Unter
den viralen Vektoren, die für
Gentransfer verwendet werden, werden Vektoren, die auf Retroviren
basieren, besonders bevorzugt, da mit Ihnen eine stabile Integration
des transferierten Gens in das Genom von Säugetierzellen erreicht wird.
Lentiviren sind eine Untergruppe der Retroviren, die Zellen infizieren
können,
die sich nicht teilen. Mehrere lentivirale Vektorsysteme basierend
auf dem Human Immunodeficiency Virus (HIV) oder dem (nahe) verwandten
Simian Immunodeficiency Virus (SIV) sind beschrieben (
US 5,665,577 ;
US 5,747,324 ;
US 5,861,282 ;
US 5,919,458 ;
US 5,981,276 ;
US 6,013,516 ;
US 6,555,342 ;
US 6,627,442 ;
US 6,669,936 ;
US 6,712,612 ;
US 6,790,641 ;
US 6,790,657 ).
Die
Verwendung von HIV- oder SIV-basierten Systemen für den Gentransfer
in Menschen bringt jedoch ernsthafte Sicherheitsprobleme mit sich,
da die Möglichkeit
der Rekombination des Vektors in eine virulente und krankheitsverursachende
Form besteht. Dies gilt weniger stark für Vektoren, die auf verwandten
Viren basieren, wie dem Bovine Immunodeficiency Virus (BIV – WO 03/066810),
dem Equine Infectious Anaemia Virus (EIAV –
US 6,277,633 ,
US 6,312,683 ) oder dem Feline Immunodeficiency
Virus (FIV –
US 6,555,107 ). Die ausgeprägte Homologie
zwischen den Hilfs- und Strukturproteingenen und dem (jeweiligen)
Transduktionsvektor, der in diesen Ansätzen gebraucht wird, erhöht (jedoch)
die Wahrscheinlichkeit von Rekombinationen.
US 6,479,281 betrifft lentivirale
Virus-Vektoren (abgeleitet von HIV, SIV, FIV, Visnavirus oder EIAV),
die ein verkürztes
Matrixprotein aufweisen (Anspruch 17b), das mit einem heterologen
Myristylatierungs-Anker und einem verkürzten Hüllprotein ersetzt ist (envelope
protein – Anspruch
17c). Da der Vektor ein replikationskompetentes Retrovirus ist,)
ist das Risiko der Ausbreitung und Rekombination beachtlich. Es
werden keine Beispiele der Transduktion eines heterologen Gens gezeigt.
Das
Visnavirus (Virus Code 61.0.6.4.002) ist ein Lentivirus, das Schafe
infiziert und für
Menschen nicht pathogen ist. Das Wildtyp-Visnavirus hat ein dimeres
RNA Genom (einzelsträngig,
positive Polarität),
welches in ein sphärisches,
umhülltes
Virion verpackt ist, das einen Nukleoproteinkern enthält. Die
Replikation des Wildtyp-Visnavirus-Genomes erfolgt durch Reverse
Transkription und Integration in das Genom der Wirtszelle. Das Virusgenom
besteht aus einer RNA (9202 bp, Genbank Accession Number: NC 001452)
und enthält
drei wesentliche Gene, welche für
die Gag, Pol und Env Polyproteine codieren, und Long Terminal Repeats
(LTR) an jedem Ende des integrierten viralen Genoms. Der LTR ist
in etwa 600 nt lang, davon ist die U3 Region 450, die R Sequenz
100 und die U5 Region etwa 70 nt lang. Das gag Gen des Wildtyp-Visnavirus
codiert für
das Polyprotein Gag, welches durch die virale Protease in das Strukturprotein
der Matrix p17, das Hauptkapsid-Protein (major capsid Protein) p24
und die Nukleokapsidproteine p7 bis p11 gespalten wird. Das pol
Gen codiert für
das Polyprotein Pol, welches durch die Protease in die folgenden
Enzyme gespalten wird: die Protease selbst, die reverse Transkriptase
(RT), die RNase H (RH), die dUTPase und die Integrase.
Das
natürliche
Visnavirus enthält
zusätzliche
Gene, die für
die Hilfsproteine Vif, Tat, und Rev codieren, die an der Regulation
von Synthese und Prozessierung (processing) der Virus RNA und anderen
replikativen Funktionen beteiligt sind. Das Vif-(viral infectivity
factor)-Protein ist mit der Integrase Teil des Präintegrationskomplexes
(pre-integration complex) der das DNA-Produkt, welches von der viralen RNA
durch die von Pol abgeleitete RT gebildet wird, in einer Form verpackt,
die es ihm erlaubt, die Kernmembran zu passieren. Dadurch wird die
stabile Integration des viralen Genoms in das Wirtszellgenom in
der Gegenwart einer intakten nuklearen Membran möglich, wie z. B. in einer sich
nicht teilenden (resting) oder endgültig differenzierten Zelle. Das
Tat-(transactivator of transcription)-Protein ist ein pleiotroper
Faktor, der eine Bandbreite von biologischen Effekten in einer Vielzahl
von Zelltypen induziert. Tat ist ein leistungsstarker Transaktivator
der Genexpression, welcher seine Wirkung sowohl durch Induktion
der Chromatin-Umlagerung als auch durch Rekrutierung von elongationskompetenten
Transkriptionskomplexen auf den viralen LTR Promotor entfaltet.
Das Visnavirus Tat-Protein wird für die effiziente virale Transkription
vom Visnavirus LTR (long terminal repeat) benötigt. AP-1 Bereiche innerhalb
des Visnavirus LTR, an welche die zellulären Transkriptionsfaktoren
Fos und Jun binden, sind ebenfalls notwendig für die Tat-vermittelte Aktivierung
der Transkription.
Das
Wildtypgenom des Visnavirus enthält
ferner mehrere Cis-acting Sequenzen (cis-acting sequences), Promotor
elemente wie das Tat-Response-Element (TRE), die den Transkriptionsbeginn
des integrierten Proviruses kontrollieren; eine Packaging Sequence
(Y); und ein Rev-Response Element (RRE), das für den Export der Virion-mRNA
aus dem Wirtszellkern verantwortlich ist.
Die
Nachteile der meisten Retroviren, das Wildtyp-Visnavirus eingeschlossen,
sind ein begrenzter Zelltropismus, ein niedriger Virustiter und
das Risiko der Erzeugung von replikationskompetenten Viren während des
Verpackens.
Ein
weiteres Problem der traditionellen Gentherapieansätze ist,
dass, wenn ein gesundes Gen insertiert wird, um ein defektes Gen
zu ersetzen, es nach dem Zufallsprinzip in das Wirtsgenom insertiert
wird. Das kann Probleme hervorrufen, da das Gen viel von seiner
(normalerweise) es umgebenden DNA verliert, welche regulatorische
Informationen enthält;
das eingesetzte Ersatzgen kann auch seine neuen Nachbarn stören.
Ein
anders gearteter Ansatz zur Gentherapie ist die Antisense-Therapie,
welche darauf abzielt, ein mutantes Allel eines Gens stillzulegen,
indem komplementäre
Nukleinsäuresequenzen
insertiert werden.
Ribozyme
sind RNAs, die eine enzymatische Aktivität aufweisen. Unterschiedliche
Ribozyme sind bekannt, wie das Hammerhead-Ribozym, das Hairpin-Ribozym,
das Tetrahymena Gruppe I Intron, RNase P und das Hepatitisdeltavirus-Ribozym.
Sie katalysieren einen internen Schnitt (self-cleavage – intramolekulare
oder "in-cis" Katalyse) oder sie
schneiden externe Substrate (intermolekulare oder "in-trans" Katalyse). Ribozyme, wie
das Hammerhead-Ribozym
und das Hairpin-Ribozym, werden bereits in lentiviralen Vektoren
für gene
silencing-Ansätze
(e.g. WO9710334, WO0032765) verwendet. In den gene silencing-Ansätzen werden
Ribozyme unter Anwendung vieler der von den Antisense-Nukleinsäuren bekannten
Prinzipien eingesetzt. Auch Ribozyme basieren auf der komplementären Bindung
von Nukleinsäuren
zur Erkennung ihres Zielmoleküls
(Target). Im Gegensatz zu Antisense-Nukleinsäuren binden sie jedoch nicht
nur an eine Target-Messenger-RNA, sondern legen das Gen auch still,
indem sie die RNA schneiden.
Der
vom Gruppe I Intron-Ribozym vermittelte Mechanismus der RNA-Reparatur
wird schon seit langem als vielversprechendes Tool für die Gentherapie
genannt (zusammengefasst von Long MB et al. 2003 J. Clin. Invest.
112: 312–318).
Der Einsatz von Gruppe I Intron-Ribozym
vermittelter RNA-Reparatur für
Gentherapie wurde jedoch bisher durch die begrenzte Effizienz des
Transfers des für
das Ribozym kodierenden Gens in humane Zellen, die begrenzte intrazelluläre Aktivität des Ribozyms
im Zytoplasma und die kurze nutzbare Lebensdauer des Ribozyms bei
transienter Transfektion erschwert.
Bis
heute ist kein sicheres und effizientes Gentransfersystem für die Ribozym-vermittelte
RNA-Reparatur bekannt, welches für
eine große
Bandbreite sich teilender und nicht-teilender Zellen eingesetzt
werden kann. Weil die Sicherheit des Gentransfers vermittelt durch
die Packaging-Konstrukte von höchstem
Interesse ist, besteht immer noch eine Notwendigkeit für sicherere
und effiziente lentivirale Vektorsysteme, die Gentransfer in eine
große
Bandbreite von sich teilenden und sich nicht-teilenden Zellen vermitteln
können.
Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein sichereres
und effizientes Gentransfersystem für die Ribozym-vermittelte RNA-Reparatur
anzugeben, das in einer großen
Bandbreite von sich teilenden und sich nicht-teilenden Zellen angewandt
werden kann.
Diese
Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch
ein rekombinantes lentivirales Gentransfersystem für die Ribozym-vermittelte
Reparatur einer mutierten Target-RNA enthaltend:
- a.
ein erstes Plasmid enthaltend eine Nukleinsäuresequenz codierend für das Visna-Lentivirus (VLV)
Polyprotein Gag, wobei das Plasmid nicht für andere VLV-Proteine codiert
und kein kompetentes Verpackungssignal (packaging signal) enthält,
- b. ein zweites Plasmid als Transfer-Plasmid enthaltend:
(i)
VLV-Nukleinsäuresequenzen,
welche die für
die reverse Transkription des Plasmidgenoms benötigten Cis-acting Sequenzelemente
(cis-acting sequence elements) enthalten,
(ii) ein kompetentes
Verpackungssignal (packaging signal) und
(iii) eine Ribozymkassette,
welche die Sequenz der katalytischen Domäne eines selbst-spleißenden Intron-Ribozyms
(Gruppe I Intron) enthält,
und
(iv) ein heterologes Gen oder ein Teil eines Gens, welches
für das
akkurate (nicht-mutierte)
Gegenstück
der zu reparierenden Target-RNA codiert, oder eine Klonierungsstelle
(cloning site), in die ein heterologes Gen oder ein Teil eines Gens,
welches für
das akkurate (nicht-mutierte) Gegenstück der zu reparierenden Target-RNA
codiert, eingesetzt werden kann,
wobei das zweite Plasmid nicht
für irgendein
funktionelles Protein des VLV codiert;
- c. ein drittes Plasmid enthaltend eine Nukleinsäuresequenz,
die für
das VLV-Polyprotein
Pol codiert, wobei das Plasmid nicht für andere VLV-Proteine codiert
und kein kompetentes Verpackungssignal (packaging signal) enthält,
- d. ein viertes Plasmid enthaltend Nukleinsäuresequenzen codierend für die VLV-Proteine Vif, Rev
und Tat, wobei das Plasmid nicht für andere VLV-Proteine codiert
und kein kompetentes Verpackungssignal enthält,
- e. ein fünftes
Plasmid enthaltend eine Nukleinsäuresequenz
codierend für
ein virales Hüllprotein
(envelope protein – Env),
welches nicht vom Visnavirus abgeleitet ist und wobei das Plasmid
nicht für
VLV-Proteine codiert und kein kompetentes Verpackungssignal enthält.
Das
erfindungsgemäße rekombinante
lentivirale Gentransfersystem ist einsetzbar, um replikationsdefiziente
Virion-Vektorpartikel zu produzieren. Diese sind ein brauchbares
Tool für
die Ribozym-vermittelte Gentherapie. Die Sicherheit des rekombinanten
lentiviralen Gentransfersystems ist verbessert, da durch eine Kombination
mehrerer Strategien das Risiko der Rekombination und Formierung
eines funktionellen Virus auf ein Minimum reduziert wird. Die kombinierten
Strategien sind:
- 1. Aufteilung (Separierung)
der Gene, welche für
die funktionellen VLV-Proteine Gag, Pol, Vif, Tat und Rev codieren,
auf drei unterschiedliche Plasmide,
- 2. Abtrennen der Gene, welche für die funktionellen VLV-Proteine
codieren, von dem Verpackungssignal und den für die Reverse Transkription
benötigten
Cis-acting Sequenzen (cis-acting sequences),
- 3. Abtrennen der Gene, welche für die funktionellen VLV-Proteine
codieren, von dem für
das Hüllprotein
(envelope Protein) codierenden Gen, welches nicht vom Visnavirus
abgeleitet ist.
Das
Risiko der Rekombination wird weiter reduziert und die Sicherheit
weiter erhöht,
da die Gene, welche für
die funktionellen Proteine des Visnavirus codieren, bevorzugt aus
synthetischen, nicht in der Natur vorkommenden Nukleotidsequenzen
aufgebaut sind.
Die
Proteine Pol, Vif, Rev und Tat werden für die richtige Funktion des
rekombinanten lentiviralen Gentransfersystems benötigt.
Um
das Risiko des Auftretens von Rekombinationsereignissen zu reduzieren,
sind alle erfindungsgemäßen Plasmide
so aufgebaut, dass sie auf der Nukleinsäureebene minimale Homologie
und minimale Überschneidungen
zueinander aufweisen.
Die
für die
Pol, die akzessorischen (Vif, Rev und Tat) und die strukturellen
(Gag) Proteine codierenden Sequenzen sind von dem Transferplasmid
abgetrennt und auf 3 getrennte Plasmide verteilt.
Durch
die Aufteilung des Konstruktgenoms auf eine Anzahl von Plasmiden
wird das Risiko der Produktion von replikationskompetenten Retroviren
ausgehend von dem erfindungsgemäßen Gentransferkonstrukt
erniedrigt, da die Anzahl der notwendigen Rekombinationsereignisse
erhöht
wird.
Im
Gegensatz zu dem natürlichen
Visnavirus, in dem die gag und pol Gene überlappen, sind erfindungsgemäß die Gene,
die für
das Nukleokapsidprotein Gag und das Pol-Protein codieren, auf zwei
unterschiedliche Plasmide verteilt. Diese beiden Plasmide werden
nachfolgend "Pol-Plasmid" (c) und "Gag-Plasmid" (a) genannt.
Im
Wildtypvirus werden die Gag und Pol Polyproteine durch überlappende
open reading frames codiert, und zwar in einer Weise die sicher
stellt, dass Pol in einer geringeren Rate gebildet wird, als Gag.
Im
erfindungsgemäßen Gentransferkonstrukt
werden die Gag und Pol Proteine von synthetischen Nukleotidsequenzen
codiert. Die synthetischen Nukleotidsequenzen codieren für die gleichen
Aminosäuresequenzen
wie im Wildtyp, gebrauchen dazu jedoch Codons, die so unterschiedlich
wie möglich
von den Wildtyp-Sequenzen sind. Diese Änderung der Codon-Usage beseitigt die
Möglichkeit
einer Überlappung
der ORFs (open reading frames) der für Gag und der für Pol codierenden
Sequenzen.
Um
einen hohen Titer des Gentransferkonstrukts sicher zu stellen, sollten
sowohl die Gag- als
auch die Pol-Expression unter der Kontrolle von starken Promotoren
sein. Die für
Gag und Pol codierenden Sequenzen müssen jedoch unter der Kontrolle
von verschiedenen Promotoren sein. Im Wildtyp-Visnavirus wird das Pol-Polyprotein
in einer (circa 20-mal) niedrigeren Rate gebildet als das Gag-Polyprotein.
Da in der Erfindung die für
Pol codierende Sequenz und die für
Gag codierende Sequenz auf unterschiedliche Plasmide verteilt sind,
sollten ihre Produkte auch in unterschiedlichen Raten gebildet werden
und zwar in einem Verhältnis,
welches dem natürlichen
Verhältnis
entspricht. Um dies zu erreichen, ist die Pol-Expression erfindungsgemäß immer
unter der Kontrolle eines schwächeren,
bevorzugt eines zehn bis zwanzigfach schwächeren, Promotors als die Gag-Expression.
Bevorzugt ist die für
Gag codierende Sequenz unter der Kontrolle des Cytomegalievirus
(CMV) Promotors und die für
Pol codierende Sequenz unter der Kontrolle des Simianvirus 40 (SV
40) Promotors. Andere Promotorpaare, die sicherstellen, dass die
Gag-Expression die Pol-Expression signifikant übertrifft, sind auch geeignet.
Die
für die
akzessorischen Proteine des Visnavirus codierenden Gene, nämlich Vif,
Rev und Tat, die für
die Produktion von Virionen notwendig sind, sind bevorzugt auf einem
dritten Plasmid lokalisiert, welches nachfolgend "VTR-Plasmid" (d) genannt wird.
Im
Wildtypvirus überlappt
der vif ORF (open reading frame) mit dem pol ORF in 43 Basenpaaren
(bp). In der vorliegenden Erfindung bedingt die Änderung der Codon-Usage von
vif und pol t, dass die Überlappung zwischen
diesen ORFs aufgehoben ist und dass die ORFs unter der Kontrolle
zweier unterschiedlicher Promotoren sind. Dies wird erreicht, indem
die Sequenzen, die für
die akzessorischen Proteine Vif, Tat und Rev codieren, auf ein gesondertes
Plasmid ausgegliedert werden. Wiederum führt die Abtrennung der Sequenzen vif,
tat und rev von der Sequenz pol zu einer Verbesserung der Sicherheit.
Das
Gentransfersystem enthält
weiter ein Transferplasmid (b) mit einer Kassette für die Gruppe
I Intron Ribozym vermittelte RNA-Reparatur. Diese Kassette enthält eine
Gruppe I Intron Ribozym-Sequenz und eine Klonierungsstelle, in die
ein heterologes Gen oder ein Teil eines heterologes Gens insertiert
werden kann.
Wenn
das Transferplasmid in eine eukaryotische Zelle transferiert wird,
wird die Gruppe I Intron Ribozym-Sequenz stabil als DNA in das Genom
der Targetzelle integriert, wo die Ribozym-RNA unter der Kontrolle eines
viralen Promotors exprimiert wird. Die Ribozym-Sequenz und die heterologe
Gensequenz werden dann in eine RNA umgeschrieben, die sich an die
mRNA anlagert (Annealing), die von einem Target-Gen exprimiert wird
(Target-mRNA). Dieses Ribozym spleißt dann eine vordefinierte
Sequenz 3' von einem
Schnitt, welches das Ribozym in die Target-mRNA macht. Durch die
trans-spleißende
Aktivität
des Gruppe I Intron-Ribozyms wird
ein Teilbereich der Target-mRNA durch die RNA ausgetauscht, die
von der heterologen Gensequenz bereitgestellt wird.
Verglichen
mit konventionellen Gentherapie-Ansätzen hat diese Gruppe I Intron
Ribozymvermittelte RNA-Reparatur den Vorteil, dass das Target unter
der Kontrolle seines natürlichen
Promotors transkribiert wird und anschließend auf der Messenger-RNA-Ebene
repariert wird. Durch die die trans-spleißende Aktivität des Gruppe
I Intron-Ribozyms wird der mutierte Anteil der Target-mRNA durch
das fehlerfreie Gegenstück
ersetzt. Auf diese Weise wird die Target-mRNA wieder zu einer RNA
zusammengefügt,
die für
ein funktionelles Protein mit der gewünschten Aktivität kodiert.
Die
Ribozymkassette, welche die Gruppe I Intron katalytische Ribozym-Sequenz
enthält,
hat vier wichtige funktionelle Domänen:
- 1.
der Promotor, welcher die Expression des Ribozyms steuert;
- 2. die Leitsequenz (guide sequence – GS), welche verantwortlich
ist für
die Erkennung der Target-mRNA und der Schnitt- und Spleiß-Stelle
innerhalb der Target-mRNA;
- 3. die katalytische RNA;
- 4. die Sequenz, die 3' auf
den geschnittenen 5'-Anteil
der Target-mRNA gespleißt
wird, oder eine Klonierungsstelle, in welche die Sequenz eingesetzt
werden kann, die 3' auf
den geschnittenen 5'-Anteil
der Target-mRNA zu spleißen
ist.
Die
Ribozymkassette besteht somit aus dem Promotor, welcher die Expression
des Ribozyms steuert, unmittelbar gefolgt von der Leitsequenz, welche
die Target-mRNA erkennt und bindet, gefolgt von der katalytischen
Einheit des Ribozyms, gefolgt von der Sequenz, die 3' auf den 5'-Anteil des geschnittene
Target-mRNA-Moleküls
gespleißt
wird.
Die
Expression des Ribozyms ist bevorzugt unter die Kontrolle des SV40
Promotors gestellt.
Die
katalytische Einheit des Ribozyms ist bevorzugt aus einem Tetrahymena
thermophylia 26S rDNA Intron, bevorzugt T. hyperangularis (GenBank
X03106), T. sonneborni (GenBank X03108), T. cosmopolitanis, (GenBank
X03107), T. pigmentosa (GenBank V01412) besonders bevorzugt T. thermophylia
(GenBank V01416).
Die
Leitsequenz und die zu spleißende
Sequenz werden in Abhängigkeit
vom Target-mRNA-Molekül ausgewählt. Die
Leitsequenz geht der katalytischen Einheit des Ribozyms unmittelbar
3' voran und erkennt
die definierte Spleißstelle
in der Target-RNA durch Watson-Crick-Basenpaarung.
Das
Sense-Oligonukleotid des DNA-Fragment enthält den Sense-Anteil der Leitsequenz
gefolgt von den ersten 5 Nukleotiden der katalytischen Ribozym-Sequenz.
Das entgegengesetzte (reverse) komplementäre Oligonukleotid des DNA-Fragments
enthält
das 5 Nukleotidlange Komplement zu dem Überhang am Ende der Ribozym-Promotorsequenz
gefolgt von dem Antisense-Komplement zu der gewünschten Leitsequenz.
Die
Sequenz, die 3' auf
den geschnittenen 5'-Anteil
der Target-mRNA zu gespleißt
wird, ist abhängig von
dem Ort der Mutation, welche repariert werden muss. Da die trans-spleißende Aktivität des Ribozyms
den 3'-Bereich der
Target-mRNA austauscht, enthält
die Ribozymkassette die Nukleotide, welche den Nukleotidresten entsprechen,
in denen die Mutation erfolgte, und den Bereich des für die Target-mRNA
codierenden Gens, der in 3'-Richtung
von den Nukleotidresten, in denen die Mutation erfolgte, liegt bis
zu dem Ende des besagten Gens.
Die
Ribozymkassette ist bevorzugt als eine Einheit aufgebaut. Die aus
einer Einheit aufgebaute Ribozymkassette ieignet sich für eine weitere
Entwicklung als therapeutisches Agens zur Korrektur mutierter RNA.
Eine
bevorzugte Ribozymkassette zur Reparatur des mutierten Amyloid-Prekursor-Proteins
(βAPP) mRNA
ist Teil des Transferplasmids mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ_ID
No. 6 und der in 4 gezeigten
Plasmidkarte. Diese Ribozymkassette ist so konzipiert, dass sie
eine Serie von Mutationen in der für das Amyloid-Vorläufer (Precursor)-Protein
(βAPP) codierenden
mRNA repariert.
Bevorzugt
ist der L1-Loop der katalytischen Einheit des Ribozyms so verändert, dass
er ein entgegengesetztes (reverse) Komplement (hier die 6-Nukleotidsequenz
GGACAT) zu dem 5'-Abschnitt, bevorzugt
dem zweiten bis siebten Nukleotid, der zu spleißenden Sequenz (hier: ATGTCC)
besitzt. Dieser Lösungsansatz kann
angewandt werden, um jegliche mutierte Sequenz, die vom Genom des
Zellkerns codiert wird, auszutauschen. Das reverse Komplement ist
Teil der Leitsequenz (guide sequence) „GS".
Eine
bevorzugte, für
das Ribozym verwendete Leitsequenz (GS, welche die Amyloid-Precursor-Protein
(βAPP) mRNA
erkennt, welche sowohl von NGF-stimulierten PC12-Zellen und HEK293
exprimiert wird, ist GGTGGCGCTCCTCTGGGG. Diese GS dient als ein
Erkennungsbereich und Spleißstelle
für das
Ribozym. Das GS-DNA-Fragment ist zum Beispiel aus zwei Oligonukleotiden
GCTCGGTGGCGCTCCTCTGGGG und TAATCCCCAGAG-GAGCGCCACC zusammengesetzt. Ein Annealing
dieser beiden Oligonukleotide bringt ein DNA-Fragment hervor, welches
für die
anti-APP-ribozymale GS codiert und kompatibel ist zu dem 5'-Überhang des Ribozyms und dem
3'-Überhang
des CMV-Promotors. Auswechseln der Sequenz der GS erlaubt es, das Ribozym
praktisch an jegliche Target-mRNA anzupassen.
In
einer anderen Ausführungsform
der Erfindung enthält
die Ribozymkassette eine Füllsequenz
(„stuffer") anstelle der Leitsequenz
(guide sequence). Die Leitsequenz oder die Füllsequenz hat eine bevorzugte Länge von
5 bis 20 Nukleotiden, besonders bevorzugt eine Länge von 10 bis 16 Nukleotiden.
Die Füllsequenz ermöglicht es
dem Endanwender, eine Leitsequenz (guide sequence – GS) seiner
Wahl in die Ribozymkassette einzusetzen. Die Target-RNA und die Spleißstelle
innerhalb der Target-RNA werden durch die GS für das Ribozym festgelegt. Das
Transferplasmid mit einer Füllsequenz
anstelle der Leitsequenz ist somit ein vielseitiges Konstrukt, das
so angepasst werden kann, dass es die Target-RNA der Wahl berichtigt.
Die Füllsequenz ist
so konstruiert, dass sie ihren Austausch gegen eine Leitsequenz
erleichtert. Die Füllsequenz
enthält
eindeutige (nur einmal vorkommende) Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme
(restriction sites). Die Füllsequenz,
welche die Leitsequenz ersetzt, z. B. gcgcgccgaacctcgagtacgccggcg,
enthält
bevorzugt eine Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym Psrl.
Die Psrl Restriktionsstelle ([7/12]GAACNNNNNNTAC[12/7]) wird sowohl
einmal aufwärts
und einmal abwärts
von der Erkennungsstelle für
das Restriktionsenzym geschnitten, was in 5-Nukleotid-langen Überhängen resultiert.
Der
Endanwender ersetzt die Füllsequenz,
um ein Transferplasmid mit der Spezifität für eine Target-RNA der Wahl,
die zu reparieren oder zu editieren ist, zu erhalten. Die Füllsequenz wird
durch ein DNA-Fragment ersetzt, welches die Leitsequenz enthält. Diese
wird dabei aus zwei Oligonukleotiden zusammengesetzt, die bevorzugt
10 bis 20 Nukleotide, besonders bevorzugt 12 bis 16 Nukleotide,
lang sind.
In
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung ist die Ribozymkassette aufgebaut mit einer Sequenz,
die für
ein Markerprotein codiert und 3' auf
den geschnittenen 5'-Abschnitt
der Target-RNA gespleißt wird.
Bevorzugte Markerproteine sind das Enhanced Green Fluorescent Protein
(EGFP), die plazentare Alkalische Phosphatase (PLAP) oder human-codon-optimierte
Versionen der Nukleinsäuren,
die für
E. coli β-Galactosidase
oder E. coli Alkalische Phosphatase (ECAP) codieren. Diese Ribozymkassetten-Sequenzen
sind Teil der Transferplasmide pBR322dtVLV-ECAP, pBR322dtVLV-PLAP,
pBR322dtVLVt-βGal
und pBR322dtVLV-GFP (SEQ_ID No. 7 bis 10, 2 und 9 bis 11).
Die
Ribozymkassette, welche eine Füllsequenz,
anstelle der Leitsequenz und ein Markerprotein enthält, welches
auf die Target-RNA gespleißt
wird, kann dazu verwendet werden, eine Serie von Transferplasmiden
zu erstellen, die ein Markerprotein an ein endogenes Protein hybridisieren,
welches normal von der Zelle exprimiert wird. Diese Hybridproteine
eignen sich für
Transport- und Lokalisationsstudien.
Ein
Beispiel für
eine Ribozymkassette mit einer Füllsequenz
anstelle der Leitsequenz und einer Sequenz, die für das Markerprotein
GFP codiert, ist Bestandteil des Transferplasmids pBr322dtVLV-GFP
mit der Nukleinsäuresequenz
gemäß SEQ_ID
No. 10 und der in 11 gezeigten
Plasmidkarte.
In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist die Ribozymkassette aufgebaut mit einer Füllsequenz
anstelle der Leitsequenz und einer Klonierungsstelle anstelle der
Sequenz, die 3' auf
den geschnittenen 5'-Abschnitt
der Target-RNA gespleißt
wird.
Wenn
die Sequenz, die 3' auf
den geschnittenen 5'-Abschnitt
der Target-RNA gespleißt
wird, durch eine Klonierungsstelle ausgetauscht wird, enthält diese
Klonierungsstelle (z. B. aggtcctagtactcgagtacctgcaggg) bevorzugt
eine Erkennungsstelle für
das Restriktionsenzym Bael ((10/15]ACNNNNGTAYC[12/7]). Restriktionsverdau
mit Bael lässt
einen 5-Nukleotid-Überhang
an dem 3'-Ende der
katalytischen Sequenz des Ribozyms und einen 5'-Überhang
am 5'-Ende der U3-Sequenz.
Eine für
ein Markerprotein codierende Sequenz kann zwischen diesen beiden
Stellen inseriert werden.
Eine
Ribozymkassette mit einer Füllsequenz
(stuffer) anstelle der Leitsequenz (guide sequence) und einer Klonierungsstelle
anstelle der Sequenz, die 3' auf
den geschnittenen 5'-Abschnitt der Target-RNA
gespleißt
wird, ist ein vielseitiges Konstrukt, das prinzipiell so angepasst
werden kann, dass es jede Target-RNA, die von Interesse ist, spezifisch
schneidet und spleißt.
Ein
Beispiel für
eine Ribozymkassette mit einer Füllsequenz
anstelle der Leitsequenz und einer Klonierungsstelle anstelle der
Sequenz, die auf die Target-RNA gespleißt wird, ist in dem Transferplasmid pBR322dtVLV-PsrBae
mit der Nukleinsäuresequenz
gemäß SEQ ID
No. 5 (12) enthalten.
Das
Transferplasmid enthält
weiter Cis-acting Elemente (cis acting elements), die für die Reverse Transkription
des Plasmidgenoms benötigt
werden und ein kompetentes Verpackungssignal. Cis-acting Elemente
sind RNA-Bereiche, die als RNA eine funktionale Rolle bei der Prozessierung
des Plasmids oder der Kassette, in der sie enthalten sind, spielen.
Das
Transferplasmid enthält
bevorzugt die wichtigsten Cis-acting Elemente, die für das Verpacken (packaging)
des viralen Genoms in das Virion verantwortlich sind. Diese sind
im Wildtyp-Visnavirus und im Transferplasmid 3' von gag und in der p16-Region von gag
lokalisiert. In dem Transferplasmid der Erfindung wurde gag inaktiviert,
indem das Startcodon entfernt wurde (SEQ_ID No. 16) und indem es
hinter der zu p16 homologen Region trunkiert wurde, um D-p16 zu
erhalten (SEQ_ID No. 17). Diese Verfahrensweise inaktiviert gag
und lässt
die Cis-acting Elmente intakt.
Während die
wichtigsten Abschnitte der RNA-Elemente, die verantwortlich für die Interaktion
mit den Verpackungsproteinen (packaging proteins) des Virions sind,
in der gag-Leader-Sequenz
Gag-L und in D-p16 lokalisiert sind, sind sie nicht ausschließlich auf
diese Positionen beschränkt.
Daher enthält
das Transferplasmid bevorzugt weitere Cis-acting Elemente ausgewählt aus:
- 1. dem Rev response element (RRE, SEQ_ID No.
21) des Wildtyp-Visnavirus,
- 2. der primer-binding site des Wildtyp-Visnavirus,
- 3. den LTRs des Wildtyp-Visnavirus,
- 4. dem Polypurinabschnitt (poly purine tract) des Wildtyp-Visnavirus
und seinem Komplement,
- 5. der zentralen Terminationssequenz (termination sequence)
des Wildtyp-Visnavirus,
- 6. inaktivierten Sequenzen von VLV tat (D-tat, SEQ_ID No. 18),
VLV rev (D-rev, SEQ_ID No. 19) und VLV env (D-env, SEQ_ID No. 20),
die nicht für
funktionale Proteine codieren, da die Startcodons entfernt sind.
Die
Cis-acting Elemente werden bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe der Nukleotidsequenzen
gemäß SEQ_ID
No. 16 bis 21.
Das
kompetente Verpackungssignal (packaging signal) im Transferplasmid
umfasst RNA-Elemente, die
ausreichend sind, um die Verpackung (packaging) des RNA-Moleküls in ein
Virion zu induzieren. Das kompetente Verpackungssignal ist dabei
selbst ein Teil des zu verpackenden RNA-Moleküls und in dem gag-leader (Gag-L)
und in der inaktivierten p16 (D-p16)
Sequenz des Transferplasmids enthalten.
Alle
anderen Plasmide (alle außer
dem Transferplasmid) haben kein kompetentes Verpackungssignal. Das
wird bevorzugt erreicht, indem das Verpackungssignal bei der Konstruktion
der künstlichen
Sequenzen weggelassen wird.
Das
Transferplasmid, welches Cis-acting Elemente enthält, codiert
nicht für
funktionale Proteine des VLV. Der Mangel an funktionalen Proteinen
im Transferplasmid und die fehlende Homologie mit den Plasmiden,
welche die funktionalen Proteine enthalten, beseitigen das Risiko,
dass aus dem Gentransferkonstrukt ein rekombinantes, zur Replikation
fähiges
Virus hervorgehen könnte.
Bevorzugte
Transferplasmide haben die Sequenzen gemäß SEQ_ID No. 5 bis 10.
Um
die Cis-acting Elemente aus dem erfindungsgemäßen Gag-Plasmid zu entfernen,
wurde der Bereich 3' von
gag entfernt. Im erfindungsgemäßen Gag-Plasmid
wurden die Cis-acting Elementein gag durch maximale Änderung
der Codon-Usage zerstört.
Die Expression von Gag im erfindungsgemäßen Gag-Plasmid ist bevorzugt
unter dem CMV-Promotor. Das Gag-Plasmid
enthält
somit kein funktionales Verpackungssignal und ist nicht in der Lage,
mit der inaktivierten gag-Sequenz auf dem Transferplasmid zu rekombinieren.
In
dem erfindungsgemäßen rekombinanten
lentiviralen Gentransfersystem wurde das Gen, welches für das Visnavirus-Hüllprotein
(envelope protein) codiert, inaktiviert, indem das Startcodon weggelassen
wurde, um D-env zu erhalten. Der Wildtyp env ORF enthält die rev1
und rev2 ORFs und RRE. Eine veränderte Form
von rev ist in dem VTR-Plasmid enthalten. Um den Zelltropismus des
Gentransferkonstrukts auszuweiten, ist in der Erfindung das Gen
für das
Visnavirus-Hüllprotein
ersetzt durch ein Gen, welches für
ein Hüllprotein
(envelope protein) von einem anderen Virus codiert. Das Verfahren,
die Gentransferkonstrukte mit einem Hüllprotein zu umhüllen, welches
von dem Wildtypvirus abweicht, nennt man Pseudotyping. Bevorzugte
Hüllproteine
sind: Ebola-Envelope (GenBank U31033), gp64-Envelope-Glykoprotein des
Bakulovirus (GenBank AF190124), Influenzavirus A-Haemagglutinin
(Gen-Bank, Z46395),
Jaagsiekte sheep retrovirus (JSRV) Envelope (GenBank Y18303), Lymphocytic
Choriomeningitis Virus (LCMV) Glykoprotein (LCMV-GP, GenBank AF186080),
Mokolavirus Envelope Glykoprotein (MK-G, GenBank S59448), Amphotropic
Murine Leukemia Virus (MuLV) Amphotropic envelope (4070A-Env, Genbank
M33469), Rabiesvirus-Envelope-Glykoprotein
(GenBank AB110669), RD114-Retrovirus-Envelope (RD114-Env; GenBank
X87829). Ein besonders bevorzugtes Hüllprotein ist das Vesikular
Stomatitis-Virus-Envelope-Glykoprotein
(VSVG; GenBank V01214).
Die
für das
Hüllprotein
(envelope protein – Env)
codierende Sequenz ist bevorzugt auf einem weiteren Plasmid (e)
lokalisiert, welches nicht für
VLV-Proteine codiert und kein kompetentes Verpackungssignal enthält. Dieses
Plasmid wird nachfolgend als „Env-Plasmid" bezeichnet. Ein
bevorzugtes Env-Plasmid pBR322dtVSVG codiert für das Vesikular Stomatitis-Virus-Envelope-Glykoprotein
(VSVG) und hat die Sequenz gemäß SEQ_ID
No. 4 (siehe 8 für die Plasmidkarte).
Alle
Plasmide, außer
das Transferplasmid, enthalten bevorzugt ein bekanntes Polyadenylierungssignal
(polyadenylation site), bevorzugt vom bovinen Wachstumshormon.
Um
das Risiko einer heterologen Rekombination mit natürlich vorkommenden
Viren oder dem Transferplasmid weiter zu minimalisieren, sind die
für die
funktionalen Proteine (Gag, Pol, Vif, Rev und Tat) des Visnavirus
codierenden Gene, die erfindungsgemäß eingesetzt werden, im Vergleich
zu den Wildtypsequenzen, die natürlicherweise
im Visnavirus vorkommen, verändert.
Die Gene sind bevorzugt aus synthetischen, nicht in der Natur vorkommenden
Nukleinsäuresequenzen
aufgebaut. Im Vergleich zu den natürlich vorkommenden Genen sind
die Gene auf der Nukleinsäureebene
so verändert,
dass sie so stark wie möglich
auf der Nukleinsäureebene
abweichen, jedoch noch für
die gleichen Proteine codieren. Gleichzeitig sind die DNA-Sequenzen für die Translation
in humanen Zellen optimiert.
Diese
Veränderung
wird erreicht, indem andere Codons gebraucht werden, als die von
den Wildtyp-Virusgenen verwendet werden. Die Codons werden substituiert
durch Codons, die noch für
die selben Aminosäurereste
stehen, aber in so vielen Basen wie möglich abweichen. Von den möglichen
alternativen Codons wird das ausgewählt, das am häufigsten
in humanen Zellen verwendet wird und sich von dem im Wildtyp verwendeten
Codon unterscheidet. Diese Veränderung
resultiert bevorzugt in einer Homologie zwischen den synthetischen
Genen und dem Wildtyp, die niedriger als 65 %, bevorzugt 61 %, ist.
Die erfindungsgemäße Veränderung
von im Mittel jedem dritten Nukleotid führt vorteilhaft zu der Zerstörung der
Cis-acting inhibitorischen Sequenzen und auch der Zerstörung des
Verpackungssignals im Gag-codierenden Bereich.
Die
Homologie zwischen dem Transferplasmid und den VTR, Gag und Pol
Plasmiden ist weiter reduziert, da der größte Teil des Gag-codierenden
Bereichs und der komplette Pol-codierende
Bereich aus dem Transferplasmid entfernt wurde. Durch diese Strategie
wird die Frequenz von Rekombinationen vorteilhaft über hundertfach
reduziert.
Die
veränderten
Gene sind bevorzugt aus synthetischen Oligonukleotiden mit Längen zwischen
40 bis 80 Nukleotiden zusammengebaut, die durch PCR und aufeinanderfolgende
Ligierungen (ligations) und enzymatische Verdaus (digestion) zusammengesetzt
sind. Diese Verfahrensweise hat drei Vorteile: Erstens ermöglicht der
Zusammenbau aus kleineren Fragmenten beim Erstellen der Derivate,
eine größere Vielfalt
von Restriktionsschnittstellen zu gebrauchen. Zweitens ermöglicht das
Weglassen eines einzelnen Fragments von dem fertiggestellten Plasmid
auf einfache Weise, den Anteil des Transferplasmid, der vom Virus
abgeleitet ist, zu reduzieren. Drittens basierte die Konstruktion
des Virus auf einer Konsensussequenz anstelle eines charakterisierten
Wildtypvirus. Diese Konstruktionsstrategie erlaubt es, die Genauigkeit
des Sequenz besser zu kontrollieren, als eine RT-PCR eines Wildtypvirus.
Das
Gen, welches für
das Gag Polyprotein codiert, hat bevorzugt eine Nukleinsäuresequenz
gemäß SEQ_ID
No. 11.
Das
Gen, welches für
das Pol Polyprotein codiert, hat bevorzugt eine Nukleinsäuresequenz
gemäß SEQ_ID
No. 12.
Die
Gene, welche für
Vif, Rev und Tat codieren, haben bevorzugt Nukleinsäuresequenzen
gemäß SEQ_ID
No. 13 bis 15.
In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung enthält
das rekombinante lentivirale Gentransfersystem:
- a.)
ein Gag-Plasmid enthaltend eine künstliche Nukleinsäuresequenz
codierend für
VLV-Gag, bevorzugt gemäß SEQ_ID
No. 11 und bevorzugt unter der Kontrolle des CMV-Promotors, und ein Polyadenylierungssignal,
bevorzugt vom bovinen Wachstumshormon, wobei dieses Plasmid kein
kompetentes Verpackungssignal enthält;
- b.) ein Transferplasmid – enthaltend
eine VLV-Nukleinsäuresequenz
beinhaltend Cis-acting
Elemente (cis-acting sequence elements) benötigt für die reverse Tanskription
des Plasmidgenoms, wobei besagter Vektor enthält:
(i) den Gag-Leader
(Gag-L) und inaktivierte Sequenzen von gag p16 (D-p16), beinhaltend
ein kompetentes Verpackungssignal (competent packaging signal) und
die Cis-acting Elemente
D-tat, D-rev und D-env, welche nicht für funktionale Proteine codieren,
da die Start-Codons entfernt sind, und ein kompetentes Rev-response
element (RRE);
(ii) eine Ribozymkassette enthaltend entweder
eine Leitsequenz (guide sequence) mit einer Länge von 10 bis 20 Nukleotiden
oder eine Füllsequenz
(stuffer) flankiert von Restriktionsstellen, bevorzugt Psrl Restriktionsstellen,
die katalytische Domain eines Gruppe I Introns, bevorzugt ein Tetrahymena
26S rDNA Intron, und entweder eine Nukleinsäure codierend für das korrekte
Gegenstück
der zu reparierenden Target-RNA, welches
auf die geschnittene Target-RNA gespleißt wird oder eine Klonierungsstelle
flankiert von Restriktionsstellen, bevorzugt Bael-Restriktionsstellen,
wobei die Ribozymkassette bevorzugt unter der Kontrolle des SV40-Promotors
ist;
- c.) ein Pol-Plasmid enthaltend eine künstliche Nukleinsäuresequenz
codierend für
VLV-Pol, bevorzugt
gemäß SEQ_ID
No. 12 und bevorzugt unter der Kontrolle des SV40-Promotors, und ein
Polyadenylierungssignal, bevorzugt vom bovinen Wachstumshormon,
wobei dieses Plasmid kein kompetentes Verpackungssignal enthält;
- d.) ein VTR-Plasmid enthaltend künstliche Nukleinsäuresequenzen
codierend für
VLV-Vif, Rev und
Tat, bevorzugt gemäß SEQ_ID
No. 13 bis 15 und bevorzugt unter der Kontrolle des SV40-Promotors,
und ein Polyadenylierungssignal, bevorzugt vom bovinen Wachstumshormon,
wobei dieses Plasmid kein kompetentes Verpackungssignal enthält;
- e.) ein Env-Plasmid enthaltend eine künstliche Nukleinsäuresequenz
codierend für
ein (i) virales Hüllprotein,
welches nicht vom Visnavirus ist, bevorzugt das Vesicular Stomatitis
Virus Envelope Glykoprotein (VSVG) und ein Polyadenylierungssignal,
bevorzugt vom bovinen Wachstumshormon, wobei dieses Plasmid kein
kompetentes Verpackungssignal enthält.
Ein
besonders bevorzugtes Gag-Plasmid ist pBr322dtVLVgag mit der Nukleinsäuresequenz
gemäß SEQ_ID
No. 1. Dieses Plasmid enthält
die für
Gag codierende Sequenz gemäß SEQ_ID
No. 11.
Ein
besonders bevorzugtes Pol-Plasmid ist pBr322dtVLVpol mit der Nukleinsäuresequenz
gemäß SEQ_ID
No. 2. Dieses Plasmid enthält
die für
Pol codierende Sequenz gemäß SEQ ID
No. 12.
Ein
besonders bevorzugtes VTR-Plasmid ist pBr322dtVLV-VTR, mit der Nukleinsäuresequenz
gemäß SEQ_ID
No. 3. Dieses Plasmid enthält
die für
Vif, Rev und Tat codierenden Sequenzen gemäß SEQ_ID No. 13 bis 15.
In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung enthält
das rekombinante lentivirale Gentransfersystem:
- a.)
das Gag-Plasmid pBr322dtVLVgag mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ_ID
No. 1,
- b.) ein Transferplasmid mit einer Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus
pBR322dtVLVt-βGal, pBR322dtVLVdAPP,
pBR322dtVLV-ECAP, pBR322dtVLV-PLAP, pBR322dtVLV-GFP, pBR322dtVLV-PsrBae
mit den Nukleinsäuresequenzen
gemäß SED_ID
No 5 bis 10,
- c.) das Pol-Plasmid pBr322dtVLVpol mit der Nukleinsäuresequenz
gemäß to SEQ_ID
No. 2,
- d.) das VTR-Plasmid pBr322dtVLV-VTR mit der Nukleinsäuresequenz
gemäß SEQ_ID
No. 3,
- e.) das Env-Plasmid pBr322dtVSVG mit der Nukleinsäuresequenz
gemäß SEQ_ID
No. 4.
Nach
der Transduktion des rekombinanten leintiviralen Gentransfersystems
in Zellen, werden die Zellen replikationsdefiziente Lentivirus-Partikel
produzieren.
Ein
zweiter Bestandteil der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung
von replikationsdefizienten Visnavirus-Partikeln, beinhaltend die
Transfektion einer Verpackungszelllinie (producer cells) mit dem
oben beschriebenen erfindungsgemäßen Gentransfersystem
Die
Transfektion von Verpackungszelllinien (producer cells) wird mit
Standardmethoden der Molekularbiologie, z. B. der Calciumphosphat-Copräzipitation,
durchgeführt.
Bevorzugte
Zellen für
die Virusproduktion sind die Zelllinien 293 (ATCC # CRL-1573) oder
293T (ATCC # CRL-11268) oder 293ts/A1609 (DuBridge et al., 1987,
Mol Cell Biol. 7: 379–387).
Um
einen lentiviralen Vorrat (lentiviral stock) zu erzeugen, kultiviert
man die Verpackungszelllinie (producer cells) unter Zellkulturbedingungen,
die ausreichend sind, um die Produktion von replikationsdefizienten lentiviralen
Partikeln in der Zelllinie zu erlauben. Die replikationsdefizienten
Lentivirus-Partikel werden dann von den Verpackungszellen (producer
cells) kollektiert.
Die
Visnavirus-Partikel, die nach einem erfindungsgemäßen Verfahren
erhalten werden und ihre Verwendung für die Ribozym-vermittelten
Reparatur einer mutierten Gensequenz in eukanotischen Zellen sind auch
Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Ein
weiterer Bestandteil der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren
für die
Ribozymvermittelte Reparatur einer mutierten Target-RNA in eukarotischen
Zellen, mit den Schritten:
- a.) Klonierung eines
heterologen Gens oder eines Genabschnittes, welcher für das wiederherzustellende korrekte
Gegenstück
(z. B. die Wildtyp-cDNA-Sequenz der mutierten Target-RNA) codiert
und welches dem Abschnitt der mutierten Target-RNA entspricht, welcher
ausgetauscht werden muss, in die Klonierungsstelle des Transferplasmids,
- b.) Transfektion einer Verpackungszelllinie (producer cells)
mit dem so erhaltenen Transferplasmid und den weiteren Plasmiden
des erfindungsgemäßen Gentransfersystems;
- c.) Wachstum der Verpackungszellen (producer cells) unter Zellkulturbedingungen,
die ausreichend sind, um die Produktion von replikationsdefizienten
lentiviralen Partikeln in der Zelle zu erlauben, und Sammeln der
replikations-defizienten Lentivirus-Partikel von den Verpackungszellen
(producer cells).
- d.) Infektion von eukanotischen Zellen mit den replikations-defizienten
Visnavirus-Partikeln.
Vor
der Infektion der eukanotischen Zellen werden die replikations-defizienten
Visnavirus-Partikel
sterilisiert und Zellreste (cellular debris) entfernt, bevorzugt
mittels Filtration durch Filter mit einer Porengröße von 0,22 μm. Bevorzugt
werden die Visnavirus-Partikel anschließend konzentriert und Makromoleküle entfernt,
bevorzugt mit 0,1 μm
Filtern.
Für die Infektion
werden die replikations-defizienten Visnavirus-Partikel bevorzugt
in Phosphatpuffer (phosphate buffered saline) resuspendiert.
Durch
die Infektion von eukaryotischen Zellen entweder in Zellkultur oder
durch Verabreichung der replikations-defizienten Visnavirus-Partikel
mittels in vivo-Injektion wird das Ribozym in die Zelle eingebracht
und die Ribozym-vermittelte Reparatur initiiert.
Die
Effizienz der Infektion und der Ribozym-vermittelten Reparatur kann
kontrolliert werden, indem ein Markergen (wie GFP) in das Transferplasmid
eingefügt
wird. In vielen Fällen
ist die Gegenwart eines Markergens jedoch nicht erwünscht, insbesondere
in therapeutischen Ansätzen
der Ribozym-vermittelten Reparatur. In diesen Fällen wird deshalb die Effizienz
der Infektion und der Ribozym-vermittelten Reparatur durch spezifische
Messung der reparierten RNA ermittelt. Dies wird bevorzugt erreicht,
indem mRNA von dem infizierten Gewebe oder der Zellkultur extrahiert
wird und eine RT-PCR durchgeführt
wird mit Primern spezifisch für
die 5'-Target-RNA
und die heterologe Nukleinsäure,
die 3' auf die geschnittene
Target-RNA gespleißt
wurde. Erhält
man ein RT-PCR-DNA-Produkts, belegt dies eine erfolgreiche Ribozym-vermittelte
Reparatur.
Die
folgenden Beispiele sollen die Erfindung nur erläutern und sind dazu bestimmt
einen Fachmann in die Lage zu versetzen die Erfindung auszuüben. Sie
sollen den Schutzumfang der Erfindung, wie sie in den Ansprüchen definiert
ist, nicht einschränken.
1 zeigt eine Plasmidkarte
des Plasmids pBR322Lnk1, ein Ausgangsplasmid für die Transferplasmide des
lentiviralen Gentransferkonstrukt-Expressionsystems.
pBR322Lnk1
wurde ausgehend von dem Klonierungsplasmid pBR322 durch Entfernen
des Tetracyclin-Resistenzgens (tet) zwischen der Styl- und der Hindill-Restriktionsstelle
erstellt. Ein synthetischer Linker (Lnk1) wurde anstelle der entfernten
Sequenz eingefügt.
Dieser Linker Lnk1 enthält
eine Swal-blunt-end-Restriktionsstelle, in welche ein PCR-Produkt
einkloniert werden kann. Zwei Aarl-Restriktionsstelle flankieren
die Swal-Erkennungs- und Restriktionsstelle. Die Aarl-Erkennungsstellen
sind so platziert, dass die zugehörigen Restriktionsstellen an
die Enden des DNA-Fragments fallen, das in die Swal-Site kloniert
wird. Ein nachfolgender Verdau des Derivats, welches durch die Ligierung
in die Swal-Site gebildet wird, setzt ein DNA-Fragment frei, welches
von der eingefügten
Sequenz abgeleitet ist und in dem die vier Basenpaare an den Enden
in 4 Rasenpaar-lange 5'-Überhänge konvertiert
sind.
Dieses
Sticky-End-DNA-Fragment wird verwendet, um die Plasmide der vorliegenden
Erfindung aufzubauen.
Das
Plasmid pBR322Lnk1 enthält
weiter die Sequenzen des ursprünglichen
pBR322, welche erforderlich für
die Replikation, Transkription und Translation des Plasmides sind:
zwei Promotoren (P1 P, P3 P), als Ribosom-Bindungsteile (ribosome
binding site – RBS)
wirkende Shine-Dalgarno-Sequenzen (SD SEQ), das Ampicillin-Resistenzgen
(β-lactamase)
APr, eine L-Strand und eine H-Strand-Y-Effector
Site (L Y EFF und N Y EFF), ein Origin of replication (ORI) und
ein für
das ROP-Protein codierendes Gen.
Um
pBR322Lnk1 zu erhalten, wird das Klonierungsplasmid pBR322 (ATCC
37017) mit den Restriktionsenzymen Hindill (New England Biolabs)
und Styl (New England Biolabs) verdaut. Zur Durchführung des Doppelverdaus
werden 1 μg
pBR322 DNA, 1.5 μl
Styl und 1 μl
HindIII und 1 μl
BSA zu 50 NEB-Puffer 3 in ein 500 μl Reaktionsgefäß gegeben.
Die Mischung wird in einem Thermomixer (Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Deutschland)
bei 37 °C
und 300 rpm für
1 Stunde inkubiert. Dieser Verdau schneidet das Tetracyclin-Resistenzgen
heraus. Durch den Verdau erhält
man zwei Fragmente: das Styl-HindIII-Fragment (1370-29) mit 3021 bp-Länge und das HindIII-Styl-Fragment
(30-1369) mit 1340 bp-Länge.
Diese Fragmente werden mittels Elektrophorese in Agarose aufgetrennt.
Das größere DNA-Fragment
wird aus dem Elektrophoresegel herausgeschnitten, die DNA extrahiert
und in drei Aliquots aufgeteilt.
Um
den Linker Lnk1 zu erhalten, wird das Oligonukleotid Lnk1 s (agcttcacctgcatttaaatgcaggtgc)
mit einem weiteren Oligonukleotid (Lnk1rc; caaggcacctgcatttaaatgcaggtga)
annealiert und phosphonliert (5' mit der
T4-Polynucleotid-Kinase; NEB, M0201). Lnk1 wird in das pBR322 Styl-HindIII-Fragment
ligiert. Das resultierende Plasmid wird pBR322Lnk1 genannt. pBR322Lnk1
wird in E. Coli transformiert, das Plasmid über Nacht expandiert und dann
extrahiert.
2 zeigt eine Plasmidkarte
von pBR322dtVLVt-βGal,
ein Beispiel für
das erfindungsgemäße auf VLV
basierende Transferplasmid, welches das Transkript des Reportergens
E. coli β-Galaktosidase-Gen
3' in eine Target-mRNA
spleißt.
pBR322dtVLVt-βGal enthält eine
Ribozymkassette bezeichnet mit "ribozyme" und eine Füllsequenz (stuffer)
bezeichnet mit "sPsrl". Die Füllsequenz "sPsrl" kann durch eine
Ribozym-Leitsequenz
(guide-sequence), welche eine spezifizierte Target-mRNA erkennt,
ersetzt werden. Die codierende Sequenz, die durch das Ribozym 3' aufgespleißt wird,
ist hier das für
die E. coli β-Galaktosidase
(βGal) odierende
Reportergen „LacZ", in welchem die
Codon-Usage zur optimalen humanen Form verändert ist. Die Ribozymkassette
ist unter der Kontrolle des SV40-Promotors. Das Ribozym entspricht
der katalytischen Domain des 26S rDNA-Introns von T. thermophylia
(GenBank V01416).
Um
die reverse Transkription, das Verpacken und die Integration des
Genoms zu ermöglichen,
enthält das
Transferplasmid Cis-acting Elmente (cis acting elements) des VLV,
die in den Nukleinsäuresequenzen
bezeichnet mit "Gag-L", "pbs", "D-env", "D-rev, "D-tat", "D-p16" enthalten sind.
Diese Sequenzen codieren nicht für
funktionelle Proteine, da die Start-Codons (die jeweils für das erste
Methionin codieren) entfernt sind.
Der
Gag-Leader "Gag-L" und die inaktivierte
p16-Sequenz "D-p16" enthalten auch ein
kompetentes Verpackungssignal (competent packaging signal).
Das
Transferplasmid pBR322dtVLVt-βGal
enthält
weiter ein Rev-response element (RRE), das verantwortlich für den Export
der Virion-mRNA aus dem Nukleus der Wirtszelle ist, und eine als
Ribosomen-Bindungsteile (ribosome binding site – RBS) wirkende Shine-Dalgarno-Sequenz (SD SE).
Das
RRE wird für
den Export der viralen RNA aus dem Nukleus der Verpackungszelle
(producer cell) benötigt
und wirkt durch die Interaktion mit Rev. REV2-L ist die Nukleinsäuresequenz,
die das RRE enthält. Empirische
Ergebnisse zeigen, dass die Sequenz rev 2 notwendig für die Funktion
des GTC ist. U5 und R5 sind notwendige Elemente des 5'-LTR, während U3
die untranslatierte Leader-Sequenz des 3'-LTRs ist. Die Nukleinsäuresequenz
von pBR322dtVLVt-βGal
ist in SEQ_ID No. 9 aufgeführt.
Um
pBR322dtVLVt-βGal
zu erhalten, wird das Plasmid pBR322Lnk1 mit dem Restriktionsenzym
SwaI (New England Biolabs) verdaut. Durch diesen Verdau erhält man ein
lineares blunt-end-Plasmid. Das verdaute Plasmid wird mit Alkalischer
Phosphatase aus dem Kalbdarm (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase – CIP, New England
Biolabs) dephoshoryliert und auf einem Agarosegel gereinigt.
Die
für die
Ribozymkassette codierende DNA und die Cis-acting Elemente (cis
acting elements) werden aus synthetischen Oligonukleotiden zusammengebaut,
welche zu vier DNA-Fragmenten
zusammengefügt
werden: U5-p16, tat-RRE, R2L-LacZ und U3-R3. Ein Schema für die Konstruktion
des Plasmids pBR322dtVLVt-βGal
wird in 3 gezeigt. Zusammengefasst
wird pBR322dtVLVt-βGal
durch Zusammenbau der Fragmente U5-p16, tat-RRE, R2L- LacZ und U3-R3 zu
dem Fragment "VLV-LacZ" und Klonierung von "VLV-LacZ" in den verdauten
pBR322Lnk1 erhalten.
Das
U5-p16-Fragment enthält
die Primerbindungstelle (primer binding site – pbs), die long terminal repeats
R5 und U5 des VLV, den Gag-Leader (Gag-L, SEQ ID NO. 16) und den
inaktivierten p16-Bereich von gag ("D-p16", SEQ ID NO. 17). Das tat-RRE-Fragment
enthält
die inaktivierten Sequenzen "D-env" (SEQ ID NO. 20), "D-rev" (SEQ ID NO. 19), "D-tat" (SEQ ID NO. 18)
und die Sequenzen RRE (SEQ ID NO. 21 ), Rev2-L und rev2. Das R2L-LacZ-Fragment enthält die Ribozymkassette,
einschließlich
der PsRI-Füllsequenz
(sPsRI), dem SV40-Promotor und dem für βGal (LacZ) codierenden Gen.
Das U3-R3-Fragment enthält
die U3'- und R3-Abschnitte
des VLV einschließlich
dem 3' LTR.
Diese
DNA-Fragmente U5-p16, tat-RRE, R2L-LacZ und U3-R3 wurden aus DNA-Fragmenten
mit 44 bis 73 Basenpaaren zusammengefügt, die wiederum mittels PCR
von Paaren chemisch synthetisierter Einfach-Strang-DNA-Oligonukleotide
(Sigma-Genosys Ltd., Cambridge CB2 4EF, UK) generiert wurden. Bei
der PCR agierten die Oligonukleotide sowohl als Primer als auch
als Templates. Das 3'-Oligonukleotid
entsprach in der Länge
der Hälfte
des Fragments plus 12 Basen. Das 5'-Oligonukleotid entsprach 4 Basen des
3'-folgenden Fragments,
plus der Hälfte
des besagten Fragments plus 10 Basen. Die PCR verlängert die
Oligonukleotide, sowohl Sense- und Antisense-, zur vollen Länge des
DNA-Fragments. Jedes DNA-Fragment,
welches so zusammengebaut wurde, überlappt mit dem folgenden
DNA-Fragment um 4 Basen. Die Überlappung
wurde so gestaltet, dass die folgende Ligierung die Fragmente zu
dem vollständigen
Plasmid zusammenfügt.
Die
PCR wird in einem sterilen, Nuklease-freien 0,5 ml PCR-Gefäß in einem
Thermocycler (MultiCycler PTC 200, Biozym Diagnostik GmbH, Hessisch
Oldendorf, Deutschland), der auf 95°C vorgeheizt wurde, unter folgenden
Bedingungen durchgeführt: PCR-Reaktionsgemisch:
PCR
Thermocycler-Bedingungen:
Die
PCR ergibt Fragmente mit Längen
von 67 bis 123 by (abhängig
von der Länge
der in der PCR eingesetzten Oligonukleotide), die aus der Reaktionsmischung
durch Agarosegel-Elekrophorese
auf einem 2 % Gel (61-3112 Certified Low-Malt agarose, Bio-Rad Laboratories
GmbH, München,
Deutschland) in einer Sub-Cell Model 192 Cell exakt nach den Herstellerangaben
(Sub-Cell® Model
96 and Model 192 Agarose Gel Electrophoresis Systems Instruction
Manual, Bio-rad) aufgetrennt werden.
Die
Bande, welche das DNA-Fragment enthält, wird ausgeschnitten und
die DNA aus dem Gel gemäß den Herstellerangaben
extrahiert (QIAquick PCR purificationigel extraction kit, Qiagen,
Hilden, Deutschland). Das DNA-Fragment wird in pBR322Lnk1 durch
eine Blunt-end-Ligierung
in die Swal-Site eingefügt.
Das so erhaltene Plasmid wird in kompetente E. coli exakt nach den
Herstellerangaben transformiert (One Shot® TOP10 Chemically
Competent E. coli, Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Deutschland). Das
Plasmid wird über
Nacht expandiert und mit einem Mini-Prep-Kit extrahiert (Qiagen).
Alle
anderen PCRs, Plasmid-Vervielfältigungen
(plasmid expansions) und Extraktionen werden genauso ausgeführt, wenn
nicht anders erwähnt.
Die
Plasmid-DNA wird mit BfuAl (New England Biolabs GmbH, Frankfurt
am Main, Deutschland) für
2 h bei 37 °C
verdaut. Das Fragment, welches dem ligierten PCR-Produkt entspricht,
wurde aus einem Agarosegel nach einer Elektrophorese aufgereinigt.
Die
DNA-Fragmente U5-p16, tat-RRE, R2L-LacZ und U3-R3 werden auf diese
Weise durch mehrere aufeinanderfolgende Runden des Schneidens mit
dem Restriktionsenzym BfuAl und Religierung zusammengebaut.
Der
SV40 Early-Promoter wird aus dem Plasmid pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO (Invitrogen)
durch PCR-Amplifizierung der für
den Promotor codierenden Sequenz mit den Primern CTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGT
und CTATTGGTTTAAAGACTAGCTACCAGGTGCAT mit den oben beschriebenen PCR-Bedingungen erhalten.
Um
pBR322dtVLVt-βGal
zu erhalten, werden die DNA-Fragmente U5-p16, tat-RRE, R2L-LacZ und U3-R3, der
SV40 Early Promoter in pBR322Lnk1 in die Swal Site ligiert
4 zeigt eine Plasmidkarte
von pBR322dtVLVdAPP, ein zweites Beispiel des erfindungsgemäßen auf
VLV basierenden Transferplasmids. Das Plasmid pBR322dtVLVdAPP ist
ein Transferplasmid, welches so konzipiert ist, dass es mutiertes βAPP repariert.
Die
Ribozymkassette enthält
hier eine Leitsequenz "GS" (guide sequence),
welche komplementär
zu der Targetsequenz in der βAPP-mRNA
und der βAPP-prä-mRNA ist,
die katalytische Domäne
des 26S-rDNA-Intron-Ribozyms von Tetrahymena thermophylia und eine
Sequenz, die für
die homologe, nicht-mutierte Sequenz des 3'-Berichs von APP (Nukleotide 1168 bis
2266) codiert.
Die
Leitsequenz "GS" erkennt die Targets βAPP-mRNA
und die βAPP-prä-mRNA. Das
Ribozym ist dazu befähigt,
die Sequenz, welche durch den 3'-Bereich
der Ribozymkassette codiert wird (und für die homologe, nicht-mutierte
Sequenz codiert), auf die geschnittene Traget-RNA zu spleißen.
Die
Nukleinsäuresequenz
von pBR322dtVLVdAPP ist in SEQ_ID No. 6 aufgeführt.
Die
Herstellung von pBR322dtVLVdAPP verläuft wie die von pBR322dtVLVt-βGal (s. 2), außer, dass die für den 3'-Bereich von APP
codierende Sequenz anstelle der von LacZ und die Leitsequenz "GS" anstelle der Füllsequenz
sPSRI eingefügt
wird.
Die
Leitsequenz (GS), welche für
das Ribozym verwendet wird, das das sowohl von NGF stimulierten PC
12 und HEK293 Zellen exprimierte Amyloid Precursor Protein (APP)
erkennt, ist GGTCCTCGGTCGGCAGCA. Diese GS dient als Erkennungs-
und Spleißstelle
für das
Ribozym. Das GS-DNA-Fragment wird aus zwei Oligonukleotiden aufgebaut:
GCTCGGTCCTCGGTCGGCAGCA und TAATTGCTGCCGACCGAGGACT. Durch Annealing
dieser beiden Oligonukleotide erhält man ein DNA-Fragment, welches
für die
anti-APP ribozymale Leitsequenz (GS) codiert, die kompatibel zu
dem 5'-Überhang
des Ribozyms und dem 3'Überhang
des SV40-Promotors ist. Durch Veränderung dieser GS-Sequenz kann
das Ribozym an nahezu jede Target-RNA angepasst werden.
5 zeigt eine Plasmidkarte
von pBR322dtVLVgag, ein Beispiel für ein Gag-Plasmid, welches
für das
Polyprotein Gag des Visna-Lentivirus (VLV) codiert.
Das
Plasmid pBR322dtVLVgag enthält
eine Expressionskassette für
die Produktion des Polyproteins VLV-Gag (welches die Proteine p16,
p25 und p14 umfasst). Die für
VLV-Gag codierende Sequenz ist komplett artifiziell. Die Codon-Usage
der für
VLV-Gag codierenden Sequenz wurde gegenüber der VLV gag codierenden
Wildtypsequenz maximal abgeändert,
um das Risiko einer homologen Rekombination mit dem Wildtyp zu minimieren.
Zusätzlich
wurde die Codon-Usage für
die Translation in humanen Zellen optimiert und die für VLV-Gag
codierende Sequenz mit einem Polyadenylierungssignal des bovinen
Wachstumshormons (BGH pA) ausgestattet. Die Expression der für VLV-Gag
codierenden Sequenz ist unter der Kontrolle des Cytomegalievirus
(CMV) Promotors.
Die
Nukleinsäuresequenz
von pBR322dtVLVgag ist in SEQ_ID No. 1 aufgeführt.
pBR322dtVLVgag
wurde basierend auf pBR322Lnk1 und durch Zusammenbau der für VLV-Gag codierenden Sequenz
ausgehend von synthetischen Oligonukleotiden und durch aufeinander
folgenden Ligierungen und Restriktionsverdaus in gleicher Weise
wie unter 2 für das Transferplasmid
beschrieben hergestellt.
Der
CMV (Cytomegalovirus Immediate-early Gene) Promotor wird aus dem
Plasmid pcDNA3.1(+) (Invitrogen, Cat # V790-20) durch eine PCR-Amplifizierung
der für
den Promotor codierenden Sequenz mit den Primern:
GTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAG
und
GAGCTCTGCTTATATAGACCTCCCACCG
unter den oben beschriebenen
PCR-Bedingungen erhalten.
6 zeigt eine Plasmidkarte
von pBR322dtVLVpol, einem Beispiel für ein Pol-Plasmid, welches
für das
Polyprotein Pol des Visna-Lentivirus (VLV) codiert.
Das
Plasmid pBR322dtVLVpol enthält
eine Expressionskassette für
die Produktion des Polyprotein VLV-Pol. Die für VLV-Pol codierende Sequenz
ist komplett artifiziell. Die Codon-Usage der für VLV-Pol codierenden Sequenz
wurde gegenüber
dem Wildtyp VLV pol Gen maximal abgeändert, um das Risiko einer
homologen Rekombination mit dem Wildtyp zu minimieren. Zusätzlich wird
die Codon-Usage für
die Translation in humanen Zellen optimiert und die für VLV-Pol
codierende Sequenz mit einem Polyadenylierungssignal des bovinen Wachstumshormons
(BGH pA) ausgeststattet. Die Expression der für VLV-Pol codierenden Sequenz
ist unter der Kontrolle des Simian Virus 40 (SV40) Promotors.
Die
Nukleinsäuresequenz
von pBR322dtVLVpol ist in SEQ_ID No. 2 aufgeführt.
pBR322dtVLVpol
wurde basierend auf pBR322Lnk1 und durch Zusammenbau der für VLV-Pol codierenden Sequenz
ausgehend von synthetischen Oligonukleotiden und durch aufeinander
folgenden Ligierungen und Restriktionsverdaus in gleicher Weise
wie unter 2 für das Transferplasmid
beschrieben hergestellt.
7 zeigt eine Plasmidkarte
von pBR322dtVLV-VTR, einem Beispiel für das VTR-Plasmid, das für die akzessorischen
VLV-Proteine Vif, Rev und Tat codierende Nukleinsäuresequenzen
enthält.
Das
Plasmid pBR322dtVLV-VTR enthält
eine Expressionskassette für
die Produktion der VLV-Proteine Vif, Tat und Rev. Die Codon-Usage
der für
Vif, Tat und Rev codierenden Sequenzen weicht vom Wildtyp maximal
ab, um das Risiko einer homologen Rekombination mit dem Wildtyp
zu minimieren. Zusätzlich
ist die Codon-Usage für
die Translation in humanen Zellen optimiert und die für VLV-Vif,
Tat und Rev codierende Sequenz mit einem Polyadenylierungssignal
des bovinen Wachstumshormons (BGH pA) ausgestattet. Die Expression
der für
VLV-Vif, Tat und Rev codierenden Sequenz ist unter der Kontrolle
des Simian Virus 40 (SV40) Promotors.
Die
Nukleinsäuresequenz
von pBR322dtVLV-VTR ist in SEQ_ID No. 3 aufgeführt.
pBR322dtVLV-VTR
wurde basierend auf pBR322Lnk1 und durch Zusammenbau der für Vif, Tat
und Rev codierenden Sequenz ausgehend von synthetischen Oligonukleotiden
und durch aufeinander folgenden Ligierungen und Restriktionsverdaus
in gleicher Weise wie unter 2 für das Transferplasmid
beschrieben hergestellt.
8 zeigt eine Plasmidkarte
von pBR322dtVSVG, einem Beispiel für das Env-Plasmid, das für ein virales
Hüllprotein
(envelope protein Env) codiert, welches nicht vom Visnavirus stammt.
Das
Plasmid pBR322dtVSVG enthält
eine Expressionskassette für
das Vesicular Stomatitis Virus Envelope Glycoprotein (VSVG). Die
für VSVG
codierende Sequenz wurde für
die humane Codon-Usage optimiert und ist mit einem Polyadenylierungssignal
des bovinen Wachs tumshormons (BGH pA) ausgestattet. Die Expression
der für
VSVG codierenden Sequenz ist unter der Kontrolle des CMV-Promotors.
Das
Plasmid pBR322dtVSVG wurde basierend auf pBR322Lnk1 und durch Zusammenbau
von Oligonukleotiden aufgebaut.
Die
Nukleinsäuresequenz
von pBR322dtVSVG ist in SEQ_ID No. 4 aufgeführt.
9 zeigt eine Plasmidkarte
von pBR322dtVLV-ECAP, einem dritten Beispiel für das erfindungsgemäße Transferplasmid,
welches das Transkript des Reportergens E. coli Alkalische Phosphatase
3' in eine Target-mRNA
spleißt.
pBR322dtVLV-ECAP
enthält
eine Ribozymkassette, die der des (in 2 gezeigten)
Plasmids pBR322dtVLVt-βGal ähnelt. In
dieser Ribozymkassette kann die Füllsequenz sPsrl durch eine
ribozymale Leitsequenz (guide-sequence GS) für eine spezifizierte Target-mRNA
ersetzt werden. Die codierende Sequenz, die 3' durch das Ribozym gespleißt wird,
ist hier die das Reportergen Alkalische Phosphatase von E. coli
codierende Sequenz, in der die Codon-Usage in die optimale humane Form verändert wurde.
Die
Nukleinsäuresequenz
von pBR322dtVLV-ECAP ist in SEQ_ID No. 7 aufgeführt.
Die
Herstellung von pBR322dtVLV-ECAP verläuft identisch zu der von pBR322dtVLVt-βGal (s. 2) mit dem Unterschied,
dass das DNA-Fragment LacZ durch die Sequenz ersetzt wird, die für die Alkalische Phosphatase
von E. coli optimiert für
humane Codon-Usage codiert, wobei diese, wie oben beschrieben, aus synthetischen
Oligonukleotiden aufgebaut wird.
10 zeigt eine Plasmidkarte
von pBR322dtVLV-PLAP, einem vierten Beispiel für das erfindungsgemäße Transferplasmid,
welches das Transkript des Reportergens Placental Alkaline Phosphatase
(PLAP) 3' in eine
Target-mRNA spleißt.
Das
Plasmid pBR322dtVLV-PLAP enthält
eine Ribozymkassette, die der des (in 2 gezeigten) Plasmids
pBR322dtVLVt-βGal ähnelt. In
dieser Ribozymkassette kann die Füllsequenz sPsrl durch eine
ribozymale Leitsequenz (guide-sequence GS) für eine spezifische Target-mRNA
ersetzt werden. Die codierende Sequenz, die 3' durch das Ribozym gespleißt wird,
ist das für
die plazentare alkalischen Phosphatase (placental alkaline phosphatase – PLAP)
codierende Reportergen in dem die Codon-Usage in die optimale humane Form
verändert
wurde.
Die
Nukleinsäuresequenz
von pBR322dtVLV-PLAP ist in SEQ_ID No. 8 aufgeführt.
Die
Herstellung von pBR322dtVLV-PLAP verläuft wie die von pBR322dtVLVt-βGal (s. 2) mit dem Unterschied,
dass das DNA-Fragment LacZ durch die für die plazentare alkalischen
Phosphatase (placental alkaline phosphatase – PLAP) codierende Sequenz
ersetzt wird, die als synthetische, für die humane Codon Usage optimierte
Sequenz erhalten wurde und wie oben beschrieben, aus synthetischen
Oligonukleotiden aufgebaut wird.
11 zeigt eine Plasmidkarte
von pBR322dtVLV-GFP, einem fünften
Beispiel für
das erfindungsgemäße Transferplasmid,
welches das Transkript des Reportergens Enhanced Green Fluorescent
Protein (eGFP) 3' in
eine Target-mRNA spleißt.
Das
Plasmid pBR322dtVLV-GFP enthält
eine Ribozymkassette, die der des (in 2 gezeigten)
Plasmids pBR322dtVLVt-βGal ähnelt. In
dieser Ribozymkassette kann die Füllsequenz sPsrl durch eine
ribozymale Leitsequenz (guide-sequence GS) für eine spezifische Target-mRNA ersetzt werden.
Die codierende Sequenz, die 3' durch
das Ribozym aufpleißt
wird, ist hier das Reportergen Enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP),
in dem die Codon-Usage in die optimale humane Form verändert wurde.
Die
Nukleinsäuresequenz
von pBR322dtVLV-GFP ist in SEQ_ID No. 10 aufgeführt.
Die
Herstellung von pBR322dtVLV-GFP verläuft wie die von pBR322dtVLVt-βGal (s. 2) mit dem Unterschied,
dass das DNA-Fragment LacZ durch die Reportergensequenz ersetzt
wird, die für
Enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) codiert, welche von dem
Plasmid pEGFP (BD Biosciences Clontech, Heidelberg, Deutschland)
durch eine PCR-Amplifizierung der promotor-codierenden Sequenz mit
den Primern gtgagcaagggcgaggagctg und ttacttgtacagctcgtccatgccg
erhalten wird.
12 zeigt eine Plasmidkarte
von pBR322dtVLV-PsrBae, einem sechsten Beispiel für das erfindungsgemäße Transferplasmid,
welches eine Klonierungsstelle enthält, in die eine Sequenz, die
3' durch das Ribozym
gespleißt
werden soll, eingefügt
werden kann.
pBR322dtVLV-PsrBae
enthält
eine Ribozymkassette, die der des (in 2 gezeigten)
Plasmids pBR322dtVLVt-βGal ähnelt. In
dieser Ribozymkassette kann die Füllsequenz sPsrl durch eine
ribozymale Leitsequenz (guide-sequence – GS) für eine spezifische Target-mRNA
ersetzt werden. pBR322dtVLV-PsrBae enthält weiter eine Klonierungsstelle
(cloning site – csBael)
flankiert von Bael-Restriktionsstellen, in die eine Sequenz, die
3' durch das Ribozym gespleißt werden
soll, nach einem Bael-Restriktionsverdau des Plasmids eingefügt werden
kann.
Die
Nukleinsäuresequenz
von pBR322dtVLV-PsrBae ist in SEQ_ID No. 5 aufgeführt.
Die
Herstellung von pBR322dtVLV-GFP verläuft wie die von pBR322dtVLVt-βGal (s. 2), mit dem Unterschied,
dass das DNA-Fragment LacZ durch die Klonierungsstelle csBae ersetzt
wird, die durch die Einfügung
eines Linkers anstelle der für βGal codierenden
Sequenz aufgebaut wird.
Produktion von replikationsdefizienten
Virion-Vektoroartikeln:
Um
replikationsdefiziente Virion-Vektorpartikel zu erhalten, werden
Zellen mit einem Beispiel des erfindungsgemäßen rekombinanten lentiviralen
Gentransfersystems transfiziert: dem Gag-Plasmid pBR322dtVLVgag,
dem Transferplasmid pBR322dtVLV-GFP, dem Pol-Plasmid pBR322dtVLVpol,
dem für
die akzessorischen Proteine Vif, Rev und Tat codierenden VTR-Plasmid pBR322dtVLV-VTR,
und dem für
das VSV-Envelope-Protein codierenden Env-Plasmid pBR322dtVSVG.
Damit
die Ribozymkassette die für
das β-Amyloid-Precursor
Protein (APP) codierende mRNA als Target hat, wird die Füllsequenz
(stuffer) sPsrl in dem Transferplasmid pBR322dtVLV-GFP hier durch die
Leitsequenz (guide sequence) GGTGGCGCTCCTCTGGGG, welche die für APP codierende
mRNA erkennt (s. 4 ersetzt.
Die Ribozymkassette wird die für
EGFP codierende Sequenz auf die APP-mRNA spleißen.
Die
Zell-Linie 293T (ATCC CRL-11268) wird in Dulbecco's modified Eagle's Medium ergänzt mit
10% fötalem
Kälberserum
(foetal calf serum – FCS),
Penicillin, Streptomycin und Glutamin (Invitrogen) aufrechterhalten.
Die 293T-Zellen wurden nach der Calciumphosphat-Copräzipitation-Methode,
wie beschrieben (Soneoka et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23: 628–633), transfiziert.
Der Überstand
der transfizierten 293T-Zellen, der die replikationsdefizienten
Virion-Vektorpartikel enthält,
wird durch einen Filter mit 0,45 μm
Porengröße gegeben
und in 500 μl
Aliquots bei –80°C gelagert.
Die gefrorenen Aliquots, welche die replikationsdefizienten Virion-Vektorpartikel
enthalten, stellen einen lentiviralen Vorrat (lentiviral stock)
dar, der nachfolgend für
die Infektion von Zellen gebraucht wird.
Infektion von Zellen mit
Virion-Vektorpartikeln:
Die
Infektion von Zellen mit Virion-Vektorpartikeln wird in der Abwesenheit
und in der Gegenwart von Aphidicolin durchgeführt, um zu bestimmen, ob sich
nicht-teilende Zellen transfiziert werden können.
Virion-Vektorpartikel
werden wie oben beschrieben hergestellt.
Kultivierte
Ratten-Pheochromocytoma-Zellen PC12 (ATCC CRL-1721) und HEK293-Zellen
werden in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 2 × 104 Zellen/Well gegeben. PC12-Zellen werden
in 82,5% Ham's F12K-Medium
mit 2 mmol/l L-Glutamin eingestellt auf 1,5 g/l Natriumhydrogencarbonat,
15% Pferdeserum, 2,5% Fötales
Kälberserum
(Invitrogen) und 50ng/ml 2.6s Neuronaler Wachstumsfaktor (nerve
growth factor, Sigma-Aldrich Chemie, Deisenhofen, Deutschland) kultiviert.
HEK293-Zellen werden in 90% Minimum Essential Medium (Eagle) mit
2 mmol/l L-Glutamin und Earle's
BSS eingestellt auf 1,5 g/l Natriumhydrogencarbonat, 0,1 mmol/l
Nicht-essentielle Aminosäuren
und 1,0 mmol/l Natriumpyruvat, sowie 10% Hitzeinaktiviertem Pferdeserum
(Invitrogen) kultiviert.
Nach
einem Tag wird das Medium entfernt und die Zellen werden für 2 bis
4 Stunden mit seriellen Verdünnungen
(1:30, 1:100, 1:300, 1:1000, 1:3000, 1:10000) der Virion-Vektorpartikel-Präparationen
in einem Gesamtvolumen von 150 μl/Well
in einer 24-Well-Platte bzw. 30–50 μl/Well in
einer 96-Well-Platte inkubiert. Frisches Medium wird hinzugefügt. Die
Anzahl der GFP-postiven Zellen wird 2 Tage nach Infektion bestimmt.
Um
PC12- und HEK293-Zellen in der G1/S-Phase
des Zellzyklus zu arretieren, werden die Zellen in einer 96-Well-Platte
mit einer Dichte von 4 × 104 bis 5 × 104 Zellen/Well gegeben, wobei Aphidicolin
mit einer Konzentration von 5 μg/ml
(Sigma) während
der gesamten Zelelkulturperiode anwesend ist.
Die
Anzahl der transfizierten Zellen wird bestimmt, indem die GFP-Fluoreszenz
in Lysaten dreier unabhängiger
Transfektionen bestimmt wird – in
Gegenwart von Aphidicolin mit 5μg/ml
(+) oder seiner Abwesenheit (–)
(siehe 13).
Die
transfizierten PC12- und HEK293-Zellen werden dazu in Luciferase
Cell Culture Lysis Reagent (Promega, Mannheim, Deutschland) suspendiert
und die Intensität
der GFP-Fluoreszenz
der Lysate in einem 1420 Multi-Label Counter (Victor; Wallac, Turku,
Finland) nach der Methode von Schnell et al. bestimmt (2000, Development
of a seif-inactivating, minimal lentivirus vector based on simian
immunodeficiency virus, Human Gene Therapy 11: 439–447). In 13 sind die Mittelwerte
und Standardabweichungen der GFP-Fluoreszenzmessungen
gezeigt (GFU, Green Fluorescence-forming Units).
In
Gegenwart und Abwesenheit von Aphidicholin wird eine große Anzahl
von PC12- und HEK293-Zellen mit Virion-Vektorpartikeln infiziert.
Obwohl die Titer bei einer Behandlung mit Aphidicholin niedriger
waren, zeigen die Ergebnisse signifikant, dass sich nicht-teilende
Zellen effizient mit den erfindungsgemäßen replikationsdefizienten
Virion-Vektorpartikeln infiziert werden können.
Reparatur einer Punktmutation
durch Ribozym-vermittelte RNA-Reparatur:
Als
ein Beispiel der Ribozym-vermittelten Reparatur mit dem erfindungsgemäßen lentiviralen
Gentransfersystems wird die Reparatur von Punktmutationen in der
für das β-Amyloid-Precursor Protein
codierenden Messenger-RNA beschrieben.
Eine
Anzahl von Punktmutationen in dem für β-Amyloid-Precursor Protein (APP,
GenBank D87675) codierenden Gen rufen klinisch signifikante Pathologien
hervor (Online Mendelian Inheritance in Man *104760, NCBI, Bethesda,
USA). Davon sind der Korrektur durch einen Austausch (Substitution)
einer 3'-Untersequenz zugänglich:
Das
Transferplasmid, das verwendet wird, um das selbstspleißende Ribozym,
welches diese Punktmutationen korrigiert, zu transferieren, ist
pBR322dtVLVdAPP, dargestellt durch die Plasmidkarte in 4.
Um
replikaktionsdefiziente Virion-Vektorpartikel zu erhalten, werden
Zellen wie oben beschrieben mit dem Transferplasmid pBR322dtVLVdAPP,
dem Gag-Plasmid pBR322dtVLVgag, dem Pol-Plasmid pBR322dtVLVpol,
dem für
die akzessorischen Proteine Vif, Rev und Tat codierenden VTR-Plasmid pBR322dtVLV-VTR,
und dem für
das VSV-envelope
Protein codierenden Env-Plasmid pBR322dtVSVG transfiziert.
PC12-Zellen
und HEK293-Zellen werden, wie oben beschrieben, mit Virion-Vektorpartikeln
infiziert. Vor der Infektion werden die PC12-Zellen sieben Tage
mit 50 ng/ml neuronalem Wachstumsfaktor (NGF) (N6009, Sigma-Aldrich
Chemie GmbH, Deutschland) stimuliert.
Alternativ
können
primäre
Zellen in Zellkultur infiziert oder die Virion-Vektorparfikel durch in vivo-Injektion
appliziert werden.
Um
die Effizienz der Infektion zu kontrollieren, wird mRNA aus der
infizierten Zellkultur (oder dem infizierten Gewebe) mit dem Oligotex
Direct mRNA Micro Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) entsprechend
den Herstellerangaben extrahiert.
Eine
RT-PCR mit Primern spezifisch für
die 5'-Substrat-RNA
und die heterologe Nukleotidsequenz, die 3' auf die Substrat-RNA gespleißt wurde,
wird ausgeführt.
Die RT-PCR wird dabei nach der Methode von Bangsow, Huch, Male und
Müller
(2002; Kapitel 5.2.2.1 Schrimpf (Ed) in Gentechnische Methoden,
Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg, Deutschland) mit
den oben beschrieben Bedingungen für die PCR durchgeführt. Als
Antisense-Primen wird GACGATCACTGTCGCTATGACAACAC und als Sense-Primer
TGCCGACCGAGGAC-TAATGTCCCAGGTCATGAGAGA
verwendet.
Die
durch die PCR erhaltenen DNA-Fragmente werden in einer Agarosegel-Elektrophorese
aufgetrennt. Die Agarosegel-Elektrophorese wird durchgeführt wie
oben beschrieben. Der Anti-Sense-Primen ist spezifisch für Wildtyp-βAPP. Das
Vorhandensein einer Bande eines RT-PCR-Produkts (Länge 952bp)
weist auf das erfolgreiche Transspleißen des trans-duzierten Ribozyms
hin. Die Produktion eines RT-PCR-DNA-Produkts zeigt den Erfolg der
mRNA-Reparatur.
Die
folgenden Abkürzungen
werden in der Erfindungsbeschreibung und in den Figuren verwendet:
- 3'APP
- Bereich der für das β-Amyloid-precursor
protein (APP) codierenden Sequenz, der 3' gespleißt wird, um eine mutante APP
mRNA zu reparieren
- Aarl
- Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym
Aarl
- Apr
- Ampicillin Resistenzgen
(β-Lactamase)
- ATCC
- American Type Culture
Collection
- Bael
- Bael-Restriktionsstelle
- csBael
- Klonierungsstelle
(cloning site – cs)
flankiert von Bael-Restriktionsstellen für den Einbau einer Target-Sequenz
- BGH
- bovines Wachstumshormon
(Bovine growth hormone)
- CMV
- Cytomegalievirus
- D-env
- Inaktivierte VLV-Envelope-Nukleidsequenz
- D-p16
- Inaktivierte VLV-p16-Nukleidsequenz
- D-rev
- Inaktivierte VLV-rev-Nukleidsequenz
- D-tat
- Inaktivierte VLV-tat-Nukleidsequenz
- ECAP
- Humanisierte Sequenz
codierend für
die E. coli Alkalische Phosphatase
- EGFP
- Enhanced Green Fluorescent
Protein
- EGFP-PA
- EGFP-Polyadenylierungssignal
- Gag
- Humanisierte für Gag-codierende
Sequenz
- Gag-L
- Gag-Leader-Sequenz
- GFP
- Green Fluorescent
Protein
- GFU
- grüne Fluoreszenz-bildende Einheiten
(Green Fluorescence-forming Units)
- GS
- Ribozym-Leitsequenz
(guide-sequence)
- H Y EFF
- H-strand Y-eftector
site
- HEK293
- Human embryonic kidney
fibroblast cell-line
- HindIII
- Erkennungsstelle des
Restriktionsenzyms HindII
- L Y EFF
- L-strand Y-Effector-Site
- LacZ
- Sequenz codierend
für eine
humanisierte Form der E. coli β-Galaktosidase
- Lnk1
- Linker 1
- LTR3
- 3' Long Terminal Repeat
- LTR5
- 5' Long Terminal Repeat
- ORI
- Bakterieller Startpunkt
für die
Replikation (Origin of replication)
- p
- Plasmid
- P10'
- P10-Loop der katalytischen
Sequenz des Ribozyms
- P1P
- Bakterieller Promotor
P1
- P3P
- Promotor P3
- PA
- Polyadenylierungssignal
(Polyadenylation signal)
- pbs
- Primerbindungsstelle
(Primer binding site)
- PC12
- Rat pheochromocytoma
cell line
- PLAP
- Optimierte Sequenz
codierend für
humane plazentare alkalische Phosphatase (placental alkaline phosphatase)
- Pol
- Humanisierte Sequenz
codierend für
das VLV Pol-Polyprotein
- sPsrl
- Füllsequenz (stuffer) flankiert
von Psrl Restriktionsstellen für
den Einbau einer (Leistsequenz guide sequence)
- Psrl
- Erkennungsstelle des
Restriktionsenzyms Psrl
- R5
- 5'-Repeat
- Rev
- 2 Zweites rev-Exon
- Rev2-L
- Rev 2-Leader
- Ribozyme
- Katalytische Ribozym-Sequenz
- ROP
- Rop-Protein codierendes
Gen
- RRE
- Rev Response Element
- SD SEQ
- Shine-Dalgarno-Sequenz
- Styl
- Erkennungsstelle des
Restriktionsenzyms Styl
- SV40
- Simianvirus 40 Early
Promoter
- Swal
- Erkennungsstelle des
Restriktionsenzyms Swal
- Tat
- Humanisierte Sequenz
codierend für
den Transactivator of transcription
- U3
- Nichttranslatierte
3'-Sequenz (Untranslated
3'-Sequence)
- U5
- Nichttranslatierter
5'-Bereich des VLV
(Untranslated 5'-Region
of VLV)
- vif
- Humanisierte Sequenz
codierend für
den Viral-infectivity factor
- VLV
- Visna-Lentivirus
- VSVG
- Vesicular Stomatitis
Virus Envelope Glykoprotein codierende Sequenz