DE102005023474A1

DE102005023474A1 - Affinitätsträger mit immobilisiertem Protein A

Info

Publication number: DE102005023474A1
Application number: DE102005023474A
Authority: DE
Inventors: Lothar Dr. Britsch
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 2004-06-17
Filing date: 2005-05-20
Publication date: 2006-01-05

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Affinitätsträger mit immobilisiertem, kovalent gebundenem Protein A, die sich durch einen besonders hohen funktionellen Wirkungsgrad auszeichnet, deren Herstellung sowie deren Verwendung bei der affinitätschromatographischen Aufreinigung und Analyse von Antikörpern.
Kennzeichnend für die erfindungsgemäßen Trägermaterialien ist, dass das Protein A über eine Aminocarbonsäure als Abstandshalter an den Träger gebunden ist.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Affinitätsträger mit immobilisiertem, kovalent gebundenem Protein A, die sich durch einen besonders hohen funktionellen Wirkungsgrad auszeichnen, deren Herstellung sowie deren Verwendung bei der affinitätschromatographischen Aufreinigung und Analyse von Antikörpern.
Die Verwendung einer großen Vielfalt von Trägermaterialien mit chemisch kovalent gebundenem Protein A zur analytischen Bestimmung sowie zur präparativen Aufreinigung von Antikörpern aus Blutplasma oder Zellkulturen hat in den vergangenen Jahrzehnten eine stetig steigende Bedeutung erlangt. Diese bezieht sich sowohl auf Applikationen der besagten Affinitätsmedien in der medizinischen Diagnostik und der biomedizinischen Forschung als auch auf die Herstellung von auf Antikörpern beruhenden neuartigen Arzneistoffen.

Für die genannten Zwecke, insbesondere die Herstellung von Affinitätsmedien mit immobilisiertem Protein A, wurden in jüngster Zeit nicht nur die in der Zellwand von Staphylococcus aureus vorkommende und als Pathogenitätsfaktor dieser Mikroorganismen bekannte natürliche Form des antikörperbindenden Protein A in gereinigter Form, benutzt, sondern zunehmend auch gentechnisch veränderte, sogenannte rekombinante Formen dieses Proteins, die aus Zellkulturen mit entsprechend transformierten Wirtszellen erhalten werden. Derartige rekombinante Formen beinhalten beispielsweise die Entfernung eines Teils carboxyterminaler Aminosäuresequenzen, deren biologische Funktion die Anbindung des Protein A an die bakterielle Zellwand ist und die für die Verwendung des Proteins als Affinitätsligand nicht benötigt wird. Rekombinante Formen von Protein A zeichnen sich u.a. etwa durch erhöhte Stabilität gegen proteolytischen Abbau aus oder durch verbesserte Beständigkeit gegen alkalische Lösungen.

Allen bis heute bekannten Affinitätsmedien mit immobilisiertem Protein A ist gemeinsam, dass eine bestimmte Menge des gereinigten Proteins durch chemisch kovalente Immobilisierung auf eine gegebene Oberfläche von porösen oder nicht porösen Partikeln oder sonstigen Formkörpern aufgebracht wird. Eine nachteilige Folge dieser Art von Immobilisierung ist, dass nur noch ein Teil der vorhandenen affinen Bindungsstellen des Protein A tatsächlich für die temporäre Bindung der Antikörpermoleküle zur Verfügung steht. Die maximale Menge an Antikörpern, die an immobilisiertes Protein A theoretisch gebunden werden kann, ergibt sich wie folgt:
Jedes Protein A Molekül besitzt fünf Bindungsstellen für Antikörper, lokalisiert an den entsprechenden Domänen A bis E, d.h. das stöchiometrische Verhältnis für die Bindung von IgG an Protein A, auch als Wirkungsgrad oder Nutzungsgrad des immobilisierten Protein A bezeichnet, beträgt theoretisch bis zu 5.0 : 1. Unter Berücksichtigung der bekannten relativen Molekularmassen für Protein A von ca. 45'000 und Immunglobulin G von ca. 150'000 ist im Falle der Besetzung sämtlicher affiner Bindungsstellen des Protein A mit Immunglobulin G das Massenverhältnis gegeben zu 5 × rel. Molmasse IgG/rel. Molmasse Protein A = 16.7 : 1

Dies bedeutet, dass an 1 mg Protein A maximal 16.7 mg nicht aggregiertes molekulardispers gelöstes IgG affin gebunden werden können. Dies hat unter Bedingungen zu erfolgen, unter denen eine auf lediglich ionischer Wechselwirkung zwischen Protein A und IgG beruhende Bindung des letzteren an das erstere keinen wesentlichen Beitrag zur gebundenen Gesamtmenge darstellt.

Mit den bislang bekannten Trägermaterialien mit immobilisiertem Protein A können Wirkungsgrade der affinen Bindung von IgG an Protein A von nur 0.5 bis 1.5 zu 1 erreicht werden. Diese liegen also weit unterhalb der theoretisch möglichen Wirkungsgrade von bis zu 5.0 zu 1. Als Erklärung für die verminderte Fähigkeit des immobilisierten Protein A zur Bindung der 5-fachen stöchiometrischen Menge an IgG können Effekte der sterischen Hinderung, etwa durch schlechte Zugänglichkeit einzelner Domänen des immobilisierten Proteins für die wesentlich größeren Antikörpermoleküle herangezogen werden. Diese kann etwa in der molekularen Topologie und anderen Eigenschaften der Trägeroberfläche oder auch in der Art und Multiplizität der chemischen Anbindung des Protein A an diese Oberfläche begründet sein. Daneben kommen auch physikalisch oder chemisch bedingte teilweise Denaturierung, insbesondere der antikörper-affinen Domänen des Protein A, als Ursache für Funktionsverlust in Frage.

Da Affinitätsmedien mit immobilisiertem Protein A, insbesondere in ihrer Verwendung zur affinitätschromatographischen Aufreinigung diverser Antikörper für pharmazeutische Zwecke, aufgrund des hohen Preises für aufgereinigtes natürliches oder rekombinantes Protein A einen erheblichen Kostenfaktor für die damit betriebenen Herstellprozesse darstellen, folgt eine hohe Motivation, die Ökonomie derartiger Affinitätsmedien durch Verbesserung des Wirkungsgrades des immobilisierten Protein A zu erhöhen. Durch eine derartige Verbesserung des Wirkungsgrades, etwa auf Werte größer 1.5 : 1, könnte bei der Aufreinigung von IgG ein höherer Durchsatz der aufzureinigenden Probe, bezogen auf die eingesetzte Menge an immobilisiertem Protein A, erzielt werden. Anders ausgedrückt, würde zur Aufreinigung einer gegebenen Menge an IgG bei gleichem zeitlichem Durchsatz eine geringere Menge an immobilisiertem Protein A benötigt werden, was eine Kostensenkung für die Anwendung des Verfahrens zur Folge hätte.

Demnach besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, Protein A so auf geeignete Träger zu immobilisieren, dass ein Wirkungsgrad bezüglich der Ausnutzung der vorhandenen affinen Bindestellen für IgG zu Protein A von größer 1.5 : 1 erzielt wird.

Es wurde gefunden, dass Affinitätsmedien mit oberflächlich chemisch kovalent immobilisiertem Protein A mit einem Wirkungsgrad für das immobilisierte Protein A von größer als 1.5 : 1, typischerweise zwischen 2 1 und 4 : 1 erzeugt werden können.

Die Verbesserung des Wirkungsgrades wurde bei der Immobilisierung von Protein A auf hydroxylgruppenhaltige Träger erzielt, wobei die Anbindung des Proteins an die Oberfläche des Trägermaterials über einen besonderen, mit geeigneten funktionellen Gruppen ausgestatteten Abstandshalter („spacer") erfolgte.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein hydrophiles Trägermaterial, an das Protein A über einen Abstandshalter kovalent gebunden ist, dadurch gekennzeichnet, dass der Abstandhalter aus der Gruppe der Aminocarbonsäuren gemäß Formel I abgeleitet ist H₂N-R-COOH Imit
R = (CH₂)_n und
n = 2 – 10,
wobei ein oder mehrere H-Atome der Gruppe R unabhängig voneinander ersetzt sein können durch lineares oder verzweigtes C₁-C₆-Alkyl, F, Cl, OH, O-C₁-C₆-Alkyl, SH, S-C₁-C₆-Alkyl, NO₂, lineares oder verzweigtes C₁-C₆-Alkyl-OH, NH-C₁-C₆-Alkyl, insbesondere Methyl, Ethyl, Propyl, Methoxy, Ethoxy, 2-Hydroxyethyl, 2-Hydroxypropyl und
ein oder mehrere nicht benachbarte Methylengruppen der Gruppe R unabhängig voneinander ersetzt sein können durch O, S, N-Alkyl, NH, CONH oder NHCO.

In einer bevorzugten Ausführungsform trägt das Trägermaterial zumindest auf seiner Oberfläche Hydroxylgruppen.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist Protein A über eine seiner primären Aminogruppen über eine Amid-Bindung an den Abstandshalter gebunden.

In einer bevorzugten Ausführungsform besteht R nur aus unsubstituierten Methylengruppen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist R = (CH₂)₄.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Trägermaterial porös mit mittleren Porendurchmessern zwischen 50 und 150 nm.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Trägermaterial ein hydrophiles Polymer aus 2,3-Dihydroxypropylallylether und Methylen-bis-Acrylamid als Vernetzer und hat bevorzugt eine Porosität von ungefähr 80% und einen mittleren Porendurchmesser zwischen 80 und 100 nm.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das Trägermaterial poröses Kieselgel.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung von Trägermaterial mit immobilisiertem Protein A, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte:

a) Bereitstellen eines aktivierten hydrophilen Trägermaterials
b) Kovalente Anbindung eines Abstandshalters gemäß Formel I an das Trägermaterial aus Schritt a) H₂N-R-COOH Imit R = (CH₂)_n und n = 2 – 10, wobei ein oder mehrere H-Atome der Gruppe R unabhängig voneinander ersetzt sein können durch lineares oder verzweigtes C₁- C₆-Alkyl, F, Cl, OH, O-C₁-C₆-Alkyl, SH, S-C₁-C₆-Alkyl, NO₂, lineares oder verzweigtes C₁-C₆-Alkyl-OH, NH-C₁-C₆-Alkyl, insbesondere Methyl, Ethyl, Propyl, Methoxy, Ethoxy, 2-Hydroxyethyl, 2-Hydroxypropyl und ein oder mehrere nicht benachbarte Methylengruppen der Gruppe R unabhängig voneinander ersetzt sein können durch O, S, N-Alkyl, NH, CONH oder NHCO.
c) Kovalente Anbindung von Protein A an die Abstandshalter des aus Schritt b) erhaltenen modifizierten Trägermaterials

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Anbindung des Abstandshalters an das Trägermaterial über dessen primäre Aminogruppe durch Reaktion mit einer auf dem Träger vorhandenen Epoxygruppe.

In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Anbindung des Abstandshalters an das Trägermaterial als sekundäres Amin über dessen primäre Aminogruppe an eine auf dem Träger vorhandene Aldehydgruppe.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Anbindung des Protein A an eine Carboxygruppe des Abstandshalters.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Anbindung des Protein A an eine Carboxygruppe des Abstandshalters, die zuvor in einen N-Hydroxysuccinimidester umgewandelt wurde.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Chromatographiesäulen oder Extraktionskartuschen enthaltend das erfindungsgemäße Trägermaterial.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Trägermaterials zur Analyse oder Isolierung von Antikörpern.

1 zeigt beispielhaft eine Abfolge der chemischen Reaktionen zur Herstellung der erfindungsgemäßen Trägermaterialien mit immobilisiertem Protein A.

Zur Darstellung der erfindungsgemäßen Trägermaterialien ist jede Art von antikörperbindendem Protein A geeignet, d.h. z.B. die bekannte natürliche Form des antikörperbindenden Protein A oder auch gentechnisch veränderte, sogenannte rekombinante Formen dieses Proteins, die aus Zellkulturen mit entsprechend transformierten Wirtszellen erhalten werden.

Erfindungsgemäß geeignete Trägermaterialien sind feste oder gelartige Materialien wie sie typischerweise für chromatographische oder Extraktionszwecke eingesetzt werden. Typischerweise sind dies organische oder anorganische Polymere, die zumindest an ihrer Oberfläche hydrophil sind. Bevorzugt tragen die Trägermaterialien zumindest an ihrer Oberfläche Hydroxylgruppen. Enthält das Basis-Polymer keine Hydroxylgruppen, so können diese nachträglich durch entsprechende Modifikation eingeführt werden oder aber bereits während der Polymer-Synthese durch Kopolymerisation mit entsprechend funktionalisierten Monomeren eingebracht werden.

Beispiele für geeignete Trägermaterialien und/oder Basis-Träger sind homogen und/oder heterogen quervernetzte Polystyrole, homogen und/oder heterogen quervernetzte Polyvinylacetate, Polyamide, Polyethylene, Polypropylene, quervernetzte Dextrane, quervernetzte Agarose, Materialien auf Basis von Polysacchariden wie Cellulose oder Amylose, sowie Trägermaterialien auf Basis von Silica, Titanoxid, Zirkonoxid und Aluminiumoxid.

Besonders bevorzugt ist als Trägermaterial ein hydrophiles Polymer aus 2,3-Dihydroxypropylallylether und Methylen-bis-Acrylamid als Vernetzer. Besonders bevorzugt ist ein derartiges Polymer mit einer Porosität von ungefähr 80% und einem mittleren Porendurchmesser zwischen 80 und 100 nm. Ein solches Material ist bei der Firma Merck KGaA unter dem Namen Fractoprep^® erhältlich.

Es ist darauf zu achten, dass das gewählte Trägermaterial keine Nebenreaktionen eingehen kann, die die Anbindung des Protein A stören. Beispielsweise scheint ein vernetztes Polymethacrylat mit NHS-Ester-Zwischenstufen bei der Immobilisierung zu reagieren. In diesem Fall müssen andere Arten der Immobilisierung gewählt werden oder das Trägermaterial entsprechend behandelt oder geändert werden.

Bei Trägermaterialien auf Basis von Silica handelt es sich um Materialien, die ganz aus Glas, Keramiken und/oder Silica (Kieselgel) bestehen, oder bei denen die Oberfläche zumindest teilweise mit Glas, Keramiken und/oder Silica belegt ist. Der Begriff Silica umfasst auch Materialien, bei deren Herstellung Silane verwendet wurden, die ein oder zwei organische Reste (d.h. z.B. C1 bis C8-Alkyl und/oder C5 bis C18 Aryl-Reste, insbesondere Methyl, Ethyl, n/iso-Propyl, n/tert-Butyl, Phenyl, Benzyl oder Naphthyl) tragen, d.h. sogenannte Hybrid-Materialien.

Das Trägermaterial kann beispielsweise als monolithische Säule oder Kapillare, Platte, Partikel, Beschichtung, Faser, Filter oder andere poröse oder unporöse Struktur vorliegen. Bevorzugt liegt das Material als poröse Struktur vor, besonders bevorzugt als Partikel oder monolithischer Formkörper. Bei partikulären Materialien sind z.B. Materialien mit einer Partikelgröße (mittlerer Durchmesser) zwischen 20 und 100 μm geeignet.

Im Fall von porösen Trägermaterialien ist die Porenstruktur bevorzugt monomodal oder bimodal. Auch tri- oder oligomodale Porenverteilungen sind möglich. Bevorzugt sind mittlere Porendurchmesser zwischen 30 und 300 nm, besonders bevorzugt zwischen 50 und 150 nm.

In WO 95/03256 und besonders in WO 98/29350 werden Verfahren zur Herstellung anorganischer monolithischer Formkörper nach einem Sol-Gel Prozess offenbart. Diese Materialien enthalten Mesoporen mit einem Durchmesser zwischen 2 und 100 nm und Makroporen mit einem mittleren Durchmesser von über 0,1 μm und sind somit für eine erfindungsgemäße Anwendung gut geeignet.

Verfahren zur Einführung von Hydroxylgruppen auf der Oberfläche von Trägermaterialien sind dem Fachmann bekannt. Im Fall von Kieselgel-Materialien können z.B. Diol-modifizierte Phasen verwendet werden.

Unter aktivierten Trägermaterialien sind erfindungsgemäß Trägermaterialien mit reaktiven Gruppen zu verstehen, die mit oder ohne Zugabe zusätzlicher Reagenzien eine kovalente Bindung mit primären Aminen eingehen können. Entsprechende aktivierte Trägermaterialien werden z.B. auch für die Einführung von Separationseffektoren in Trägermaterialien für die Chromatographie verwendet. Beispiele für aktivierte Trägermaterialien sind Materialien mit Azlacton-Gruppen, NHS-Estern, Epoxid-Gruppen oder Aldehydgruppen. Dem Fachmann ist bekannt, welche Reaktionsbedingungen und/oder zusätzliche Reagenzien notwendig sind, um eine kovalente Bindung des Abstandshalters mit einem speziellen aktivierten Träger zu erzeugen.

Ein Abstandshalter ist erfindungsgemäß ein Molekül, das einerseits kovalent mit dem Trägermaterial verbunden werden kann und an das andererseits kovalent Protein A gebunden werden kann. Auf diese Weise ist Protein A nicht direkt an das Trägermaterial gebunden sondern mit einem durch den Abstandshalter bewirkten räumlichen Abstand. Wichtigste Eigenschaft des Abstandshalters ist also, dass eine funktionelle Gruppe zur Anbindung an das Trägermaterial vorhanden ist und eine funktionelle Gruppe zur Anbindung von Protein A. Zur Anbindung an das Trägermaterial ist eine funktionelle Gruppe nötig, die eine Anbindung an den Träger ermöglicht, die unter den weiteren Schritten für die Immobilisierung des Protein A und unter den folgenden chromatographischen bzw. Extraktionsbedingungen stabil ist. Erfindungsgemäß erfolgt die Anbindung über eine primäre Aminogruppe, die z.B. mit einer Aldehyd-Funktion oder einer Epoxy-Gruppe auf dem Trägermaterial reagiert. Zur Anbindung des Protein A trägt der Abstandshalter eine Carbonsäure-Funktion, die mit primären Amino-Gruppen des Protein A reagieren kann.

Der erfindungsgemäße Abstandshalter ist ausgewählt aus der Gruppe der Aminocarbonsäuren gemäß Formel I H₂N-R-COOH Imit R = (CH₂)_n,
n = 2 – 10,
wobei ein oder mehrere H-Atome der Gruppe R unabhängig voneinander ersetzt sein können durch lineares oder verzweigtes C₁-C₆-Alkyl, F, Cl, OH, O-C₁-C₆-Alkyl, SH, S-C₁-C₆-Alkyl, NO₂, lineares oder verzweigtes C₁-C₆-Alkyl-OH, NH-C₁-C₆-Alkyl, insbesondere Methyl, Ethyl, Propyl, Methoxy, Ethoxy, 2-Hydroxyethyl, 2-Hydroxypropyl und
ein oder mehrere nicht benachbarte Methylengruppen der Gruppe R unabhängig voneinander ersetzt sein können durch 0, S, N-Alkyl, NH, CONH oder NHCO.

Beispiele für geeignete Abstandshalter sind 5-Amino-pentansäure (R = (CH₂)₄) oder 6-Amino-hexansäure (R = (CH₂)₅). Besonders bevorzugt ist R = (CH₂)₃, d.h. der Abstandshalter ist 4-Amino-buttersäure (GABA).

Die erfindungsgemäßen Trägermaterialien haben daher die folgende allgemeine Struktur gemäß Formel II T---HN-R-CO---ProtA IImit
T = Trägermaterial
ProtA = Protein A
R = (CH₂)_n und
n = 2 – 10,
wobei ein oder mehrere H-Atome der Gruppe R unabhängig voneinander ersetzt sein können durch lineares oder verzweigtes C₁-C₆-Alkyl, F, Cl, OH, O-C₁-C₆-Alkyl, SH, S-C₁-C₆-Alkyl, NO₂, lineares oder verzweigtes C₁-C₆-Alkyl-OH, NH-C₁-C₆-Alkyl, insbesondere Methyl, Ethyl, Propyl, Methoxy, Ethoxy, 2-Hydroxyethyl, 2-Hydroxypropyl und
ein oder mehrere nicht benachbarte Methylengruppen der Gruppe R unabhängig voneinander ersetzt sein können durch O, S, N-Alkyl, NH, CONH oder NHCO.

Es versteht sich, dass das Trägermaterial nicht wie in Formel II schematisch dargestellt nur einen Abstandshalter hat, sondern eine Vielzahl von Abstandshaltern. Zumeist ist nicht an alle Abstandshalter ein Protein A gebunden.

Die chemische Bindung zwischen dem Abstandshalter und dem Trägermaterial bzw. Protein A ist durch eine unterbrochene Linie dargestellt, da je nach chemischer Struktur und/oder Aktivierung des Trägermaterials oder des Proteins die Anbindung über unterschiedliche Funktionalitäten erfolgen kann.

a) Bereitstellen eines aktivierten Trägermaterials. Zumeist werden dazu die erfindungsgemäß geeigneten hydrophilen Trägermaterialien zunächst mit entsprechenden Reagenzien zur Einführung von (Amino-) reaktiven Gruppen umgesetzt.
b) Kovalente Anbindung eines erfindungsgemäßen Abstandshalters an das Trägermaterial aus Schritt a)
c) Kovalente Anbindung von Protein A an die Abstandshalter des aus Schritt b) erhaltenen modifizierten Trägermaterials

Die kovalente Bindung des Abstandshalters an das Trägermaterial erfolgt in Abhängigkeit von der Art der funktionellen Gruppen auf dem Trägermaterial und der funktionellen Gruppen des Abstandshalters nach dem Fachmann bekannten Methoden.

Eine bevorzugte Möglichkeit besteht darin, ein Trägermaterial mit oberflächlich vorhandenen Diolgruppen zu verwenden. Diese können dann beispielsweise durch Oxidation mit Natriummetaperiodat teilweise oder vollständig in Aldehydgruppen umgewandelt werden. An dieses aktivierte Trägermaterial wird dann die primäre Aminogruppe des Abstandshalters durch reduktive Aminierung gebunden. Zur Kopplung des Protein A wird dann eine endständige Carboxylgruppe des Abstandshalters eingesetzt. Diese wird unter Verwendung eines intermediär daraus hergestellten N-Hydroxysuccinimidesters oder einer anderen entsprechend aktivierten Form, unter Ausbildung einer amidartigen Bindung zwischen der Carboxygruppe des Abstandshalters und primären Aminogruppen der Oberfläche des Proteins, mit dem Protein A umgesetzt. Man erhält einen Träger mit kovalent immobilisiertem Protein A.

1 zeigt das eben beschriebene Reaktionsschema nochmals ausführlich:
Das in Schritt A eingesetzte Aldehyd-funktionalisierte Trägermaterial wird zunächst durch Oxidation mit Natriumperiodat aus Diolgruppen der Oberfläche des Trägermaterials hergestellt.
A → B, Bildung von Schiff'schen Basen durch Kopplung von Aminocarbonsäuren an die Aldehydgruppen
B → C, Reduktion der Doppelbindung der Schiff'schen Basen zum sekundären Amin
C → D, Aktivierung der terminalen Carboxygruppe zum N-Hydroxysuccinimidester über ein intermediär gebildetes O-Acylisoharnstoffderivat
D → E, Ausbildung einer Amidbindung zwischen primären Aminogruppen von Protein A und der als N-Hydroxysuccinimidester aktiviert vorliegenden terminalen Carboxygruppe des als sekundäres Amin an das Trägermaterial gekoppelten Abstandshalters.
Abkürzungen: NHS = N-Hydroxysuccinimid; EDC = N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid

Eine weitere Möglichkeit zur Herstellung der erfindungsgemäßen Trägermaterialien besteht im Einsatz von Epoxy-aktivierten Trägermaterialien, die mit Amino-Gruppen eines Abstandshalters umgesetzt werden.

Die erfindungsgemäßen Trägermaterialien mit immobilisiertem Protein A zeigen einen Wirkungsgrad > 1,5. Typischerweise beträgt der Wirkungsgrad sogar > 2, bevorzugt > 3. Auf diese Weise benötigt man bei Verwendung der erfindungsgemäßen Trägermaterialien pro Einheit des zu bindenden Antikörpers weniger Protein A. Da Protein A sehr teuer ist, spielt die Verminderung der Menge an benötigtem Protein A wirtschaftlich eine große Rolle.

Das erfindungsgemäße Trägermaterial kann für jede Form der Affinitätschromatographie oder Extraktion eingesetzt werden. Typischerweise wird es in Chromatographiesäulen oder Extraktionskartuschen eingesetzt.

Auch ohne weitere Ausführungen wird davon ausgegangen, daß ein Fachmann die obige Beschreibung im weitesten Umfang nutzen kann. Die bevorzugten Ausführungsformen und Beispiele sind deswegen lediglich als beschreibende, keineswegs als in irgendeiner Weise limitierende Offenbarung aufzufassen.

Die vollständige Offenbarung aller vor- und nachstehend aufgeführten Anmeldungen, Patente und Veröffentlichungen, insbesondere der korrespondierenden Anmeldung DE 10 2004 029 341 .4, eingereicht am 17.06.2004, ist durch Bezugnahme in diese Anmeldung eingeführt.

1. Vergleich der erfindungsgemäßen Trägermaterialien mit dem Stand der Technik
Die folgende Tabelle zeigt Bindungskapazität, immobilisierte Menge an Protein A und Wirkungsgrad desselben bei verschiedenen Proben der erfindungsgemäßen Chromatographiemedien für die Affinitätschromatographie von Immunglobulinen sowie von Vergleichsproben. Herstellvorschriften zu den aufgeführten Materialien finden sich in den Beispielen 2 und 3.
Tabelle 1
Die Proben S1 – S11 stellen Präparate dar, bei denen Protein A durch reduktive Aminierung direkt an die Oberfläche des Trägermaterials Fractoprep gebunden wurde. Dabei wurden verschiedene Aktivierungsgrade der Oberfläche mit Aldehydgruppen sowie unterschiedliche Mengen von daran immobilisiertem Protein A verwendet.
Die Proben S14 bis S17 sind Präparate, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung von unterschiedlichen Abstandshaltern hergestellt wurden (β-ALA = β-Alanin, GABA = Gamma-Aminobuttersäure, 5-AVA = 5-Aminovaleriansäure, 6-AHA = 6-Aminohexansäure).
Die Proben S18 bis S21 wurden mit GABA als Abstandshalter, jedoch mit zunehmender Aktivität des für die Kopplung von Protein A intermediär hergestellten aktivierten N-Hydroxysuccinimidesters (s. 1 D) hergestellt.
Die Probe S24 wurde ausgehend von einem Kieselgel-Diol (Fuji Silysia 800 Diol) mit 6-AHA als Abstandshalter für das immobilisierte Protein A hergestellt.
Die folgende Tabelle 2 zeigt weiterhin die entsprechenden Daten für kommerziell erhältliche Protein A Trägermaterialien:
Tabelle 2
Die aufgeführten Daten zeigen deutlich, dass die erfindungsgemäßen Trägermaterialien wesentlich höhere Wirkungsgrade aufweisen als Trägermaterialien nach dem Stand der Technik.
2. Vorschriften zur Herstellung von Protein A Trägern nach dem Stand der Technik ohne Abstandshalter
Vorschrift zur Herstellung der Probe S1
Aus 20 ml FRACTOPREP^® Rohstoff wird durch zehnmaliges Waschen auf einer Glasfritte mit je 20 ml Wasser das Lagermedium entfernt und der Filterkuchen in 40 ml 0,8M Natriummetaperiodatlösung suspendiert und 15 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt.
Danach wird das Gel von der überstehenden Flüssigkeit auf einer Glasfritte abgesaugt und zehnmal mit Wasser und fünfmal mit 0,1M Natriumhydrogenphosphatpuffer, pH 8.0, 0,15M Natriumchlorid, gewaschen.
Der Filterkuchen wird suspendiert in einer frisch angesetzten Lösung von 150 mg Protein A in 20ml 0,1M Natriumhydrogenphosphat, 0,15M Natriumchlorid, pH 8,0. Sodann werden 125 mg Natriumcyanoborhydrid zugegeben und 12 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt.
Es Gel wird erneut abgesaugt und fünfmal mit 0,1M Natriumhydrogenphosphat, 0,15M Natriumchlorid, pH 8,0 und dann zehnmal mit 20mM Natriumacetatpuffer, pH 5,5, gewaschen.
Es wird in 20mM Phosphat-Puffer pH 7,0 mit 0,01 % Azid oder aber in demselben Puffer mit einem Gehalt von 20% (v/v) an Ethanol anstelle von Azid, bei 5°C gelagert.
Vorschrift zur Herstellung der Probe S5
Die Probe wird analog zur Probe S1 hergestellt, jedoch mit 75 mg anstelle von 150 mg Protein A.
Vorschrift zur Herstellung der Probe S6 Die Probe wird analog zur Probe S1 hergestellt, jedoch mit 0.2M anstelle von 0.8M Natriumperiodatlösung.
Vorschrift zur Herstellung der Probe S11
Die Probe wird analog zur Probe S5 hergestellt, jedoch mit 0.022M anstelle von 0.8M Natriumperiodatlösung.
3. Vorschriften zur Herstellung erfindungsgemäßer Trägermaterialien
Vorschrift zur Herstellung der Probe S15
Aus 20 ml FRACTOPREP^© Rohstoff wird durch zehnmaliges Waschen auf einer Glasfritte mit je 20 ml Wasser das Lagermedium entfernt und der Filterkuchen in 40 ml 0,2M Natriummetaperiodatlösung suspendiert und 15 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt.
Danach wird das Gel von der überstehenden Flüssigkeit auf einer Glasfritte abgesaugt und zehnmal mit Wasser und fünfmal mit 0,1M Natriumhydrogenphosphatpuffer, pH 8.0, 0,15M Natriumchlorid, gewaschen.
Der Filterkuchen wird suspendiert in einer frisch angesetzten Lösung von 500 mg 4-Aminobuttersäure in 20ml 0,1M Natriumhydrogenphosphat, 0,15M Natriumchlorid, pH 8,0. Sodann werden 125 mg Natriumcyanoborhydrid zugegeben und die Suspension 16 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt.
Das Gel wird erneut abgesaugt und fünfmal mit 0,1M Natriumhydrogenphosphat, 0,15M Natriumchlorid, pH 8,0 und dann zehnmal mit 20mM Natriumacetatpuffer, pH 5,5, gewaschen.
Der Filterkuchen wird nacheinander mit je 10ml einer frisch angesetzten Lösung von 1,4g EDC in 10ml 20mM Natriumacetatpuffer pH 5,5 und 10ml 0,2g N-Hydroxysuccinimid in 10ml 20mM Natriumacetatpuffer pH 5,5 versetzt, suspendiert und 1 Stunde bei Raumtemperatur geschüttelt. Anschließend wird abgesaugt, zehnmal mit je 20ml Natriumacetatpuffer (20mM, pH 5,5) gewaschen und sofort der nachfolgende Schritt durchgeführt.
Der Filterkuchen wird in eine Lösung von 150 mg Protein A in 25 ml 20mM Natriumacetatpuffer pH 5,5 gegeben, darin suspendiert und 12h bei Raumtemperatur geschüttelt. Anschließend wird abgesaugt und 5-mal mit 20mM Natriumacetatpuffer pH 5,5 gefolgt von fünfmal 20mM Phosphat-Puffer pH 7,0 gewaschen.
Es wird in 20mM Phosphat-Puffer pH 7,0 mit 0,01 % Azid oder aber in demselben Puffer mit einem Gehalt von 20% (v/v) an Ethanol anstelle von Azid, bei 5°C gelagert.
Die Herstellung der Proben S14 und 16-17 erfolgt entsprechend, wobei jeweils der in Tabelle 1 genannte Abstandshalter eingesetzt wird.
Vorschrift zur Herstellung der Probe S24
In 160 ml einer 0,2M Natriummetaperjodatlösung werden 35 g Kieselgel Diol (Fuji Silysia MB 800-40/75) suspendiert und 15 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt. Danach wird das Gel abgesaugt und zehnmal mit Wasser und fünfmal mit 0,1M Natriumhydrogenphosphatpuffer, 0,15M Natriumchlorid, pH8,0, gewaschen. Das erhaltene aldehydaktivierte Kieselgel nimmt ein Volumen von etwa 80 ml ein.
Das gewaschene Gelsediment wird in einer frisch angesetzten Lösung von 2.4g 6-Aminohexansäure in 40ml 0,1M Natriumhydrogenphosphat, 0,15M Natriumchlorid, pH8,0, suspendiert. Dann werden 500mg Natriumcyanoborhydrid, frisch gelöst in 40ml 0,1M Natriumhydrogenphosphat, 0,15M Natriumchlorid, pH8,0, zugegeben und die Suspension 16 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Es wird erneut abgesaugt und fünfmal mit 0,1M Natriumhydrogenphosphat, 0,15M Natriumchlorid, pH8,0 und zehnmal mit 20mM Natriumacetatpuffer, pH5,5, gewaschen.
Der Filterkuchen wird nacheinander mit je 40ml einer frisch angesetzten Lösung von 5,6g EDC in 10ml 20mM Natriumacetatpuffer pH5,5 und 40ml 0,8g N-Hydroxysuccinimid in 10ml 20mM Natriumacetatpuffer, pH5,5, suspendiert und eine Stunde bei Raumtemperatur geschüttelt. Anschließend wird abgesaugt, zehnmal mit je 20ml 20mM Natriumacetatpuffer, pH5,5, gewaschen und unmittelbar danach der Filterkuchen in eine Lösung von 50mg Protein A in 25 ml 20mM Natriumacetatpuffer, pH5,5, gegeben.
Es wird 16 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt, danach abgesaugt und fünfmal mit 20mM Natriumacetatpuffer, pH5,5 und fünfmal mit 20mM Natriumphosphat-Puffer, pH7,0, gewaschen.
Es wird in 20mM Phosphat-Puffer pH 7,0 mit 0,01 % Azid oder aber in demselben Puffer mit einem Gehalt von 20% (v/v) an Ethanol anstelle von Azid, bei 5°C gelagert.

Claims

Hydrophiles Trägermaterial an das Protein A über einen Abstandshalter kovalent gebunden ist, dadurch gekennzeichnet, dass der Abstandhalter aus der Gruppe der Aminocarbonsäuren gemäß Formel I abgeleitet ist H₂N-R-COOH Imit R = (CH₂)_n und n = 2 – 10, wobei ein oder mehrere H-Atome der Gruppe R unabhängig voneinander ersetzt sein können durch lineares oder verzweigtes C₁-C₆-Alkyl, F, Cl, OH, O-C₁-C₆-Alkyl, SH, S-C₁-C₆-Alkyl, NO₂, lineares oder verzweigtes C₁-C₆-Alkyl-OH, NH-C₁-C₆-Alkyl, insbesondere Methyl, Ethyl, Propyl, Methoxy, Ethoxy, 2-Hydroxyethyl, 2-Hydroxypropyl und ein oder mehrere nicht benachbarte Methylengruppen der Gruppe R unabhängig voneinander ersetzt sein können durch O, S, N-Alkyl, NH, CONH oder NHCO.
Trägermaterial nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial zumindest auf seiner Oberfläche Hydroxylgruppen trägt.
Trägermaterial nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass Protein A über eine seiner primären Aminogruppen über eine Amid-Bindung an den Abstandshalter gebunden ist.
Trägermaterial nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass R nur aus unsubstituierten Methylengruppen besteht.
Trägermaterial nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass R = (CH₂)₄ ist.
Trägermaterial nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial porös mit mittleren Porendurchmessern zwischen 50 und 150 nm ist.
Trägermaterial nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial ein hydrophiles Polymer aus 2,3-Dihydroxypropylallylether und Methylen-bis-Acrylamid als Vernetzer ist.
Trägermaterial nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial poröses Kieselgel ist.
Verfahren zur Herstellung von Trägermaterial mit immobilisiertem Protein A, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte: a) Bereitstellen eines aktivierten Trägermaterials b) Kovalente Anbindung eines Abstandshalters gemäß Formel I an das Trägermaterial aus Schritt a) c) Kovalente Anbindung von Protein A an die Abstandshalter des aus Schritt b) erhaltenen modifizierten Trägermaterials
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Anbindung des Abstandshalters an das Trägermaterial über dessen primäre Aminogruppe durch Reaktion mit einer auf dem Träger vorhandenen Epoxygruppe erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Anbindung des Abstandshalters an das Trägermaterial als sekundäres Amin über dessen primäre Aminogruppe an eine auf dem Träger vorhandene Aldehydgruppe erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Anbindung des Protein A an eine Carboxygruppe des Abstandshalters erfolgt.
Chromatographiesäulen oder Extraktionskartuschen enthaltend das Trägermaterial entsprechend einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7.
Verwendung des Trägermaterials entsprechend einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7 zur Analyse oder Isolierung von Antikörpern.