindung der Viren an einen Membranadsorber mit anschließender Reinigung und Eluation der Viren, führt dazu, dass beispielsweise 100 ml Virenüberstand auf wenige ml Eluat konzentriert werden, so dass reine und höher konzentrierte Virenpräparationen zur Verfügung stehen. Dadurch, dass hohe Ausgangstiter in der Spike-Lösung bzw. Virensuspension erzielt werden, können die im Scale-Down-Experiment bzw. Kleinmaßstab des Anwenders ermittelten Volumen pro Flächeninhalt auch in der Virus-Validierungsstudie erreicht werden. Die oben genannten Nachteile werden damit sicher und zuverlässig vermieden.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens ergeben sich aus den Unteransprüchen.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stellt der Membranadsorber eine mikroporöse Anionen- oder Kationenaustauschermembran mit Porengrößen > 1 μm dar. Da die Diffusionslimitierung bei der Membranchromatographie praktisch keine Rolle spielt, kann mit relativ hohen Flussraten operiert werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die infizierten Zelllinien durch einen Gefrierprozess (Schockgefrieren) mit anschließendem Auftauen aufgeschlossen und bei ca. 2000 U/min über einen Zeitraum von ca. 10 min zentrifugiert. Die so gewonnene Virussuspension wird über einen Membranadsorber mit mikroporöser Struktur prozessiert, wobei die negativ geladenen Viren an positiv geladene Seitenketten des Membranadsorbers gebunden werden.
Durch Anwendung eines Waschpuffers mit erhöhter Salzkonzentration können weniger stark bindende Kontaminationen entfernt werden. Das reine Virus kann hiernach mit einer hochmolekularen Salzlösung eluiert und beispielsweise durch eine Vivaspin-Ultra-Filtrationseinheit umgepuffert werden und liegt dann in stark konzentrierter Form vor. Die konzentrierte und gereinigte Virussuspension kann dann der zu untersuchenden Proteinlösung zugesetzt oder zwischengelagert werden. In einem Folgeschritt wird die virushaltige Proteinlösung in bekannter Weise durch den zu validierenden Filter filtriert und anschließend die Virusabreicherung analysiert.
Anwendungsbeispiel:
Zur Durchführung einer Virusfiltration werden Parvoviren in einer PK13-Zellkultur vermehrt. Die PK13-Zellen stammen von der American Type Culture Collection, USA (ATCC-No CRL-6489). PK13-Zellkulturschalen mit je 175 cm² Fläche werden hierzu mit PPV infiziert und 3 bis 5 Tage später die Viren abgeerntet. Die Viren befinden sich in dem Überstand der durch die Infektion und Schockgefrierung zerstörten Zellen. Aus einer Kulturflasche werden so ca. 40 ml Überstand gewonnen. 45 Flaschen werden für die Vorbereitung der Virusfiltration mit insgesamt 1800 ml Überstand (erzielt durch Zentrifugation bei 2000 U/min (etwa 800 g) ± 100 U/min bei 10 min ± 1 min, die Zellen werden vorher durch eine Gefrier- und Auftauschritt vollständig zerstört) herangezogen. Der Überstand wurde mit 0,45 μm eines Membranfilters vorfiltriert und danach der Titer mit 5,6·10⁸/ml bestimmt.
Hiervon werden nun 300 ml für die Virusfiltration direkt herangezogen (Suspension A). Für die Aufbereitung der übrigen 1500 ml (Suspension B) mit dem Membranadsorber wurde das Filtrat des Zellkulturüberstandes auf eine mit 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 Puffer äquilibrierte Membranadsorbereinheit geladen. Dabei binden die Viren an Liganden auf der porösen Membranstruktur.
Durch Anwendung eines Waschpuffers (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200–500 mM NaCl) mit erhöhter Salzkonzentration können weniger stark bindende Kontaminationen entfernt werden. Das gereinigte Virus selbst wird mit einer hochmolekularen Salzlösung (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1.5 M NaCl) eluiert, durch eine Vivaspin-UF-Einheit umgepuffert und liegt dann ca. hundertfach konzentriert in 16 ml Puffer nach Wahl oder Medium vor. Der erneut bestimmte Titer zeigt eine Viruskonzentration von ca. 3,6·10¹⁰/ml. Sowohl die herkömmlich hergestellte Virussuspension A als auch die neue Suspension B wurden für Virus-Filtrationsversuche herangezogen.
Hierzu wurde eine proteinhaltige Lösung (polyklonale Antikörperlösung mit 4 mg/ml in Glycinpuffer, pH 4,1) mit verschiedenen Konzentrationen der Virussuspensionen A und B in unterschiedlichen Testläufen gespiked und über einen 5cm²-Virusfilter (Sartorius Virosart CPV Virusfilter, 20 nm nominal) filtriert. Im Rahmen der Versuchsreihe wurde die Filtrationszeit, das maximale Filtrationsvolumen bei 75%iger Verblockung des Filters und die Titerreduktion des Filters ermittelt.
Die Ergebnisse sind in 4 als Einfluss der Virusaufbereitung auf die Filtrierbarkeit zusammenfasst. Die Tabelle zeigt deutlich verbesserte Filtrierbarkeit der Virussuspension B nach membranchromatographischer Aufreinigung. Es zeigt sich, dass trotz hoher Spike-Konzentrationen mit der Virussuspension B (5% und mehr) die Kapazitäten des Virusfilters in einem Bereich liegen, der für den Virusfilter ohne Zusatz einer Virussuspension ermittelt wurde. Hiermit zeigen sich für den Anwender die in der Praxis beschriebenen Vorteile in besonderem Maße.

Claims

Verfahren zum Nachweis der Virenabreicherung für die Validierung von Filtern, Filtrationsprozessen, physikalischen und chemischen Inaktivierungsmethoden oder von adsorptiven Abreicherungsmethoden unter vorgegebenen Prozessbedingungen, die im Kleinmaßstab nachgestellt werden, wobei: – in einem ersten Schritt Viren in geeigneten Zelllinien angezüchtet werden, – in einem zweiten Schritt nach einem Zellaufschluss eine Virusssuspension gewonnen wird, – in einem dritten Schritt die gewonnene Virussuspension einer zu untersuchenden Proteinlösung zugesetzt und – in einem vierten Schritt die virushaltige Proteinlösung durch den zu validierenden Filter filtriert und anschließend die Virusabreicherung analysiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass nach dem zweiten Schritt die Virussuspension zunächst über einen Membranadsorber prozessiert wird, dass die Viren an den Membranadsorber gebunden und Kontaminationen mit Hilfe eines Waschpuffers entfernt werden und dass die gebundenen, gereinigten Viren von der Membranadsorberfläche eluiert und im dritten Schritt als konzentrierte Virussuspension der zu untersuchenden Proteinlösung zugesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Membranadsorber eine mikroporöse Anionen- oder Kationenaustauschermembran darstellt mit Porengrößen > 1 μm.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die infizierten Zelllinien durch einen Gefrierprozess mit anschließendem Auftauen aufgeschlossen und die Virussuspension aus einem Zellkulturüberstand nach vorangegangener Zentrifugation gewonnen wird.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Zentrifugation bei 2000 U/min ± 100 U/min über einen Zeitraum von 10 min ± 1 min erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die negativ geladenen Viren an positiv geladene Seitenketten des Membranadsorbers gebunden werden.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass beim Bindungsvorgang der isoelektrische Punkt zwischen 3 bis 6 und der pH-Wert zwischen 5,5 und 8 eingestellt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die gebundenen Viren mit wässrigen Puffern mit ansteigendem Salzgehalt im kleinen Volumen von der Membranadsorberfläche isoliert wird.