DE102005008196B4

DE102005008196B4 - Verfahren zum Erkennen von Dunkelzuständen bei der spektroskopischen oder mikroskopischen Untersuchung von fluoreszenten Proben und Vorrichtung zur spektroskopischen oder mikroskopischen Untersuchung von fluoreszenten Proben

Info

Publication number: DE102005008196B4
Application number: DE102005008196.7A
Authority: DE
Inventors: Jürgen Riedmann; Dr. Knebel Werner; Dr. Kuschel Lioba
Original assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2005-02-22
Filing date: 2005-02-22
Publication date: 2019-08-29
Anticipated expiration: 2025-02-23
Also published as: US20060186345A1; JP4739981B2; DE102005008196A1; JP2006234815A; US7446322B2

Abstract

Verfahren zum Erkennen von Dunkelzuständen bei der spektroskopischen oder mikroskopischen Untersuchung von fluoreszenten Proben (1), insbesondere mit fluoreszenten Proteinen, wobei das Anregungs-/Beleuchtungsvolumen und somit die Intensitätsverteilung des Anregungslichts bei mindestens zwei voneinander unabhängigen Messungen verändert wird und wobei festgestellt wird, ob sich die dabei beobachteten Zeitkonstanten ändern, und wobei im Falle unveränderter Zeitkonstanten auf das Vorliegen eines Dunkelzustandes geschlossen wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erkennen von Dunkelzuständen bei der spektroskopischen oder mikroskopischen Untersuchung von fluoreszenten Proben, insbesondere mit fluoreszenten Proteinen. Des Weiteren betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zur spektroskopischen oder mikroskopischen Untersuchung von fluorszenten Proben, insbesondere mit fluoreszenten Proteinen, mit einer Lichtquelle und einer Detektoreinrichtung, wobei sich zwischen der Lichtquelle und der Probe ein Beleuchtungsstrahlengang und zwischen der Probe und der Detektoreinrichtung ein Detektionsstrahlengang erstreckt.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ganz allgemein auf spektroskopische oder mikroskopische Untersuchungen, bei denen es um die photochemischen Eigenschaften beobachtbarer Fluorophore geht. Lediglich beispielhaft wird in Bezug auf einschlägigen druckschriftlichen Stand der Technik zunächst auf die US 5,742,437 , dort auf Spalte 9, Zeilen 27 bis 50 sowie auf die 5 und 14 der Druckschrift, verwiesen.
Des Weiteren ist aus der DE 103 43 722 A1 ein Verfahren zum Erkennen von Dunkelzuständen bekannt. Beispielsweise ist in den Absätzen [0072] und [0073] dieser Druckschrift beschrieben, dass durch Anpassen der Autokorrelationsfunktion an einen analytischen Ausdruck wichtige Grundparameter extrahiert werden können, beispielsweise der Anteil von Teilchen, die den Triplettzustand belegen (langlebige, nicht fluoreszierende Dunkelzustände).
Bei der Untersuchung biologischer Proben geht es oftmals um die Beobachtung lebender Zellen. Dabei werden fluoreszente Proteine genutzt, um interessierende zelluläre Proteine gentechnisch fluoreszent zu markieren. Nach einer entsprechenden Markierung lassen sich die Bewegungen der Proteine in der lebenden Zelle beobachten und analysieren.
Problematisch ist dabei ein ganz besonderes Phänomen der Fluorophore, nämlich das Auftreten sogenannter Dunkelzustände, auch genannt Blinken, welches beispielsweise durch Triplett-Übergänge, Isomerisierung, Protonierung, etc. entsteht. Das Auftreten bzw. die Häufigkeit solcher Dunkelzustände und auch deren Lebensdauer ist von zahlreichen Faktoren abhängig, so beispielsweise von der Umgebung des Fluorophores, aber auch und insbesondere von der Lichtintensität des Anregungslichts. In Bezug auf die regelmäßig auftretenden Dunkelzustände entstehen gravierende Probleme bei der Beobachtung biologischer Proben dann, wenn die Zeitkonstanten der Dunkelzustände in den Bereichen der Diffusionszeiten liegen, so dass man die beiden Phänomene nicht mehr unterscheiden kann. Mit anderen Worten lässt sich nicht unterscheiden, ob es sich bei dem beobachteten Zustand um einen Dunkelzustand oder um das Resultat einer stattgefundenen Diffusion von Zellen handelt.
Im Lichte der voranstehenden Ausführungen liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Erkennen von Dunkelzuständen bei der spektroskopischen oder mikroskopischen Untersuchung von fluoreszenten Proben anzugeben, wonach eine eindeutige Differenzierung zwischen den zu beobachtenden Phänomenen und den zwangsweise auftretenden Dunkelzuständen möglich ist. Des Weiteren soll eine Vorrichtung zur spektroskopischen oder mikroskopischen Untersuchung von fluoreszenten Proben angegeben werden, die sich unter Vermeidung der voranstehend genannten Probleme ganz besonders zur Untersuchung biologischer Proben, insbesondere mit fluoreszenten Proteinen, eignet.
Erfindungsgemäß wird die voranstehende Aufgabe durch die Merkmale der nebengeordneten Patentansprüche 1 und 8 gelöst. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das Anregungs-/Beleuchtungsvolumen und somit die Intensitätsverteilung des Anregungslichts bei mindestens zwei voneinander unabhängigen Messungen verändert. Es wird festgestellt, ob sich die dabei beobachteten Zeitkonstanten ändern. Im Falle unveränderter Zeitkonstanten wird auf das Vorliegen eines Dunkelzustands geschlossen. Eine Differenzierung ist somit möglich.
Das Wesen der Erfindung stützt sich auf die Erkenntnis, dass beispielsweise gentechnisch markierte zelluläre Proteine eine längere Verweilzeit in dem Bereich eines Beleuchtungsstrahls mit größerem Anregungs-/Beobachtungsvolumen haben als in einem „dünneren“ Strahl. Entsprechend lässt sich folgern, dass bei zwei aufeinander folgenden Messungen mit kleinerem Anregungs-/Beleuchtungsvolumen und mit größerem Anregungs-/Beleuchtungsvolumen dann jedenfalls keine Diffusion vorliegen kann, wenn sich die Beobachtung nicht ändert. In einem solchen Falle wird ganz offensichtlich ein Dunkelzustand erkannt. Ändert sich dagegen die Beobachtung, kann bei dem hier gewählten Beispiel auf Diffusion geschlossen werden, da die sich ändernden Beobachtungen aus unterschiedlichen Verweildauern im Beleuchtungsvolumen resultieren. Erhöht sich nämlich nach Vergrößerung des Anregungs-/Beobachtungsvolumens, d.h. nach Vergrößerung des konfokalen Beleuchtungsvolumens, im Rahmen der konfokalen Spektroskopie oder Mikroskopie auch die beobachtete Zeitkonstante, so handelt es sich bei dem zugehörigen bzw. erkannten Prozess um Diffusion. Bleibt dagegen die Zeitkonstante gleich, tritt nämlich keine Änderung in der Beobachtung ein, handelt es sich um eine intrinsische Eigenschaft, d.h. um einen Dunkelzustand der verwendeten Fluorophore.
Zur Realisierung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es erforderlich, dass mindestens zwei voneinander unabhängige Messungen mit verändertem Anregungs-/Beleuchtungsvolumen durchgeführt werden. Zur qualitativen Verbesserung des Verfahrens ist es sinnvoll, mehrere voneinander unabhängige, vorzugsweise aufeinander folgende Messungen mit jeweils geändertem Anregungs-/Beleuchtungsvolumen vorzunehmen, um nämlich mehr Sicherheit hinsichtlich der aus den Messungen resultierenden Aussage zu gewinnen. Auf jeden Fall wird mit einer Veränderung des Anregungs-/Beleuchtungsvolumens die Verweilzeit fluoreszenter Proteine in dem beleuchteten Bereich verändert, woraus sich Rückschlüsse auf das beobachtete Phänomen ziehen lassen.
So lässt sich das Anregungs-/Beleuchtungsvolumen über eine Änderung der Apertur beeinflussen, wobei sich das Anregungs-/Beleuchtungsvolumen umgekehrt proportional zur Apertur verhält. Je kleiner die Apertur ist bzw. eingestellt wird, desto größer ergibt sich das Anregungs-/Beleuchtungsvolumen, wobei es sich dabei grundsätzlich um die Intensitätsverteilung im Fokus oder in Fokusnähe handelt.
Im Konkreten lässt sich das Anregungs-/Beleuchtungsvolumen über eine vorzugsweise variabel einstellbare Lochblende im Beleuchtungsstrahlengang verändern, wobei sich die Verwendung einer Irisblende vor dem Hauptstrahlteiler oder vor einem AOBS eignet. Der Lichtstrahl soll an dieser Stelle zumindest weitgehend parallel sein und einen nicht allzu großen Strahldurchmesser aufweisen.
Alternativ ist es denkbar, dass das Anregungs-/Beleuchtungsvolumen über eine farbselektive Blende im Beleuchtungsstrahlengang verändert wird, wobei die farbselektive Blende vorzugsweise in der Objektivpupille eingebracht ist. Diese Blende wirkt in weiter vorteilhafter Weise ausschließlich auf das Beleuchtungslicht, wodurch die Ausleuchtung der Pupille verändert werden kann. Dabei ist wesentlich, dass das von der Probe zurückkehrende Detektionslicht die Blende stets ungehindert passieren sollte, damit das von der Probe kommende Signal nicht reduziert wird. So ist es denkbar, dass die Blende für beispielsweise zwei oder mehrere unterschiedliche Wellenlängenbereiche bzw. Wellenlängen derart ausgelegt ist, dass sie für die unterschiedlichen Wellenlängen bzw. Wellenlängenbereiche unterschiedliche Beleuchtungsdurchmesser oder Beleuchtungsmuster liefert. Das durch die Blende „abgeschnittene“ Beleuchtungslicht wird entweder in der Blende absorbiert oder über die Blende reflektiert und danach mit geeigneten Mitteln aus dem Detektionsstrahlengang herausgefiltert. Die Anordnung mehrerer Blenden, beispielsweise auf einem Filterrad angeordnet, ist denkbar, wobei die jeweils gewünschte Blende über das Filterrad in den Strahlengang einschwenkbar ist. Wesentlich ist jedenfalls, dass die Blende so geschaffen sein sollte, dass das Detektionslicht bzw. das von der Probe zurückkehrende Emissionslicht nicht reduziert wird, da nämlich die von der Probe kommenden Photonen für die Messung bzw. angestrebte Korrelation benötigt werden.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur spektroskopischen oder mikroskopischen Untersuchung von fluoreszenten Proben, insbesondere mit fluoreszenten Proteinen, mit einer Lichtquelle und einer Detektoreinrichtung, wobei sich zwischen der Lichtquelle und der Probe ein Beleuchtungsstrahlengang und zwischen der Probe und der Detektoreinrichtung ein Detektionsstrahlengang erstreckt, dient insbesondere zur Anwendung des zuvor beschriebenen Verfahrens. Die Vorrichtung ist dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungs-/Beleuchtungsvolumen und somit die Intensitätsverteilung des Anregungslichts bei mindestens zwei voneinander unabhängigen Messungen verändert wird und wobei festgestellt wird, ob sich die beobachteten Zeitkonstanten ändern, und wobei im Falle unveränderter Zeitkonstanten auf das Vorliegen eines Dunkelzustandes geschlossen wird.
Wie bereits zu den vorteilhaften Ausführungen des erfindungsgemäßen Verfahrens ausgeführt, kann zur Veränderung des Anregungs-/Beleuchtungsvolumens im Beleuchtungsstrahlengang eine vorzugsweise variable Lochblende vorgesehen sein, nämlich beispielsweise eine Irisblende. Insoweit ist es von Vorteil, wenn die Lochblende in einem Bereich des Beleuchtungsstrahlengangs mit zumindest weitgehend parallelem Licht angeordnet ist, und zwar vorzugsweise vor einem Hauptstrahlteiler oder einem AOBS.
Alternativ ist zur Veränderung des Anregungs-/Beleuchtungsvolumens im Beleuchtungsstrahlengang eine farbselektive Blende vorgesehen, die vorzugsweise in der Objektivpupille angeordnet ist. Die Vorkehrung mehrerer farbselektiver Blenden kann zur Auswahl einer geeigneten Blende dienen, wobei die mehreren farbselektiven Blenden auf einem Filterrad angeordnet und wahlweise in den Strahlengang einschwenkbar sind.
Die farbselektive Blende kann beispielsweise zum Durchlass für zwei verschiedene Anregungswellenlängen dienen, wobei sich bei den unterschiedlichen Anregungswellenlängen entsprechend der Auslegung der Blende unterschiedliche Anregungs-/Beleuchtungsvolumina ergeben. In Richtung des Beleuchtungslichts, d.h. zur Probe hin, ist die Blende entsprechend der jeweiligen Anregungswellenlänge teildurchlässig und in Richtung des Detektionslichts, d.h. zu der Detektoreinrichtung hin, komplett durchlässig, damit hinreichend viele Photonen zu der Detektoreinrichtung gelangen.
In Bezug auf die vorteilhafte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung sei an dieser Stelle angemerkt, dass die Blende in vorteilhafter Weise derart ausgelegt ist, dass das die Blende nicht passierende Beleuchtungslicht durch die Blende absorbiert wird. Es ist auch denkbar, dass das die Blende nicht passierende Beleuchtungslicht durch die Blende reflektiert und aus dem Detektionsstrahlengang komplett herausgefiltert wird, nämlich durch geeignete Maßnahmen, beispielsweise durch entsprechenden Lichtfallen oder dergleichen.
Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die nachgeordneten Ansprüche, andererseits auf die nachfolgende Erläuterung zweier bevorzugter Ausführungsbeispiele der erfindungsgemäßen Lehre anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit der Erläuterung der bevorzugten Ausführungsbeispiele der erfindungsgemäßen Lehre anhand der Zeichnung werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigt

1 in einer schematischen Ansicht ein erstes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung,
2 in einer schematischen Ansicht ein zweites Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung und
2a in einer schematischen Draufsicht eine farbselektive Blende für zwei Anregungswellenlängen,

1 zeigt ein erstes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur mikroskopischen Untersuchung von fluoreszenten Proben 1, wobei diese Proben 1 mit Fluorophoren dotiert sind, nämlich fluoreszente Proteine enthalten. Die Vorrichtung umfasst im Wesentlichen eine Lichtquelle 2, wobei es sich dabei im Konkreten um eine Laserlichtquelle handelt. Des Weiteren umfasst die Vorrichtung eine Detektoreinrichtung 3. Zwischen der Lichtquelle 2 und der Probe 1 erstreckt sich ein Beleuchtungsstrahlengang 4. Zwischen der Probe 1 und der Detektoreinrichtung 3 erstreckt sich ein Detektionsstrahlengang 5.
Im Beleuchtungsstrahlengang 4 folgt nach der Lichtquelle 2 ein AOTF 6, durch den die Lichtintensität regelbar ist. Über eine Linsenanordnung 7 und ein zwischen den Linsen angeordnetes Beleuchtungs-Pinhole 8 gelangt das Beleuchtungslicht über eine verstellbare Irisblende 9 zum Hauptstrahlteiler 10 und von dort aus über die Scaneinrichtung 11 mit dem Scanspiegel 12 über eine Linsenanordnung 13 durch das Objektiv 14 zur Probe 1.
Bei dem in 1 gezeigten Ausführungsbeispiel wird das Anregungs-/Beleuchtungsvolumen und somit die Intensitätsverteilung des Anregungslichts mittels der verstellbaren Irisblende 9 beeinflusst und verändert, so dass bei mindestens zwei voneinander unabhängigen Messungen mit verändertem Anregungs-/Beleuchtungsvolumen festgestellt wird, ob sich die beobachteten Zeitkonstanten ändern. Im Falle unveränderter Zeitkonstanten lässt sich auf das Vorliegen eines Dunkelzustands schließen, wie dies bereits im allgemeinen Teil der Beschreibung ausführlich dargestellt worden ist.
2 zeigt ein zweites Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, wobei zur Veränderung des Anregungs-/Beleuchtungsvolumens eine farbselektive Blende 16 bzw. mehrere farbselektive Blenden 16 vorgesehen ist bzw. sind.
Bei dem in 2 gezeigten Ausführungsbeispiel ist im Beleuchtungsstrahlengang 4 gleich nach der Lichtquelle 2 ein AOTF 6 zur Anpassung der Lichtleistung vorgesehen. Nach einer Linse 17 folgt ein Beleuchtungs-Pinhole 8. Das Beleuchtungslicht gelangt über den Hauptstrahlteiler 10 zur Scaneinrichtung 11 mit dem Scanspiegel 12 und über eine Linsenanordnung 13 durch das Objektiv 14 zur Probe 1.
Das von der Probe 1 zurückkehrende Detektionslicht gelangt über den Detektionsstrahlengang 5 durch den Hauptstrahlteiler 10 und das Detektions-Pinhole 18 zur Detektoreinrichtung 3, wie auch bei dem Ausführungsbeispiel gemäß 1.
In der Objektivpupille des Objektivs 14 ist ein Filterrad 19 mit mehreren farbselektiven Blenden 16 angeordnet, wobei die farbselektiven Blenden 16 durch Drehen des Filterrads 19 in die jeweilige Arbeitsposition verbringbar sind.
2a zeigt schließlich ein Beispiel für eine farbselektive Blende 16, wie dies bei dem Ausführungsbeispiel in 2 in dem dort vorgesehenen Filterrad 19 angeordnet ist. Die in 2a schematisch gezeigte farbselektive Blende 16 ist für zwei verschiedene Anregungswellenlängen ausgelegt. Für das Detektionslicht ist die Blende 16 über die gesamte Fläche hinweg transparent.
Im Hinblick auf weitere Merkmale, die sich den Fig. nicht entnehmen lassen, sei zur Vermeidung von Wiederholungen auf den allgemeinen Teil der Beschreibung verwiesen.
Schließlich sei angemerkt, dass die voranstehend erörterten Ausführungsbeispiele lediglich der beispielhaften Erörterung der beanspruchten Lehre dienen, diese jedoch nicht auf dieses Ausführungsbeispiel einschränken.

Claims

Verfahren zum Erkennen von Dunkelzuständen bei der spektroskopischen oder mikroskopischen Untersuchung von fluoreszenten Proben (1), insbesondere mit fluoreszenten Proteinen, wobei das Anregungs-/Beleuchtungsvolumen und somit die Intensitätsverteilung des Anregungslichts bei mindestens zwei voneinander unabhängigen Messungen verändert wird und wobei festgestellt wird, ob sich die dabei beobachteten Zeitkonstanten ändern, und wobei im Falle unveränderter Zeitkonstanten auf das Vorliegen eines Dunkelzustandes geschlossen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungs-/Beleuchtungsvolumen bei mehreren voneinander unabhängigen, vorzugsweise aufeinander folgenden Messungen geändert wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungs-/Beleuchtungsvolumen über eine Änderung der Apertur beeinflusst wird, wobei sich das Anregungs-/Beleuchtungsvolumen umgekehrt proportional zur Apertur verhält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungs-/Beleuchtungsvolumen über eine vorzugsweise variabel einstellbare Lochblende im Beleuchtungsstrahlengang (4), insbesondere über eine Irisblende (9) vor dem Hauptstrahlteiler (10) oder einem AOBS, verändert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungs-/Beleuchtungsvolumen über eine farbselektive Blende (16) im Beleuchtungsstrahlengang (4), insbesondere In der Objektivpupille, verändert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Messungen bei gleicher Lichtintensität des Anregungslichts durchgeführt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass bei sich ändernder Uchtintensität aufgrund unterschiedlicher Einstellungen des Anregungs-/Beleuchtungsvolumens die Lichtlntensttät vorzugsweise über einen AOTF (6) auf einen vergleichbaren Wert nachgeregelt wird.
Vorrichtung zur spektroskopischen oder mikroskopischen Untersuchung von fluoreszenten Proben (1), insbesondere mit fluoreszenten Proteinen, mit einer Lichtquelle (2) und einer Detektoreinrichtung (3), wobei sich zwischen der Lichtquelle (2) und der Probe (1) ein Beleuchtungsstrahlengang (4) und zwischen der Probe (1) und der Detektoreinrichtung (3) ein Detektionsstrahlengang (5) erstreckt, insbesondere zur Anwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungs-/Beleuchtungsvolumen und somit die Intensitätsverteilung des Anregungslichts bei mindestens zwei voneinander unabhängigen Messungen verändert werden, und wobei festgestellt wird, ob sich die beobachteten Zeitkonstanten ändern, und wobei im Falle unveränderter Zeitkonstanten auf das Vorliegen eines Dunkelzustandes geschlossen wird.
Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass zur Veränderung des Anregungs-/Beleuchtungsvolumens im Beleuchtungsstrahlengang (4) eine vorzugsweise variable Lochblende vorgesehen ist.
Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Lochblende um eine vorzugsweise verstellbare Irisblende (9) handelt.
Vorrichtung nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Lochblende in einem Bereich des Beleuchtungsstrahlengangs (4) mit zumindest weitgehend parallelem Lichtstrahl angeordnet ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Lochblende vor einem Hauptstrahlteiler (10) oder einem AOBS angeordnet Ist.
Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass zur Veränderung des Anregungs-/Beleuchtungsvolumens im Beleuchtungsstrahlengang (4), vorzugsweise in der Objektivpupille, eine farbselektive Blende (16) vorgesehen ist.
Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere farbselektive Blenden (16) zur Auswahl vorgesehen sind und dass die mehreren farbselektiven Blenden (16) auf einem Filterrad (19) angeordnet und wahlweise in den Strahlengang einschwenkbar sind.
Vorrichtung nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass die farbselektive Blende (16) in Richtung des Beleuchtungslichts, d.h. zur Probe (1) hin, entsprechend der jeweiligen Anregungswellenlänge teildurchlässig und in Richtung des Detektionslichts, d.h. zu der Detektoreinrichtung (3) hin, komplett durchlässig ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die farbselektive Blende (16) für zwei oder mehrere Wellenlängen des Beleuchtungslichts derart ausgelegt ist, dass für die jeweiligen Wellenlängen unterschiedliche Beleuchtungsdurchmesser - entsprechend der jeweiligen Wellenlänge - realisiert sind.
Vorrichtung nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Blende derart ausgelegt ist, dass das die Blende (16) nicht passierende Beleuchtungslicht durch die Blende (16) absorbiert wird.
Vorrichtung nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass das die Blende (16) nicht passierende Beleuchtungsllcht durch die Blende (16) reflektiert und aus dem Detektionsstrahlengang (5) herausgefiltert wird.