DE102013203628A1 - Immersionsobjektiv für Mikroskope und seine Verwendung - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Immersionsobjektiv (100) für Mikroskope, wobei das Objektiv eine numerische Apertur von NA > 1,36 besitzt und eine Frontlinsengruppe (101) aufweist, die als erstes objektseitiges optisches Element eine Planparallelplatte (103) und als zweites optisches Element eine Überhalbkugel (102) aufweist, wobei die Planparallelplatte (103) an die plane Seite der Überhalbkugel (102) angesprengt ist.

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft ein Immersionsobjektiv für Mikroskope mit einer numerischen Apertur von NA > 1,36.
• Stand der Technik
• Immersionsobjektive für Mikroskope sind an sich aus dem Stand der Technik bekannt. Hierbei wird zwischen das Objektiv und das Präparat eine Immersionsflüssigkeit eingebracht, wodurch die erzielbare Auflösung gesteigert wird, sodass auch bei hohen Vergrößerungen keine leere Vergrößerung auftritt. Ein weiterer Effekt ist die Unterdrückung von kontrastsenkenden Reflexionen, insbesondere bei Verwendung eines Immersionsöls, das nahezu dieselbe Brechzahl wie Glas hat. Bei einem Ölimmersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von NA = 1,4 ergibt sich bei einer Wellenlänge von 500 nm beispielsweise eine maximale Auflösung von 217 nm. Eine Obergrenze der numerischen Apertur ist durch den Brechungsindex des Immersionsmediums gegeben, der bei Öl typischerweise 1,518 beträgt.
• Ohne Beschränkung der Allgemeinheit soll im Folgenden der praktisch relevante Fall eines Ölimmersionsobjektivs betrachtet werden. Andere mögliche Immersionsmedien sind Wasser, Glycerin oder Silikonöl. Aber auch für andere Immersionsmedien ist die vorliegende Erfindung geeignet.
• Häufiges Einsatzgebiet von Ölimmersionsobjektiven ist die Fluoreszenzmikroskopie. Hier muss darauf geachtet werden, dass das verwendete Immersionsöl keine Eigenfluoreszenz hat.
• Übliche Ölimmersionsobjektive zeichnen sich in der Regel dadurch aus, dass die dem Objekt am nächsten liegende Linsengruppe ("Frontlinsengruppe") zumindest aus zwei verkitteten Linsen besteht. Bei der Verkittung werden benachbarte Linsenflächen, die gleiche Radien aufweisen müssen, mit einer dünnen, durchsichtigen Kittschicht zusammengeklebt. Die Kittschicht, meist aus Kunstharz, dient auch zur Verhinderung der Totalreflexion (und allgemein von Reflexionen) an Glas-Luft-Flächen zwischen zwei Linsen ohne Kitt. Die verwendeten Kitte sind in verschiedenen Mikroskopie-Anwendungen jedoch nachteilig. Bei bestimmten mikroskopischen Verfahren, insbesondere der Fluoreszenzmikroskopie, wird mit einer Laserbeleuchtung hoher Leistung gearbeitet. Dadurch kommt es, speziell bei Verfahren, die das Laserlicht in das Objektiv fokussieren, zu einer hohen Intensität innerhalb des Objektivs, vor allem im Bereich der Frontlinsengruppe. Dort verwendete Kitte können bei Bestrahlung mit diesen hohen Intensitäten geschädigt werden. In der Folge entstehen Trübungen an der geschädigten Kittstelle.
• Weiterhin zeigen Kitte eine gewisse Eigenfluoreszenz. Dies ist bei Verfahren der (Weitfeld-)Fluoreszenzmikroskopie nachteilig, da das im Kitt entstehende Fluoreszenzlicht ebenfalls zu einem großen Teil in das Bild gelangt und dort den Kontrast des Nutzlichtes aus der fluoreszierenden Probe mindert.
• Aus der US 7,199,938 B2 ist ein apochromatisches Immersionsobjektiv für Mikroskope bekannt mit einer objektseitigen Frontlinsengruppe aus verkitteten Linsen. Die Frontlinsengruppe besteht hier aus einem plan-konvexen Linsenelement, dessen plane Oberfläche dem Objekt zugewandt ist, und einem Meniskuslinsenelement, dessen konkave Fläche der Objektseite zugewandt ist und mit der konvexen Seite des plankonvexen Linsenelements durch Verkittung verbunden ist. Das dort vorgestellte Objektiv soll eine numerische Apertur NA > 1,4 erreichen.
• Aus der US 2002/0154414 A1 ist ein Mikroskop-Objektiv hoher Apertur für Immersionsanwendungen, insbesondere TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) bekannt. Die Frontlinsengruppe umfasst eine erste Linse positiver Brechkraft mit plan-konvexer Oberfläche, wobei die plane Fläche dem Objekt zugewandt ist. Diese Linse ist verkittet mit einer zweiten Linse, die die konvexe Fläche der ersten Linse umschließt und negative Brechkraft besitzt.
• Weiterhin ist aus der US 7,046,451 B2 ein Ölimmersionsobjektiv für Mikroskope mit einer numerischen Apertur NA > 1,45 bekannt, dessen erste objektseitige (Front-)Linsengruppe ebenfalls eine erste plan-konvexe Linse, deren plane Fläche dem Objekt zugewandt ist, aufweist, wobei die plan-konvexe Linse mit einer Meniskuslinse verkittet ist, deren konvexe Fläche der Bildseite zugewandt ist. Als Anwendungsgebiet wird auch hier die TIRF-Mikroskopie angegeben. Die numerische Apertur soll hier NA ≥ 1,46 betragen.
• Ein bekanntes Konstruktionsprinzip auch der oben genannten Ölimmersionsobjektive zur Herstellung hoher Aperturen ist die Einbettung der plan-konvexen, dem Objekt zugewandten Linse in eine zweite Linse durch Verkitten. Die Verkittung von Linsen ist allerdings mit den oben erwähnten Nachteilen behaftet.
• Aufgabe vorliegender Erfindung ist daher, ein Immersionsobjektiv für Mikroskope hoher numerischer Apertur NA > 1,36 anzugeben, das die mit der Verwendung von Kitten verbundenen Nachteile (Schädigung der Kitte bei hohen Bestrahlungsintensitäten und/oder Eigenfluoreszenz der Kitte) möglichst vermeidet.
• Kurzfassung der Erfindung
• Die Erfindung schlägt ein Immersionsobjektiv für Mikroskope gemäß Anspruch 1 und die Verwendung eines solchen Immersionsobjektivs für die Lokalisierungs- oder TIRF-Mikroskopie vor. Weitere Ausgestaltungen ergeben sich aus den jeweiligen Unteransprüchen und der nachfolgenden Beschreibung.
• Vorteile der Erfindung
• Das erfindungsgemäße Immersionsobjektiv für Mikroskope mit einer numerischen Apertur von NA > 1,36 besitzt eine Frontlinsengruppe, also eine unmittelbar dem Objekt zugewandte Linsengruppe, die als erstes objektseitiges optisches Element eine Planparallelplatte und als zweites optisches Element eine Überhalbkugel aufweist, wobei die Planparallelplatte an die plane Seite der Überhalbkugel angesprengt ist.
• Dem Optikfachmann ist der Begriff "Überhalbkugel" (englisch "hyper hemisphere") bekannt. Es handelt sich um einen Ausschnitt aus einer Kugel mit einem Öffnungswinkel über 180 Grad, also über den Scheitel hinaus. Eine solche Überhalbkugel ist beispielsweise in 2b dargestellt.
• Im Folgenden soll, wie bereits in der Beschreibungseinleitung erwähnt, die Erfindung für den konkreten Fall eines Ölimmersionsobjektivs erläutert werden. Die Erfindung ist jedoch ausdrücklich nicht auf Ölimmersionsobjektive beschränkt. Auch andere Immersionsmedien können beim erfindungsgemäßen Objektiv zum Einsatz kommen.
• Bei dem erfindungsgemäßen Objektiv handelt es sich um einen neuen Ansatz im Bereich der Ölimmersionsobjektive, wobei die Planparallelplatte als erstes objektseitiges optisches Element ein vollständig neues Design des gesamten Objektivs bedingt. Die Verwendung einer Planparallelplatte ermöglicht das Ansprengen des zweiten optischen Elements der Überhalbkugel. Bei der an sich bekannten Technik des Ansprengens werden zwei glatte, ebene Oberflächen frei von Schmutzpartikeln passgenau aufeinander aufgebracht und bleiben anschließend nur durch molekulare Anziehungskräfte miteinander fest verbunden. Die Verbindung der Planparallelplatte mit der planen Seite der Überhalbkugel muss dauerhaft und stabil sein. Aufgrund des Wegfalls der Notwendigkeit, die erwähnten optischen Elemente der Frontlinsengruppe miteinander zu verkitten, fallen die genannten Nachteile der Möglichkeit der Kittbeschädigung durch hohe Lichtintensitäten und der Eigenfluoreszenz des Kitts weg. Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass die damit verbundenen Vorteile etwaige Nachteile des neuen Objektivdesigns (Notwendigkeit der neuen Objektivkonstruktion und Möglichkeit einer optischen Verschlechterung durch das neue Objektiv) überwiegen.
• In der DE 199 29 403 A1 wird für einen anderen Objektivtyp, nämlich für ein Objektiv für eine Halbleiter-Lithographie-Projektionsbelichtungsanlage das Ansprengen einer dünnen äquidistanten Platte an ein weiteres optisches Element vorgeschlagen. Bei der dünnen äquidistanten Platte handelt es sich hier um eine sogenannte Abschlussplatte, die das Objektiv gegen Verunreinigungen schützt und abdichtet. Diese Abschlussplatte ist fassungsfrei und auswechselbar an das weitere optische Element angesprengt.
• Aus der DE 102 00 243 A1 ist ein allgemeines Verfahren zum Ansprengen eines optischen Elements auf ein Gegenelement bekannt. Hierbei wird das Gegenelement beispielsweise mittels einer Piezokeramik verformt, sodass seine Oberflächenform nicht mehr direkt mit der Oberflächenform des optischen Elements korrespondiert. Nach Aufbringen des optischen Elements auf das Gegenelement wird die Veränderung der Oberflächenform kontinuierlich aufgehoben, bis sich beide Elemente aneinander angesprengt haben.
• Vorteilhafterweise steht die Planparallelplatte über die plane Seite der Überhalbkugel. Dies eröffnet die Möglichkeit, die Frontlinsengruppe an der überstehenden Planparallelplatte mechanisch zu fassen bzw. zu fixieren. Prinzipiell ist auch der umgekehrte Fall denkbar, bei dem die mechanische Fixierung an der Überhalbkugel erfolgt, wenn diese über die Planparallelplatte übersteht.
• Vorzugsweise beträgt die Objektivvergrößerung beim erfindungsgemäßen Ölimmersionsobjektiv 50x bis 200x, vorzugsweise 100x bis 160x.
• Es hat sich gezeigt, dass die numerische Apertur des erfindungsgemäßen Ölimmersionsobjektivs NA > 1,40 betragen kann. Insbesondere können Aperturen von 1,43, 1,44 oder 1,45 erzielt werden.
• Die Dicke der Planparallelplatte sollte höchstens 1 mm betragen. Darüber hinaus sind Werte unterhalb 0,6 mm vorteilhaft. Als untere Grenze sind 0,4 mm sinnvoll.
• Mit besonderem Vorteil ist das erfindungsgemäße Ölimmersionsobjektiv ein plan-apochromatisches Objektiv. Dies bezeichnet bekanntlich ein Objektiv, bei dem die Farbfehler korrigiert sind und das Bildfeld auch in den Randbereichen geebnet ist. Dies ist insbesondere bei der Verwendung für die TIRF-Mikroskopie von großem Vorteil. Insbesondere ist der gesamte visuelle Bereich des erfindungsgemäßen Immersionsobjektivs apochromatisch nutzbar.
• Vorteilhafterweise besteht das erfindungsgemäße Ölimmersionsobjektiv aus drei Linsengruppen G1, G2 und G3. Hierbei bezeichnet die erste Linsengruppe G1 die Frontlinsengruppe, vorliegend also die Überhalbkugel mit der angesprengten Planparallelplatte. Die zweite Linsengruppe G2 besteht aus einer Einzellinse und verkitteten Linsen mit insgesamt drei Kittflächen (also beispielsweise drei Dubletts oder einem Dublett und einem Triplett). Die dritte Linsengruppe G3 beinhaltet den Rest des Objektivs, der mindestens vier Linsen mit mindestens zwei Kittflächen aufweist. Üblicherweise enthält die Linsengruppe G3 nicht mehr als sechs Linsen.
• Bei einem erfindungsgemäßen Ölimmersionsobjektiv mit der genannten Einteilung in Linsengruppen G1 bis G3 ist es für eine vorteilhafte Korrektion der Bildfehler zweckmäßig, wenn folgende drei Bedingungen erfüllt sind. Hierbei bezeichnet f die Brennweite: 3,0 < f(G1)/f(Objektiv) < 4,0 6,0 < f(G2)/f(Objektiv) < 7,0 –15,5 < f(G3)/f(Objektiv) < –14,5
• Das erfindungsgemäße Ölimmersionsobjektiv eignet sich insbesondere für die Lokalisierungsmikroskopie sowie für die TIRF-Mikroskopie. Allgemein ist das erfindungsgemäße Objektiv auch in allen anderen Verfahren der Fluoreszenzmikroskopie einsetzbar.
• Verfahren der Lokalisierungsmikroskopie zeichnen sich dadurch aus, dass bei der Aufnahme eines Bildes immer nur wenige Objektpunkte gleichzeitig Licht aussenden. Liegen die Punkte deutlich weiter voneinander entfernt als die optische Auflösung, kann der Ort dieser Punkte über mathematische Verfahren zur Schwerpunktsbestimmung mit einer Genauigkeit bestimmt werden, die höher ist als die optische Auflösung des verwendeten Objektivs. Werden viele dieser Einzelbilder aufsummiert, bei denen jeweils unterschiedliche Objektpunkte abgebildet werden, kann schließlich das gesamte Objekt mit Überauflösung bildlich dargestellt werden. Bekannte Ausführungsformen solcher Verfahren unterscheiden sich im Hinblick darauf, wie sichergestellt wird, dass nur wenige Objektpunkte gleichzeitig Licht aussenden. Bezeichnungen für solche Verfahren sind beispielsweise PALM, STORM oder GSDIM. Letzteres Verfahren soll nachfolgend kurz beschrieben werden.
• GSDIM steht für (engl.) "Ground State Depletion microscopy followed by Individual Molecule return". Für dieses Verfahren werden Fluorophore mit Tripletzuständen (auch "dark states") verwendet. Zunächst wird ein Farbstoffmolekül aus dem Grundzustand in einen angeregten Zustand durch Einstrahlung entsprechender Laserleistung gebracht. Vom angeregten Zustand aus erfolgt ein Übergang in den Tripletzustand, wobei dieser Tripletzustand eine weitaus höhere Lebensdauer (ca. 100 ms) als der angeregte Singletzustand (von nur etwa 3 ns) besitzt, so dass bei ausreichender Lichtintensität die Moleküle im Tripletzustand akkumulieren. Aus dem Tripletzustand gehen die Moleküle unter spontaner Emission in den Grundzustand zurück. Es werden Einzelbilder dieser spontanen Emissionen aufgenommen, wobei die Orte der spontanen Emissionen über die erwähnten mathematischen Verfahren mit einer Genauigkeit bestimmt werden können, die höher ist als die optische Auflösung. Die erreichbare Auflösung liegt zwischen 20 und 25 nm, im Allgemeinen unter 60 nm. Die erzielbare Auflösung hängt auch von der Laserleistung und der Auflösung der verwendeten Kamera ab.
• Die technische Hauptvoraussetzung zur Realisierung von GSDIM ist die Fluoreszenzanregung des Präparats mit hoher Lichtleistung. Dies kann über eine geeignete Laserbeleuchtung geschehen. Diese kann wiederum von einer TIRF-Beleuchtungseinrichtung bereitgestellt werden, die den Laserstrahl in die Objektivpupille (hintere Objektivbrennebene) fokussiert. Dies hat den Vorteil, dass man eine homogene Ausleuchtung des Präparats bei großer Schärfentiefe der Beleuchtung erhält. Um die Lichtleistung des Lasers optimal auszunutzen, wird der Strahlquerschnitt des Lasers so verkleinert, dass das ausgeleuchtete Präparatfeld im Vergleich zur TIRF-Beleuchtung nur noch etwa ein Viertel beträgt (beispielsweise beträgt der Durchmesser des ausgeleuchteten Präparatfelds ca. 60 µm bei Verwendung eines Objektivs mit Vergrößerung 100-fach, während bei TIRF-Beleuchtung dieser Durchmesser ca. 250 µm beträgt).
• Bezüglich der TIRF-Mikroskopie sei Folgendes kurz ausgesagt. Üblicherweise wird ein inverses Lichtmikroskop mit einem Ölimmersionsobjektiv mit sehr hoher numerischer Apertur eingesetzt, um den für eine Totalreflexion erforderlichen flachen Einstrahlwinkel erreichen zu können. Die Totalreflexion erfolgt an der Grenzfläche von Deckglas zu Präparat. Im Bereich hinter dem Deckglas bildet sich ein sogenanntes evaneszentes Feld aus, dessen Intensität exponentiell in das Präparat hinein abfällt. Für sichtbares Licht beträgt die typische Eindringtiefe 100 bis 200 nm. Befinden sich innerhalb dieses Bereiches fluoreszierende Moleküle, die Licht der eingestrahlten Wellenlänge absorbieren können, so werden diese zur Emission von Fluoreszenzlicht angeregt. Da die beobachtbare Schicht im Präparat nur 100 bis 200 nm dünn ist, kann eine deutlich höhere Auflösung entlang der optischen Achse des Objektivs erreicht werden als bei normaler Fluoreszenzmikroskopie (Schichtbereiche von typischerweise 500 nm). Bei der TIRF-Mikroskopie wird das Anregungslicht am Rand des Objektivs eingekoppelt, so dass es unter dem erforderlichen flachen Winkel auf das Deckglas fällt.
• Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachfolgend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
• Die Erfindung ist anhand von Ausführungsbeispielen in der Zeichnung schematisch dargestellt und wird im Folgenden unter Bezugnahme auf die Zeichnung ausführlich beschrieben.
• Kurze Beschreibung der Zeichnungen
• 1 zeigt schematisch den Mikroskopieaufbau bei einem gängigen Widefield-Verfahren der Fluoreszenzmikroskopie.
• 2 zeigt eine Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Objektivs in Gesamtansicht (2a) und deren Frontlinsengruppe in Detailansicht (2b).
• 3 zeigt schematisch eine typische Beleuchtung für die Lokalisierungsmikroskopie (3a) sowie für die TIRF-Mikroskopie (3b).
• 4 zeigt einen Strahlengang durch eine Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Objektivs für den Aufbau gemäß 3a in Gesamtansicht (4a) und in Detailansicht der Frontlinsengruppe (4b).
• 5 zeigt einen Strahlengang durch eine Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Objektivs bei einem Aufbau gemäß 3b in Gesamtansicht (5a) und in Detailansicht der Frontlinsengruppe (5b).
• 6 zeigt eine besondere Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Ölimmersionsobjektivs mit drei Linsengruppen.
• 7 zeigt schließlich die Abbildungsleistung eines solchen Objektivs, nämlich die longitudinale Aberration (7a) und die Verletzung der Sinusbedingung (engl.: "OSC", Offence against Sine-Condition)(7b).
• Ausführungsformen der Erfindung
• Anhand der folgenden Ausführungsbeispiele sollen die beiden wesentlichen Vorteile der Erfindung näher erläutert werden. Zum einen kann bei der Fluoreszenzmikroskopie keine Eigenfluoreszenz in der sonst üblichen Kittschicht zwischen zwei optischen Flächen entstehen (Ausführungsbeispiele zu den 1 und 2). Zum anderen kann bei Mikroskopieverfahren, die eine sehr hohe Lichtenergiedichte am Ort des Kontakts von zwei optischen Flächen erzeugen, der sonst zwischen diesen Flächen übliche Kitt nicht geschädigt werden (vgl. hierzu die Ausführungsbeispiele zu den 3, 4 und 5).
• 1 zeigt den Mikroskopieaufbau bei einem gängigen Widefield-Verfahren der Fluoreszenzmikroskopie bei Beleuchtung mit voller Apertur. Das Licht einer Lichtquelle (hier nicht dargestellt), zum Beispiel einer Gasentladungslampe, wird durch eine geeignete Beleuchtungsoptik (ebenfalls nicht dargestellt) so aufbereitet, dass eine zum Präparat 7 konjugiert liegende Leuchtfeldblendenebene 2 homogen ausgeleuchtet wird. Die optische Achse ist in 1 mit 1 bezeichnet. Eine Beleuchtungslinse 3 kollimiert das von der Leuchtfeldblende ausgehende Licht, das von einem Teilerspiegel 4 in das Objektiv 6 gelenkt wird. Üblicherweise ist der Teilerspiegel 4 als dichroitischer Teilerspiegel mit einem vorgeschalteten Anregungsfilter und einem nachgeschalteten Emissionsfilter, meist in Form eines Fluoreszenzfilterblocks, ausgestattet. Hierbei selektiert das Anregungsfilter Anregungswellenlängen aus dem Beleuchtungslicht, während das Emissionsfilter zur Kontraststeigerung das vom Objekt ausgehende Fluoreszenzemissionslicht transmittieren lässt und andere Wellenlängenbereiche abblockt. Dieser allgemein bekannte Aufbau ist in 1 der Einfachheit halber nicht detailliert wiedergegeben.
• Das Objektiv 6 bildet das Licht auf das Präparat 7 ab. Dabei wird typischerweise die Eintrittspupille 5 des Objektivs 6 vollständig mit Licht gefüllt. Das vom fluoreszierenden Präparat 7 abgegebene Emissionslicht gelangt seinerseits über das Objektiv 6, den dichroitischen Strahlteiler 4 und das üblicherweise dahinter geschaltete Emissionsfilter (hier nicht dargestellt) zur Tubuslinse 8, wodurch ein Bild des Präparats 7 in der Bildebene 9 erzeugt wird.
• Die volle Ausleuchtung der Eintrittspupille 5 des Objektivs 6 hat zur Folge, wie anhand der 2a und 2b erläutert werden wird, dass ein großer Bereich in der Frontgruppe des Objektivs von Licht durchsetzt wird. Sind die entsprechenden Linsenflächen der Frontgruppe nun durch Kitt verbunden, wird der Kitt Eigenfluoreszenz zeigen. Das in der Kittschicht entstehende Emissionslicht kann dann je nach Wellenlängenspektrum ganz oder zum Teil den Teilerspiegel 4 und das Emissionsfilter passieren und zur Bildebene 9 gelangen, wo es den Kontrast des Bildes mindert, das von den Fluoreszenzemissionen des Präparats erzeugt ist.
• Wird hingegen, wie in 2a und 2b dargestellt, ein erfindungsgemäßes Objektiv eingesetzt, sind die beiden vordersten objektseitigen optischen Elemente nicht durch Kitt verbunden, sondern optisch kontaktiert (angesprengt), sodass folglich auch kein störendes Emissionslicht durch Eigenfluoreszenz entstehen kann.
• 2a zeigt den Strahlengang 111 in einer Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Ölimmersionsobjektivs 100. Der Aufbau entspricht im Übrigen dem in 1 dargestellten. Die Frontlinsengruppe des Objektivs 100 ist mit 101 bezeichnet. Die Pupille des Objektivs ist mit 105 bezeichnet. 2b zeigt einen Ausschnitt betreffend die Frontlinsengruppe 101 aus 2a. Die Frontlinsengruppe 101 weist eine Planparallelplatte 103, auch als Planplättchen bezeichnet, sowie eine Überhalbkugel 102 auf, wobei das Planplättchen 103 an die plane Seite der Überhalbkugel 102 angesprengt ist. Die Kontaktfläche ist mit 104 bezeichnet. Aus 2b ist ersichtlich, dass über einen großen Bereich dieser Kontaktfläche 104 Licht in Richtung Präparat 7 (vgl. 1) hindurch tritt. Aufgrund des fehlenden Kitts entlang der Kontaktfläche 104 werden die genannten Eigenfluoreszenzen vermieden.
• 2b zeigt, dass die Planparallelplatte 103 in lateraler Richtung über die plane Fläche der Überhalbkugel 102 hinaussteht. Dieser Aufbau hat zwei Vorteile: Zum einen ist über die Planparallelplatte 103 eine einfache mechanische Halterung der Frontgruppe möglich. Zum anderen bieten die Kombination aus Überhalbkugellinse und Planplättchen Vorteile in der optischen Korrektion des Objektivs.
• Der eingangs erwähnte zweite wesentliche Vorteil kommt bei Mikroskopieverfahren zum Tragen, bei denen hohe Energiedichten in das Objektiv gelangen. Typische Vertreter solcher Mikroskopieverfahren sind die Lokalisierungsmikroskopie und die TIRF-Mikroskopie, beides Fluoreszenzmikroskopieverfahren. Diese Verfahren werden anhand der 3 bis 5 im Folgenden erläutert.
• Den beiden genannten Verfahren ist gemeinsam, dass das Anregungslicht in die Eintrittspupille 5 des Objektivs 6 fokussiert wird. Diese Fokussierung kann entweder auf einen Punkt der optischen Achse 1 erfolgen, wie in Zeichnung 3a, oder lateral dazu versetzt sein, wie in Zeichnung 3b dargestellt. Gleiche Bezugsziffern wie in 1 bezeichnen gleiche Bauteile. Insofern sei auf die Ausführungen im Zusammenhang mit 1 verwiesen. Im Unterschied zu 1 gelangt das Beleuchtungslicht zunächst auf einen Kippspiegel 11 und von dort auf ein Scanokular 12, das das Licht an eine zur Eintrittspupille 5 des Objektivs 6 konjugierte Stelle fokussiert. Über eine Transportoptik 13 wird das Licht in die Eintrittspupille 5 an einem Ort der optischen Achse 1 (oder in der Nähe derselbigen) fokussiert. Es ergibt sich eine Beleuchtung mit kleiner Apertur nahe der optischen Achse.
• 3b stellt ausgehend von 3a einen für die TIRF-Mikroskopie geeigneten Aufbau dar, der sich von demjenigen gemäß 3a im Wesentlichen nur darin unterscheidet, dass der Kippspiegel 11 den Beleuchtungsstrahlengang aus der optischen Achse 1 heraus lenkt, wobei die Optik bestehend aus Scanokular 12 und Transportoptik 13 gewährleistet, dass die Kippung des Spiegels 11 definiert in einen Lateralversatz am Ort der hinteren Brennebene 5 des Objektivs 6 umgesetzt wird. Der Aufbau gemäß 3b resultiert in einer Beleuchtung mit kleiner Apertur unter großem Einfallswinkel. Zwischen Beleuchtung für die Lokalisierungsmikroskopie (3a) und für die TIRF-Mikroskopie (3b) kann in einfacher Weise umgeschaltet werden, indem vor den Kippspiegel 11 ein den Strahldurchmesser verkleinerndes Fernrohr (nicht dargestellt) in den Strahlengang eingeklappt wird, wenn zur Lokalisierungsmikroskopie umgeschaltet wird. Dadurch reduziert sich der im Präparat ausgeleuchtete Kreis, womit die Leistungsdichte stark erhöht werden kann.
• Der Aufbau gemäß 3a erzeugt einen Beleuchtungsstrahlengang, der das Präparat 7 in einen kleinen Bereich um die optische Achse 1 mit hohen Leistungsdichten beleuchtet. Aus den oben genannten Gründen benötigen Verfahren der Lokalisierungsmikroskopie solche hohen Beleuchtungsintensitäten. In 4 ist der entsprechende Strahlengang durch das Objektiv näher dargestellt.
• Der in 3b dargestellte Strahlengang beleuchtet das Präparat 7 unter einen großen Einfallswinkel, wie er für die eingangs erwähnte TIRF-Mikroskopie benötigt wird. Der Strahlenverlauf durch das Objektiv ist in 5 dargestellt.
• 4 zeigt den Strahlengang bei einem Aufbau gemäß 3a durch eine Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Ölimmersionsobjektivs 100. Die Bezugsziffern entsprechen denjenigen aus 2; insofern sei auf die Erläuterungen zu 2 verwiesen. Deutlich sichtbar ist ein Beleuchtungsstrahlengang 112 kleiner Apertur nahe der optischen Achse. 4b zeigt wiederum die Frontlinsengruppe 101 in vergrößerter Darstellung. Der Strahlengang 112 durchtritt die Kontaktfläche 104 zwischen Planparallelplatte 103 und Überhalbkugel 102 nur in einem sehr kleinen Bereich um die optische Achse herum. Die gesamte Lichtenergie ist folglich in diesen kleinen Bereich konzentriert, woraus hohe Leistungsdichten resultieren. Diese hohen Leistungsdichten können in einer Kittfläche auf der Kontaktfläche 104 zu Beschädigungen des Kitts führen. Solche Beschädigungen führen zu "blinden Flecken", die die Qualität der Abbildung sowie der Beleuchtung vermindern. Aufgrund des Fehlens von Kitt an der Kontaktfläche 104 werden diese Nachteile vermieden.
• 5 zeigt schließlich den Strahlengang 113 in einer Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Ölimmersionsobjektivs 100 bei einer Beleuchtung gemäß 3b. Gut sichtbar ist der Strahlengang 113 mit kleiner Apertur und großem Einfallswinkel. Wiederum sind die gleichen Bezugszeichen wie in 2 gewählt, so dass insofern wieder auf diese Figur verwiesen wird.
• 5b zeigt die vergrößerte Ansicht der Frontlinsengruppe 101 aus 5a. Deutlich sichtbar ist, dass der Strahlengang 113 einen kleinen Bereich der Kontaktfläche 104 in Richtung Präparat 7 durchtritt. Der Strahlengang 113 trifft unter einem großen Einfallswinkel auf das Präparat 7, um dort evanescente Beleuchtung hervorzurufen. Die hohe Leistungsdichte im kleinen Bereich der Kontaktfläche 104 würde wiederum zu einer Beschädigung der üblichen Kitte führen. Das Fehlen eines Kitts an dieser Kontaktfläche 104 vermeidet diesen Nachteil.
• 6 zeigt eine besondere Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Ölimmersionsobjektivs 100 mit drei Linsengruppen G1, G2 und G3. Bei der Linsengruppe G1 handelt es sich um die Frontlinsengruppe 101, wie sie oben ausführlich diskutiert wurde. Bei der zweiten Linsengruppe G2 handelt es sich um eine Einzellinse und um drei Dubletten, also drei verkitteten Linsenpaaren. Bei der Linsengruppe G3 handelt es sich um den Rest des Objektivs, hier zwei Dubletten. Die Flächen der einzelnen optischen Elemente sind wie üblich durchnummeriert. Es handelt sich um die Flächen 1' bis 20'. In nachstehender Tabelle sind in üblicher Weise für diese Flächen (Fl) 1' bis 20' die entsprechenden Krümmungsradien (R in mm), die Abstände (d in mm) entlang der optischen Achse, die Brechzahlen (n_e) und die Dispersionen (ν_e) angegeben.

  Fl	R/mm	d/mm	ne	νe
  1'	Plan	0.53	1.62068	49.54	G1
  2'	Plan	3.15	1.57098	70.93
  3'	–2.45300	0.20
  4'	257.52650	3.50	1.43985	94.49	G2
  5'	–7.78480	0.20
  6'	20.91340	1.20	1.80811	46.32
  7'	9.61610	6.00	1.57098	70.93
  8'	–11.15490	0.25
  9'	35.64880	4.00	1.59447	67.97
  10'	–8.96400	1.20	1.64133	42.20
  11'	–84.89670	0.20
  12'	15.85320	3.50	1.43985	94.49
  13'	–8.67990	1.20	1.88815	40.52
  14'	219.36250	2.60
  15'	6.44310	3.50	1.43985	94.49	G3
  16'	–49.92590	1.20	1.71616	53.61
  17'	6.81440	11.4
  18'	7.56730	3.02	1.48914	70.22
  19'	2.99810	1.63	1.72310	29.28
  20'	3.40630

• Das hierdurch beschriebene Objektiv ist ein aplanatischer Achromat mit einer Brennweite von 1,25 mm und einer numerischen Apertur NA = 1,43. Die Brennweite ergibt in Verbindung mit einer Standardtubuslinse der Brennweite 200 mm eine Vergrößerung im Zwischenbild von 160x. Der Arbeitsabstand beträgt bei Verwendung eines Deckglases mit 0,17 mm Dicke W = 0,10 mm. Die Feldebnung ist für die Benutzung mit einer Kamera optimiert.
• Um eine vorteilhafte Korrektion der Bildfehler zu erreichen, erfüllen die Linsengruppen G1 bis G3 folgende Bedingungen (f=Brennweite): 3,0 < f(G1)/f(Objektiv) < 4,0 6,0 < f(G2)/f(Objektiv) < 7,0 –15,5 < f(G3)/f(Objektiv) < –14,5
• 7 zeigt die Abbildungsleistung eines solchen Objektivs, wobei 7a die longitudinale Aberration (Längsaberration) und in 7b die OCR (Verletzung der Sinusbedingung) dargestellt ist.
• Die Kurven sind für verschiedene Wellenlängen e = 546 nm, g = 436 nm, C' = 644 nm und F' = 480 nm aufgetragen. In 7a bezeichnet DOF die Schärfentiefe (engl. "depth of focus") und NA² die numerische Apertur im quadratischen Maßstab. Die Verletzung der Sinusbedingung in 7b ist wie üblich in Prozent aufgetragen.
• Bezugszeichenliste

1

optische Achse

2

Leuchtfeldblendenebene

3

Beleuchtungslinse

4

Teilerspiegel

5

Eintrittspupille des Objektivs

6

Objektiv

7

Präparat

8

Tubuslinse

9

Bildebene

11

Kippspiegel

12

Scanokular

13

Transportoptik

100

Ölimmersionsobjektiv

101

Frontlinsengruppe

102

Überhalbkugel

103

Planparallelplatte

104

Kontaktfläche

105

Objektivpupille

111

Strahlengang

112

Strahlengang

113

Strahlengang

G1, G2, G3

Linsengruppen

1'–20'

Linsenflächen

• ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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• Zitierte Patentliteratur
• US 7199938 B2 [0007]
• US 2002/0154414 A1 [0008]
• US 7046451 B2 [0009]
• DE 19929403 A1 [0017]
• DE 10200243 A1 [0018]

Claims (9)

1. Immersionsobjektiv (100) für Mikroskope, wobei das Objektiv eine numerische Apertur von NA > 1,36 besitzt und eine Frontlinsengruppe (101) aufweist, die als erstes objektseitiges optisches Element eine Planparallelplatte (103) und als zweites optisches Element eine Überhalbkugel (102) aufweist, wobei die Planparallelplatte (103) an die plane Seite der Überhalbkugel (102) angesprengt ist.
2. Objektiv nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Planparallelplatte (103) über die plane Seite der Überhalbkugel (102) übersteht.
3. Objektiv nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Frontlinsengruppe (101) an der überstehenden Planparallelplatte (103) mechanisch gefasst ist.
4. Objektiv nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Objektivvergrößerung 50x bis 200x, vorzugsweise 100x bis 160x beträgt.
5. Objektiv nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die numerische Apertur NA > 1,40 beträgt.
6. Objektiv nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Dicke der Planparallelplatte (103) höchstens 1 mm, insbesondere höchstens 0,6 mm beträgt.
7. Objektiv nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Immersionsobjektiv (100) ein plan-apochromatisches Objektiv ist.
8. Objektiv nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das aus drei Linsengruppen G1, G2 und G3 besteht, wobei die ersten Linsengruppe G1 aus der Frontlinsengruppe (101) besteht, die zweite Linsengruppe G2 aus einer Einzellinse und verkitteten Linse mit insgesamt drei Kittflächen und die dritte Linsengruppe G3 den Rest des Objektivs darstellt, wobei für die Brennweiten f folgende Bedingungen erfüllt sind: 3,0 < f(G1)/f(Objektiv) < 4,0 6,0 < f(G2)/f(Objektiv) < 7,0 –15,5 < f(G3)/f(Objektiv) < –14,5.
9. Verwendung eines Immersionsobjektivs (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche für die Lokalisierungs- oder TIRF-Mikroskopie.

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