DE102005017592A1

DE102005017592A1 - Darreichungsformen und Kombinationspräparate von Pyrimidinbiosyntheseinhibitoren zur Erzielung zusätzlicher Wirkungen auf das Immunsystem

Info

Publication number: DE102005017592A1
Application number: DE102005017592A
Authority: DE
Inventors: Juergen Lindner
Original assignee: Lindner Juergen Dr Med
Current assignee: Lindner Juergen Dr Med
Priority date: 2005-04-16
Filing date: 2005-04-16
Publication date: 2006-10-19
Also published as: WO2006111296A2; WO2006111296A3

Abstract

Die beim Menschen eingesetzte kommerzielle Formulierung des Pyrimidinbiosyntheseinhibitors Leflunomide führt nicht zu den aus tierexperimentellen Untersuchungen erwarteten Wirkungen auf TH-2 abhängige Immunprozesse und nicht zum erwarteten Aufbau von regulatorischen Immunantworten. DOLLAR A Es wurde überraschender Weise gefunden, dass durch Verabreichungsformen bzw. Kombinationspräparate von Pyrimidinbiosyntheseinhibitoren, die zu täglichen mehrstündigen Schwankungen der Plasmakonzentrationen bzw. zu täglich mehrstündigen Schwankungen der Wirkung der Hemmung der Pyrimidinbiosynthese führen, diese pharmakodynamischen Wirkungen auf TH-2 abhängige Prozesse und der Aufbau wie z. B. regulatorische Immunantworten auch beim Menschen erzielt werden können. DOLLAR A Durch diese zusätzlichen Wirkungen sind diese Formulierungen geeignet überschießende schädigende Immunreaktionen (z. B. Autoimmunreaktionen oder allergische Reaktionen) sowie degenerative Prozesse durch Aufbau einer regulatorischen Immunantwort zu behandeln. DOLLAR A Eine geeignete Darreichungsform stellt zum Beispiel die schnell zerfallende Hartgelatinekapseln mit einer Mischung von feinpulvrigem Leflunomide in Glucose dar. Ein geeignetes Kombinationspräparat stellt zum Beispiel die Kombination mit Cholestyramin dar, welches durch eine zeitversetzte Wirkung (retardierte Freisetzung von Cholestyramin), wenige Stunden nach der Resorption von Leflunomide zu einem Abfall der Blutplasmakonzentration des wirksamen Metaboliten von Leflunomide ...

Description

Die beim Menschen eingesetzte kommerzielle Darreichungsform des Pyrimidinbiosyntheseinhibitors Leflunomide (Arava^®) führt nicht zu den aus tierexperiementellen Untersuchungen erwarteten Wirkungen auf TH-2 abhängige Immunprozesse und nicht zum erwarteten Aufbau von regulatorischen Immunantworten.

Es wurde überraschender Weise gefunden, dass durch Verabreichungsformen bzw. Kombinationspräparate von Pyrimidinbiosyntheseinhibitoren, die zu täglichen mehrstündigen Schwankungen der Plasmakonzentrationen/bzw. mehrstündigen Schwankungen der Wirkung der Hemmung der Pyrimidinbiosynthese führen, pharmakodynamische Wirkungen wie z.B. regulatorische Immunantworten hervorgerufen werden können, die

1. unter Formulierungen/Kombinationspräparaten die zu konstanten Plasmakonzentrationen führen, nicht beobachtet werden;
2. geeignet sind verschiedenste immunologische Erkrankungsprozesse nachhaltig positiv zu beeinflussen;
3. auch nach dem Absetzen der Pyrimidinbiosyntheseinhibitoren weiter bestehen bleiben können;
4. die in der Regel eine stärkere pharmakodynamische Wirkung besitzen als bei Formulierungen, die zu konstanten Plasmakonzentrationen/bzw. konstanter Hemmung der Pyrimidinbiosynthese führen.

Gegenstand der Erfindung sind Darreichungsformen und/oder Kombinationspräparate von Pyrimidinbiosyntheseinhibitoren mit denen täglich mehrstündig anhaltende Schwankungen der Hemmung der Pyrimidinbiosynthese erzielt werden können. Dadurch sind diese Formulierungen geeignet überschiessende schädigende Immunreaktionen sowie degenerative Prozesse durch Aufbau einer regulatorischen Immunantwort zu behandeln.

Überschießende, schädigende Immunreaktionen sind Immunreaktionen gegen körpereigene und/oder körperfremde Stoffe, die den Organismus mehr schädigen als nutzen. Überschießende, schädigende Immunreaktionen gegen körperfremde Sub stanzen können allergische Reaktionen, Transplantatabstoßungen oder Immunreaktionen gegen gentechnisch veränderte Zellen oder deren Produkte wie Faktor VIII oder Insulin sein. Beispiele für überschießende, schädigende Reaktionen gegen körpereigene Stoffe sind Autoimmunerkrankungen wie Multiple Sklerose, rheumatoide Arthritis, Pemphigus Vulgaris und Thyreoiditis Hashimoto. Bei einigen Erkrankungen wie Colitis ulcerosa, Morbus Crohn, Psoriasis und Arteriosklerose treten sowohl gegen körpereigene als auch gegen körperfremde Substanzen überschießende Immunreaktionen auf, die den Organismus mehr schädigen als ihm nutzen. Bei den sog. Kontaktallergien treten Immunreaktionen gegen körperfremde Antigene und/oder durch chemische Verbindungen veränderte körpereigene Strukturen auf, zum Beispiel bei den Kontaktallergien gegen Nickel oder Chrom.

Unter degenerativen Prozessen versteht man Erkrankungen, die sich durch ein Ungleichgewicht von Gewebeaufbau und Gewebeabbau auszeichnen. Hierzu gehören beispielsweise Arthrose, Osteoporose, Demenzerkrankungen und Colitis ulcerosa.

Unter einer antigen-spezifischen Effektoraktivität des Immunsystems versteht man die verstärkte Immunreaktion des Immunsystems gegen ein spezifisches, meist bereits bekanntes Antigen. Dadurch werden heftige Reaktionen ausgelöst, die zu einer Zerstörung von Zellen führen oder eine Immunreaktion im Sinne z.B. einer Entzündungsreaktion gegen das erkannte Antigen erheblich steigern.

Unter einer antigen-spezifischen Suppressoraktivität versteht man eine Reaktion des Immunsystems, bei der die Suppressorzellen mit einem meist bekannten spezifischen Antigen so reagieren, dass die Effektorimmunreaktion gegen die erkannte Struktur herunterreguliert wird. Überwiegt die Suppressoraktivität die Effektoraktivität, so sind Effektorreaktionen des Immunsystems gegen die von den Suppressorzellen erkannten Strukturen nicht mehr möglich.

Normalerweise reagiert das Immunsystem des Organismus auf das Antigen mit einer regulatorischen Immunantwort, bei der eine antigen-spezifische, suppressorische Aktivität gegenüber der proinflammatorischen oder cytoxischen Effektoraktivität des Immunsystems überwiegt. Das so entstehende Gleichgewicht zwischen suppressorischer und proinflammatorischer Effektoraktivität des Immunsystems kann nun allerdings entscheidend gestört werden, wenn eine zusätzliche entzündliche Reaktion auftritt. Diese verschiebt dann das Gleichgewicht von der antigen-spezifischen Suppressoraktivität hin zu einer antigen-spezifischen proinflammatorischen und/oder cytotoxischen Effektoraktivität. Sobald die Entzündungsreaktion eliminiert ist, verschiebt sich durch die regulatorische Immunantwort das Gleichgewicht zwischen Suppressoraktivität und Effektoraktivität wieder zu einem Übergewicht der Suppressoraktivität.

Die bisher übliche Therapie von Erkrankungen, die durch überschießende, schädigende Effektorimmunreaktionen verursacht werden, erfolgt in der Regel symptomatisch. Dabei werden die Effektorimmunreaktionen und deren unerwünschte Begleiterscheinungen relativ unspezifisch unterdrückt. Zum Teil wird zusätzlich zur erwünschten Unterdrückung der Effektorimmunantwort auch die für Langzeittherapieerfolge notwendige Suppressorimmunantwort unterdrückt bzw. zerstört. Immunsuppressive Medikamente wie Cyclosporin A, Kortikoide oder Cyclophosphamid unterdrücken derartige Erkrankungen zwar sehr effektiv, sind jedoch mit erheblichen Nebenwirkungen verbunden. Sie haben außerdem den Nachteil, dass nach dem Absetzen dieser Medikamente die Erkrankung wieder auftritt und es dabei im Rahmen des Erkrankungsschubs sehr oft zu irreparablen Schädigungen kommt. Die bisher existierenden Behandlungsmethoden für Erkrankungen, die durch überschießende, schädigende Reaktionen des Immunsystems gegen bestimmte Antigene hervorgerufen werden, sind deshalb entweder wenig wirksam oder mit erheblichen Nebenwirkungen verbunden. Es besteht deshalb ein großer Bedarf an Arzneizubereitungen, die überschießende, schädigende Reaktionen des Immunsystems verhindern und dabei gleichzeitig wenig Nebenwirkungen aufweisen. Die Behandlung mit einem derartigen Arzneipräparat darf allerdings zu keiner Beeinträchtigung des Immunsystems führen, da unter bestimmten pathologischen Bedingungen Autoimmunreaktionen physiologisch sehr sinnvoll sind, zum Beispiel bei einer Autoimmunreaktion gegen körpereigene Tumorzellen oder mit Viren infizierten Zellen. Allerdings muss diese Autoimmunreaktion nach der Zerstörung der Tumorzellen oder der mit Viren infizierten Zellen selbständig wieder zum Stillstand kommen und darf kein gesundes, körpereigenes Gewebe zerstören. Da von immunsuppressiven Zellen bekannt ist, dass sie u.a. den immunsuppressiven Faktor TGF-β (Tissue Growth Factor β) produzieren, können diese Zellen auch die Regeneration von Gewebe stimulieren.

Das bisherige Wissen über den Wirkungsmechanismus von Leflunomide lässt sich dahingehend zusammenfassen, dass in vitro Leflunomide klassische immunsuppressorische Wirkungen zeigt (Hemmung der Pyrimidinbiosynthese, Hemmung der Tyrosinphosphorylierung und Inhibition des Nuklear Factor Kappa B Signaltransduktionsweges). In vivo vermittelt Leflunomide anscheinend seine Wirkung über Lymphozyten.

Insgesamt sind die klinischen Erfolge von Leflunomide beziehungsweise dessen aktiven Metaboliten (HMR 1726 bzw. auch Teriflunomide genannt) hinter den Erwartungen zurückgeblieben, die man aufgrund von tierexperimentellen Untersuchungen an diese Substanzen und damit an die gesamte Wirkstoffgruppe der Pyrimidinbiosyntheseinhibitoren knüpfte. Insbesondere haben die Wirkungen bei der Anwendung am Menschen im Hinblick auf die Beeinflussung von TH-2 abhängigen Immunreaktionen und der Entwicklung von Langzeiteffekten („Toleranz des Immunsystems") enttäuscht.

In den tierexperimentellen Arbeiten von J.W. Williams et al. (Immunosuppressive effects of Leflunomide in a cardiac allograft model; Transplantation Proceedings 25: 745–746; 1993) und H.U. Schorlemmer et al. (Prolongation of allogenic skin grafts and induction of tolerance by Leflunomide, a new immunosuppressive isoxazol derivative; Transplantation Proceedings 25: 763–767; 1993) für Leflunomide sowie J.K. Lindner and N. Zantl (Synergism of the malononitrilamides 279 and 715 with cyclosporine A in the induction of long-term cardiac allograft survival; Transpl Int. 11 [Suppl 1] 303–309; 1998) für die Gruppe der Malononitrilamide und damit für die Pyrimidinbiosyntheseinhibitoren im Allgemeinen, weckten die Hoffnung, dass die Pyrimidinbiosynthseinhibitoren nur über einen kurzen Zeitraum verabreicht werden müssen, um unerwünschte Immunreaktionen zu unterdrücken und danach abgesetzt werden können, ohne dass die unerwünschte Immunreaktion danach wieder auftritt.

Bisher gibt es keine Veröffentlichungen, in welchen nach der Anwendung der kommerziell erhältlichen Formulierung von Leflunomide am Menschen eine dauerhafte Heilung von unerwünschten Effektorfunktion des Immunsystems, im Sinne der zuvor genannten Untersuchungen von Williams, Schorlemmer und Lindner, beschrieben wurde.

Ein weiterer Unterschied zwischen der aufgrund der tierexperimentellen Untersuchungen erwarteten Wirkung von Leflunomide zur beim Menschen gefundenen Wirkung besteht darin, dass Leflunomide tierexperimentell eingesetzt zur Behandlung von allergischen Reaktionen (TH-2 abhängigen Reaktionen) geeignet ist (Y. Mizushima et al. Oral administration of Leflunomide (HWA486) results in prominent suppression of immunoglobulin E formation in a rat type 1 allergy model; The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 288: 849–857 (1999)). In der klinischen Anwendung kann das in der kommerziellen Formulierung erhältliche Leflunomide offensichtlich TH-2 abhängige Reaktionen (allergische Reaktionen) nicht oder nicht ausreichend unterdrücken, so dass es in der klinischen Anwendung sogar zur Entwicklung von allergischen Reaktionen gegen Leflunomide kommt (siehe Packungsbeilage von Arava^®).

Weiterhin zeigen neuere experimentelle Untersuchungen, dass durch die Gabe von Leflunomide zwar TH-1 abhängige Immunreaktionen unterdrückt werden können, nicht jedoch TH-2 abhängige Reaktionen. (P. Dimitrova et al; Restriction of de novo pyrimidine biosynthesis inhibits Th1 cell activation and promotes Th2 cell differentiation; The Journal of Immunology, 2002,169: 3392–3399).

Zusammenfassend kann der Schluss gezogen werden, daß die relativ enttäuschenden Wirkungen von Leflunomide beim Menschen, darauf zurückzuführen sind, dass bei der Anwendung von Leflunomide am Menschen es nur zu einer Unterdrückung von TH-1 abhängigen Effektorimmunreaktionen, nicht jedoch zu einer ausreichenden Unterdrückung von TH-2 abhängigen Effektorimmunreaktionen kommt. Mit diesem pharmakodynamischen Profil kann Leflunomide zwar die Schwere von Erkrankungen, die hauptsächlich durch TH-1 abhängige Effektorreaktionen des Immunsystems verursacht werden, (z.B. rheumatoide Arthritis, Multiple Sklerose) abmildern, nicht jedoch vollständig unterdrücken, da die durch die Leflunomidegabe relativ unbeeinflussten TH-2 Zellen immer noch eine Immunantwort gegen das betroffene Gewebe aufrechterhalten können. Aufgrund dieses pharmakodynamischen Profils ist die kommerziell erhältliche Formulierung von Leflunomide ungeeignet zur Behandlung von TH-2 abhängige Erkrankungen, wie z.B. Allergien, und führt bei TH-1 abhängigen Immunreaktionen lediglich zu einer Milderung der Symptome und Verlangsamung der Progression der Erkrankung nicht jedoch zu einer vollständigen Behebung der Krankheitsbilder.

Weiterhin ist zu vermuten, dass es zum Aufbau einer regulatorischen Immunantwort, die auch nach dem Absetzen von Leflunomide und sämtlicher das Immunsystem beeinflussender Wirkstoffe weiter bestehen bleibt, notwendig ist, dass durch die Gabe von Leflunomide die Proliferation von Effektorzellen des Immunsystems (z.B. TH-1 und TH-2 Zellen) gehemmt wird und die Proliferation von Suppressorzellen (z.B. TGF-β produzierende TH-3 Zellen) wesentlich weniger oder überhaupt nicht gehemmt wird. Es ist vorstellbar, dass sich durch die selektive Hemmung der Proliferation von Effektorzellen (TH-1 und TH-2 Zellen) das Verhältnis zwischen Effektorzellen und Suppressorzellen soweit zu Gunsten der Suppressorzellen verschiebt, dass selbst nach dem Absetzen sämtlicher das Immunsystem beeinflussender Therapiemaßnahmen die Suppressoraktivität des Immunsystems ausreicht die Effektoraktivitäten auch weiterhin zu unterdrücken.

Bezüglich der Bedeutung von täglichen Blutplasmaspitzenkonzentrationen bei Pyrimidinbiosyntheseinhibitoren gibt es zwei Patentschriften. Jedoch behandeln die beiden bereits offengelegten Patentschriften und im folgenden kurz als Stand der Technik beschriebenen Patentschriften nicht Methoden, die zu einer Verbesserung der Wirksamkeit von Pyrimidinbiosyntheseinhibitoren führen, sondern Methoden, die zu einer Verminderung der Nebenwirkungen führen.

In den Patentschriften PCT/EP99/09380 (Zubereitung mit verbesserter therapeutischer Breite, enthaltend Nukleotidsyntheseinhibitoren) sowie DE 199 60 443 A1 (Verfahren zur Auffindung von Nukleotidsyntheseinhibitoren mit weniger Nebenwirkungen) wird aufgrund von tierexperimentellen Untersuchungen im Modell der Adjuvans induzierten Arthritis belegt, dass konstante Blutspiegel von Pyrimidinbiosyntheseinhibitoren zu stärkeren Nebenwirkungen als tägliche Peakplasmablutspiegel führen. Beide Patentschriften behandeln Methoden mit deren Hilfe die Nebenwirkungen von Pyrimidinbiosyntheseinhibitoren reduziert werden können. In den diesen beiden Patentschriften zugrunde liegenden tierexperimentellen Untersuchungen im Modell der Adjuvans induzierten Arthritis wurden keine Unterschiede in der pharmakodynamischen Wirkung zwischen Verabreichungsformen, die einen konstanten Blutspiegel zu denen die Peakplasmaspiegel hervorrufen, gefunden. Aus den in den beiden Patentschriften dargelegten Beobachtungen zur pharmakodynamischen Wirkung von Peakplasmablutspiegeln versus konstanten Blutspiegeln von Pyrimidinbiosyntheseinhibitoren ließ sich mit dem damals offenbarten Erkenntnisstand der Schluß ziehen, dass sich durch Peakplasmablutspiegel genauso starke Effekte auf das Immunsystem erzielen lassen wie durch konstante Blutspiegel. Unter Berücksichtigung der in dieser Patenschrift aufgeführten Untersuchungen lässt sich feststellen, dass das Tiermodell der Adjuvans induzierten Arthritis ungeeignet war, die Unterschiede in der pharmakodynamischen Wirkung konstanter gegenüber täglich schwankenden Wirkspiegeln von Pyrimidinbiosyntheseinhibitoren aufzuzeigen, da dieses Tiermodell hauptsächlich durch TH-1 abhängige Immunreaktionen hervorgerufen wird, die sich offensichtlich auch durch konstante Wirkspiegel von Pyrimidinbiosyntheseinhibitoren ausreichend hemmen lassen. Ergebnisse aus klinischen Studien zur Wirkung von Leflunomide belegen, dass zur Erzielung von therapeutischen Effekten in der rheumatoiden Arthritis (einer TH-1 abhängigen Erkrankung) konstante Wirkstoffspiegel von mindestens 30 mg/L des aktiven Metaboliten von Leflunomide (HMR 1726) benötigt werden, um bei 99% der Responder einen therapeutischen Effekt zu erzielen (siehe CPMP Dokument: CPMP/1694/99).

Vor dem Hintergrund der bisher bekannten Ergebnisse hielten es maßgebliche Experten von Hoechst Marion Roussel/Aventis Pharma für unwahrscheinlich, dass tägliche Fluktuationen des aktiven Metaboliten von Leflunomide von 3 bis 3,5 mg/L bei einem Patienten mit einem konstanten Basisblutspiegel von ca. 75 mg/L eine Bedeutung für die pharmkodynamische Wirkung von Pyrimidinbiosyntheseinhibitoren haben könnten. Erst durch die in dieser Patentschrift offenbarten zusätzlichen Untersuchungen, kann der Schluß gezogen werden, dass eine im Tagesverlauf schwankende Hemmung der Pyrimidinbiosynthese zu einer erheblichen Erweiterung der Wirkung auf immunologische Prozesse führt (Inhibition auch von TH-2 abhängigen Reaktionen und Aufbau von regulatorischen Immunantworten).

In der Patentschriften PCT/EP99/09380 wird ein Kombinationspräparat bestehend aus Cholestyramin und Pyrimidinbiosyntheseinhibitoren beschrieben, welches im Prinzip aus den gleichen Bestandteilen besteht, wie ein Teil der Kombinationspräparate die in dieser Patentschrift beschrieben werden. Der Unterschied zwischen den Kombinationen in dieser Patenschrift und der Patentschrift PCT/EP99/09380 liegt in der Dosierung von Cholestyramin (bzw. allgemein eines Antagonisten der Pyrimidinbiosyntheseinhibitoren). Zur Erzielung der erwünschten Reduktion der Nebenwirkungen, welches Gegenstand der Patentschriften PCT/EP99/09380 und nicht dieser Patentschrift ist, benötigt man beim Menschen tägliche Gaben von mindestens 3 g Cholestyramin oder mehr, da durch die Gabe von Cholestyramin hohe Blutspiegel von z.B. 70 oder mehr mg/L des aktiven Metaboliten von Leflunomide dauerhaft auf 30 bis 40 mg/L abgesenkt werden müssen. Aufgrund der in der klinischen Anwendung benötigten hohen Dosierungen von Cholestyramin, die zur signifikanten Reduktion der Nebenwirkungen benötigt werden, wurde von der klinischen Anwendung der Kombination von Cholestyramin mit Leflunomide Abstand genommen. Für die Verbesserung der pharmakodynamischen Wirkungen sind dagegen wesentlich geringere Dosierungen von weniger als 3 g täglich ausreichend um die notwendigen täglichen Schwankungen in den Blutspiegeln (von ca. 3 bis 3,5 mg/L) zu induzieren.

Weiterhin gibt es Arbeiten in denen die Reduktion der Nebenwirkungen durch hohe Dosierungen von Uridine bzw. Thymidin als Antagonisten der Inhibition der Pyrimidinbiosynthese beschrieben wird. Damit die Reduktion der Nebenwirkungen durch Uridine bzw. Thymidin auftritt sind sehr hohe Dosierungen dieser Substanzen notwendig, damit die Blockade der Pyrimidinbiosynthese und damit die zytostatischen Effekte der Pyrimidinbiosyntheseinhibitoren aufgehoben werden. Der verbliebene pharmakodynamische Effekt ist nach den entsprechenden Arbeiten auf eine inhibitorische Wirkung von Leflunomide auf die Tyrosinphosphorylierung zurückzuführen, welche von der Gabe von Uridine bzw. Thymidine unbeeinflusst bleibt. In keiner dieser Arbeiten wird beschrieben, dass sich die pharmakodynamische Wirkung von Pyrimidinbiosyntheseinhibitoren durch eine entsprechende Kombinationstherapie verbessert hat oder andersartige pharmakodynamische Effekte beobachtet werden. In allen Arbeiten wird lediglich eine verbliebene pharmakodynamische Restwirkung, die geringer ist als die Wirkung ohne Gabe von z.B. Uridine, bei einer erheblichen Reduktion der Nebenwirkungen beschrieben. Der Unterschied zu der in dieser Patenschrift beschriebenen Gabe von z.B. Uridine liegt darin, dass entsprechend dieser Patentschrift die Wirkung der Pyrimidinbiosyntheseinhibitoren weder vollständig noch über den gesamten Tag antagonisiert werden soll, sondern eine nur teilweise und auch nur eine über einige Stunden bestehende Antagonisierung notwendig ist. Würde die Antagonisierung über den ganzen Tag bestehen, so wäre keine Steigerung der pharmakodynamische Wirkung zu erwarten.

Es wurde nun gefunden, dass zu dem Aufbau von regulatorischen Immunantworten und zur Behandlung von TH-2 abhängigen Erkrankungen Verabreichungsformen von Pyrimidinbiosyntheseinhibitoren bzw. Kombinationstherapien von Pyrimidinbiosyntheseinhibitoren und deren Antagonisten geeignet sind, mit denen täglich mehrstündig andauernde und anschließend wieder abfallende Plasmakonzentrationen bzw. täglich schwankende Wirkung der Inhibition der Pyrimidinbiosynthese erzielt werden können. Formulierungen mit dem gleichen Inhibitor der Pyrimidinbiosynthese, die jedoch nur zu konstanten Plasmaspiegeln mit relativ geringen täglichen Schwankungen des Wirkstoffspiegels führen bzw. zu einer konstanten Inhibition der Pyrimidinbiosynthese führen, können überraschender Weise diese regulatorischen Immunantworten nicht hervorrufen und TH-2 abhängige Immunreaktionen nicht ausreichend beeinflussen, selbst wenn z.B. die konstanten Blutspiegel mehr als 20× höher sind als die konstanten Blutspiegel.

Verbindungen, die die Pyrimidinbiosynthese verhindern, werden als Pyrimidinbiosynthese-Inhibitoren bezeichnet. Erfindungsgemäß können als Pyrimidinbiosynthese-Inhibitoren eingesetzt werden zum Beispiel Brequinar und insbesondere eine Verbindung der Formel I oder II

stereoisomere Formen von Verbindungen der Formel (I) oder (II) und ein physiologisch verträgliches Salz der Verbindung der Formel (II) enthält, in der die Substituenten folgende Bedeutung haben:
R' ist a) -(C1-C4)-Alkyl.
b), -(C3-CS)-Cycloalkyl, c) -(C2-C6)-Alkenyl, oder d) -(C2-C6)-Alkynyl;
R2 ist a) -CF3, b) -O-CF3, c) -S-C F3, d) -OH,
e) -N02, f) Halogen, g) Benzyl, h) Phenyl, i) -O-phenyl, welches unsubstituiert ist, k) -CN, oder
l) -O-phenyl, das mono- oder polysubstituiert ist durch eine Gruppe ausgewählt aus
R3 ist a) -(C1-C4)-Alkyl,
b) Halogen, oder
c) ' ein Wasserstoffatom; oder
X ist a) – eine CH-Gruppe
b) ein Stickstoffatom.

Auch eine Mischung der genannten Pyrimidinbiosynthese-Inhibitoren und Verbindungen der Formel (I) und (II) oder Salze der Verbindungen der Formel, (II) können eingesetzt werden.

Ganz besonders bevorzugt ist es für die erfindungsgemäßen galenischen Formulierungen und Kombinationspräparate, wenn als Pyrimidinbiosynthese-Inhibitor das N-(4-Trifluoromethylphenyl)-5methylisoxazol-4-carboxamid der Formel (I) oder N-(4-Trifluoromethylphenyl)-2cyano-5-hydroxycrotonamid, 2-Cyano-3-cyclopropyl-3-hydroxyacrylsäure (4-cyanophenyl)amid oder N-(4- Trifluoromethylphenyl)-2-cyano-3-hydroxyhept-2-en-6-yncarboxamid als Verbindungen der Formel (II) eingesetzt werden.

Verbindungen der Formeln I oder II können nach Verfahren hergestellt werden, die aus den europäischen Patentanmeldungen 484 223, 529 500, 538 783 und 551 230 sowie der US-Patentschrift 4 061 767 bekannt sind.

Ganz besonders geeignet ist Leflunomid, das bisher als Antirheumatikum eingesetzt wird. Es kann in der klinischen Anwendung der kommerziell erhältlichen Formulierung die Symptome sowie die Progression der rheumatoiden Arthritis reduzieren, aber nicht heilen.

Folgende Formulierungen bzw. Kombinationspräparate sind zum Beispiel geeignet den Ansprüchen diese Patentes entsprechende täglich schwankende Blutplasmaspiegel bzw. tägliche Schwankungen des Ausmaßes der Hemmung der Pyrimidinbiosynthese hervorzurufen, die zur Behandlung von degenerativen Erkrankungen, überschießenden schädigenden Immunreaktionen sowie dem Aufbau von regulatorischen Immunantworten geeignet sind:
Hartgelatinekapsel gefüllt mit einer in einer Fantaschale fein verriebenen Mischung bestehend aus Leflunomide und Glucose. Anstelle von Glucose können auch andere Füllmittel wie z.B. Saccharose verwendet werden. Der Zusatz von weiteren in der Arzneistoffformulierung üblichen Stoffen und die Verwendung weiterer Verarbeitungsmethoden kann von Vorteil sein (siehe unten), solange diese die schnelle Resorption der Pyrimidinbiosyntheseinhibitoren nicht verhindern. Als Hartgelatinekapseln haben sich verschiedene in den Apotheken zur Verfügung stehenden Varianten als einsetzbar erwiesen. Wichtig ist, dass der Zerfall der Kapsel zu einem sehr schnellem Anfluten des Pyrimidinbiosyntheseinhibitors in der Blutbahn führt. Es können aber auch Weichgelatinekapsel mit flüssiger bzw. öliger Formulierung der Wirkstoffe, wie z.B. 20% ethanolige Lösungen, Lösungen in Olivenöl, Mikroemulsionen etc. eingesetzt werden, soweit diese Verabreichungsformen ein schnelles Anfluten der Pyrimidinbiosyntheseinhibitoren erlauben. Tablettenformulierungen sind geeignet, soweit sie ein schnelleres Anfluten als die augenblicklich kommerziell erhältliche Tablettenformulierung des Pyrimidinbiosynthesinhibitors (Arava^®) erlauben. Besonders geeignet sind auch intravenöse anzuwendende Formulierungen wie zum Beispiel eine 20%ige ethanolischen Lösungen anzusehen. Andere Formulierungen zur intravenösen, intraarteriellen, subkutanen und intrakutanen Verabreichung sind möglich soweit diese ein schnelles Anfluten des Pyrimidinbiosyntheseinhibitors erlauben. Auch die Formulierung in Form von oral zu verabreichenden Lösungen ist denkbar. Ebenso stellen die inhalative Formulierungen von Pyrimidinbiosyntheseinhibitoren einen möglichen Weg dar, täglich schwankende Wirkstoffspiegel zu generieren. Weiterhin können bukale, rektale, intrathekale, nasale, dermale bzw. auf Scheinhäute aufzubringende Verabreichungsformen geeignet sein.

Eine weitere erfindungsgemäße Formulierung stellt die Kombination eines Pyrimidinbiosyntheseinhibitors mit seinem Antagonisten dar (z.B. Cholestyramin, Tymidinverbindungen, Uridineverbindungen) dar. Wobei zunächst entweder zuerst der Antagonist oder der Pyrimidinbiosyntheseinhibitor freigesetzt wird und später der Pyrimidinbiosyntheseinhibitor oder der Antagonist freigesetzt wird. Ziel dieser Kombinationspräparate sind Schwankungen in den Wirkungen der Hemmung der Pyrimidinbiosynthese hervorzurufen. Zum Beispiel kann sich in einem Kapsel in Kapselsystem in der äußeren Kapsel der Pyrimidinbiosynthseinhibitor (z.B. 20 mg Leflunomide oder HMR 1726) befinden, der nach dem Auflösen der äußeren Kapsel schnell im Organismus anflutet. In der inneren Kapsel, die sich später auflöst, können sich Antagonisten der Pyrimidinbiosynthseinhibitoren befinden (z.B. 500 mg Cholestyramin, oder 500 mg Uridinephosphat), die den Wirkungsabfall des Pyrimidinbiosyntheseinhibitors verstärken und damit zu täglichen Schwankungen der Wirkung von Pyrimidinbiosynthseinhibitoren führen.

Das erfindungsgemäße Kombinationspräparat kann auch Kompositionen oder Kombinationspackungen umfassen, in denen die Bestandteile nebeneinander enthalten sind und zur gleichzeitigen, getrennten oder zeitlich abgestuften Therapie von überschießenden, schädigenden Immunreaktionen und/oder degenerativen Prozessen an ein und denselben menschlichen oder tierischen Körper bereitgestellt werden.

Die erfindungsgemäße Zubereitung kann als Dosiereinheit in Form von Arzneiformen wie Inhalationssystemen, Kapseln (einschließlich Mikrokapseln, die im allgemeinen keine pharmazeutischen Träger enthalten), Tabletten einschließlich Dra gees und Pillen, oder Zäpfchen vorliegen, wobei bei Verwendung von Kapseln das Kapselmaterial die Funktion des Trägers wahrnimmt und der Inhalt zum Beispiel als Pulver, Gel, Lösung, Emulsion oder Dispersion vorliegen kann.

Besonders vorteilhaft und einfach ist es jedoch, orale (perorale) Formulierungen des Pyrimidinbiosyntheseinhibitors herzustellen, die die berechneten Mengen der Wirkstoffe zusammen mit dem gewünschten pharmazeutischen Träger enthalten.

Auch eine entsprechende Formulierung (Zäpfchen) für die rektale Therapie kann angewandt werden. Ebenso ist die transdermale/epikutane/bucale/sklerale/nasale/pulmonale/intrathekale/okuläre/inhalative Applikation in Form von Salben, Cremes, Lösungen, Emulsionen und Pulvern möglich, welche die täglichen Schwankungen der Wirkung von Pyrimidinbiosyntheseinhibitoren ermöglichen. Weiterhin ist die parenterale, intravenöse, intraarterielle, subkutane, intramuskuläre, intravesicale, intrathekale, okuläre, inhalative und intravaginale Applikation von Formulierungen möglich, eine entsprechende Resorptionskinetik bzw. Inhibitionskinetik der Pyrimidinversorgung erzielen.

Salben, Pasten, Cremes und Puder können neben dem Wirkstoff die üblichen Trägerstoffe enthalten, z.B. tierische und pflanzliche Fette, Wachse, Paraffine, Stärke, Tragant, Cellulosederivate, Polyethylenglykole, Silicone, Kieselsäure, Aluminiumhydroxid, Talkum, Zinkoxid, Milchzucker, Bentonit, Calciumsilikat und Polyamidpulver oder Gemische dieser Stoffe. Die Tabletten, Pillen oder Granulatkörper können nach Verfahren wie Press-, Tauch- oder Wirbelbettverfahren oder Kesseldragierung hergestellt werden und enthalten Trägermittel und andere übliche Hilfsstoffe wie Gelatine, Agarose, Stärke (zum Beispiel Kartoffel-, Mais- oder Weizenstärke), Cellulose wie Ethylcellulose, Siliziumdioxid, Magnesiumcarbonat, verschiedene Zucker wie Milchzucker und/oder Calciumphosphate. Die Dragierlösung besteht gewöhnlich aus Zucker und/oder Stärkesirup und enthält meistens noch Gelatine, synthetische Celluloseester, Gummiarabicum, Polyvinylpyrrolidon, Pigmente, oberflächenäktive Substanzen, Weichmacher und ähnliche Zusätze entsprechend dem Stand der Technik. Zur Herstellung der Zubereitungsformen kann jedes übliche Fließregulierungs-, Schmier- oder Gleitmittel, wie Magnesiumstearat, und Trennmittel verwendet werden. Bevorzugt haben die Zubereitungen die Form von Mantel-/Kern-Tabletten oder Mehrschichttabletten, wobei sich der Pyrimidinbiosyntheinhibitor im Mantel bzw. im Kern bzw. in einer Schicht befindet, während sich der Antagonist des Pyrimidinbiosyntheseinhibitors im Kern, im Mantel befindet. Die Wirkstoffkomponenten können auch in retardierter Form vorliegen oder an Retardierungsmaterial adsorbiert bzw. im Retardierungsmaterial (zum Beispiel Cellulose- oder Polystyrolharzbasis, zum Beispiel Hydroxyethylcellulose) eingeschlossen sein soweit diese Formulierungen die erfindungsgemäße Resorptionskinetik bzw. Inhibitionskinetik ergeben. Eine verzögerte Freisetzung der Wirkstoffe kann auch erreicht werden, indem die betreffende Schicht bzw. das Kompartiment mit üblichen magensaftunlöslichen Überzügen versehen wird. Vorteilhaft können Maßnahmen, wie zum Beispiel die Behandlung mit Polyethylenglykol sein, die die Resorption im Speziellen und den Transport zum Wirkort im Allgemeinen erleichtern und ermöglichen. Auch eine entsprechende Formulierung (Zäpfchen) für die rektale Therapie kann angewandt werden. Ebenso ist die transdermale/epikutane/bucale/sklerale/nasale/pulmonale/intrathekale/okuläre/inhalative Applikation in Form von Salben, Cremes, Lösungen, Emulsionen und Pulvern möglich, die eine erfindungsgemäße Resorptionskinetik bzw. Inhibitionskinetik der Pyrimidinbiosynthese ermöglichen. Weiterhin ist die parenterale, intravenöse, intraarterielle, subkutane, intramuskuläre, intravesicale, intrathekale, okuläre, inhalative und intravaginale Applikation von Formulierungen möglich, welche die erfindungsgemäße Resorptionskinetik bzw. Inhibitionskinetik aufzeigen.

Die anzuwendende Dosierung ist selbstverständlich abhängig von verschiedenen Faktoren wie des zu behandelnden Patienten, Alter, Gewicht, allgemeiner Gesundheitszustand, dem Schweregrad der Symptome, der zu behandelnden Erkrankung, eventuellen Begleiterkrankungen, (falls vorhanden) der Art der begleitenden Behandlung mit anderen Arzneimitteln oder der Häufigkeit der Behandlung. Die Dosierungen werden im allgemeinen mehrfach pro Tag und vorzugsweise einmal pro Tag verabreicht. Die verwendeten Mengen an Einzelwirkstoff orientieren sich hierbei an der empfohlenen Tagesdosis des jeweiligen Einzelwirkstoffs und sollen im allgemeinen sowohl bei der erfindungsgemäßen Formulierung als auch bei dem erfindungsgemäßen Kombinationspräparat bei 10% bis 300% der empfohlenen Tagesdosis liegen, bevorzugt bei 50% bis 150%, insbesondere bei 80%. Die geeignete Therapie mit den erfindungsgemäßen Zubereitungen besteht somit zum Beispiel in der Verabreichung von einer, zwei oder drei Einzeldosierungen der Zubereitung bestehend aus N-(4-Trifluormethylphenyl)-5-methylisoxazol-4-carboxamid oder N-(4-Trifluormethylphenyl)-2-cyan-3-hydroxycrotonsäureamid in einer Menge von 2 mg bis 250 mg, bevorzugt 5 mg bis 150 mg, insbesondere 10 mg bis 50 mg. Bei der Kombinationstherapie mit z.B. dem Antagonisten Cholestyramin werden bevorzugt 50 bis 3000 mg, insbesondere aber eine Dosierung von 500 mg bevorzugt.

Antagonisten der Inhibitoren der Pyrimidinbiosynthese sind z.B. Stoffe wie z.B. Cholestyramin, welches die gastrointestinale Zirkulation von HMR 1726 und MNA 715 verhindert. Weiterhin können z.B. Uridin und Thymidin haltige Verbindungen als Antagonisten einsetzt werden, welche zeitlich begrenzt über sogenannte „Salvage Pathways" den intrazellulären Mangel an Pyrimidinen und dessen Vorstufen beheben.

Ferner können die erfindungsgemäßen Zubereitungen auch zusammen mit anderen geeigneten Wirkstoffen, beispielsweise Antiuricopathika, Analgetika, steroidalen oder nichtsteroidalen Antiphlogistika, Thrombozytenaggregationshemmern, Cytokinen, Cytokinagonisten, Cytokinantagonisten oder immunsuppressiven Verbindungen wie zum Beispiel Cyclosporin A, FK 506 oder Rapamycin eingesetzt werden.

Eine Kombination mit folgenden Wirkstoffen kann von Vorteil sein: Substanzen mit Steroidwirkung (zum Beispiel Fluocortolon oder Dexamethason), nicht steroidale Antiphlogistika (zum Beispiel Diclofenac, Indometacin, Ibuprofen, allgemein Hemmstoffe der Cyclooxygenase 1 und/oder der Cyclooxygenase 2, Leukotrienantagonisten oder Hemmstoffe der Leukotrienbildung, Cytokinantagonisten oder Hemmstoffe der Cytokinbildung, Mastzellstabilisatoren (zum Beispiel Cromoglycinsäure), Antihistaminika (zum Beispiel Terfenadin), Cyclosporin A, FK506, antinflammatorische Cytokine (zum Beispiel TGFβ, IL.-10 etc.), Substanzen, die die Freisetzung von antiinflammatorischen Mediatoren veranlassen (zum Beispiel Cyclosporin A), antiinflammatorische Fettsäuren, deren Vorstufen oder Hemmstoffe des Abbaues der antiinflammatorischen Fettsäuren handeln. (Ebenso kann die kombinierte Gabe mit einem oder mehreren Antigenen von Vorteil sein, die direkt oder indirekt an den unerwünschten Immunreaktionen beteiligt sind oder diesen Antigenen ähnlich sind (z.B. Gtatirameracetat).

Im Rahmen zweier klinischer Fallbeobachtungen, bei denen eine Formatierung von Leflunomide in Hartgelatinekapseln und zum Vergleich die kommerziell erhältliche Tablettenform eingesetzt wurde, wurden Erkenntnisse gewonnen, die zeigen, dass galenische Formulierungen, welche zu tägliche Schwankungen in der Blutplasmakonzentration (Δ c ~ 3 bis 3,5 mg/L) von HMR 1726 (aktiver Metabolit von Leflunomide) führen, Voraussetzung sind damit Leflunomide auch bei Pemphigus vulgaris, als Beispiel einer TH-1 und TH-2 abhängigen Immunreaktion, und bei einer allergischen Rhinitis/Conjunctivitis/bronchialer Hyperreaktivität, als Beispiel einer TH-2 abhängigen Immunreaktion, wirkt und diese notwendigen Schwankungen mit der kommerziellen Tablettenform nicht zu erzielen sind. Weiterhin zeigt der klinische Verlauf des Pemphigus vulgaris Patienten, der mit einer erfindungsgemäßen Formulierung von Leflunomide behandelt wurde, dass erfindungsgemäße galenische Formulierungen von Leflunomide in der Lage sind auch beim Menschen Langzeitwirkungen des Immunsystems hervorzurufen, sodaß nach einer gewissen Behandlungsperiode sämtliche Behandlungsmaßnahmen abgesetzt werden können, ohne dass die unerwünschte Immunreaktion wieder auftritt. Aufgrund dieser klinischen Beobachtungen wurden im tierexperimentellen Modell der heterotopen Herztransplantation Untersuchungen durchgeführt, die zeigen, dass im Gegensatz zu konstanten Blutspiegeln nur bei täglich schwankenden Blutspiegeln sich eine antigen spezifische Toleranz als Zeichen einer regulatorischen Immunantwort entwickeln kann, die auch nach dem Absetzen der Applikation die Abstoßung des Transplantates verhindert.

Im einzelnen wurden folgende Beobachtungen gemacht:
Klinisches Beispiel 1:
Im Rahmen eines klinischen Heilversuchs an einem 77 jährigen Patienten vor der Erstanwendung von Leflunomide seit über 10 Jahren an der Autoimmunerkrankung Pemphigus vulgaris mit mindestens 3 bis 4 schweren mehrwöchigen Schüben pro Jahr litt, wurden unter der Anwendung von Leflunomideformulierung in einer Hartgelatinekapsel folgende Beobachtungen gemacht:

1. Das in der Hartgelatinekapsel verabreichte Leflunomide war hocheffektive in der Behandlung des Pemphigus vulgaris. Unter der Gabe von Leflunomide verkürzten sich die Schübe, welche nur in der Anfangsphase der Gabe von Leflunomide auftraten, von mehreren Wochen vor der Gabe von Leflunomide auf wenige Tage. Schübe traten nur in der Anfangsphase der Therapie von Leflunomide auf, als die wirksame tägliche Minimaldosis von Leflunomide unterschritten oder als die anderen immunsuppressiven Medikamente (Azathioprim und Fluocortolon) stufenweise reduziert wurden. Nach dieser Anfangsphase gab es unter der täglichen Verabreichung von Leflunomide in Hartgelatinekapseln keinen Schub der Erkrankung. Ebenso wurde kein Anstieg der Infektanfälligkeit des Patienten beobachtet, obwohl er seine Tätigkeit als Hausarzt wieder aufnahm und somit einem erhöhten Infektionsrisiko ausgesetzt war. Da der Pemphigus vulgaris sowohl durch TH-1 als auch durch TH-2 Zellen ausgelöst werden kann (C. Veldman et al.; Dichotomy of Autoreactive Th1 and Th2 Cell Responses to Desmoglein 3 in Patients with Pemphigus Vulgaris (PV) and Healthy Carriers of PV-Associated HLA Class II Alleles, The Journal of Immunology, 2003, 170:635–642), kann aus diesen Beobachtungen geschlossen werden, dass die Formulierung von Leflunomide in der Hartgelatinekapsel sowohl zur Unterdrückung von TH-1 als auch von TH-2 abhängigen Effektorreaktionen des Immunsystems geeignet ist, ohne dass die Infektionsanfälligkeit gesteigert wird.
2. Bei der schrittweisen Reduktion der anfänglichen täglichen Dosierung von 25 mg Leflunomide pro Tag stellte sich bei diesem Patienten eine tägliche Dosis von 17 mg als minimal wirksame Dosierung heraus. Wurde eine Dosierung von 15 mg und 20 mg im täglichen Wechsel gegeben, so wurde keine Wirkung beobachtet, obwohl die mittlere tägliche Dosis mit 17,5 mg über der als minimal wirksamen Dosis von 17 mg pro Tag lag. Daher kann geschlossen werden, dass zur Erzielung der gewünschten Wirkung täglich schwankende Blutplasmaspiegel von ausreichender Höhe benötigt werden. Wurde die minimal wirksame Dosis von 17 mg Leflunomide unterschritten, so entwickelten sich innerhalb von 2 bis 3 Tagen Symptome eines neuen Schubes des Pemphigus vulgaris. Wurde die Dosis daraufhin wieder auf 20 mg erhöht so verschwanden die Symptome innerhalb von 24 Stunden. Weiterhin kann aus diesen Beobachtungen geschlossen werden, dass eine tägliche Gabe von mindestens 17 mg Leflunomide bei diesem Patienten benötigt wurde, um den Pemphigus Vulgaris erfolgreich zu behandeln. Aus dieser Beobachtung kann letzt endlich auch der Schluß gezogen werden, dass es sich bei den hier beobachteten pharmakodynamischen Effekten, um andersartige Effekte handeln muß, als diejenigen pharmakodynamischen Effekten, die mit der kommerziellen Tablettenformulierung erzielt werden, da sich die Effekte der kommerziellen Tablettenformulierung in 99% der behandelten Patienten bei konstanten HMR 1726 Blutspiegeln von 30 mg/L einstellen. Da der hier beschriebene Patient mit Pemphigus vulgaris Blutplasmaspiegel von ~75 mg/L aufwies und Leflunomide eine Halbwertszeit von ca. 2 Wochen besitzt, hätte die Wirkung von Leflunomide bei vollständigem Absetzen von Leflunomide erst nach ca. 2 Wochen auf einen kritischen Wert von 30 mg/L absinken dürfen und damit die Wirksamkeit nachlassen müssen, entsprechendes zeigt die fehlende Wirkung von Leflunomide nach Reduzierungen der täglichen Dosis, hier hätte eigentlich die Wirkung von Leflunomide erst nach mehreren Monaten nachlassen dürfen, falls die konstanten Blutspiegel für die Wirkung beim Pemphigus vulgaris verantwortlich wären. Dies war aber nicht der Fall. Die Folgerung ist, dass es sich bei den bei dem Pemphigus vulgaris beobachteten pharmakodynamischen Effekten um Effekte handeln muß, die andersartig sind als die Effekte, die durch die kommerzielle Leflunomideformulierung erzielt werden.
3. Nachdem der Patient mehr als 1,5 Jahre mit einer Monotherapy von 20 mg Leflunomide pro Tag behandelt wurde, ohne dass ein Schub de Pemphigus auftrat, wurde die Gabe von Leflunomide aufgrund eines grippalen Infektes eingestellt. Am 4. Tag nach der letzten Gebe von Leflunomide entwickelte sich ein schwerer Schub des Pemphigus der Haut und Schleimhäute betraf. Daraufhin wurde am Abend die 4. Tages 20 mg Leflunomide eingenommen. Ca. 12 Stunden später am nächsten Morgen trockneten die Bläschen der Pemphigus Eruptionen ein und das brennen in der Haut stoppte. In einer Blutprobe die am Nachmittag des gleichen Tages genommen wurde, konnten keine Antikörper gegen Desmosomen festgestellt werden. Zusammen mit dem Befund, dass an diesem Patienten mehrfach Blutplasmaspiegel des aktiven Metaboliten von Leflunomide in Höhe von 75 mg/L bei einer Halbwertszeit von ca. 2 Wochen gemessen wurde, ist sowohl der unter Punkt 2 beschriebene Wirkungsverlust innerhalb weniger Tage nach Reduktion der täglichen Dosis von Leflunomide unter 17 mg als auch der hier beschriebene Wirkungsverlust nach dem vollständigen Absetzten von Leflunomide ein Hinweis, dass nicht die konstanten Blutspiegel sondern die täglichen relativ geringen Schwankungen der Plasmaspitzenkonzentrationen verantwortlich sind für die Wirkung bei Pemphigus Vulgaris. Hierfür spricht auch die Beobachtung, dass innerhalb von 24 Stunden, nachdem wieder mit der Gabe einer ausreichenden Leflunomidedosis begonnen wurde, die Symptome der Erkrankung wieder verschwanden.
4. Erhielt der Patient anstelle von Leflunomide in der Hartgelatinekapsel Leflunomide in Tablettenform so entwickelte er innerhalb von 3 Tagen Symptome des Pemphigus vulgaris. Daraufhin wurde wieder Leflunomide in der Formulierung in der Hartgelatinekapsel verabreicht und die Symptome verschwanden innerhalb eines Tages.
5. Bei dem Vergleich der Blutspiegel nach Gabe von Leflunomide in der Tablettenform und Leflunomide in der Hartgelatinekapsel zeigte sich, dass bei Verwendung der Hartgelatinekapsel der aktive Metabolit von Leflunomide schneller im Plasma anflutet und zu höheren Spitzenkonzentrationen führt. Zusammen mit der Beobachtung unter 4. legen diese Befunde den Schluss nahe, dass im Gegensatz zur Formulierung in der Hartgelatinekapsel die kommerziell erhältliche Tablettenform von Leflunomide ungeeignet zur Behandlung des Pemphigus vulgaris ist. Weiterhin kann gefolgert werden, dass dieser Unterschied in der Wirksamkeit sehr wahrscheinlich auf die Unterschiede in den täglichen Schwankungen der Blutplasmaspiegel zurückzuführen sind.
6. 2 Jahre und 10 Monate nach dem Beginn der Behandlung mit Leflunomide in der Formulierung mit Hartgelatinekapsel wurde die Gabe von Leflunomide beendet, ohne dass bei diesem Patienten ein erneuter Schub des Pemphigus Vulgaris auftrat. Nach dem Absetzen der Gabe von Leflunomide konnten die den Pemphigus vulgaris verursachenden Antikörper gegen Desmosomen weiterhin auf sehr niedrigem Niveau verfolgt werden. Aus dieser Beobachtung kann geschlossen werden, dass Leflunomide, welches in der Formulierung in der Hartgelatinekapsel verabreicht wurde, dazu geeignet ist eine regulatorische Immunantwort aufzubauen, die in der Lage ist auch nach der Beendigung der Gabe sämtlicher das Immunsystem beeinflussender Medikamente überschießende schädigende Immunreaktionen zu unterdrücken, ohne dass die entsprechende prinzipielle Fähigkeit des Immunsystems gegen das spezifische Antigen zu reagieren verloren geht. Da derartige Langzeiteffekte nach dem Absetzen von Leflunomide bei der Anwendung der kommerziell erhältlichen Formulierung von Leflunomide nicht berichtet wurden, muß vermutet werden, dass die kommerziell erhältliche Formulierung von Leflunomide hierzu nicht in der Lage ist, da aus ihr Leflunomide zu langsam und in einer zu geringen Konzentration anflutet. Um dies zu belegen wurden weitergehende tierexperimentelle Untersuchungen im Modell der heterotopen Herztransplantation durchgeführt. Siehe hierzu weiter unten.

Klinisches Beispiel 2:
Bei einem Patienten mit einer seit mehr als 10 Jahren bekannten Allergie gegen Gräser wurde unter der Gabe von Leflunomide folgendes beobachtet:

1. Die Symptome eines Patienten mit Allergie gegen Gräser wurden über 2 Pollenflugsaisonen erfolgreich mit einer täglichen Dosis von 20 mg Leflunomide in der Hartgelatinekapsel behandelt. Unter Antigenexposition wurden weder Atemnot, Niesen, Juckreiz, Schwellung von Schleimhäuten noch vermehrter Sekretfluss beobachtet.
2. Während der zweiten Pollenflugsaison wurde der Patient für 3 Wochen erfolgreich mit der Formulierung in der Hartgelatinekapsel behandelt. Nach 3 Wochen wurde der Patient ohne Unterbrechung der Behandlung von einem Tag auf den anderen auf die kommerziell erhältliche Formulierung von Leflunomide in Tabletten umgesetzt. Innerhalb von 48 Stunden nach dem Umsetzen auf die kommerzielle Tablettenform entwickelte der Patient Symptome einer Rhinitis und Conjunctivitis bei Allergenexposition. Nach erfolgloser Verabreichung von Leflunomide in der kommerziell erhältlichen Tablettenform wurde der Patient wieder auf die Formulierung in der Hartgelatinekapsel umgestellt. Bereits 24 Stunden nach der Umstellung auf Leflunomide in Hartgelatinekapseln waren die Symptome deutlich verringert und nach 48 Stunden nach Umstellung auf die Formulierung in Hartgelatinekapsel konnte sich der Patient wieder einer Allergenexposition ohne Krankheitssymptome unterziehen.

Tierexperimetelle Untersuchungen mit dem aktiven Metaboliten von Leflunomide (HMR 1726):
Tierexperimentelle Untersuchung 1:
In der tierexperiementellen Untersuchung 1 wurde der Unterschied der Wirksamkeit von konstanten zu täglich schwankenden Blutspitzenkonzentrationen von HMR 1726 auf das Überleben von heterotop transplantierten Herzen untersucht. Konstante Blutspiegel wurden durch die subkutane Implantation einer Miniinfusionspumpe generiert, die über 21 Tage kontinuierlich Wirkstoff freisetzte. Schwankende Blutplasmaspiegel wurden über die tägliche orale Verabreichung von HMR 1726 hervorgerufen. Es zeigte sich, dass durch konstante Blutspiegel von 4,3 bis 14,1 μg HMR 1726 zwar die Überlebenszeit der Transplantate verlängert wurde, jedoch keine Toleranz gegen die Transplantate hervorgerufen wurde, die zu einem Überleben der Transplantate bis über 100 Tage führte. Im Gegensatz zur Situation bei konstanten Blutspiegeln konnte durch täglich schwankende Blutspiegel bei 50 bis 67% der transplantierten Tiere eine Toleranz des Immunsystems gegen das Transplantat etabliert werden. Hierbei wurden tägliche Schwankungen der Blutplasmaspiegel mit Spitzenspiegeln von 9,8 bis 30,3 μg/ml beobachtet. Dieses Ergebnis ist insbesondere deswegen beeindruckend da gezeigt werden kann, dass in der Gruppe die täglich 5 mg HMR 1726 per oral und dabei maximale Blutspiegel von 9,8 μg/ml zeigten, 50% der Tiere eine Toleranz entwickelten während in den Gruppen die 10 mg bzw 15 mg HMR 1726 pro Tag per Miniinfusionspumpe erhielten kein einziges Tier eine Toleranz entwickelte obwohl in diesen beiden Gruppen die Blutplasmaspiegel mit 10,5 und 14,1 μg/ml ähnlich hoch bzw. sogar höher lagen als in der 5 mg per oral HMR 1726 Gruppe.
Tierexperimentelle Untersuchung 2:
In der tierexperimentellen Untersuchung 2 wurde untersucht ob trotz Verabreichung von HMR 1726 über eine Miniinfusionspumpe die Transplantattoleranz induzierende Wirkung von HMR 1726 wiedergewonnen werden kann, indem durch die tägliche orale Gabe von Cholestyramin, welches enterohepatisch zirkulierendes HMR 1726 bindet, täglich schwankende HMR 1726 induziert werden. Zum Vergleich wurde auch die Wirkung von per oral verabreichtem HMR 1726, alleine oder in Kombination mit der Gabe von Cholestyramin untersucht.
In der Gruppe die 10 mg HMR 1726 oral erhielt entwickelten 50% der Tiere eine Toleranz. In dieser Gruppe lag 4 Stunden nach der oralen Verabreichung der HMR 1726 Blutplasmaspiegel bei 21,2 μg/ml der in den folgenden 4 Stunden auf 10,4 μg/ml absank.
Wurde HMR 1726 entweder in einer täglichen Dosis von 10 mg oder 15 mg oral verabreicht und 4 Stunden danach 1000 mg Cholestyramine verabreicht, so entwickelten die Tiere ähnlich wie in der Gruppe mit alleiniger oraler Gabe von HMR 1726 in 50 bis 67% der Fälle eine Toleranz gegenüber dem Transplantat. Im Gegensatz zur alleinigen Gabe von HMR 1726 sanken die Blutplasmaspiegel jedoch bei dem 8 Stundenwert (4 Stunden nach Gabe von Cholestyramin) um ca 30% weiter ab.
Wurde HMR 1726 über eine Miniinfusionspumpe verabreicht, so wurde an denjenigen Gruppen in denen kein Cholestyramin verabreicht wurde keine Toleranz gegenüber den transplantierten Herzen entwickelt. Wurden die Tiere jedoch zusätzlich täglich mit 1000 mg Cholestyramin behandelt, welches tägliche Schwankungen in den HMR 1726 Blutspiegeln von 3 (10 mg Gruppe) bis 4 μg/ml (15 mg Gruppe) hervorrief, so wurde in 33 (10 mg Gruppe) bis 50% (15 mg Gruppe) der Tiere eine Toleranz induziert.
Aus den Tierexperimentellen Untersuchungen 1 und 2 kann gefolgert werden, dass sich unter konstanten HMR 1726 Blutplasmaspiegeln keine Toleranz gegenüber den transplantierten Herzen aufbauen kann, welche die transplantierten Herzen auch noch auch dem Absetzen von HMR 1726 gegen die Abstoßungsreaktion schützt.
Es zeigt sich vielmehr, dass sich unter konstanten Blutspiegeln von HMR 1726 offensichtlich Zellen des Immunsystems entwickeln, welche innerhalb von bis zu maximal 4 Tage nach Beendigung der Gabe von HMR 1726 (am Tag 21) zu einer Zerstörung des Transplantates führen. Würden durch die konstanten HMR 1726 alle Zellen des Immunsystems, welche zur Zerstörung des Transplantates befähigt sind, vollständig unterdrückt werden, so dürfte es frühestens nach 5 bis 8 Tagen nach der Beendigung der Gabe von HMR 1726 zu Abstoßungsreaktionen kommen, da dies die Zeit ist, die in den Placebokontrollgruppen benötigt wird bis das Transplantat abgestoßen wird.
Im Gegensatz zu den Gruppen in denen konstante HMR 1726 Blutplasmaspiegel generiert wurden, zeigte sich in allen anderen Gruppen in denen schwankende HMR 1726 Bluspiegel auftraten ein Überleben aller Transplantate, das länger war als die Behandlungsdauer mit HMR 1726 zuzüglich der maximalen Überlebensdauer der Transplantate in der Placebogruppe.
Dieses längere Überleben aller Transplantate beweist, dass schwankende HMR 1726 Blutplasmakonzentrationen bei alten Transplantaten eine sogenannte regulatorische Immunantwort hervorgerufen hat, die zu einer Verlängerung des Transplantatüberlebenszeit führt. Konstante HMR 1726 Blutplasmaspiegel konnten selbst dann nicht diesen Effekt erzielen, als sie ählich hoch oder höher als die maximalen Spiegel der schwankenden HMR 1726 Blutspiegel waren.
Tierexperimentelle Untersuchungen 3:
In den tierexperimentellen Untersuchungen wurde untersucht ob die für Leflunomide und HMR 1726 geltenden Untersuchungsbefunde bezüglich der unterschiedlichen Wirkung von konstanten Blutplasmaspiegeln gegenüber täglich schwankenden Blutplasmaspiegeln allgemein für die Gruppe der Pyrimidinbiosyntheseinhibitoren gilt. Daher wurde in dieser Versuchsreihe Anstelle von HMR 1726 der Pyrimidinbiosyntheseinhibitor MNA 715 eingesetzt.
Bei der oralen Gabe von MNA 715 wurde bei 30% der Versuchstiere eine Toleranz gegen das Transplantat induziert. Wurde die gleiche tägliche Dosis jedoch mittels einer Miniinfusionspumpe verabreicht, die kontinuierlich über 21 Tage den Wirkstoff freisetzt und daher zu kontinuierlichen Wirkstoffspiegeln führt, so konnte wie bei HMR 1726 keine Toleranz gegen das Transplantat induziert werden. Dieses Ergebnis zeigt, das auch bei anderen Pyrimidinbiosynthesinhibitoren konstante Blutspiegel eine andersartige und geringere Wirkung auf das Immunsystem ausüben als bei täglich schwankenden Wirkstoffspiegeln.
In einer weiteren Versuchsgruppe wurde untersucht ob Cholestyramin wie bei HMR 1726 auch bei MNA 715 die Resorption aus dem Gastrointestinaltrakt verhindern kann. Hierzu wurde 1 Stunde nach der oralen Gabe von MNA 715 1000 mg Cholestyramin verabreicht, da nach diesem kurzem Zeitintervall Cholestyramin das noch nicht vollständig resorbierte MNA 715 binden kann, sofern Cholestyramin MNA 715 gastrointestinal binden kann. Die Fähigkeit von Cholestyramin MNA 715 zu binden zeigte sich in dieser Versuchsgruppe in einer gegenüber der Kontrollgruppe verringerten Überlebenszeit der Transplantate. In dieser Gruppe wurde die Überlebenszeit der Transplantate nach Gabe von Cholestyramin gegenüber der Placebogruppe erwartungsgemäß nur geringfügig verlängert, da das meiste MNA 715 vor der Resorption an Cholestyramin gebunden wird und herdurch nicht mehr resorbiert werden kann. Dieses Experiment zeigt, dass Cholestyramin wie bei HMR 1726 auch bei MNA 715 die Resorption aus den Magen Darmtrakt verhindern kann und damit enterohepatisch zirkulierendes MNA 715 binden kann.
Wurde das Cholestyramin 4 Stunden nach der Gabe von MNA 715 verabreicht, also einem Zeitabstand der als ausreichend für die systemische Resorption von MNA 715 angesehen werden muß, so wurde in 50% der Transplantationen eine transplantatspezifische Toleranz induziert.
Wurde MNA 715 über eine Miniinfusionspumpe verabreicht, die zu konstanten Wirkstoffspiegeln führt, so wurde in keinem Fall eine Toleranz gegenüber dem Transplantat induziert. Auffallend ist bei dieser Versuchsgruppe wie bei HMR 1726, dass die Transplantate nach Beendigung der Verabreichung mittels Miniinfusionspumpe innerhalb des Zeitrahmens abgestoßen wurden, die auch in der Placebogruppe für die Abstoßung der Transplantate benötigt wurde.
Wurde MNA 715 zwar über eine Miniinfusionspumpe verabreicht, aber zusätzlich einmal täglich Cholestyramin verabreicht, um dadurch enterohepatisch zirkulierendes MNA 715 abzufangen und somit täglich schwankende MNA 715 Wirkstoffspiegel zu generieren, so entwickelte sich bei 50% der transplantierten Organe eine Toleranz des Immunsystems. In dieser Versuchsgruppe wie in allen anderen Versuchsgruppen in denen ausreichend hohe schwankende Wirkstoffspiegel eines Pyrimidinbiosynthesinhibitors generiert wurde, überlebten alle Transplantate nach dem Absetzen der Wirkstoffgabe länger als es der Abstoßungszeit in der Placebogruppe entspricht. Dies bedeutet, dass in allen Gruppen mit täglich schwankenden Spiegeln von MNA 715 Effekte auf das Immunsystem generiert wurden, die auch nach dem Absetzen des Wirkstoffes anhielten. Diese Effekte waren bei konstanten Wirkstoffspiegeln nicht zu beobachten.
Tierexperimentelle Untersuchungen 4:
Die Ergebnisse der tierexperimentellen Untersuchungen 4 zeigen, dass durch die tägliche Gabe von Uridine als funktionellen Antagonisten der inhibitorischen Wirkung von HMR 1726 auf die Pyrimidinbiosynthese die gleichen pharmakodynamischen Wirkungen (Langzeitüberleben der Transplantate) erzielt werden wie durch täglich schwankende Wirkstoffspiegel von HMR 1726.
Zusammenfassung und Diskussion der Ergebnisse:
In den beiden klinischen Fallbeispielen wurde gezeigt, dass die galenische Formulierung von Leflunomide in einer Hartgelatinekapsel zur Behandlung von TH-2 abhängigen Immunreaktionen geeignet ist, während die Formulierung in der Tablettenform hierzu nicht in der Lage ist, Weiterhin zeigt das klinische Fallbeispiel des Patienten mit Pemphigus Vulgaris, dass auch beim Menschen durch die Gabe von Leflunomide in Hartgelatinekapseln das Immunsystem in der Art verändert werden kann, dass auch nach dem Absetzen der Gabe von Leflunomide die unerwünschten Immunreaktionen nicht mehr auftreten. Schließlich geben pharmakokinetische Vergleichsuntersuchungen am Menschen den Hinweis, dass die gegenüber der Formulierung in der Hartgelatinekapsel gefundene geringere Wirksamkeit der kommerziell erhältlichen Tablettenformulierung auf eine langsameres Ansteigen der Blutplasmawirkstoffspiegel und ein geringere Höhe der täglichen Schwankung in den Blutplasmaspiegel des aktiven Metaboliten von Leflunomide zurückzuführen ist. Die Interpretation dieser pharmakokinetischen Untersuchungsbefunde ist auch in Übereinstimmung mit den Beobachtungen, dass die Wirksamkeit von Leflunomide bei Dosisreduktionen, Absetzen oder Wechsel auf die galenische Formulierung in Tablettenform spätestens nach wenigen Tagen verloren geht und nicht nach Wochen bzw. Monaten, wie dies Aufgrund der langen Halbwertszeit von Leflunomide zu erwarten wäre, wenn tatsächlich die Wirkung auf TH-2 abhängige Immunreaktionen von der Höhe der konstanten Wirkspiegel von HMR 1726 abhängen würde.
Durch die ausführlichen tierexperimentellen Untersuchungen bezüglich der Entwicklung von Langzeiteffekten im Tiermodell der heterotopen Herztransplantation der Ratte wurde bewiesen, dass täglich schwankende Wirkstoffspiegel von HMR 1726 und anderen Pyrimidinbiosyntheseinhibitoren bzw. schwankende Inhibition der Pyrimidinbiosynthese benötigt werden, damit sich Effekte auf das Immunsystem einstellen, die im Sinne einer regulatorischen Immunantwort auch nach dem Absetzen der Gabe von Pyrimidinbiosyntheseinhibitoren fortbestehen.
Diese Effekte sind umso erstaunlicher, da bei anderen Wirkstoffen, wie zum Beispiel bei Cyclosporin A, Formulierungen, die einen möglichst konstanten Blutspiegel mit geringen täglichen Schwankungen erzeugen, gegenüber Formulierungen mit größeren Schwankungen in den Wirkstoffspiegel therapeutische Vorteile bieten.
Die Befunde bezüglich der besseren pharmakodynamischen Wirksamkeit sind auch deshalb vom pharmakodynamischen Mechanismus überraschend, da tägliche Schwankungen in den Blutplasmaspiegel, welche nur 1/20 der Gesamtkonzentration an Wirkstoff ausmachen, zu derartigen Veränderungen in der Wirksamkeit führen. Man kann ermuten, dass diese Effekte zum Teil durch Beeinflussung von Resistenzmechanismen hervorgerufen werden, die sich unter der Gabe von Lelfunomide entwickeln. So wurde das Targetenzym der Wirkung von Leflunomide ursprünglich dadurch identifiziert, dass sich in Zellkulturen unter über Wochen ansteigenden Konzentrationen von HMR 1726 das Targetenzym DHODH stark vermehrt und somit zum Teil die inhibierende Wirkung von Leflunomde antagonisiert wird. Ein weiterer potentieller Mechanismus der Resistenzbildung gegenüber HMR 1726 könnte in der Ausbildung von Transportmechanismen liegen, die HMR 1726 von ihrem Targetenzym wegtransportieren.
Aufgrund der in diesem Patent dargelegten pharmakodynamischen Untersuchungen kann vermutet werden, dass TH-1 Zellen des Immunsystems gegenüber der inhibierenden Wirkung von Leflunomide empfindlicher sind als TH-2 Zellen bzw. immunsuppressive Zellen des Immunsystems. Es kann vermutet werden, daß TH-1 Zellen wahrscheinlich eine höhere Stoffwechselaktivität als TH-2 Zellen besitzen und immunsuppressive Zellen eine nochmals geringere Stoffwechselaktivität aufweisen. Die Eigentliche Überraschung stellt dar, dass TH-2 Zellen durch täglich schwankende Wirkstoffspiegel an HMR 1726 stärker inhibiert werden als durch konstante Wirkstoffspiegel. Es ist denkbar, dass sich bei täglich schwankenden Wirkstoffspiegeln die Resistenz der Zellen nicht auf die täglichen Spitzenkonzentrationen einstellt, sondern auf einen unbekannten Wert unterhalb dieser Spitzenkonzentration, und dass hierdurch beim Auftreten von Wirkstoffkonzentrationen oberhalb dieses Wertes die Pyrimidinbiosynthese für mehrere Stunden in einem ausreichenden Umfang unterdrückt wird, um auch TH-2 Zellen in Funktion und Proliferation zu unterdrücken. Unter diesen Bedingungen, die bei TH-1 und TH-2 Zellen zu einem Stopp der Proliferation führen, könnten die weniger stoffwechselaktiven immunsuppressiven T-Zellen langsam soweit zunehmen, dass sie ab einem gewissen Zeitpunkt auch nach dem Absetzen der Gabe von Pyrimidinbiosynthesinhibitoren die verbliebenen TH-1 und TH-2 Effektorzellen erfolgreich unterdrücken können und somit zu den beschriebenen Langzeiteffekten bei der Organtransplantation in der Ratte sowie bei dem Patienten mit Pemphigus vulgaris geführt haben könnten.
Untersuchungen/Experimente:
Klinische Einzelfallbeobachtungen:
Herstellung der Hartgelatinekapseln.
Entsprechende Mengen an pulerförmigen Leflunomide wurde in einer Fantaschale mit Hilfe eines Pestil mit einer entsprechenden Menge an Glucose fein verrieben und anschließend in weiße Hartgelatinekapseln (Qualität gemäß DAB 8, ohne Maßnahmen zur Verzögerung der Resorption) eingefüllt. Diese Arbeiten wurde mit Hilfe einer in der Ausstattung von Apotheken enthaltenen manuellen Kapselmaschine durchgeführt. Um das Risiko der Umwandlung von Leflunomide in HMR 1726 durch Feuchtigkeit zu minimieren, wurden alle 2 Wochen neue Kapseln hergestellt. Sowohl die fertigen Kapseln als auch Leflunomide wurden vor Licht und Feuchtigkeit geschützt in braunen Glasflaschen gelagert.
Einnahme der Hartgelatinekapseln:
Die Hartgelatinekapseln wurden in der Regel am Morgen auf nüchternen Magen zusammen mit ca. 60 ml Leitungswasser eingenommen.
Bestimmung der Leflunomide Blutspiegel:
Da sich Leflunomide nach der Resorption innerhalb kürzester Zeit in seinen aktiven Metaboliten HMR 1726 umwandelt, wurden die Spiegel von HMR 1726 anstelle von Leflunomide bestimmt. Zur Detektion von HMR 1726 wurde eine selektive HPLC-MS/MS Methode verwendet.
Bestimmung der Autoantikörper gegen Desmosomen und interzelluläre Substanz:
Sämtliche Bestimmungen von Autoantikörpern wurden mit Routinemethoden des Labors Dr. G. Holzer und Dr. L. Holzer in Würzburg und frei käuflichen Reagenzien durchgeführt. Antikörper gegen die Desmosomen von Akanthozyten wurden mit Hilfe der indirekten Immunfluorezenz an Schnitten von Rinderlippen oder Ösophagus/Zunge von Meerschweinchen durchgeführt. Die für Pemphigus vulgaris unspezifischeren Antikörper gegen die interzelluläre Substanz wurde mittels der indirekten Immunfluoreszenz an Schnitten von Affenösophagen bestimmt.
Klinisches Fallbeispiel 1:
Männlicher Patient, 75 kg Körpergewicht, Beruf Allgemeinarzt, der vor der ersten Leflunomide Gabe seit über 10 Jahren an einem Pemphigus vulgaris litt. Vor der Behandlung mit Leflunomide befand sich der Patient seit über 10 Jahren in der Betreuung der Universitätshautklinik Erlangen-Nürnberg. Betroffen von der Erkrankung waren die Schleimhaut des Mundes, die Haut leicht, der Genitalbereich und die Konjunktiven bis 1985. Der Patient litt vor dem Therapiebeginn mit Leflunomide jährlich an 2 bis 3 schweren Schüben des Pemphigus vulgaris, die mindestens 3 Wochen anhielten und die Gabe von bis zu 40 mg Fluocortolon täglich erforderten, welches weit über der Cushingschwellendosis von ca. 8 mg täglich liegt. Aufgrund der hohen Steroidgaben entwickelte der Patient einen Steroidkatarakt, der 1985 operiert wurde, sowie mehrfach operationspflichtige Inguinalhernien sowie Abrisse der Achillessehnen. Selbst in schubfreien Phasen konnte die Dosierung der immunsuppressiven Medikamente minimal auf 5 mg Fluocortolon in Kombination mit 50 mg Azathioprim als sogenannte „Erhaltungsdosis" reduziert werden.
Wurde diese Dosierung unterschritten so entwickelte sich innerhalb weniger Tage ein Schub des Pemphigus der mehrere Wochen anhielt.
Vor der erstmaligen Gabe von Leflunomide am 12. November 1992 lag der letzte Schub des Pemphigus vulgaris 2 Monate zurück und der Patient erhielt seit 2 Wochen die minimal immunsuppressive Therapie von 5 mg Fluocortolon und 50 mg Azathioprim. Der Titer an Anti-Desomsomalen Antikörpern lag zu diesem Zeitpunkt bei 1 : 80. Am 12. November 1992 erhielt der Patient eine Initialdosis von 100 mg Leflunomide gefolgt von täglichen Gaben von 25 mg.
Innerhalb von 5 Wochen nach Beginn der Gabe von Leflunomide verschwand das Krankheitsgefühl, welches sich in Müdigkeit und Abgeschlagenheit seit Beginn der Erkrankung äußerte. Als Nebenwirkung stellten sieh leichte Durchfälle ein, die mit der Gabe von Immodium^® therapiert wurden.
Ab dem 27.12.1992 wurde stufenweise zunächst die Gabe von Azathioprim reduziert. Bei jeder Reduktion der Dosis von Azathioprim kam es zu einem leichten Schub mit der Entwicklung einzelner Bläschen an der Haut, die jedoch innerhalb eines Tages durch Erhöhung der Dosis an Fluocortolon gestoppt werden konnte. Hierzu wurden Dosierungen von maximal 20 mg Fluocortolon Tag eingesetzt. Bereits einen Tag nach Gabe von 20 mg Fluocortolon konnte am folgenden Tagen die Dosis um jeweils 5 mg reduziert werden, sodass innerhalb weniger Tage wieder die minimale Dosis von 5 mg Flucortolon erreicht wurde. Die Gabe von Azathioprim konnte bis Ende Februar 1993 vollständig abgesetzt werden. Von April 1993 bis Mai 1993 wurden Untersuchungen zur Findung der minimal notwendigen Dosis von Leflunomide durchgeführt (siehe Details im Hauptteil dieser Arbeit). Ab Ende Mai 1993 erhielt der Patient täglich eine Dosis von 20 mg Leflunomide in Hartgelatinekapseln in Kombination mit 5 mg Fluocortolon.
Im September 1993 entwickelte der Patient aufgrund einer viralen Infektion der oberen Atemwege einen erneuten Schub des Pemphigus vulgaris. Dieser Schub wurde mit Erhöhung der Fluocortolondosis auf 20 mg abgefangen. Anschließend wurde die Fluocortolondosis täglich um 5 mg reduziert und schließlich komplett abgesetzt.
Ab diesen Zeitpunkt erhielt der Patient nur noch Leflunomide in einer Dosis von täglich 20 mg. Bis zum 16. März 1995 hatte der Patient unter der Therapie von Leflunomide keinerlei Symptome des Pemphigus vulgaris. An diesem Tag wurde Leflunomide komplett abgesetzt, da der Patient an einem schweren Infekt, einer zum damaligen Zeitpunkt kursierenden Influenzaepedemie erkrankt war und Fieber von 39°C bis 40° C entwickelt hatte. Da der Patient seit über einem Jahr keinerlei Symptome des Pemphigus gezeigt hatte, war es zu diesem Zeitpunkt unklar ob er überhaupt noch Leflunomide benötigt. Wie im Hauptteil dieser Arbeit beschrieben entwickelte der Patient innerhalb von wenigen Tagen nach dem Absetzten von Leflunomide einen schweren Schub des Pemphigus der auch die Konjunktiven der Augen betraf. Daraufhin wurde mit der Gabe von Leflunomide am Abend des 19.03.1995 wieder begonnen. Am Morgen des 20.03.1995 trockneten die Bläschen der Pemphigus Eruptionen ein. Eine am Nachmittag des 20.03.1995 genommene Blutprobe zeigte bezüglich der Antikörper gegen Desmosomen einen Titer von null (spezifische Antikörper für Pemphigus vulgaris) und bezüglich Antikörper gegen die interzelluläre Substanz einen Titer von 1:80. Die im Hauptteil beschriebenen Untersuchungen zur Wirksamkeit von Leflunomide in Tablettenform erfolgten im Juni 1995.
Im August 1995 erlitt der Patient einen Infekt der oberen Atemwege mit Bronchitis. Während der Erkrankung wurde Leflunomide unverändert weitergegeben. Es wurden keinerlei Symptome des Pemphigus beobachtet. 2 Tage nach Beendigung der Symptome der Bronchitis, am 27.08.1995 wurde Leflunomide komplett abgesetzt. Seit diesem Zeitpunkt hat der Patient keinerlei Immunsuppressive Medikamente mehr benötigt. Klinische Symptome des Pemphigus sind seit diesem Zeitpunkt nicht mehr aufgetreten. Die Autoantikörpertiter wurden bis zum 9. Januar. 1997 weiterverfolgt. Am 26.10.1995 lagen zum Beispiel die Antikörpertiter gegen Desmosomen bei 1:40, was beweist, dass durch die Gabe von Leflunomide die Fähigkeit zur Produktion von Pemphigus verursachenden Autoantikörpern nicht zerstört wurde. Am 9. Januar 1997 lag der Titer bei den Antikörpern gegen Desmosomen bei null und bei den für Pemphigus vulgaris unspezifischen Antikörpern gegen die interzelluläre Substanz bei einem niedrigen Wert von 1:80.
Vergleich der Blutplasmakonzetrationen nach Gabe von Leflunomide in der Hartgelatinekapsel gegenüber Gabe in Tablettenform:
Leflunomide in Hartgelatinekapseln und Leflunomide in Tablettenform wurde dem Patienten verabreicht und die Blutspiegel des aktiven Metaboliten von Leflunomide, der sich innerhalb kürzester Zeit nach der Resorption bildet, zu den Zeitpunkten 0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 18 und 24 Stunden bestimmt. Ziel der Untersuchungen war herauszufinden in wie weit sich das Resorptionverhalten von Leflunomide in Hartgelatinekapseln von Leflunomide in Tablettenform unterscheidet. Bei Δc handelt es sich um die Differenz zwischen der Konzentration zum Zeitpunkt 0 Stunden zur Konzentration zum angegebenen Zeitpunkt.
Klinisches Einzelfallbeispiel 2:
Bei dem klinischen Fallbeispiel handelt es sich um einen 52 jährigen männlichen Patientenmit einem Körpergewicht von 97 kg. Der Patient litt an einer saisonalen allergischen Reaktion gegen Gräser die von Mai bis Juli anhielt. Der Patient nahm mit Beginn der Allergiesaison im Mai täglich eine Dosis von 20 mg in Hartgelatinekapseln, welche genauso hergestellt wurden, wie die Hartgelatinekapseln im klinischen Fallbeispiel 1.
Die Auswirkungen auf die allergische Reaktion wurde aufgrund der Entwicklung klinischer Symptome einer allergischen Reaktion, wie Atemnot, verstärkte Sekretsekretion in Nase und Auge, Schwellung von Nasenschleimhaut und Konjuktiven. Bewertet wurde lediglich ob die Symptome vorhanden waren oder nicht.
Unter der Gabe von Leflunomide in Hartgelatinekapseln verschwanden die Symptome der Allergie vollständig. Wie im Hauptteil der Patentanmeldung beschrieben ging die Wirkung auf die allergische Reaktion bei identischer Wirkstoffdosierung verloren als der Patient von der Formulierung in Hartgelatinekapseln auf die kommerziell erhältliche Tablettenform umgesetzt wurde.
Tierexperimentelle Untersuchungen:
Tierexperimentelle Untersuchung 1
In diesem Experiment wurde die Wirksamkeit von konstanten Blutspiegeln von HMR 1726 (aktiver Metabolit von Leflunomide) gegenüber pulsartig auftretenden Blutspiegeln von HMR 1726 bestimmt. Zur Erzielung konstanter Blutspiegel, wurde den Versuchstieren eine Miniinfusionspumpe subkutan implantiert. Die Mininfusionpumpen enthielten 2 ml einer 15%igen ethanolischen Lösung, die kontinuierlich über 21 Tage freigesetzt wurden. Implantiert wurden die Mininfusionspumpen am Tag 0 direkt nach erfolgreicher Transplantation des BN Herzens. Eingesetzt wurden Dosierungen von 5, 10 und 15 mg/kg/Tag HMR 1726 (aktiver Metabolit von Leflunomide). Zum Vergleich erhielten Tiere, welche die gleichen täglichen Dosierungen an HMR 1726 oral in einer Carboxymethylcelluloselösung appliziert erhielten Miniinfusionspumpen implantiert, die jedoch lediglich mit dem Vehikel (15% Ethanol in Wasser) befüllt waren. Tiere, welche HMR 1726 über Miniinfusionspumpen erhielten, erhielten zusätzlich oral eine 1%ige Carboxymethylcelluloselösung. Täglich wurde das Überleben des Transplantates durch Palpieren des Bauchraumes überprüft. Als Erfolgsparameter diente das Überleben des Transplantates in Tagen. Am 21.Tage des Versuchs wurden den Tiere narkotisiert, durch kupieren der Schwanzspitze Blut zur Bestimmung der HMR 1726 Plasmakonzentrationen gewonnen und die subkutan implantierten Miniinfusionspumpen entfernt. Zur Detektion von HMR 1726 wurde eine selektive HPLC-MS/MS Methode verwendet. Denjenigen Tieren, die HMR 1726 oral erhielten wurde am Tag 21 vier Stunden nach der Gabe von HMR 1726 Blut abgenommen.
Die heterotope Herztransplantation wurde entsprechend der Methode von Ono und Lindsey (Ono K, Lindsey ES, Improved technique of heart transplantation in rats. J. Thorac Cardiovasc Surg 57:225 (1969)) durchgeführt. Als Empfängertiere dienten männliche Lewis Ratten mit einem Gewicht von ca. 170 g, als Spendertiere dienten Brown Norway Ratten mit ca 170 g Körpergewicht.
Tierexperimentelle Untersuchung 2:
In diesem Experiment wurde untersucht, ob durch die tägliche orale Gabe von 1000 mg Cholestyramin bei Tieren mit Miniinfusionspumpen Schwankungen im HMR 1726 Plasmaspiegel induziert werden können und welchen Einfluß diese Schwankungen der HMR 1726 Plasmaspiegel auf das Transplantatüberleben haben. Zum Vergleich wurde HMR 1726 auch in Vergleichsgruppen per oral eingesetzt. Die per orale Gabe von 1000 mg Cholestyramin erfolgte 4 Stunden nach der oralen Gabe von 1726. Die Bestimmung der Blutplasmaspiegel erfolgte am Tag 21, zum Zeitpunkt 4 Stunden und 8 Stunden nach der oralen Gabe von HMR 1726 und bei den Gruppen mit Miniinfusionspumpen 4 Stunden nach der letzten Gabe von 1000 mg Cholestyramin.
Der weitere Versuchsablauf erfolgte wie in Untersuchung 1 geschildert.
Tierexperimentelle Untersuchung 3:
In diesem Experiment wurde im Gegensatz zu den vorhergehenden Experimenten, anstelle von HMR 1726 der Pyrimidinbiosyntheseinhibitor MNA 715 in einer Dosierung von 15 mg/kg Körpergewichteingesetzt.
MNA 715 wurde entweder oral an 1% Methylcellulose oder zur Erielung von konstanten Blutspiegeln mittels subkutan implantierten Alzet Miniinfusionsfusionspumpen verabreicht. Tiere die MNA 715 p.o. erhielten, wurden aus Vergleichsgründen Miniinfusionspumpen mit Vehikel (25%ige ethanolische Lösung) implantiert. Tiere die MNA 715 mittels Miniinfusionspumpen erhielten, wurde täglich eine 1%ige Carboxymethylcelluloselösung verabreicht.
Wurde in den Gruppen Cholestyramin verabreicht so erfolgte die Gabe einmal täglich in einer Dosierung 1000 mg, bei oraler Gabe von MNA 715 erfolgte die Gabe von Cholestyramin vier Stunden nach Gabe von MNA 715. Um zu zeigen das Cholestyramin tatsächlich MNA 715 im Gastrointestinaltrakt binden kann und damit Gastrointestinal zirkulierendes MNA 715 beschleunigt eliminieren kann, wurde in einer Versuchsgruppe Cholestyramin nur 1 Stunde nach oraler Gabe von MNA 715 verabreicht. Hierdurch ist zu erwarten, dass MNA 715 vor der Resorption mit Cholestyramin in Kontakt kommt und hierdurch die Aufnahme von MNA 715 in den Körper verhindert wird.
Die Versuchsgruppengröße war 10 Tiere. In die Auswertung wurden nur Tiere aufgenommen, welche die Behandlung mit MNA 715 über 21 Tage überlebten.
Die restliche Versuchsdurchführung war wie in Experiment 1. Pharmakokinetische aussagekräftige Untersuchungen über die verschiedenen Versuchsgruppen hinweg waren nicht möglich, da die meisten Versuchstiere am Tag 21 sehr geschwächt waren (insbesondere die Gruppe MNA 715 via Miniinfusion).
Tierexperimentelle Untersuchung 4:
In diesem Experiment wurde untersucht, ob durch die zweimalige tägliche Gabe von jeweils 200 mg Uridine und der damit verbundenen funktionellen Antagonisierung der Wirkung von HMR 1726 auf die Pyrimidinbiosynthese die gleiche Wirkung auf das Transplantatüberleben erzielt werden wie bei täglich schwankenden Wirkstoffspiegel von HMR 1726. Hierzu wurde den Tieren 2 mal täglich 200 mg Uridine in 0,9% NaCl Lösung in einem Zeitabstand von 4 Stunden subkutan verabreicht. Die Vergleichsgruppen die kein Uridine erhielten, wurde zu den gleichen Zeiten 0,9% NaCl Lösung subkutan verabreicht. Am Tag 21 wurden bei allen Tieren die Miniinfusionspumpen entfernt und danach die Gabe von Uridine bzw. 0,9% NaCl Lösung beendet.
Der weitere Versuchsablauf erfolgte wie in Untersuchung 1 geschildert.

Claims

Pharmazeutisches Kombinationspräparat beziehungsweise Formulierung, dadurch gekennzeichnet, dass es Pyrimidinbiosyntheseinhibitoren (bzw. Prodrugs von Pyrimidinbiosyntheseinhibitoren) enthält und sich täglich schwankende Wirkungen auf die Inhibition der Pyrimidinbiosynthese induzieren lassen. Im Falle von Leflunomide sind diese täglichen Schwankungen ausgeprägter als bei dem kommerziell erhältlichen Präparat (Arava^®).
Pharmazeutische Formulierung beziehungsweise Kombinationspräparat entsprechend Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es Pyrimidinbiosyntheseinhibitoren (bzw. Prodrugs von Pyrimidinbiosyntheseinhibitorem) enthält und aufgrund der Formulierung täglich schwankende Wirkstoffspiegel generiert, die im Vergleich zu kommerziell erhältlichen Formulierung von Leflunomide (Arava^®) zu ausgeprägteren täglichen Schwankungen in der Pyrimidinbiosynthese führt.
Pharmazeutisches Kombinationspräparatspräparat entsprechend Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es Pyrimidinbiosyntheseinhibitoren (bzw. Prodrugs von Pyrimidinbiosyntheseinhibitoren) und Antagonisten der Hemmung der Pyrimidinbiosynthese enthält und hierdurch täglich schwankende Wirkungen der Hemmung der Pyrimidinbiosynthese hervorrufen.
Pharmazeutische Formulierung beziehungsweise Kombinationspräparat entsprechend Anspruch 2, der dadurch gekennzeichnet ist, das es sich bei dem Pyrimidinbiosyntheseinhibitoren bzw. deren Vorstufen um Malononitrilamide wie HMR 1726 oder MNA 715 sowie um Leflunomide handelt.
Pharmazeutisches Kombinationspräparat entsprechend Anspruch 3 gekennzeichnet dadurch, dass es sich bei dem Antagonisten um Cholestyramin in einer Dosierung von bis zu täglich 3 g handelt.
Pharmazeutisches Kombinationspräparat entsprechend Anspruch 3 dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Antagonisten der Pyrimidinbiosynthese um sogenannte „Bypassing Agents" wie zum Beispiel Uridineverbindungen oder Thymidineverbindungen handelt.
Pharmazeutisches Kombinationspräparat entsprechend Anspruch 6 dadurch gekennzeichnet, dass Malononitrilamide wie z.B. HMR 1726 oder MNA 715 bzw. deren Prodrugs wie z.B. Leflunomide als Pyrimidinbiosyntheseinhibitor eingesetzt werden.
Pharmazeutisches Kombinationspräparat entsprechend Anspruch 5 dadurch gekennzeichnet, dass Malononitrilamide wie z.B. HMR 1726 oder MNA 715 bzw. deren Prodrugs wie z.B. Leflunomide als Pyrimidinbiosyntheseinhibitor eingesetzt werden.
Pharmazeutische Formulierung beziehungsweise Kombinationspräparat entsprechend Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es als Pyrimidinbiosyntheseinhibitor bzw. Prodrug ein Malononitrilamide bzw. Leflunomide enthält und aufgrund der Formulierung täglich schwankende Wirkstoffspiegel generiert, die im Vergleich zu Arava^®, der bis jetzt kommerziell erhältlichen Tablettenformulierung, zu stärkeren der Pyrimdinbiosynthese führen.
Pharmazeutische Formulierung beziehungsweise Kombinationspräparat entsprechend Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Pyrimidinbiosynthesinhibitor um HMR 1726 bzw. Leflunomide handelt und das Anfluten bzw. Abfluten der täglichen HMR 1726 Blutspiegel größer als 2 mg/L in 2 Stunden ist, beziehungsweise die maximale tägliche Schwankung des Blutplasmaspiegels größer 2,8 mg/L ist, bezogen auf eine Dosis von 20 mg Leflunomide und einem Körpergewicht von 75 kg.