DE102005038847B3 - Oligonukleotid-Anordnungen und Verfahren zum Erstellen zellulärer Ribonuklease- und Nuklease-Profile und deren Verwendung - Google Patents

Abstract

Verwendung einer Oligonukleotid-Anordnung, umfassend Nuklease-Substrat-Oligonukleotide oder Ribonuklease-Substrat-Oligonukleotide, zur Optimierung der Expression mindestens eines Gens in Abhängigkeit vom Profil von in einer Ziel-Zelle aktiven Nukleasen oder Ribonukleasen und in Abhängigkeit von der Codon-Usage der Ziel-Zelle.

Description

• Gegenstand der Anmeldung ist eine Anordnung von Substrat-Oligonukleotiden für Nukleasen oder Ribonukleasen. Die Substrat-Oligonukleotide können hierbei Markierungen tragen. Anordnungen sind beispielsweise Mikroarrays oder Biochips.
• Die Oligonukleotide, die als Substrate von Nukleasen oder Ribonukleasen hydrolysiert werden können, sind in Mikrolokationen oder Mikrobereichen auf einer Oberfläche, beispielsweise einer Oberfläche aus Glas oder Kunststoff, angeordnet.
• Durch die Hydrolyse des jeweiligen Substrates wird die Markierung entfernt, was detektierbar ist. Bei Verwendung von Fluorophoren als Markierungen wird die jeweilige Substratspezifität der Nuklease oder Ribonuklease erkennbar aus der Kenntnis der Substrate in der jeweiligen Mikrolokation.
• Gegenstand der Anmeldung ist weiterhin die Verwendung der Anordnung von Oligonukleotid-Substraten zur Identifizierung neuartiger Nukleasen oder Ribonukleasen, sowie zur Erstellung von Profilen von in einer Zelle aktiven Nukleasen oder Ribonukleasen.
• Nach Herstellung eines zellfreien Extraktes der zu untersuchenden Zelle wird die Anordnung mit dem Extrakt inkubiert und über die Substratspezifität das Profil an Nukleasen oder Ribonukleasen der untersuchten Zelle ermittelt. Hieraus ergibt sich auch ein Vorkommen an neuartigen Nukleasen oder Ribonukleasen, die noch nicht untersucht wurden.
• Goodrich, T.T. et al. (Enzymatically amplified surface plasmon resonance imaging method using RNase H and RNA microarrays for the ultrasensitive detection of nucleic acids. Anal. Chem. (2004) 76 (21) 6173-8) zeigt in 1, Seite 6174 einen Mikroarray mit immobilisierten RNA-Oligonukleotiden. Bei Anwesenheit von DNA-Molekülen kann eine RNase H die RNA-Oligonukleotide als Substrate spalten.
• Itaya, M. et al. (Steady-state kinetic studies of the inhibitory action of Zn2+ on ribonuclease T1 catalysis. Biochem. J. (1982) 207 (2) 357-62) untersucht RNase T1 und setzt hierfür nach Tabelle 1, Seite 361 RNA-Dinukleotide als Substrate ein.
• Lebrasseur, N.D. et al. (Local and systemic wound-induction of RNase and nuclease activities in Arabidopsis: RNS1 as a marker for a JA-independent systemic signaling pathway. The Plant Journal (2002) 29 (4) 393-403) beschreibt die Veränderung des RNase-Profils bei Pflanzen im Zuge der Verwundung mittels RNase-Aktivitätsgelen. Diese Aktivitätsgele werden in Yen, Y. et al. (Identification and properties of the major ribonucleases of Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 97, 1487-1493), Seite 1488, linke Spalte, zweiter Absatz genauer beschrieben; sie umfassen keine definierten RNA-Substrat-Moleküle, sondern Hefe-Gesamt-RNA.
• Lopez-Otin, C. et al. (Protease Degradomics: A New Challenge for Proteomics. Nature Reviews Molecular Cell Biology (2002) 3, 509-519) zeigt in 2c, Seite 515 die Erstellung eines Protease-Profils bzw. der Netto-Proteolyse-Aktivität mit Hilfe eines Substrat-Mikroarrays z.B. mit synthetischen, markierten Peptiden.
• DE 102 60 805 A1 beschreibt die Erstellung Codon-Usage-optimierter Gensequenzen, um eine maximale Expression in transgenen Organismen zu erzielen. Die Beachtung des Protease- oder RNase-Profils der Ziel-Organismen geht aus DE 102 60 805 A1 nicht hervor.
• Gegenstand der Anmeldung ist weiterhin die Verwendung der Anordnung von Oligonukleotid-Substraten zur Optimierung der Expression von Genen in Abhängigkeit vom Profil von in einer Ziel-Zelle aktiven Nukleasen oder Ribonukleasen und in Abhängigkeit von der Codon Usage der Ziel-Zelle: Verschiedene Organismen oder verschiedene Zellen bzw. Gewebe desselben Organismus verwenden verschiedene synonyme Codons. Wenn ein Gen aus einem bestimmten Organismus in einem anderen Organismus exprimiert werden soll, empfiehlt sich daher eine Optimierung auf den Codon-Gebrauch des Ziel-Organismus hin. Die Anmeldung schlägt aber darüber hinaus auch die Beachtung des Ribonuklease-Profils der Zellen des Ziel-Organismus vor, in Abstimmung mit der bereits bekannten Codon-Optimierung.
• Die Ziel-Zelle, in der das optimierte Gen exprimiert wird, kann Teil eines transgenen Organismus sein.
• Neben dem Einbau von Dinukleotiden nach den folgenden Verfahren a) und b) ist auch der Einbau von Trinukleotiden oder mehreren Substratbereichs-Nukleotiden Gegenstand der Anmeldung. Die Zahl der in den 2 und 4 gezeigten Mikrolokationen erhöht sich dementsprechend.
• Es zeigen die Abbildungen:
• 1: Schematischer Aufbau eines RNA-Oligonukleotid-Substrats
• 2: Schematischer Aufbau eines RNA-Mikroarrays
• 3: Schematischer Aufbau eines DNA Oligonukleotid-Substrats
• 4: Schematischer Aufbau eines DNA-Mikroarrays
• Zur Erläuterung der Erfindung dient das folgende Beispiel.
• BEISPIEL
• a) Herstellung eines RNA-Mikroarrays
• Der Aufbau des RNA-Mikroarrays (siehe 1 und 2) ist folgendermaßen:
  Auf silanisiertem Glas als Trägermatrix sind gebundene modifizierte RNA-Moleküle mit einem Fluoreszenzfarbstoff am 3'-Ende gekoppelt. Die Substrat-Oligonukleotide sind folgendermaßen aufgebaut: Es beginnt vom 5'-Ende aus mit einem Aminolinker zur kovalenten Kopplung an die silanisierte Aldehyd-modifizierte Glasoberfläche. Daran wird ein aus 2'-O-Methyl-(2OM)-RNA-Basen bestehendes Poly (in 2OM-RNA Molekül gebunden. An dieses wird ein kurzes RNA Substrat (Dinukleotid) angefügt und daran wiederum ein aus 2'-O-Methyl-(2OM)-RNA-Basen bestehendes Poly (U) 2OM-RNA Molekül. Das 3'-Ende des RNA-Moleküls wird mit Perjodat in ein Dialdehyd oxidiert und daran ein Fluoreszenzfarbstoff z. B. Fluoreszein-5-Thiosemicarbazid, durch die Kondensation von Carbazid und Aldehyd) kovalent gebunden (1).
• Die 2'-O-Methyl-Oligonukleotide besitzen eine beträchtliche Ribonuklease Resistenz, haben aber die gleichen Bindungseigenschaften wie RNA-Moleküle.
• Der RNA-Mikroarray der 2 testet 16 unterschiedliche RNA-Dinukleotide AA, AC, AG, AU, CA, CC, CG, CU, GA, GC, GG, GU, UA, UC, UG, UU. Felder 1-9 sind Kontrollen und Fluoreszenzstandards (2).
• b) Herstellung eines DNA-Mikroarrays
• Der Aufbau des DNA-Mikroarrays (siehe 3 und 4) ist folgendermaßen:
  Auf silanisiertem Glas als Trägermatrix sind gebundene modifizierte DNA Moleküle mit einem Fluoreszenzfarbstoff am 3'-Ende gekoppelt. Die Substrat-Oligonukleotide sind folgendermaßen aufgebaut: Es beginnt vom 5'-Ende aus mit einem Aminolinker zur Kopplung an die silanisierte Glasoberfläche. Daran wird ein aus Phosphothioat-(PTO)-DNA-Basen bestehenden Poly (T) PTO-DNA Molekül gebunden. An dieses wird ein kurzes DNA Substrat (Dinukleotid) eingebaut und daran wiederum ein aus Phosphothioat-(PTO)-DNA-Basen bestehendes Poly (T) PTO-DNA Molekül. Das 3'-Ende des RNA-Moleküls wird mit Perjodat in ein Dialdehyd oxidiert und daran ein Fluoreszenzfarbstoff z. B. Cy3 (3). Die Phosphothioat-DNA-Basen besitzen eine beträchtliche Nuklease Resistenz, haben aber die gleichen Bindungseigenschaften wie DNA-Moleküle.
• Der DNA-Mikroarray der 4 testet 16 unterschiedliche DNA-Dinukleotide AA, AC, AG, AT, CA, CC, CG, CT, GA, GC, GG, GT, TA, TC, TG, TT. Felder 1-9 sind Kontrollen und Fluoreszenzstandards (4).
• c) Herstellung zellfreier Extrakte
• Hier wird bezug genommen auf das Dokument für die Herstellung zellfreier, cytosolischer Extrakte aus Zellen aus humaner Zellkultur:
• Mayeda A, Krainer AR.: Preparation of HeLa cell nuclear and cytosolic S 100 extracts for in vitro splicing. Methods. Mol Biol. 1999; 118:309-14.
• d) Inkubation der Extrakte mit der Anordnung (RNA- oder DNA-Mikroarray)
• Enzymassay:
• Der Mikroarray wird mit einem zytosolischen Extrakt des zu untersuchenden Zellmaterials nach c) benetzt, nach Zeit t1 mit Stoplösung gewaschen und die Fluoreszenz beim Absorptionsmaximum (z. B. Fluoreszein-5-Thiosemicarbazid – Absorption bei 494 nm, Emission bei 520 nm) angeregt. Die Auswertung erfolgt durch Messung bei dem dem Fluoreszenzfarbstoff eigenen Emissionsmaximum. Die einzelnen Dinukleotide fluoreszieren je nach Abbaurate unterschiedlich stark. Die Spezifität des im Zellextrakt enthaltenen Ribonukleasecocktails wird so bestimmt.
• e) Detektion
• Software-unterstützte Auslesung mittels Scanner.
• Nachgereichtes Erläuterungsbeispiel
• Gegeben sei beispielhaft ein Minimal-Gen, das nur ein Basen-Triplett „TTA" aufweise. Dieses kommt offensichtlich bei allen Organismen vor und ist damit nach dem Wortlaut des § 1a Absatz 4 Patentgesetz auch eine Teilsequenz eines natürlichen menschlichen Gens – wie alle anderen Tripletts auch.
• – Menschliche Ausgangs-Gensequenz: TTA (kodierend für Leucin),
• – Codon-Usage-optimierte Gensequenzen für eine gegebene Ziel-Zelle Kartoffelzelle seien: CTA oder CTC oder CTG oder CTT (auch kodierend für Leucin),
• – die Anordnung trage die mRNA-Gensequenzen CUA, CUC, CUG und CUU,
• – das RNase-Profil der Ziel-Zelle zeige Spaltung von CUC, CUG und CUU an, nicht aber von CUA,
• – verbleibt zusätzlich als RNase-Profil-optimierte Gensequenz: CTA.
• Aufgrund der bereitgestellten DNA-Sequenz „CTA" wird das Gen „CTA" synthetisiert, in die transgene Ziel-Zelle Kartoffelzelle eingebracht und exprimiert. Selbstverständlich ist dieses Gen „CTA" auch in der Kartoffel identisch zu einer Sequenz oder Teilsequenz eines natürlichen menschlichen Gens „CTA".

Claims (2)

1. Verwendung einer Oligonukleotid-Anordnung, umfassend Nuklease-Substrat-Oligonukleotide oder Ribonuklease-Substrat-Oligonukleotide, zur Optimierung der Expression mindestens eines Gens in Abhängigkeit vom Profil von in einer Ziel-Zelle aktiven Nukleasen oder Ribonukleasen und in Abhängigkeit von der Codon-Usage der Ziel-Zelle.
2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Ziel-Zelle Teil eines transgenen Organismus ist.