DE102004038535B4

DE102004038535B4 - Zelluläre Einschleusung von Nukleinsäurewirkstoffen

Info

Publication number: DE102004038535B4
Application number: DE200410038535
Authority: DE
Inventors: Marita Overhoff; Georg Sczakiel
Original assignee: Universitatsklinikum Schleswig Holstein UKSH
Current assignee: Universitatsklinikum Schleswig Holstein UKSH
Priority date: 2004-08-06
Filing date: 2004-08-06
Publication date: 2012-10-04
Anticipated expiration: 2024-08-07
Also published as: DE102004038535A1; WO2006012896A1

Abstract

Verwendung einer Phosphorothioat-modifizierten Nukleinsäure zur Verbesserung der Wirkung eines siRNA enthaltenden Arzneimittels.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verbesserung der zellulären Aufnahme von Nukleinsäuren in Zellen. Außerdem betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zubereitung zur Verbesserung der zellulären Aufnahme von Nukleinsäuren, insbesondere Nukleinsäurewirkstoffen mit erhöhter Wirkung.
Die Biotechnologie ermöglicht mit ihren molekularbiologischen Methoden die direkte Einflussnahme auf molekulare Mechanismen sehr unterschiedlicher Organismen. Dabei stehen Steuerungs- und Optimierungsprozesse zellulärer Leistung, z. B. bei Mikroorganismen und Pflanzen, die gezielte Steuerung phänotypischer Ausprägungen, die Unterdrückung pathogener Genexpression wie auch die therapeutische Anwendung in der Human- und Veterinärmedizin im Vordergrund. Neben dem Einfügen zusätzlicher genetischer Information in das Genom eines Organismus (Gentherapie) wird insbesondere in der Humanmedizin die Entwicklung von therapeutischen Oligonukleotiden vorangetrieben. Insbesondere dann, wenn Krankheitsbilder mit fehlgesteuerter, weit erhöhter Genexpression oder viraler Genexpression korreliert ist, können oligomere Nukleinsäure-Wirkstoffe erfolgreich als Therapeutikum angewandt werden. Die aussichtsreichsten Klassen oligomerer Nukleinsäure-Wirkstoffe schließen Antisense-Oligonukleotide, doppelsträngige RNA (siRNA) und Ribozyme ein aber auch andere Klassen sind potenzielle Wirkstoffe, wie zum Beispiel Aptamere, Spiegelmere, immunstimulatorische Oligonukleotide und decoys. Die Verwendung von Oligonukleotidwirkstoffen besitzt gegenüber der Gentherapie den Vorteil, dass lediglich in die Genexpression, nicht aber in das Genom selbst, eingegriffen wird bzw. „klassische drug targets” durch den Wirkstoff erkannt, gebunden und inhibiert werden. Die ethischen Bedenken und zulassungsrechtlichen Anforderungen an Oligonukleotidwirkstoffe sind dadurch gegenüber dem Verfahren der Gentherapie wesentlich geringer.
In der klinischen Forschung werden gegenwärtig verschiedene Ansätze zur Entwicklung von Oligonukleotidwirkstoffen verfolgt. Die am intensivsten untersuchten Wirkstoffe sind Antisense-Oligonukleotide, immunstimmulatorische CpG-Oligonukleotiden und siRNA. Antisense-Oligonukleotide sind einzelsträngige, kurzkettige Nukleinsäuremoleküle, die aufgrund ihrer spezifischen Sequenz über komplementäre Basenpaarung an die RNA ihres Targets binden und so die Expression des entsprechend kodierten Zielproteins hemmen. Die immunstimmulatorische Wirkung von CpG-Oligonukleotiden hingegen beruht auf der Erkennung nicht-methylierter Cytidin-Guanosin-Dinukleotide, die charakteristisch für mikrobielle DNA sind. Kurzkettige Doppelstrang-RNA-Moleküle, die die Translation einer Ziel-mRNA posttranskriptionell und sequenzspezifisch hemmen, werden siRNA (small interfering RNA) und der Vorgang RNA-Interferenz (RNAi) genannt. Vergleichende Wirksamkeitsstudien zwischen siRNA und Antisense-Oligonukleotiden zeigen häufig einen Vorteil für siRNA.
Eines der weitgehend ungelösten, technischen Erfordernisse für die biologische Anwendung sowie die therapeutische Applikation von Nukleinsäurewirkstoffen ist die zelluläre Einschleusung. Es ist beispielsweise bekannt, dass Antisense-Oligonukleotide von Ziel-Zellen nur in geringem Maße oder nicht messbar spontan aufgenommen werden. Die Aufnahme kann teilweise dadurch verbessert werden, dass bestimmte Trägerstoffe, oft peptidische, lipidische oder kationische organische Substanzen, verwendet werden, die die zelluläre Aufnahme der Antisense-Oligonukleotide erhöhen und damit auch die Wirkung der applizierten Antisense-Oligonukleotide verbessern. In Säugetieren und beim Menschen erweisen sich solche Trägerstoffe oft als toxisch und daher nicht anwendbar. Daher besteht insbesondere für die klinische Anwendung von oligomeren Nukleinsäurewirkstoffen der Bedarf an geeigneten Verfahren für deren Einschleusung in Ziel-Zellen und Ziel-Gewebe. Diese Betrachtung gilt ebenso für andere Anwendungsfelder wie zum Beispiel der Tiermedizin.
So ist zwar aus der WO 95/03406 A2 bekannt, dass einzelsträngige Oligonukleotide durch Komplexierung mit einer phosphorothioat-modifizierten Nukleinsäure verbessert in Zellen aufgenommen werden. Die Komplexierung führt allerdings unter Umständen dazu, dass die komplexierten Oligonukleotide unwirksam sind. Insbesondere für doppelsträngige Nukleinsäuren, beispielsweise siRNA-Wirkstoffen, die von Zellen viel schlechter als einzelsträngige Nukleinsäuren oder überhaupt nicht aufgenommen werden, ist eine Komplexierung als Transportmechanismus ungeeignet.
Aufgabe dieser Erfindung ist es, die Wirkung eines siRNA enthaltenden Arzneimittels zu verbessern. Eine weitere Aufgabe ist es, eine pharmazeutische Zubereitung bereitzustellen, bei der die zelluläre Aufnahme des siRNA-Wirkstoffs verbessert ist.
Überraschend wurde entgegen der oben genannten Ansicht gefunden, dass die Verwendung einer Phosphorothioat-modifizierte Nukleinsäuren die Wirkung eines siRNA enthaltenden Arzneimittels verbessert. Die Phosphorothioat-modifizierte Nukleinsäuren bzw. Oligonukleotide (Transporter-Oligonukleotide: T-ON) agieren somit als Transporter-Nukleinsäuren, die insbesondere zur Verbesserung der zellulären Aufnahme von Nukleinsäurewirkstoffen oder zur Gentherapie verwendet werden können. Die Nukleinsäure selbst kann ein endogen exprimiertes, halbsysnthetisches, synthetisches oder chemisch modifiziertes Nukleinsäuremolekül sein, das vorzugsweise Ribonukleotide und/oder Desoxyribonukleotide enthält. Der Begriff „zelluläre Aufnahme” schließt in diesem Zusammenhang die einzelnen Schritte Transmembran-Transport, subzelluläre Lokalisation und intrazelluläre Mobilität ein. Dabei ist es im Rahmen der Erfindung genügend, dass nur einige Phosphate (wenigstens drei) der zur Verbesserung der zellulären Aufnahme anderer Nukleinsäuren verwendeten Phosphorothioat-modifizierten Nukleinsäuren Phosphorothioatmodifiziert sind. Bevorzugt ist jedoch das gesamte Nukleinsäurerückgrat der Phosphorothioat-modifizierten Nukleinsäuren Phosphorothioat-modifiziert.
Weiterhin wurde gefunden, dass diese Transportaktivität der Phosphorothioat-modifizierten Nukleinsäuren „in trans” für Oligonukleotid-Wirkstoffe unabhängig von der Sequenz der Phosphorothioat-modifizierten Nukleinsäuren erfolgt.
Entscheidend für die Transportaktivität der Phosphorothioat-modifizierten Nukleinsäuren mit Transportaktivität in trans ist das Vorhandensein eines Phosphorothioat-modifizierten Nukleinsäurerückgrates. Die zelluläre Aufnahme der Oligonukleotidwirkstoffe ist von der Konzentration und der Länge der Phosphorothioat-modifizierten Nukleinsäure abhängig, nicht jedoch von deren Sequenz.
Einige bevorzugte, beispielhafte Phosphorothioat-modifizierte Nukleinsäuren sind mit ihrer Sequenz in SEQ ID NO:1 bis SEQ ID NO:9 dargestellt. Dabei ist zum Verständnis der Erfindung nur die Abfolge der Nukleotide (Sequenz) dargestellt. Wie bereits erläutert ist erfindungsgemäß bevorzugt das gesamte Nukleinsäure-Rückgrat Phosphorothioat-modiflziert, wenigstens aber an drei Stellen.
Die zu transportierende Nukleinsäure ist dabei besonders bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe von Antisense-Nukleinsäuren, Ribozymen, CpG-immunstimmulatorischer DNA, Aptameren, siRNA/RNAi, DNA und RNA und ist bevorzugt ein Nukleinsäurewirkstoff.
Im Rahmen der Erfindung ist es dabei auch möglich die Phosphorothioat-modifizierten Nukleinsäuren besonders bevorzugt mit einem anderen biologisch aktiven Molekül zu komplexieren oder kovalent zu binden.
Des Weiteren können die erfindungsgemäßen Phosphorothioat-modifizierten Nukleinsäuren in einem Vektorsystem zur zellulären Einschleusung von Nukleinsäuren verwendet werden.
Zum besseren Verständnis wird die Erfindung im Folgenden anhand von Beispielen und den diese begleitenden Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:
1 eine schematische Darstellung des Versuchsaufbaus zur Quantifizierung der zellulären Aufnahme von siRNA;
2 die verbesserte zelluläre Aufnahme von siRNA durch Co-Inkubation mit einer Phosphorothioat-modifizierten Nukleinsäure;
3 die Unabhängigkeit der siRNA-Aufnahme von der Sequenz des verwendeten Phosphorothioat-Oligonukleotids;
4 die Transportaktivität der Phosphorothioat-Oligonukleotide in Abhängigkeit von der Chemie des Nukleinsäure-Rückgrates der Phosphorothioat-modifzierten Nukleinsäuren;
5 die Konzentrationsabhängigkeit der durch Phosphorothioat-modifzierte Nukleinsäuren vermittelten Aufnahme von siRNA;
6 die Abhängigkeit der durch Phosphorothioat-modifizierte Nukleinsäuren vermittelten siRNA-Aufnahme von der Länge der Phosphorothioat-modifzierten Nukleinsäure.
7 die durch Phosphorothioat-modifzierte Nukleinsäuren gesteigerte der zellulären Aufnahme von siRNA in primären humanen Endothelzellen (HUVEC);
8 die apparente biologische Wirksamkeit der ICAM-1-gerichteten siRNA „si2B” in primären humanen Endothelzellen (HUVEC), die mit der durch Phosphorothioat-modifzierte Nukleinsäuren gesteigerten zellulären Aufnahme einher geht (siehe 7);
1 zeigt eine schematische Darstellung des Versuchsaufbaus zur Quantifizierung der zellulären Aufnahme von siRNA in Anwesenheit von Phosphorothioat-Oligonukleotiden (T-ON: Transporter-Oligonukleotiden). ECV-304-Zellen wurden gemeinsam mit siRNA (in den Beispielen die gegen ICAM-1 gerichtete siRNA „si2B”) und einem Transporter-Oligonukleotid über einen Zeitraum von im Allgemeinen 14 h in OptiMEM Medium inkubiert. Die zelluläre Aufnahme der siRNA wurde nach sich anschließender RNA-Zellextraktion mit Hilfe der Liquid-Hybridisierung mit einer radioaktiv markierten Sonde (³²P-sense 2B), anschließender enzymatischer Verdauung (RNase A/T 1) und Auftrennung in einem Polyacrylamidgel unter semi-denaturierenden Bedingungen mit einem Phosphor-Imager quantifiziert.
Insbesondere wurden in definierter Zellzahl ausgebrachte ECV-304 Zellen nach 18 h mit den Inkubationslösungen, bestehend aus siRNA und T-ON in OptiMEM, überschichtet und für unterschiedliche Zeiträume bei 37°C, 5% CO₂ inkubiert. Danach erfolgte die RNA-Extraktion über eine Phenol-Chloroform-Extraktion. Die gewonnene RNA wurde in 30 μl einer Hybridisierungslösung (100 mmol/l NaCl, 20 mmol/l Tris-HCl pH 7,4) resuspendiert und ein Aliquot dieser Lösung mit 40 fmol ³²P-sense-2B hybridisiert. Anschließend erfolgte eine RNase Verdauung mit 40 ng RNase A und 0,1 U T1 (MBI) für 10 min bei 30°C. Diese Lösung wurde mit Probenpuffer (7 mol/l Urea, 50% Glyerin in 1×TBE) versetzt und auf ein semi-denaturierendes PAA-Gel mit 4 mol/l Urea aufgetragen. Die Auswertung der Bandenintensitäten des Gels erfolgte mittels eines Phosphor-Imagers.
In dem in 2 abgebildeten Beispiel wird gezeigt, dass die zelluläre Aufnahme von siRNA durch Co-Inkubation mit einem Phosphorothioat-Oligonukleotid erheblich verbessert wird. Im Rahmen der Erfindung wurde dazu eine Anzahl von 300.000 ECV-304-Zellen mit 200 nm si2B allein, mit zusätzlich 600 nM HHex als Oligodesoxyribonukleotid bzw. 600 nm HHex als Phosphorothioat-modifiziertes Oligodesoxyribonukleotid über Nacht bei 37°C, 5% CO₂ in OptiMEM-Medium inkubiert. Die Auswertung erfolgte wie in der Figurenbeschreibung zu 1 erläutert.
Während die Zugabe von 600 nm des Desoxyribonukleinsäure-Oligonukleotids HHex keinen signifikanten Einfluss auf die Aufnahme der siRNA si2B ausübt, zeigt die Phosphorothioatmodifizierte Variante von HHex (SEQ ID NO:6) eine stark positive Wirkung auf die Aufnahme der siRNA. Wie bei der Beschreibung zu 4 gezeigt werden soll, ist diese positive Wirkung allein auf die Modifikation des Nukleinsäure-Rückgrates zurückzuführen.
3 zeigt, dass die durch Phosphorothioat-modifizierte Oligonukleotide vermittelte Aufnahme von si2B nicht von der Sequenz der Phosphorothioat-modifizierten Oligonukleotide abhängig ist. Für diesen Versuch wurde die Wirkung von vier mit 24 Basen gleichlangen Phosphorothioat-modifizierte Oligonukleotiden, nämlich das Tetramer des Hexamermotivs 5'-(TCGTGT)_n-3'; n = 4 und die randomisierten Sequenzen Nov 2009 AAAA, ODN 2006 und S0K27(24), auf die zelluläre Aufnahme von si2B nach den unter 2 beschriebenen Bedingungen untersucht.
Zwischen den in ihrer Sequenz sehr unterschiedlichen Phosphorothioat-modifizierten Oligonukleotiden TeH, ODN 2006 und S0K27(24) sind keine signifikanten Unterschiede in Bezug auf die Wirkung der zellulären Aufnahme von si2B erkennbar. Daraus kann geschlossen werden, dass die durch Phosphorothioat-modifizierte Oligonukleotide vermittelte Aufnahme von Nukleinsäurewirkstoffen unabhängig von der Sequenz der Phosphorothioatmodifizierten Oligonukleotide ist
4 zeigt, dass die Transportaktivität der Phosphorothioat-Oligonukleotide von der Chemie des Nukleinsäure-Rückgrates der Phosphorothioat-Oligonukleotide abhängig ist. Während Oligonukleotide mit einem Ribonukleinsäure- oder Desoxyribonukleinsäure-Rückgrat keinen oder nur schwachen Einfluss auf die zelluläre Aufnahme von si2B haben, zeigen dieselben Sequenzen mit Phosphorothioat-modifiziertem Nukleinsäurerückgrat einen signifikanten Anstieg der Aufnahme von si2B.
5 zeigt die Abhängigkeit der durch Phosphorothioat-Oligonukleotide vermittelten Aufnahme von siRNA von der Konzentration der Phosphorothioat-Oligonukleotide. Im Unterschied zu den vorhergehenden Experimenten wurden für dieses Experiment nach oben stehendem Versuchsaufbau 400.000 ECV-Zellen verwendet, die mit einer Konzentration von 200 nmol/l si2B und aufsteigender Konzentration von Phosphorothioat-modifiziertem HHex inkubiert wurden.
Die Ergebnisse des in 6 gezeigten Experiments legen am Beispiel des Phosphorothioatmodifizierten nahe, dass die Wirkung der Phosphorothioat-Oligonukleotide mit steigender Kettenlänge zunimmt.
Für das in 7 abgebildete Experiment wurden primäre HUVEC-Zellen 48 h vor Beginn des Experiments in einer 12 Well Platte in RPMI1640 mit 10%FKS und EGF ausgebracht. Nach zweimaligen Waschen der Zellen mit PBS wurden die Zellen mit den Inkubationslösungen (siRNA + T-ON in OptiMEM) überschichtet und über Nacht bei 37°C, 5%-CO₂ inkubiert. Bei den Zellen mit der 20 ständigen Inkubationszeit wurden die Zellen nach 14 h mit RPMI1640 mit 10% FKS überschichtet und für weitere 6 h bei 37°C/5%CO2 inkubiert. Nach den unterschiedlichen Inkubationszeiten erfolgte die RNA-Präparation mittels Phenol-Chloroform-Extraktion. Der Nachweis der aufgenommenen siRNA erfolgte mittels Liquid-Hybridisierung. Wie auch 4 zeigt 7, dass die Transportaktivität der Phosphorothioat-Oligonukleotide von der Chemie des Nukleinsäure-Rückgrates der Phosphorothioat-Oligonukleotide abhängig ist. Während Nukleinsäuren mit einem DNA-Rückgrat nur einen geringen Einfluss auf die Transportaktivität von si2B haben, zeigt das vollständig Phosphorothioat-modifizierte Nukleinsäure-Rückgrat von HHex eine verbesserte zelluläre Aufnahme von si2B. Dieses gilt für die Inkubation sowohl über 14 h als auch über 20 h.
8 zeigt die apparente biologische Wirksamkeit der siRNA und damit auch die gesteigerte Wirksamkeit durch die Transportaktivität der Phosphorothioat-modifizierten Oligonukleotide. Das in 8 abgebildete Experiment folgt zunächst den Arbeitsanweisungen der Figurenbeschreibung zu 7. Daraufhin wurde die RNA in 30 μl Hybrdisierungslösung (200 mmol/l NaCl, 20 mmol/l Tris-HCl pH 7,4) resuspendiert. 10 μl dieser Lösung wurden mit Superscript II (Invitrogen) revers transkribiert und die cDNA für den Nachweis von ICAM-1 mRNA und GapDH mRNA in eine Q-PCR eingesetzt. Die ICAM-1 mRNA Kopienzahlen wurden auf die GapDH Kontrollen normalisiert. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung einer Phosphorothioat-modifizierten Nukleinsäure zur Verbesserung der Wirkung eines siRNA enthaltenden Arzneimittels.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Phosphorothioatmodifizierte Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe von Phosphorothioatmodifizierten Nukleinsäuren der Sequenz 5'-(TCGTGT)_n-3', wobei n eine ganze Zahl ist.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Phosphorothioatmodifizierte Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe von Phosphorothioatmodifizierten Nukleinsäuren der unter SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 dargestellten Sequenzen.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Phosphorothioat-modifzierte Nukleinsäure an ein biologisch aktives Molekül kovalent gebunden ist.
Pharmazeutische Zubereitung zur Verbesserung der zellulären Aufnahme eines siRNA-Wirkstoffs, bestehend aus dem siRNA-Wirkstoff und mindestens einer Phosphorothioat-modifizierten Nukleinsäure.
Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Phosphorothioat-modifizierte Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe von Phosphorothioat-modifizierten Nukleinsäuren der Sequenz 5'-(TCGTGT)_n-3', wobei n eine ganze Zahl ist.
Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Phosphorothioat-modifizierte Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe von Phosphorothioat-modifizierten Nukleinsäuren der unter SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID) NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 dargestellten Sequenzen.
Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 5, 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Phosphorothioat-modifizierte Nukleinsäure an ein biologisch aktives Molekül kovalent gebunden ist.
Verfahren zur Verbesserung der zellulären Aufnahme eines siRNA-Wirkstoffs von Zellen in Zellkultur, gekennzeichnet durch Inkubieren der Zellen mit dem siRNA-Wirkstoff und mindestens einer Phosphorothioat-modifizierten Nukleinsäure.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Phosphorothioat-modifizierte Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe von Phosphorothioat-modifzierten Nukleinsäuren der Sequenz 5'-(TCGTGT)_n-3', wobei n eine ganze Zahl ist.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Phosphorothioat-modifizierte Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe von Phosphorothioat-modifzierten Nukleinsäuren der unter SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 dargestellten Sequenzen.
Verfahren nach Anspruch 9, 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Phosphorothioat-modifzierte Nukleinsäure an ein biologisch aktives Molekül kovalent gebunden ist.
Vektor zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor mindestens eine Phosphorothioat-modifizierte Nukleinsäure enthält.