DE69516007T2

DE69516007T2 - Verfahren zum nachweiss von antikörpern

Info

Publication number: DE69516007T2
Application number: DE69516007T
Authority: DE
Inventors: B. Metha; F. Ullman; S. Vold
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1994-09-21
Filing date: 1995-09-20
Publication date: 2000-11-02
Anticipated expiration: 2015-09-21
Also published as: JPH09511582A; EP0782710A1; ES2145924T3; US5561049A; DE69516007D1; JP3104999B2; EP0782710B1; AU3632195A; WO1996009552A1; AU695419B2; CA2200683A1; ATE191277T1

Description

Hintergrund der Erfindung

Gebiet der Erfindung

Die Detektion von Antikörpern ist ein nützliches Instrument zur Diagnose von durch Antigene hervorgerufenen Krankheiten. Die Detektion von Autoantikörpern eignet sich auch zur Bestimmung des Risikos eines Patienten, eine Krankheit zu entwickeln. Es wurde bereits viel über die Detektion von Autoantikörpern als Risikofaktor für Patienten geforscht, die insulinabhängigen Diabetes mellitus ("IDDM") entwickeln. Es existieren zahlreiche Autoantikörper, die offenbar ein Indikator für IDDM sind, der auch als Typ 1- Diabetes oder Jugenddiabetes bekannt ist. Dazu zählen Insulin-Autoantikörper, Zellantigen-Autoantikörper von Langerhans-Inseln oder - in jüngster Zeit - Autoantikörper gegen die 65 kd-Isoform von Glutaminsäure-Decarboxylase ("GAD&sub6;&sub5;").
Autoantikörper gegen GAD&sub6;&sub5; wurden als einer der frühesten Marker für die Entwicklung von IDDM vorgeschlagen. Diese Autoantikörper sind mehrere Jahre vor dem klinischen Einsetzen von IDDM vorhanden, wo Interventionsschritte gesetzt werden könnten, um das Fortschreiten der Krankheit zu unterbinden.

Beschreibung des verwandten Standes der Technik

Spezifische Antikörper können nur durch Detektion der Bindung an ihr Antigen oder eine Kopie davon gemessen werden. Obwohl bestimmte Klassen von Immunglobulinen, welche die Antikörper von Interesse enthalten, in einigen Fällen vor dem Assay von der Probe abgetrennt werden können (Decker et al., EP 0.168.689 A2), wird in allen Assays zumindest ein Teil der Proben-Immunglobuline mit Antigen kontaktiert. Beispielsweise kann in Assays auf spezifisches IgM ein Teil des gesamten IgM an eine Oberfläche adsorbiert und die Probe vor der Detektion des spezifischen IgM durch Kontaktieren mit Antigen entfernt werden. Bindung wird dann durch Detektion des gebundenen Antikörpers, Detektion des gebundenen Antigens oder Detektion des freien Antigens gemessen.
Zur Detektion von gebundenem Antikörper lässt man normalerweise markiertes Anti- Human-Immunglobufin oder markiertes Antigen an Antikörper binden, die spezifisch von der Probe an die mit dem Antigen beschichtete Oberfläche adsorbiert wurden (Bolz et al., US-A-4.020.151). Überschüssiges Reagens wird weggespült und die Markierung, die an der Oberfläche gebunden bleibt, detektiert. Dies ist das Verfahren in den am häufigsten angewandten Assays, beispielsweise Für Heptatis und menschliches Immunschwächevirus sowie für zahlreiche immunhistochemische Tests (Nakamura et al., Arch. Pathol. Lab. Med 112, 869-877 (1988)). Obwohl dieses Verfahren relativ empfindlich ist, wird es durch nicht-spezifische Bindung nicht-spezifischer Immunglobuline an die Oberfläche beeinträchtigt, welche Immunglobuline nicht von den spezifischen Immunglobulinen unterschieden werden können.
Ein weiteres Verfahren zum Detektieren gebundener Antikörper umfasst das Kombinieren der Probe und eines konkurrierenden markierenden Antikörpers mit einem trägergebundenen Antigen (Schuurs et al., US-A-3.65.090). Dieses Verfahren unterliegt Einschränkungen, da Antikörper in Seren zahlreiche Epitope binden, wodurch ein Konkurrieren ineffizient wird.
Zur Detektion von gebundenem Antigen kann das Antigen in einer größeren Menge als der maximalen Menge von in der Probe vorhandenem Antikörper oder in einer geringeren Menge als jene von Antikörper eingesetzt werden. Beispielsweise wurden Radioimmunfällungs-("RIP"-)Assays auf GAD-Autoantikörper entwickelt und werden derzeit eingesetzt (Atkinson et al., Lancet 335, 1357-1360 (1990)). Versuche, diesen Assay in das Format eines enzymgebundenen Immunosorbensassays ("ELISA") umzuwandeln, schlugen jedoch fehl. Der RIP-Assay basiert auf der Fällung von Immunglobulinen in menschlichen Seren und führte zur Entwicklung eines Radioimmungssays ("RIA") auf GAD-Autoantikörper. Sowohl im RIP als auch im RIA wird das Antigen im Überschuss zugegeben und der gebundene Antigen-Antikörper-Komplex mit Protein A-Sepharose gefällt. Der Komplex wird dann gewaschen oder durch Elektrophorese weiter aufgetrennt und das Antigen im Komplex detektiert.
Auch andere FällungsMittel können eingesetzt werden, wie z. B. Rheumafaktor oder C1q (Masson et al. US-A-4.062.935); Polyethylenglykol (Soeldner et al., US-A-4.855.242); und Protein A (Ito et al., EP 0.410.893 A2). Das gefällte Antigen kann gemessen werden, um die in der Probe vorhandene Menge an Antigen anzuzeigen; die in Lösung verbleibende Antigen-Menge kann gemessen werden; oder es können sowohl das gefällte Antigen als auch das lösliche Antigen gemessen werden, um jedes markierte Antigen zu berücksichtigen, das nicht-spezifisch gefällt wurde. Zwar sind diese Verfahren alle recht empfindlich, doch ist ihre Durchführung schwierig, da eine strenge Abtrennung des freien Antigens vom gebundenen Komplex notwendig ist, was zumindest Filtration oder Zentrifugation und mehrere Waschungen des Niederschlags voraussetzt.
Alternativ dazu kann Detektion des gebundenen Antigens erfolgen, wenn die Menge an Antigen geringer ist als die maximale Menge an Antikörper. Normalerweise geschieht dies unter Verwendung von Teilchen, wie z. B. Latexteilchen oder Erythrozyten, die mit dem Antigen beschichtet wurden (Cambiaso et al., US-A-4.184.849 und Uchida et al., EP 0.070.527 A1). Antikörper können diese Teilchen spezifisch agglutinieren und dann durch Lichtstreuung oder andere Verfahren detektiert werden. Es ist in diesen Assays notwendig, eine exakte Menge an Antigen zu verwenden, da zu wenig Antigen eine Assayreaktion hervorruft, die zweiphasig ist; hohe Antikörpertiter können als negativ abgelesen werden, während zu viel Antigen die Empfindlichkeit beeinträchtigt. Es ist daher notwendig, Reihenverdünnungen der Probe vorzunehmen, uni sicherzustellen, dass positive Proben nicht unbeachtet bleiben. Außerdem deektieren diese Assays oft nur Antikörper mit relativ hohen Affinitäten, und die Empfindlichkeit des Verfahrens leidet unter der Tendenz aller Bindungsstellen jedes Antikörpers, sich an das Antigen auf dem Teilchen zu binden, an das er sich zuerst bindet, wodurch zur Bindung an das andere Teilchen keine Stellen zur Verfügung stehen.
Für Assays, in denen das freie Antigen detektiert wird, kann das Antigen auch im Überschuss oder in einer begrenzten Menge zugegeben werden, obwohl nur über die erstere Vorgangsweise berichtet wurde. Assays dieser Art wurden beschrieben und umfassen die folgenden Schritte: Zugabe eines Antigen-Überschusses zur Probe, Fällen der Immunglobuline und Messen des in der Lösung verbleibenden Antigens (Masson et al., s. o., und Soeldner et al., s. o.). Diese Assays sind relativ unempfindlich, da nur eine geringe prozentuelle Änderung der Menge an freiem Antigen mit geringen Antikörper- Mengen eintritt und es schwierig ist, diesen geringen Prozentsatz präzise zu messen.
Praktische Assays, in denen das freie Antigen detektiert wird und das Antigen nicht in einer größeren Menge als der maximalen Menge an Antikörper vorhanden ist, die in einer Probe erwartet wird, wurden bislang nicht beschrieben. Bei von Erp et al., Journal of Immunoassay 12(3), 425-443 (1991), wurde jedoch eine fixe Konzentration an monoklonalem Antikörper mit einer Konzentrations-Verdünnungsreihe von Antigen inkubiert und das freie Antigen dann mittels eines Goldsol-Partikelagglutinations-Immungssays gemessen, um Antikörper-Affinitätskonstanten zu bestimmen.
Die EP-A-0.524.502 beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung der Menge an freiem Analyten in einer Probe. Ein erstes Flüssigkeitsvolumen, das löslichen Anti-Analyt-Rezeptor in größerer Menge als freien Analyten in der Probe enthält, wird zugegeben, das Gemisch wird inkubiert, ein zweites Flüssigkeitsvolumen, das ein markierten Analyten umfassendes lösliches Konjugat enthält, wird zugegeben, und das Gemisch wird wieder inkubiert. Das Konjugat bindet sich an alle freien Anti-Analyt-Rezeptoren, die nicht in der ersten Inkubationsreaktion gebunden wurden. Die Konzentration an freiem Analyten in der Probe wird durch Messen der Menge an Konjugat bestimmt, das an ein Festphasen-Tennmittel gebunden ist.
Es wurden im Bereich der Bewertung nützlicher Marker zur Bestimmung des Risikofaktors von IDDM entwickelnden Patienten viele Forschungsarbeiten durchgeführt. Dazu zählen Insulin-Autoantikörper (Soeldner et al., s. o.) und zirkulierende Autoantikörper gegen Glutaminsäure-Decarboxylase ("GAD"; Atkinson et al., PCT/US89/05570) und Tobin et al., PCT/US91/06872). Außerdem beschreiben Rabin et al., US-A-5.200.318, mehrere Assayformate zur Detektion von GAD und Zellantigen-Autoantikörpern von Langerhans-Inseln. GAD-Autoantikörper sind von besonderer diagnostischer Bedeutung, da sie in präklinischen Stadien der Krankheit auftauchen, was therapeutische Interventionen ermöglichen kann. Die Verwendung von GAD-Autoantikörpern als diagnostische Marker jedoch wurde durch den Mangel eines geeigneten, Nicht-Isotopen-Assays beeinträchtigt.
Ein Assayverfahren umfasst das Inkubieren eines trägergebundenen Antigens mit der Probe und das anschließende Zugeben eines markierten Anti-Human-Immunglobulins. Dies ist die Basis für zahlreiche im Handel erhältliche Assaysets auf Antikörper, wie z. B. das Synelisa-Set, das auf Autoantikörper gegen GAD&sub6;&sub5; testet Lind in der Produktliteratur unter dem Titel "Synelisa GAD II-Antibodies" (Elias USA, Inc.) beschrieben ist. Es ist eine hohe Verdünnung der Probe erforderlich, da das Verfahren starken Hintergrundsignalen aus der Adsorption nicht-spezifischer Immunglobuline an den Träger ausgesetzt ist.
Viele der oben beschriebenen Assays umfassen die Detektion von Antikörper, der sich an ein immobilisiertes Antigen bindet. Dies kann nachteilige Wirkung auf die Empfindlichkeit des Assays haben, da es schwierig ist, zwischen spezifischen Immunglobulinen und anderen Immunglobulinen in der Probe zu unterscheiden, die sich nicht-spezifisch an das immobilisierte Antigen binden. Es besteht nicht nur die Notwendigkeit, einen Assay zu entwickeln, der nicht-spezifische Detektion von Immunglobulinen vermeidet, sondern auch die Notwendigkeit, ein verbessertes Verfahren zum Detektieren von Antikörpern bereitzustellen, das den Empfindlichkeitsvorteil von Immunfällungsassays mit einer vereinfachten Arbeitsvorschrift kombiniert. Schließlich sind Assays, die dazu beitragen, das Risiko der Entwicklung von Krankheiten wie etwa IDDM abzuschätzen, medizinisch und wirtschaftlich sehr wichtig. Die vorliegende Erfindung deckt diesen Bedarf ab.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweis der Gegenwart oder zur Bestimmung der Menge von Antikörpern in einer Probe, die vermutlich die Antikörper enthält.
Ein Aspekt der Erfindung betrifft das Kombinieren der Probe mit einem Antigen, das die Antikörper in der Probe bindet, um einen Antigen-Antikörper-Komplex zu bilden. Die Menge des eingesetzten Antigens ist Z, worin Z im Bereich von X bis nX liegt und Z kleiner als Y ist, worin n = 5 bis 1000, vorzugsweise 10 bis 100, ist, X die minimale Menge an Antigen ist, die zuverlässig nachweisbar ist, wenn in einer Probe keine Antikörper vorhanden sind, und Y die maximale erwartete Menge an Antikörpern in der Probe ist.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung eines ersten Bindemittels, das zwar den Komplex, nicht aber das Antigen bindet, wenn das Antigen kein Teil des Komplexes ist, und die Verwendung eines zweiten Bindemittels, welches das Antigen relativ zur Bindung des Komplexes selektiv bindet, wenn der Komplex am ersten Bindemittel gebunden ist. Das erste Bindemittel kann an einem löslichen Polymer oder einer suspendierbaren festen Phase gebunden sein. Das zweite Bindmittel kann an einer festen Phase gebunden sein. Das zweite Bindemittel kann auch zwei Rezeptoren darstellen, die das Antigen binden, wobei jeder Rezeptor an eine Komponente eines signalerzeugenden Systems gebunden ist.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft den Nachweis der Gegenwart oder die Bestimmung der Menge an Antigen, das kein Teil des Komplexes ist, als Nachweis der Gegenwart oder zur Bestimmung der Menge der Antikörper in der Probe.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Nachweis der Gegenwart oder zur Bestimmung der Menge von Glutaminsäure-Decarboxylase-("GAD-")Autoantikörpern.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine Verbesserung eines Assays, vorin eine Probe, die vermutlich einen Zielantikörper enthält, und ein Antigen, das den Antikörper bindet, kombiniert werden, um ein Gemisch zu bilden, das einen Antigen-Antikörper-Komplex und freies Antigen enthält, das detektiert wird. Die Verbesserung umfasst die Verwendung einer Menge von Antigen, die Z ist, worin Z im Bereich von X bis nX liegt und Z kleiner als Y ist, vorin n = bis 1000, vorzugsweise 10 bis 100, ist, X die minimale Menge an Antigen ist, die zuverlässig nachgewiesen werden kann, wenn keine Antikörper in einer Probe vorhanden sind, und Y die maximale erwartete Menge an Antikörpern in der Probe ist. In einem weiteren Aspekt der Erfindung umfasst die Verbesserung die Zugabe eines ersten Bindemittels, das den Komplex, jedoch nicht freies Antigen bindet, gefolgt von der Zugabe eines zweiten Bindemittels, das freies Antigen, jedoch nicht Antigen bindet, wenn es Teil des an das erste Bindemittel gebundenen Komplexes ist.
Die Erfindung umfasst ferner Sets zur Verwendung in diesen Verfahren.

Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen

Vor einer weiteren Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen der Erfindung werden einige Begriffe definiert.
Analyt: Die zu detektierenden Antikörper oder Autoantikörper. Dazu zählen vollständige Immunglobuline oder deren Fragmente sowie verschiedene Klassen und Isotypen, z. B. IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b und IgG3 sowie IgM.
Antigen: Eine Verbindung, gegen die Antikörper gebildet werden können und die sich an einen Antikörper binden kann, um spezifische Antikörper-Antigen-Komplexe zu bilden. Das Antigen wird durch den Antikörper-Analyten gebunden, üblicherweise ein Biomolekül viralen, mikrobiologischen oder Säugetierursprungs oder eine Nachbildung davon oder andere Moleküle synthetischen oder natürlichen Ursprungs, die sich in der Umwelt finden, z. B. Arzneimittel, Pestizide, Umweltschadstoffe und dergleichen. Das Antigen kann in seiner natürlichen Form im Assay eingesetzt oder modifiziert werden, sofern die Modifikation seine antigene Beschaffenheit nicht beeinträchtigt. Typische Modifikationen sind kovalente oder nicht-kovalente Bindung eines spezifischen Bindungspaarelements und/oder eines detektierbaren Markers an das Antigen, wovon einer oder beide Faktoren die Detektion des Antigens erleichtern kann/können.
Probe, die vermutlich den Analyten enthält: Jede Probe, von der man vernünftigerweise annehmen kann, dass sie die Antikörper oder Autoantikörper von Interesse enthält, kann durch die erfindungsgemäßen Verfahren analysiert werden. Die Probe ist typischerweise eine wässrige Lösung wie z. B. eine Körperflüssigkeit eines Wirts, beispielsweise Harn, Vollblut, Plasma, Serum, Speichel, Sperma, Stuhl, Sputum, Rückenmarksflüssigkeit, Tränen, Schleim oder dergleichen, vorzugsweise jedoch Plasma oder Serum. Die Probe kann - wie unten beschrieben - vorbehandelt und in jedem geeigneten Medium bereitgestellt werden, das den Assay nicht stört. Ein wässriges Medium wird bevorzugt.
Element eines spezifischen Bindungspaars ("sbp"-Element): ein oder zwei unterschiedliche Moleküle mit einem Bereich an der Oberfläche oder in einem Hohlraum, der sich spezifisch an eine bestimmte räumliche und polare Organisation des anderen Moleküls bindet und daher als komplementär dazu definiert ist. Die sbp-Elemente können als Ligand und Rezeptor bezeichnet werden, z. B. Elemente eines immunologischen Paars wie etwa Antigen-Antikörper. Der Ausdruck "Ligand" bezieht sich auf jede organische Verbindung, für die ein Rezeptor natürlich existiert oder hergestellt werden kann; der Ausdruck "Rezeptor" bezieht sich auf jede Verbindung oder Zusammensetzung, die zur Erkennung einer bestimmten räumlichen und polaren Organisation eines Moleküls, d. h. einer epitopen oder Determinantenstelle, fähig ist. Komplementäre sbp-Elemente binden sich aneinander, z. B. ein Ligand und sein komplementärer Rezeptor. Sbp-Elemente können immunologische Paare, wie etwa Antigen und Antikörper, oder nicht-immunologische Paare, wie etwa Avidin und Biotin, oder die komplementären Stränge eines Oligonukleotids sein. Sbp-Elemente können auch kleine Moleküle oder Reste kleiner Molekü le und deren Rezeptoren sein. Kleine Moleküle besitzen ein Molekulargewicht von 100 bis 2000, vorzugsweise 150 bis 1000, und ein Rezeptor für das kleine Molekül existiert entweder oder kann produziert werden. Beispiele für kleine Moleküle sind Derivate von Biotin, Lysergsäure, Fluorescein oder ein Fluorescein-Derivai und Vitamin B&sub1;&sub2;, wobei die korrespondierenden Rezeptoren Avidin oder Streptavidin, Anti-Lysergsäure, Anti- Fluorescein bzw. innerer Faktor sein. Kleine Moleküle sind oft kovalent an andere sbp- Elemente gebunden, um ein Konjugat mit zumindest einem und häufig 2 bis 20 kleinen Molekülen zu bilden. Die Bindung des kleinen Moleküls an das sbp-Element kann folgendermaßen erfolgen: durch chemische Reaktionen, die zur Ersetzung eines Wasserstoffatoms des kleinen Moleküls durch eine Bindung an das sbp-Element führen, oder durch eine Bindungsgruppe zwischen den kleinen Molekül und dem sbp-Element jeder beliebigen Größe, das jedoch vorzugsweise nicht größer als notwendig ist, um die Bindung des Konjugats eines Rezeptors für das kleine Molekül und des sbp-Elements zu ermöglichen. Antikörper gegen kleine Moleküle können durch Immunisieren von Tieren mit einem Immunogen gebildet werden, das durch Verbinden des kleinen Moleküls mit einem immunogenen Träger entsteht.
Träger oder Oberfläche: Die teste Phase ist typischerweise ein Träger oder eine Oberfläche, der/die ein poröses oder nicht-poröses wasserunlösliches Material ist, das einige unterschiedliche Formen aufweisen kann, z. B. Streiten, Stäbe, Teilchen, Perlen und dergleichen. Geeignete Materialien sind auf dem Gebiet allgemein bekannt und beispielsweise in folgenden Publikationen beschrieben: Ullman et al., US-A-5.185.243, Spalten 10-11; Kurn et al., US-A-4.868.104, Spalte 6, Zeilen 21-42; und Milburn et al., US-A- 4.959.303, Spalte 6, Zeilen 14-31, die hierin durch Verweis aufgenommen sind. Die Bindung von Liganden und Rezeptoren an den Träger oder die Oberfläche kann durch allgemein bekannte und in der Literatur beschriebene Verfahren durchgeführt werden. Siehe z. B. "Immobilized Enzymes", Ichiro Chibata, Halsted Press, New York (1978), und Cuatrecasas, J. Biol. Chem. 245, 3059 (1970). Gleichgültig, welcher teste Träger eingesetzt wird, muss er behandelt werden, um entweder einen Rezeptor oder einen Liganden, der das Antigen direkt oder indirekt bindet, an seine Oberfläche zu binden. Ty pische Rezeptoren sind Antikörper, innerer Faktor, spezifisch reaktive Chemikalien wie etwa Sulfhydrylgruppen, die mit einer Gruppe auf dem Antigen reagieren können, und dergleichen. Beispielsweise können Avidin oder Streptavidin kovalent an kugelförmige Glasperlen von 0,5 bis 1,5 mm gebunden und dazu verwendet werden, ein biotinyliertes Antigen zu binden.
Signalerzeugendes System ("sps"): eine oder mehrere Komponenten, wovon zumindest eine ein Marker ist, die ein detektierbares Signal erzeugen, das mit der Menge an gebundenem und/oder ungebundenem Marker in Zusammenhang steht, d. h. der Menge an Marker, der an der detektierten Verbindung gebunden oder nicht gebunden ist. Der Marker ist ein beliebiges Molekül, das ein Signal erzeugt oder dazu gebracht werden kann, ein Signal zu erzeugen, z. B. ein Fluoreszenzmittel, Enzym, Chemolumiszenzmittel oder Photosensibilisator. Somit wird das Signal durch Detektieren von Enzymaktivität, Lumineszenz oder Lichtabsorption detektiert und/oder gemessen.
Die folgende Auflistung geeigneter Marker ist lediglich veranschaulichend und nicht einschränkend: Enzyme, wie z. B. alkalische Phosphatase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase ("G6PDH") und Meerrettich-Peroxidase; Ribozym; ein Substrat für eine Replikase, wie z. B. Qβ-Replikase; Beschleuniger; Farbstoffe; Fluoreszenzmittel, wie z. B. Fluorescein, Isothiocyanat, Rhodamin-Verbindungen, Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthalaldehyd und Fluorescamin; Chemolumineszenzmittel wie etwa Isoluminol; Sensibilisatoren; Coenzyme; Enzymsubstrate; Photosensibilisatoren; Teilchen wie etwa Latex- oder Kohlenstoffteilchen; suspendierbare Teilchen; Metallsol; Crystallit; Liposome; Zellen usw., die mit einem Farbstoff, Katalysator oder eine anderen detektierbaren Gruppe weiter markiert sein können. Geeignete Enzyme und Coenzyme sind bei Litman et al., US-A-4.275.149, Spalten 19-18; und Boguslaski et al., US-A-4.318.980, Spalten 10-14, geoffenbart; geeignete Fluoreszenzmittel und Chemolumineszenzmittel sind bei Litman et al., US-A-4.275.149, Spalten 30 und 31, beschrieben, welche Veröffentlichungen hierin durch Verweis aufgenommen sind. Vorzugsweise ist zumindest ein sps-Element aus der aus Fluoreszenzmitteln, Enzymen, Chemolumineszenzmitteln, Photosensibilisatoren und suspendierbaren Teilchen bestehenden Gruppe ausgewählt.
Der Marker kann direkt ein signal erzeugen, weshalb keine zusätzlichen Komponente zur Signalerzeugung notwendig sind. Zahlreiche organische Moleküle, z. B. Fluoreszenzmittel, können auch ultraviolettes und sichtbares Licht absorbieren, wobei die Lichtabsorption Energie auf diese Moleküle überträgt und sie in einen angeregten Energiezustand hebt. Diese absorbierte Energie wird dann durch Lichtemission bei einer zweiten Wellenlänge abgeleitet. Andere Marker, die direkt ein Signal erzeugen, umfassen radioaktive Isotope und Farbstoffe.
Alternativ dazu kann der Marker andere Komponenten zur Signalerzeugung benötigen, und das sps würde dann all jene Komponenten enthalten, die zur Erzeugung eines messbaren Signals erforderlich sind; dazu zählen z. B. Substrate, Coenzyme, Verstärker, zusätzliche Enzyme, Substanzen, die mit Enzym-Produkten reagieren, Katalysatoren, Aktivatoren, Cofaktoren, Inhibitoren, Fänger, Metallionen, spezifische Bindungssubstanzen, die zur Bindung signalerzeugender Substanzen notwendig sind, und dergleichen. Eine detaillierte Besprechung geeigneter signalerzeugender Systeme findet sich bei Ullman et al., US-A-5.185.243, Spalten 11-13, welche Veröffentlichung hierin durch Verweis aufgenommen ist.
Der Marker wird an ein sbp-Element gebunden, welches das Antigen ist, das Antigen direkt oder indirekt binden kann oder ein Rezeptor für das Antigen ist; dazu zählen u. a. das Antigen; ein Ligand für einen an das Antigen gebundenen Rezeptor; ein Rezeptor für einen an das Antigen gebundenen Liganden; ein Antikörper, der das Antigen bindet; ein Rezeptor für einen Antikörper, der das Antigen bindet; ein Rezeptor für ein an einen Antikörper gegen das Antigen gebundenes Molekül; ein Antigensurrogat, das einen Rezeptor für das Antigen binden kann; ein Ligand, der das Antigen bindet, usw. Die Bindung des Markers an das sbp-Element kann mittels nicht-kovalenter Bindung, z. B. durch Bildung eines Komplexes des Markers mit dem Antikörper gegen den Marker, oder mit tels kovalenter Bindung, z. B. durch chemische Reaktionen, die zur Ersetzung eines Wasserstoffatoms des Markers durch eine Bindung an das sbp-Element führen oder eine Bindungsgruppe zwischen dem Marker und dem sbp-Element vorsehen, erfolgen. Solche Konjugationsverfahren sind auf dem Gebiet allgemein bekannt. Siehe z. B. Rubenstein et al., US-A-3.817.837, die hierin durch Verweis aufgenommen ist. Andere sps- Elemente können auch kovalent an sbp-Elemente gebunden sein. Bei Ullman et al., US- A-3.996.345, beispielsweise können zwei sps-Elemente, wie z. B. Fluoreszenzmittel und Quencher, jeweils an zwei sbp-Elemente gebunden sein, die beide den Analyten binden, wodurch ein Fluoreszenzmittel-sbp&sub1;:Analyt:sbp&sub2;-Quencher-Komplex entsteht. Die Bildung des Komplexes bringt das Fluoreszenzmittel und den Quencher in unmittelbare Nähe, wodurch der Quencher mit dem Fluoreszenzmittel in Wechselwirkung treten kann, um ein Signal zu erzeugen. Es handelt sich hier um einen Fluoreszenz-Anregungs- Übertragungs-Immungssay. Ein anderes Konzept ist bei Ullman et al., EP 0.515.194 A2, beschrieben, worin eine Chemolumineszenz-Verbindung und ein Photosensibilisator als sps-Elemente eingesetzt werden. Dies ist ein sogenannter Lumineszenz-Sauerstoffkanalisierungs-Immungssay. Beide Veröffentlichungen sind hierin durch Verweis aufgenommen.
Hilfsmaterialien: Verschiedene Hilfsmaterialien werden häufig in den Verfahren der Erfindung eingesetzt. Beispielsweise sind Puffer ebenso wie Stabilisatoren für das Assaymedium und die Assaykomponenten normalerweise im Assaymedium vorhanden. Oft können zusätzlich zu diesen Additiven Proteine, z. B. Albumine, organische Lösungsmittel wie Formamid, quaternäre Ammoniumsalze, Polykationen, wie z. B. Dextransulfat, oder Tenside, insbesondere nicht-ionogene Tenside, Bindungsverstärker, wie z. B. Polyalkylenglykole, oder dergleichen enthalten sein.
Wie bereits erwähnt, betrifft die Erfindung Verfahren zum Nachweis der Gegenwart oder zur Bestimmung der Menge an Antikörpern, vorzugsweise Serumantikörpern, in einer Probe, die vermutlich die Antikörper enthält. Die Verfahren kombinieren den Empfindlichkeitsvorteil von Immunfällungsassays mit einer vereinfachten Arbeitsvorschrift.
Die Verfahren der Erfindung bieten verschiedene große Vorteile gegenüber früheren ELISA-Verfahren zum Detektieren von Antikörpern. "Traditionelle" ELISA-Verfahren zum Detektieren von Antikörpern umfassen die Bindung von Antikörpern in einer Probe an ein Antigen, das Abtrennen des resultierenden Antigen-Antikörper-Komplexes von der Probe und das anschließende Detektieren der Antikörper oder des Antigens. Wenn sich ein Antikörper direkt an ein immobilisiertes Antigen bindet, wird der Antikörper detektiert, doch die empfindliche Detektion dieses Antigen gebundenen spezifischen Immunglobulins ist aufgrund nicht-spezifischer Bindung irrelevanter Immunglobuline in der Probe, die in großen Mengen vorhanden sein können, schwierig. In der Folge weisen Assays, welche die Menge gebundener Antikörper direkt messen, oft begrenzte Empfindlichkeit auf. Eine zusätzliche Komplikation ergibt sich beim Testen auf Autoantikörper, da einige Patienten sehr niedrige Titer der detektierten Autoantikörper besitzen. Die Erfindung detektiert Antikörper nicht direkt, weshalb sie durch die nicht-spezifische Bindung von Immunglobulinen nicht beeinflusst wird. Wenn Immunkomplexe auf Antigen analysiert werden, sind aufwändige Trenn- und Waschschritte erforderlich, während derer die Gefahr besteht, dass ein Teil des Antigens verloren geht. Das vorliegende Verfahren vermeidet diesen Schritt. Da Antigendetektion nach einem homogenen Verfahren durchgeführt werden kann, können sehr einfache Arbeitsvorschriften zur Anwendung kommen, da für das gesamte erfindungsgemäße Verfahren keine Trennschritte notwendig sind.
Ein Schlüsselaspekt der Erfindung ist die molare Menge an Antigen, die dem die Probe enthaltenden Medium zugegeben wird; sie ist üblicherweise weniger als 1 uM, häufig weniger als 1 nM und vorzugsweise weniger als 0,1 nM und wird in einer Menge zugegeben, welche die höchste erwartete Menge an Antikörpern in der Probe nicht übersteigen sollte. Die Messung von freiem Antigen, das nach der Bindung an die Antikörper verbleibt, ermöglicht die außerordentlich empfindliche Detektion der Antikörper. Obwohl hohe Konzentrationen der Antikörper nicht quantifiziert werden können, besteht kein Risiko, Proben mit hohem Titer falsch zu messen, was in direkten Latex-Agglutinie rungsassays der Fall ist. Wenn ein großer Überschuss an Antigen zugegeben werden würde, d. h. wenn die molare Menge an Antigen größer wäre als die höchste erwartete molare Menge an Antikörper, z. B. in einem typischen RIP-Assay, tritt infolge der Unmöglichkeit, eine genaue Messung der Reduktion von freiem Antigen mit Proben mit niedrigem Titer zu erreichen, ein Verlust an Empfindlichkeit ein.
Maximale Empfindlichkeit erfordert daher die Verwendung einer niedrigen Konzentration an Antigen. Obwohl die niedrigeste praktikable Konzentration an Antigen die niedrigste Konzentration ist, die detektiert werden kann, wenn die Probe keinen Antikörper enthält, ist es normalerweise wünschenswert, bis zum 1000-fachen dieser minimalen nachweisbaren Konzentration, vorzugsweise höchstens das 100-fache der minimalen nachweisbaren Konzentration, zu verwenden. Im Allgemeinen gilt: je mehr Antigen eingesetzt wird, desto größer der Bereich an Antikörper-Konzentrationen, die genau messbar sind, und desto geringer die Empfindlichkeit des Assays.
Die minimale Menge an Antigen, die in den Verfahren der Erfindung zugegeben wird, wird durch die Nachweisgrenze des Antigens in Abwesenheit von Antikörper in der Probe bestimmt, d. h. ausreichend Antigen muss zugegeben werden, damit es nach dem angewendete Assayverfahren detektierbar ist. Dieser Wert kann von Fachleuten auf dem Gebiet problemlos ermittelt werden, indem eine Reihe von Tests durchgeführt wird - beginnend mit null Antigen und unter Verwendung bekannter Inkrement-Mengen an Antigen, bis ein Antigen-Wert erreicht ist, der durch das im Assay angewendete Verfahren zuverlässig detektiert werden kann. Der Ausdruck "zuverlässig" bedeutet hierin, dass der gleiche Assay wiederholt durchgeführt werden kann und das Antigen reproduzierbar detektiert wird. Die minimale Menge an Antigen, die zuverlässig detektierbar ist, ist als Antigen-Menge definiert, die ein Signal erzeugt, das sich um etwa die dreifache Standardabweichung vom Signal unterscheidet, das bei Abwesenheit von Antigen erhalten wird. Wenn beispielsweise das im Assay anzuwendende Verfahren ELISA ist, sind Anti- Antigen-Antikörper an einen Träger gebunden, und Proben variierender bekannter Mengen an Antigen werden dem Träger zugegeben, der erneut gewaschen wird, gefolgt von der Zugabe von Enzymsubstrat. Die Umsetzungsrate des Substrats in Produkt steht mit der Menge an vorhandenem Antigen in Zusammenhang. Wenn ein Antigen-Wert erreicht wird, der wiederholt über mehrere Assays detektierbar ist, wird diese Menge als "minimale Menge an Antigen, die zuverlässig detektierbar ist, wenn in einer Probe keine Antikörper vorhanden sind", bezeichnet.
Die maximale einem Assay zuzugebende Menge an Antigen übersteigt nicht die höchste erwartete Menge an Antikörper, die dem Assay von der Probe aus zugeführt wird, und ist üblicherweise zumindest 100-fach geringer als die höchste erwartete Menge an Antikörper. Für diesen Zweck kann eine präzise Messung der Menge an Antikörper in einer Probe erzielt werden, indem ein Assay der Erfindung unter Verwendung einer willkürlich festgelegten Konzentration des Antigens durchgeführt und der Assay in Reihenverdünnungen der Probe wiederholt wird. Die Menge an Antikörpern in der Probe wird als das Doppelte der Menge an Antigen angesehen, dividiert durch den Verdünnungsfaktor, wenn das Signal aufgrund des freien Antigens im Assay infolge der zugegebenen Probe um 50% reduziert ist.
Die dem Medium in der Erfindung zugegebene Menge an Antigen kann auch als "Z" ausgedrückt werden, vorin Z in einem Bereich von X bis nX liegt und Z kleiner als Y ist. Der Wert "n" liegt in einem Bereich von 5 bis 1000, vorzugsweise 1 bis 100. Die Menge "X" ist die minimale Menge an Antigen, die zuverlässig nachweisbar ist, wenn in einer Probe keine Antikörper vorhanden sind; die Menge "Y" ist die maximale erwartete Menge an Antikörpern in der Probe.
Eine Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung ist ein Verfahren, das die folgenden Schritte umfasst: (a) das Vermischen von Folgendem in einem wässrigen Medium, um ein Gemisch zu bilden: (i) der Probe, die vermutlich spezifische Antikörper gegen ein Antigen enthält, (ii) eines Antigens, das die Antikörper bindet, um einen Antigen-Antikörper-Komplex zu bilden, worin die dem Medium zugegebene Menge an Antigen Z ist, worin Z in einem Bereich von X bis nX liegt und Z kleiner als Y ist, worin n = 5 bis 1000, vorzugsweise 10 bis 100, ist, worin X die minimale Menge an Antigen ist, die zuverlässig nachgewiesen werden kann, wenn in einer Probe keine Antikörper vorhanden sind, und Y die maximale erwartete Menge an Antikörpern in der Probe ist, und (iii) eines ersten Bindemittels, das zwar den Komplex bindet, aber nicht das Antigen bindet, wenn das Antigen nicht Teil des Komplexes ist; (b) das Zugeben eines zweiten Bindemittels zum Gemisch, welches Bindemittel relativ zur Bindung des Komplexes, wenn der Komplex an das erste Bindemittel gebunden ist, selektiv das Antigen bindet; und (c) das Detektieren des an das zweite Bindemittel gebundenen Antigens, wobei dessen Gegenwart oder Menge mit der Gegenwart oder Menge der Antikörper in der Probe in Zusammenhang steht.
Der Ausdruck "Antigen-Antikörper-Komplex" bezieht sich hierin auf den Komplex, der durch die immunologische Bindung eines Antigens an einen Antikörper entsteht. Der Ausdruck "selektive Bindung" bedeutet, dass das zweite Bindemittel relativ zur Bindung des Antigen-Antikörper-Komplexes, wenn der Komplex an das erste Bindemittel gebunden ist, die Fähigkeit besitzt, sich vorzugsweise an das freie Antigen zu binden. Freies Antigen ist Antigen im Gemisch, das keinen Komplex mit dem Antikörper-Analyten gebildet hat. Die Affinität des zweiten Bindemittels für das freie Antigen ist zumindest das Fünffache, vorzugsweise zumindest das Zehnfache, seiner Affinität für den ersten Bindemittel-gebundenen Komplex. Diese bevorzugte Bindung kann kinetisch oder thermodynamisch sein und ist üblicherweise das Ergebnis von Ladungsabstoßung und/oder sterischer Hinderung. Wenn beispielsweise das erste Bindemittel an den Antigen-Antikörper- Komplex gebunden ist, kann es eine solche Masse aufweisen, dass das zweite Bindemittel im Komplex vorhandenes Antigen nicht in signifikantem Ausmaß binden kann. Daher bindet sich nur freies Antigen an das zweite Bindemittel.
Ein wesentliches Merkmal der Erfindung ist, dass das erste Bindemittel den Antigen-Antikörper-Komplex solcherart binden kann, dass Bindung des zweiten Bindemittels an den Komplex ausgeschlossen wird. Die Bindemittel sind sbp-Elemente, und die Bindung des zweiten Bindemittels an den durch das erste Bindemittel gebundenen Komplex kann besser verhindert werden, wenn das erste Bindemittel an ein lösliches Polymer oder eine suspendierbare Feste Phase gebunden ist. Dies bietet den zusätzlichen Vorteil, dass der an das erste Bindemittel gebundene Komplex nicht vom Medium abgetrennt werden muss, bevor die Zugabe des zweiten Bindemittels erfolgt, da der an das erste Bindemittel gebundene Komplex die Messung von freiem Antigen nicht beeinträchtigt. Das sbp-Element, welches das erste Bindemittel darstellt, wird so ausgewählt, dass es zwar den Antigen-Antikörper-Komplex, aber nicht das Antigen bindet, wenn das Antigen nicht Teil des Komplexes ist, d. h. das erste Bindemittel bindet sich an im Medium vorhandenes freies oder ungebundenes Antigen nicht in signifikantem Ausmaß. Das sbp-Element kann auch andere in der Probe vorhandene Substanzen binden, z. B. Nicht- Analyten-Antikörper. Dies ist akzeptabel, sofern das erste Bindemittel nur dann Antigen bindet, wenn das Antigen am Analyten-Antikörper gebunden ist.
Geeignete sbp-Elemente für die ersten Bindemittel sind u. a. Antikörper gegen Immunglobuline; Komplementfaktor, C1q; Rheumafaktor; Protein G und/oder Protein A. Einige dieser Materialien binden bestimmte Immunglobuline in licht-selektiver Weise, beispielsweise Antikörper und Proteine A, und einige binden Immunkomplexe in selektiver Weise, z. B. C1q und Rheumafaktor. Wie bereits erwähnt, ist es zur Verhinderung der Bindung des zweiten Bindemittels an den Antigen-Antikörper-Komplex vorzuziehen - wenn auch nicht erforderlich -, dass das erste Bindemittel außerdem eine suspendierbare feste Phase oder lösliches Polymer umfasst, d. h. dass das Bindemittel an eine suspendierbare feste Phase oder an lösliches Polymer gebunden ist.
Geeignete lösliche Polymere sind unverzweigt oder vorzugsweise verzweigt und umfassen u. a. Polysaccharide, wie z. B. Dextran und Heparin; Polyacrylate, Polyacryloylglucosamin, Polyvinylpyrrolidon und dergleichen. Die Polymere besitzen üblicherweise ein Molekulargewicht von zumindest 10.000, und vorzugsweise besitzen die das erste Bindemittel umfassenden Polymere Molekulargewichte von über 250.000.
Geeignete suspendierbare teste Phasen sind u. a. Latex, Glasteilchen, insbesondere poröse Glasteilchen, Polyacrylamid-Teilchen, Agarose, SEPHADEX (Pharmacia Fine Chemicals, Inc.) sowie andere Teilchenphasen, die genau genommen keine Feststoffe sind, z. B. Liposome, Öltröpfchen usw. Zahlreiche der oben erwähnten löslichen Polymere können vernetzt sein, um suspendierbare Fesiphasenmaterialien zu ergeben. Diese Materialien sind üblicherweise teilchenförmig und besitzen eine Größe im Bereich von 10 nm bis 100 nm, vorzugsweise 100 nm bis 10 nm.
Das zweite Bindemittel ist ein sbp-Element, das zur Bindung des Antigens fähig ist. Beispiele sind ein Antikörper, vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper, oder ein anderer Rezeptor für das Antigen; ein Ligand, an den sich das Antigen bindet, z. B. ein irreversibler Inhibitor, wenn das Antigen ein Enzym ist; oder ein Element eines sbp, worin das andere Element an das Antigen gebunden ist. Beispielsweise kann Biotin an das Antigen gebunden sein, und das sbp-Element, welches das zweite Bindemittel umfasst, kann Avidin, Streptavidin oder Antikörper gegen Biotin sein. Alternativ dazu kann das zweite Bindemittel eine chemisch reaktive Gruppe sein, die spezifisch mit Gruppen auf dem Antigen reagiert. Beispielsweise könnte das zweite Bindemittel Bromacetamid-Gruppen aufweisen, die sich spezifisch an Sulfhydryl-Gruppen auf dem Antigen binden können.
Das zweite Bindemittel kann an ein lösliches Polymer oder eine suspendierbare oder nicht-suspendierbare feste Phase gebunden sein, die allesamt überdies einen Marker umfassen können, um die Detektion von an das zweite Bindemittel gebundenem Antigen zu ermöglichen. Die löslichen Polymere und suspendierbaren Träger umfassen vorzugsweise einen Marker; Beispiele sind Polymere wie z. B. Nukleinsäure, Proteine, Dextrane und Polyacrylate; Aggregate, wie z. B. Immunkomplexe, Teilchen wie z. B. Latex, Agarose, SEPHADEX, Trockenkristallite, Liposome, Öltröpfchen, Metallsole und dergleichen. Zu nicht-suspendierbaren festen Phasen zählen saugfähige Materialien wie etwa Glas- oder Cellulosepapier; Kunststoffe wie etwa Polystyrol, Nylon, Polymethacrylat usw. Silikone, Metalle wie etwa Gold und Indium und dergleichen.
Nach der Zugabe des zweiten Bindemittels wird das an das zweite Bindemittel gebundene Antigen detektiert, wobei seine Gegenwart oder Menge mit der Gegenwart oder Menge der Antikörper in der Probe in Zusammenhang steht. Diese Beziehung ist umgekehrt proportional, da Folgendes gilt: Je höher die Konzentration von in der Probe vorhandenen Antikörpern, desto geringer die Menge an freiem Antigen, d. h. die Menge an Antigen, die sich an das zweite Bindemittel bindet.
Die Detektion des freien Antigens kann in unterschiedlicher Weise erfolgen. In heterogenen Formaten ist das zweite Bindemittel an eilen abtrennbaren Träger, d. h. eine suspendierbare oder nicht-suspendierbare teste Phase, gebunden. Beispielsweise kann das zweite Bindemittel ein Anti-Antigen-Antikörper oder ein Rezeptor wie z. B. Streptavidin sein, der sich an einen Liganden binden kann, der an das Antigen gebunden ist. In diesen Formaten werden die Probe und das Antigen zuerst kombiniert und das erste Bindemittel dann zugegeben. Nach der Zugabe des zweiten an einen Träger gebundenen Bindereagens wird der Träger vom Gemisch abgetrennt. Die Menge an Antigen, die sich an den zweiten Bindemittelträger bindet, kann direkt oder indirekt gemessen werden. Wenn das Antigen einen daran gebundenen Marker aufweist, kann die Gegenwart des Markers auf dem Träger detektiert werden. Bei bestimmten Trägern, insbesondere Indium und Kieselsäure, und mit akustischen Geräten kann sogar unmarkiertes Antigen direkt gemessen werden. Alternativ dazu kann das Antigen indirekt gemessen werden, indem ein Reagens zugegeben wird, wodurch das Antigen spezifisch markiert wird, z. B. durch Addition eines Markierungsmittels wie etwa eines markierten Antikörpers an das Antigen. Der Marker kann dann durch Fachleuten auf dem Gebiet allgemein bekannte Verfahren detektiert werden.
In den oben erwähnten heterogenen Formaten bietet die teste Phase eine Möglichkeit der wirkungsvollen Trennung des Assaygemisches oder der Markierungsmittel vom oberflächengebundenen Antigen. Typischerweise umfasst der trennbare Träger eine Oberfläche wie z. B. die Oberfläche eines Mikrotiternapfes, ein poröses Material wie etwa Papier oder Nitrocellulose oder Perlen wie etwa magnetisierbare Teilchen. Das an die teste Phase gebundene Antigen kann dann detektiert werden. Das Antigen kann an ein sps-Element gebunden sein oder in der Lage sein, an dieses gebunden zu werden. Beispielsweise kann das Antigen an ein Enzym wie etwa Meerrettich-Peroxidase gebunden oder mit einem Rezeptor kontaktiert werden, der an ein sps-Element gebunden ist, z. B. enzymmarkierten Anti-Antigen-Antikörper. Alternativ dazu kann - wenn das Antigen ein daran gebundenes sbp-Element aufweist - die feste Phase des zweiten Bindemittels, an die sich das Antigen gebunden hat, mit einem markierten komplementären sbp-Element kontaktiert werden. Nach der Inkubation des trägergebundenen Antigens mit dem komplementären sbp-Element wird der Träger üblicherweise vom komplementären sbp-Element getrennt und die Gegenwart von Marker auf dem Träger detektiert.
In homogenen Formaten ist es nicht erforderlich, das an das zweite Bindemittel gebundene Antigen abzutrennen, damit es detektierbar wird. Beispielsweise könnte das zweite Bindemittel auf einem angeschlossenen akustischen Gerät als feste Phase oder auf einer festen Phase, die Oberflächen-Plasmonresonanz oder Fluoreszenzdetektion mit abklingenden Wellen ermöglicht, immobilisiert werden; all dies erfordert keine Trennung der flüssigen Phase, um an die Oberfläche gebundenes Antigen zu detektieren. Alternativ dazu könnte das Signal aus einem an das Antigen gebundenen Marker durch die feste Phase oder durch ein Polymer, ein anderes Aggregat oder eine an das zweite Bindemittel gebundene, suspendierbare, feste Phase moduliert werden. Zu diesem Zweck könnte der Marker z. B. ein Sensibilisator, Fluoreszenzmittel, Enzym oder Quencher sein, woraufhin das zweite Bindemittel direkt oder indirekt an ein Chemolumineszenzteilchen, einen Quencher, ein zweites Enzym bzw. ein Fluoreszenzmittel gebunden wird. Die Bindung zwischen den zwei Elementen jedes dieser Paare ermöglicht die direkte Detektion der Bindung beispielsweise durch die Techniken, die im Lumineszenz- Sauerstoffkanalisierungs-Immungssay und dem Fluoreszenz-Anregungs-Übertragungs- Immungssay angewandt werden.
Eine weitere Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung ist ein Verfahren, das die folgenden Schritte umfasst: (a) das Vermischen von Folgendem in einem wässrigen Me dium: (i) der Probe, die vermutlich die Antikörper gegen ein bestimmtes Antigen enthält, (ii) eines Antigens, das die Antikörper bindet, um einen Antigen-Antikörper-Komplex zu bilden, wobei die Menge des dem Medium zugesetzten Antigens Z ist, worin Z im Bereich von X bis nX liegt und kleiner als Y ist, wobei n = 5 bis 1000 ist, X die minimale Menge des Antigens ist, die zuverlässig nachgewiesen werden kann, wenn keine Antikörper in einer Probe vorhanden sind, und Y die maximal in der Probe zu erwartende Menge der Antikörper ist, und (iii) eines ersten Bindemittels, das zwar den Komplex, nicht aber das Antigen bindet, wenn das Antigen nicht Teil des Komplexes ist; (b) das Kontaktieren des Mediums mit einem zweiten, an eine teste Phase gebundenen Bindemittel, wobei das zweite Bindemittel ein Rezeptor ist, der zwar das Antigen bindet, um an die teste Phase gebundenes Antigen zu bilden, jedoch nicht den Antigen-Antikörper- Komplex bindet; (c) das Detektieren des an die Feste Phase gebundenen Antigens, wobei dessen Gegenwart oder Menge mit der Gegenwart oder Menge der Antikörper in der Probe in Zusammenhang steht.
Diese Ausführungsform wird durch das folgende Beispiel veranschaulicht. Eine Serumprobe, die vermutlich Antikörper ("Ab") gegen ein Hepatitis A-Virusantigen ("AgHAV") enthält, wird 1 Stunde lang in einem wässrigen Medium mit an einen fluoreszierenden Marker gebundenem; AgHAV inkubiert. Das AgHAV bindet die Antikörper, um einen AgHAV-Ab-Komplex zu bilden. Die dem Medium zugesetzte Menge an AgHAV ist 100 Mal größer als die minimale Menge an AgHAV, die zuverlässig detektierbar ist, wenn in einer Probe keine Antikörper vorhanden sind, und auf Molbasis über 1000 Mal niedriger als die größte Menge an AgHAV-Antikörpern in einer klinischen Probe. Anti-Human- Inimunglobulin-Antikörper, die an Dextran mit Molekulargewicht von 250.000 gebunden sind, werden zugegeben. Die Anti-Human-lmmunglobulin-Antikörper binden zwar den AgHAV-Ab-Komplex, jedoch kein AgHAV, das kein Teil des Komplexes ist. Nach einer zusätzlichen Stunde Inkubation wird das Medium einem Mikrotiternapf zugesetzt, an den monoklonale Anti-AgHAV-Antikörper gebunden sind, die das AgHAV binden, um trägergebundenes AgHAV zu erzeugen. Diese Antikörper binden den AgHAV-Ab-Komplex nicht. Nach einer dritten einstündigen Inkubation wird das trägergebundene AgHAV durch gründliches Waschen des Napfes und Messen der Restfluoreszenz detektiert, deren Wert zur Menge der Antikörper in der Probe umgekehrt proportional ist.
Ein alternatives Verfahren zum Detektieren des Antigens umfasst das Kontaktieren der festen Phase mit einem markierten sbp-Element, welches das an die teste Phase gebundene Antigen bindet. Nach der Inkubation wird das überschüssige sbp-Element weggewaschen, und alle sbps-Elemente zusätzlich zum Marker, die zur Erzeugung eines Signals gebraucht werden, werden zugegeben. Das Signal wird dann gemessen, wobei sein Wert zur Menge an Antikörpern in der Probe umgekehrt proportional ist. Beispielsweise kann ein enzymmarkierter zweiter monoklonaler Anti-AgHAV-Antikörper zugegeben werden, gefolgt von Waschen und Zugabe von Substrat.
Eine weitere Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung umfasst die folgenden Schritte: (a) das Vermischen von Folgendem in einem wässrigen Medium: (i) der Probe, die vermutlich die Antikörper enthält, (ii) eines Antigens, das die Antikörper bindet, um einen Antigen-Antikörper-Komplex zu bilden, worin die Menge des dem Medium zugesetzten Antigens Z ist, worin Z im Bereich von X bis nX liegt und Z kleiner als Y ist, worin n = 5 bis 1000, vorzugsweise 10 bis 100, ist, X die minimale Menge an Antigen ist, die zuverlässig detektiert werden kann, wenn in einer Probe keine Antikörper vorhanden sind und Y die maximale erwartete Menge an Antikörpern in der Probe ist, und (iii) eines ersten Bindemittels, das den Komplex, jedoch nicht das Antigen bindet, wenn das Antigen nicht Teil des Komplexes ist; (b) das Zugeben eines zweiten Bindemittels zum Medium, das zwei Rezeptoren umfasst, die das Antigen binden, worin zumindest einer der Rezeptoren nicht imstande ist, sich wirkungsvoll an den Komplex zu binden, wenn der Komplex am Bindemittel gebunden ist; und (c) das Detektieren des Komplexes, der sich bildet, wenn die Rezeptoren das Antigen binden.
Diese Ausführungsform kann dazu dienen, zahlreiche Antikörper zu detektieren, z. B. jene, die in einem Patienten vorhanden sind, der das menschliche Immunschwächevirus ("HIV"), Röteln oder Herpes trägt. Das folgende Beispiel veranschaulicht einen Assay der Erfindung zum Detektieren von Antikörpern gegen HIV. Eine Probe, die vermutlich Antikörper gegen HIV enthält, wird in einem wässrigen Medium mit dem HIV-Antigen ("AgHIV") vermischt, das die Antikörper bindet, um einen AgHIV-Ab-Komplex zu bilden. Wie oben ist die Menge an zugegebenem AgHIV Z, das im Bereich von X bis nX liegt und kleiner als Y ist, worin n = 100 ist, X die minimale Menge von AgHIV ist, die zuverlässig detektiert werden kann, wenn keine Antikörper in einer Probe vorhanden sind, und Y die maximale erwartete Menge an Antikörpern in der Probe ist. Nach einstündiger Inkubation werden Ziegen-Antikörper gegen an Dextransulfat gebundene Human- Immunglobuline zugesetzt. Das erste Bindemittel bindet zwar den AgHIV-Ab-Komplex, jedoch nicht das AgHIV, wenn es nicht Teil des Komplexes ist. Nach der Inkubation werden zwei Rezeptoren für das AgHIV dem Medium zugegeben. Zumindest einer und vorzugsweise beide Rezeptoren sind an Latexteilchen gebunden, die dazu dienen, die Bindung der Rezeptoren an den an das Dextransulfat gebundenen AgHIV-Ab-Komplex zu verhindern. Günstigerweise sind die zwei Rezeptoren nicht-konkurrierende monoklonale Antikörper gegen AgHIV. Einer der Antikörper kann an Teilchen gebunden sein, in denen ein Chemolumineszenzmittel gelöst ist, z. B. N-Methylbenzalacridan. Der andere Antikörper kann direkt an einen Sensibilisator oder vorzugsweise Latexteilchen gebunden sein, in denen ein Sensibilisator wie z. B. Chlorophyll A gelöst ist. Zumindest der erstere dieser Antikörper kann sich nicht wirkungsvoll an den AgHIV-Ab-Komplex binden, wenn der Komplex an das erste Bindemittel gebunden ist. Der Chemolumineszenzmittel-Ab&sub1;-AgHIV-Ab&sub2;-Sensibilisator-Komplex wird nach 10-minütiger Inkubation durch einminütige Bestrahlung mit Licht im Wellenlängenbereich von über 600 nm und Messung der verzögerten Lumineszenz bei 400 bis 500 nm detektiert und die Bestrahlung danach eingestellt.
Die Erfindung eignet sich besonders zum Detektieren von Autoantikörpern gegen Insulin; Glutaminsäure-Decarboxylase ("GAD") - sowohl die 65 kd- als auch die 67 kd-Isoform, jedoch insbesondere GAD&sub6;&sub5;; und Langerhans-Insel-Antigene. Ein Verfahren zum Nachweis der Gegenwart oder zur Bestimmung der Menge von GAD-Autoantikörpern in einer Probe, die vermutlich die Autoantikörper enthält, umfasst die Schritte des Ver mischens von Folgendem in einem wässrigen Medium: (i) der Probe, (ii) von GAD-Antigen, das die Autoantikörper bindet, um einen Antigen-Autoantikörper-Komplex zu bilden, worin die Menge des dem Medium zugegebenen Antigens Z ist, Z im Bereich von X bis nX liegt und kleiner als Y ist, worin n = 5 bis 1000, vorzugsweise 10 bis 100 ist, X die minimale Menge an Antigen ist, die zuverlässig detektiert werden kann, wenn keine Antikörper in einer Probe vorhanden sind, und Y die maximale erwartete Menge an Antikörpern in der Probe ist, (iii) eines ersten Bindemittels, das - wenn das erste Bindemittel ein Rezeptor für die Autoantikörper ist, der den Komplex bindet - an ein Material gebunden ist, das aus der aus einer suspendierbaren testen Phase und einem löslichen Polymer bestehenden Gruppe ausgewählt ist; des Zugebens eines zweiten Bindemittels zum Medium, welches das Antigen relativ zur Bindung des Komplexes selektiv bindet, wenn der Komplex nicht vom Medium getrennt ist; und des Detektierens der Bindung des zweiten Bindemittels am Antigen, wobei dessen Bindung mit der Gegenwart oder Menge der Antikörper in der Probe in Zusammenhang steht.
Das GAD-Protein kann durch Isolierung und Reinigung aus einer biologischen Quelle erhalten werden, vorzugsweise aus einem Säugetier, wie z. B. einer Ratte, einer Katze oder einem Schwein. Besonders gute Ergebnisse lassen sich durch Verwendung von Schweinehirn-GAD erzielen. Außerdem ist die DNA-Sequenz von GAD bekannt und kann zur Rekombinations-Produktion von GAD dienen. Rabin et al., s. o., Spalte 4, Zeile 51 bis Spalte 5, Zeile 32, beschreiben zahlreiche Quellen und Verfahren zum Erhalten beider Isoformen von GAD, wobei diese Offenbarung hierin durch Verweis aufgenommen ist.
Die bevorzugte Menge an GAD-Antigen, "Z", beträgt 0,01 bis 12,0 fMol, noch bevorzugter 0,025 bis 7,5 fMol, am bevorzugtesten 0,01 bis 2,0 fMol. Dieser "Z"-Wert wurde anhand des "X"-Werts in Versuchen wie dem in Beispiel V beschriebenen und anhand des "Y"-Werts, der bis zu 10&supmin;&sup8; M beträgt, ermittelt.
Das obige Verfahren wird durch das folgende Beispiel veranschaulicht.
Rekombinierte GAD&sub6;&sub5; wird mit Biotin markiert, um bGAD zu ergeben. Dieses Konjugat wird dann mit Patienten-Serumproben inkubiert. Eine Suspension von an Protein-A gebundener Sepharose wird dann zugegeben und die Inkubation fortgesetzt. Die Suspension wird auf einen Mikrotiternapf übertragen, der mit Streptavidin beschichtet wurde. Nach der Inkubation zur Bindung von freier bGAD wird der Napf gewaschen und mit einem monoklonalen Mäuse-Antikörper gegen GAD inkubiert (entweder an einen Marker wie Meerrettich-Peroxidase ("HRP") gebunden oder ungebunden). Bei Verwendung ungebundener Antikörper wird der Napf erneut gewaschen und dann mit markierten Anti-Maus-IgG-Antikörpern inkubiert. In beiden Fällen wird nach der Zugabe der markierten Antikörper der Napf ein letztes Mal gewaschen und mit zusätzlichen sps-Elementen inkubiert. Wenn beispielsweise der Marker HRP ist, könnte die letzte Inkubation eine Lösung umfassen, die Wasserstoffperoxid und Tetramethylbenzidin enthält; die Farbentwicklung wird nach der Inkubation abgelesen.
In einem Assay, der gemäß dieser Arbeitsvorschrift der Erfindung durchgeführt wird, zeigten Proben, die bekanntermaßen Anti-GAD&sub6;&sub5;-negativ waren, minimale Signalsuppression. Proben, die bekanntermaßen Anti-GAD&sub6;&sub5;-positiv waren, wiesen unterdrückte Farbentwicklung auf.
Dieser Aspekt der Erfindung wird in einem Assay zum Nachweis der Gegenwart oder Bestimmung der Menge an Antikörpern in einer Probe veranschaulicht, die vermutlich die Antikörper zur Verwendung beim Nachweis oder der Überwachung einer menschlichen Krankheit enthält. Beispielsweise eignet sich der Assay auf GAD&sub6;&sub5;-Antikörper zum Nachweis von IDDM.
Eine weitere Ausführungsform betrifft einen verbesserten Assay, umfassend das Vermischen in einem wässrigen Medium der Probe und eines Antigens, das die Antikörper bindet, um ein Gemisch zu bilden, das aus einem Antigen-Antikörper-Komplex und freiem Antigen besteht; und das Detektieren des freien Antigens, wobei seine Gegenwart oder Menge mit der Gegenwart oder Menge der Antikörper in der Probe in Zusammenhang steht. In einer Ausführungsform umfasst die Verbesserung die Verwendung einer Menge an Antigen, die Z ist, worin Z im Bereich von X bis nX liegt und Z kleiner als Y ist, vorin n = 5 bis 1000, vorzugsweise 10 bis 100, ist, X die minimale Menge an Antigen ist, die zuverlässig detektiert werden kann, wenn keine Antikörper in einer Probe vorhanden sind, und Y die maximale erwartete Menge an Antikörpern in der Probe ist. In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Verbesserung die Zugabe eines ersten Bindemittels, das zwar den Komplex, jedoch nicht das Artigen bindet, gefolgt von der Zugabe eines zweiten Bindemittels, das zwar freies Antigen, jedoch nicht Antigen bindet, wenn es Teil des Komplexes ist.
Antikörper, die sich für die Verfahren der Erfindung eignen, können monoklonal oder polyklonal sein und durch auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannte Verfahren hergestellt werden, z. B. Immunisierung eines Wirts und Sammeln von Seren, von denen das Immunglobulin durch bekannte Techniken abgetrennt werden kann (polyklonal), indem kontinuierliche Hybridzelllinien gebildet werden und das sekretierte Protein (monoklonal) gesammelt wird, wie von Milstein und Kohler, Nature 256, 495-7 (1975), beschrieben, oder indem Nukleotidsequenzen oder mutagenisierte Versionen davon, die zumindest für die Aminosäuresequenzen kodieren, die für die spezifische Bindung natürlicher Antikörper erforderlich sind, kloniert und exprimiert werden. Antikörper können das vollständige Immunglobulin oder ein Fragment davon enthalten; dazu zählen die verschiedenen Klassen und Isotypen, z. B. IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b und IgG3 sowie IgM. Zu Fragmenten zählen Fab, Fv, F(ab')2 und Fab.
Es werden zur Durchführung der Verfahren gemäß der Erfindung geeignete Reaktionsbedingungen ausgewählt. Die folgende Beschreibung schildert solche geeigneten Bedingungen, die je nach den spezifischen Reagenzien und der Assayvorschrift, die für die jeweilige Anwendung ausgewählt wird, von Fachleuten auf dem Gebiet entsprechend geändert werden können. Beispielsweise können die Verfahren der Erfindung auf zahlrei che Arten von Assays angewendet werden (heterogene oder homogene), und die Bedingungen und Reagenzien werden dementsprechend ausgewählt.
Die Probe, die sich vorzugsweise in einem geeigneten Medium befindet, kann direkt untersucht oder vorbehandelt werden, bevor sie dem Assaymedium zugesetzt wird. Die Vorbehandlung kann dafür sorgen, dass der Antikörperanalyt einem oder mehreren Assayreagenzien besser zur Verfügung gestellt wird oder leichter durch geringeren Eingriff im Assay detektierbar wird, indem unerwünschte Materialien entfernt werden. Die Probe kann vorbehandelt werden, um Zellen abzutrennen oder zu lysieren; Proteine zu fällen, hydrolysieren oder denaturieren; Lipide zu hydrolysieren und dergleichen. Zu einer solchen Vorbehandlung zählt u. a.: Zentrifugation; Behandlung der Probe mit einem organischen Lösungsmittel, z. B. Alkohol, vorzugsweise einem Alkohol mit weniger als etwa 7 Kohlenstoffatomen, wie z. B. Methanol; und Behandlung mit Detergenzien.
Die Konzentration der zu untersuchenden Antikörper variiert im Allgemeinen von etwa 0 bis 10&supmin;&sup5; M, noch häufiger von etwa 0 bis 10&supmin;&sup8; M. Die relativen Mengen der verschiedenen im Assay eingesetzten und in den unten beschriebenen Sets verpackten Reagenzien können stark variieren, um Konzentrationen der Reagenzien zu ergeben, welche die Reaktionen, die während des erfindungsgemäßen Verfahrens ablaufen müssen, wesentlich optimieren und die Empfindlichkeit des Assays erheblich steigern. Beispielsweise bestimmen Überlegungen wie der Kompromiss zwischen Empfindlichkeit und dem Assayumfang, dem jeweiligen Detektionsverfahren und der Konzentration des Analyten die Konzentration des eingesetzten Antigens (Erklärung oben) und normalerweise auch die Konzentration der anderen Reagenzien. Darüber hinaus wird die Endkonzentration jedes der Reagenzien normalerweise empirisch bestimmt, um die Empfindlichkeit des Assays im Bereich von Interesse zu optimieren. Da das ungebundene oder "freie" Antigen gemessen wird, sollte eine signifikante Variation der Konzentration des Antigens für eine genaue Messung der Signaldifferenz sorgen.
Bei der Durchführung des Verfahrens der Erfindung wird vorzugsweise ein wässriges gepuffertes Medium bei mittlerem pH-Wert eingesetzt, im Allgemeinen eines, das optimale Assay-Empfindlichkeit bietet. Das wässrige Medium kann nur Wasser sein oder ein Co-Lösungsmittel enthalten, z. B. ein Sauerstoff-hältiges organisches Lösungsmittel mit 1 bis 6, üblicherweise 1 bis 4, Kohlenstoffatomen, beispielsweise Alkohole, Ether und dergleichen. Üblicherweise ist das Co-Lösungsmittel in einer Menge von weniger als etwa 70 Gew.-%, noch häufiger in einer Menge von weniger als etwa 30 Gew.-%, enthalten.
In Assays gemäß der Erfindung liegt der pH-Wert für das Medium üblicherweise im Bereich von etwa 5 bis 10, vorzugsweise im Bereich von etwa 7 bis 9. Der pH-Wert wird gewählt, um ein signifikantes Ausmaß an Bindung zwischen sbp-Elementen aufrechtzuerhalten, während die Signalerzeugungskapazität optimiert wird. In einigen Fällen wird ein Kompromiss zwischen diesen beiden Faktoren eingegangen.
Verschiedene Puffer können zur Erreichung des erwünschten pH-Werts und Beibehaltung des pH-Werts während der Bestimmung eingesetzt werden. Beispiele für Puffer sind Borat, Phosphat, Carbonat, Tris, Barbital und dergleichen. Der jeweils eingesetzte Puffer ist für die Erfindung nicht entscheidend, doch in einzelnen Assays kann einem Puffer gegenüber dem anderen der Vorzug gegeben werden.
Es herrschen bei der Durchführung des Verfahrens normalerweise moderate Temperaturen und üblicherweise konstante Temperturen während der Messperiode, insbesondere während der Bestimmung der Raten. Die Temperatur kann je nach dem jeweils durchgeführten Schritt variieren, wobei die Temperaturen von 5ºC bis etwa 50ºC, üblicherweise von etwa 15ºC bis 40ºC, reichen. Die Inkubationstemperaturen reichen normalerweise von 5ºC bis 45ºC, noch häufiger von 15ºC bis 40ºC. Die Temperaturen während der Messungen reichen im Allgemeinen von 10ºC bis 50ºC, noch häufiger von 15ºC bis 40ºC.
Während die Reihenfolge der Zugabe der verschiedenen Reagenzien beschränkt ist, können zahlreiche Arbeitsvorschriften unter Anwendung verschiedener Verfahren zur zeitlich abgestimmten Freisetzung von Reagenzien entwickelt werden. Wenn solche Vorgangsweisen nicht angewendet werden, ist es üblicherweise vorzuziehen, die Probe und das Antigen vor oder fast gleichzeitig mit dem ersten Bindemittel zu vermischen. Wenn das erste Bindemittel den Antigen-Antikörper-Komplex ohne Bindung der unkomplexierten Immunglobuline binden kann, ist die Reihenfolge der Zugabe dieser Reagenzien unwichtig. Die Zugabe des zweiten Bindemittels muss sich an die ersten zwei Zugaben anschließen, sofern nicht die Möglichkeit der zeitlich abgestimmten Freisetzung dieses Mittels vorgesehen ist. Andere Reagenzien, die das Antigen binden können, können zu jedem beliebigen Zeitpunkt zugesetzt werden, doch vorzugsweise werden sie fast gleichzeitig mit oder anschließend an die Zugabe des zweiten Bindemittels zugegeben. Die Zeitpunkte der Zugabe anderer Reagenzien können stark variieren.
Gegebenenfalls können ein oder mehrere Inkubationsschritte nach jeder Reagenszugabe erfolgen, die im Allgemeinen etwa 30 Sekunden bis 6 Stunden, noch häufiger etwa 2 Minuten bis 1 Stunde, lang dauern. Außerdem kann der Assay im Bedarfsfall einen oder mehrere Waschschritte umfassen.
Der letzte Schritt eines Immungssays ist die Messung der Menge an freiem Antigen, die mit der Gegenwart oder Menge des Antikörperanalyten in der Probe in Zusammenhang steht. Es gibt zahlreiche auf dem Gebiet allgemein bekannte Möglichkeiten, freies Antigen zu messen. Beispielsweise kann das Antigen an einen detektierbaren Marker gebunden oder mit einem detektierbar markierten Anti-Antigen-Antikörper kontaktiert werden. Das erzeugte Signal steht in Beziehung zur Menge des vorhandenen Antigens, die umgekehrt propotional zur Menge an Antikörpern in der Probe ist.
Es folgt eine Beschreibung von Assayvorschriften, wobei diese Beschreibung den Schutzumfang der Erfindung nicht einschränkt, sondern lediglich die qualitativen, semiqualitativen und quantitativen Assayvorschriften veranschaulicht, in denen das Verfahren der Erfindung eingesetzt werden kann, um die Gegenwart oder Menge von Antikörpern in einer Probe zu bestimmen. Das in diesen Verfahren detektierten Signal wird mit einem Standard verglichen, der einer bekannten Antikörper-Konzentration entspricht.
(A) In einem Assay auf Insulin-Antikörper wird eine Probe, die vermutlich die Antikörper enthält, mit Insulin in einem geeigneten Medium vermischt. An Agarose gebundener Komplementfaktor ("C1q") wird zugegeben und das Gemisch inkubiert. Ein monoklonaler Anti-Insulin-Antikörper, der an Dextran mit einem Molekulargewicht von 2.000.000 gebunden und mit einem Quencher, wie z. B. Rhodamin B, markiert ist, wird zugegeben. Nach der Inkubation lässt man die Agarose absetzen, und das wässrige Medium wird mit einem zweiten nicht-konkurrierenden monoklonalen Anti-Insulin-Antikörper kombiniert, der mit einem Fluoreszenzmittel, wie z. B. Fluorescein, markiert ist. Das Ausmaß des Quenchens des Fluoreszenzmittels wird dann mit der Menge an vorhandenem Insulin in Beziehung gesetzt, die zur Menge an in der Probe vorhandenen Insulin- Autoantikörpern umgekehrt proportional ist.
(B) In einem Assay für Anti-Herpes-Virus-Antikörper wird das Herpes-Antigen ("AgH") an Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase gebunden ("AgH-G6PDH"). Eine Probe, die vermutlich die Antikörper enthält, wird in einem geeigneten Medium mit AgH-G6PDH vermischt. An Polyacrylamidteilchen gebundener Rheumafaktor wird zugegeben und inkubiert. Eine mit Anti-AgH-Antikörpern beschichtete, ¹/&sub4; Zoll große Polystyrolkugel wird dem Gemisch zugegeben. Nach entsprechender Inkubation wird die Kugel gewaschen und mit Glucose-6-phosphat und NAD kontaktiert. Das durch das Auftreten von NADH erzeugte Signal steht in direktem Zusammenhang zur Menge des an der Oberfläche gebundenen AgH und ist zur Menge an in der Probe vorhandenen Anti-AgH-Antikörpern umgekehrt proportional.
Aus praktischen Gründen können die Reagenzien für die Erfindung in einem Set bereitgestellt werden, das in einem Assayverfahren zum Detekieren von Antikörpern in einer Probe, die vermutlich die Antikörper enthält, zur Anwendung kommt. Ein typisches Set der Erfindung umfasst in verpackter Kombination: (i) ein Antigen, das die Antikörper bindet, um einen Antigen-Antikörper-Komplex zu bilden, worin die Menge an Antigen Z ist, worin Z im Bereich von X bis nX liegt und Z kleiner als Y ist, vorin n = 5 bis 1000, vorzgusweise 10 bis 100, ist, X die minimale Menge an Antigen ist, die zuverlässig detektiert werden kann, wenn in einer Probe keine Antikörper vorhanden sind, und Y die maximale erwartete Menge an Antikörpern in der Probe ist, (ii) ein erstes Bindemittel, das den Komplex ohne Bindung des Antigens bindet, wenn das Antigen kein Teil des Komplexes ist, und (iii) ein zweites Bindemittel, welches das Antigen relativ zur Bindung des Komplexes selektiv bindet, wenn der Komplex an das erste Bindemittel gebunden ist.
Ein bevorzugtes Set eignet sich zur Detektion von GAD-Autoantikörpern und umfasst GAD-Antigen und einen Rezeptor für den Antigen-Antikörper-Komplex als erstes Bindemittel, das an ein lösliches Polymer gebunden ist. Ein weiteres bevorzugtes Set eignet sich zur Detektion von Insulin-Autoantikörpern und umfasst Insulin und einen Rezeptor für den Antigen-Antikörper-Komplex als erstes Bindemittel, das an ein lösliches Polymer gebunden ist.
Unter geeigneten Umständen können ein oder mehrere Reagenzien im Set in Lösung oder als Trockenpulver (üblicherweise lyophilisiert) bereitgestellt werden, umfassend Exzipienten, die in Lösung eine Reagenslösung mit den geeigneten Konzentrationen liefern, um ein Verfahren oder einen Assay gemäß der Erfindung durchzuführen. Um die Vielseitigkeit der Erfindung zu erhöhen, können Reagenzien in verpackter Kombination im gleichen oder in getrennten Behältern bereitgestellt sein, sodass das Verhältnis der Reagenzien eine erhebliche Optimierung des Verfahrens und Assays ergibt. Die Reagenzien können sich jeweils in getrennten Behältern befinden, oder es können verschiedene Reagenzien in einem oder mehreren Behältern vermischt sein (abhängig von der Kreuzreaktivität und Stabilität der Reagenzien). Aus praktischen Gründen können die in der Erfindung eingesetzten Reagenzien in vorbestimmten Mengen bereitgestellt werden. Das Set kann auch schriftliche Anweisungen enthalten, wie die Reagenzien zu verwen den sind oder ein bestimmter Assay durchzuführen ist (z. B. in Form eines Beipacktextes).
Die Erfindung wird nun durch die folgenden veranschaulichenden Beispiele beschrieben.
Abkürzungen
AET 2-Aminoethylisothiouroniumbromid
bGAD&sub6;&sub5; Biotylinierte GAD
BSA Rinderserumalbumin
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
ELISA Enzymgebundener Immunosorptionsassay
GAD&sub6;&sub5; Rekombinierte Human-Glutaminsäure-Decarboxylase (MG 65.300)
HRP Meerrettich-Peroxidase
IDDM Insulinabhängiger Diabetes mellitus
MAb Monoklonaler Antikörper
PBS Phosphatgepufferte Salzlösung
PFP Pyridoxal-5'-phosphat
RIA Radioimmungssay
RT Raumtemperatur
SAV Streptavidin
SDS-PAGE Nadriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese
TCEP Tris(carboxyethyl)phosphin
TMB 3,3',5',5'-Tetramethylbenzidin

Herstellung von Materialien

Teile und Prozentsätze beziehen sich hierin - sofern nicht anders angegeben - auf das Gewicht. Mit Streptavidin beschichtete Platten wurden durch herkömmliche Verfahren erzeugt. Die mit HRP markierten Anti-Maus-Antikörper waren affinitätsgereinigte Ziegen-Antikörper gegen Mäuse-IgG (γ-ketten-spezifisch) (Kirkegaard & Perry Laboratories). Alle anderen Chemikalien besaßen Reagensqualität und sind im Handel bei Sigma und Fisher Chemical erhältlich. Alle Lösungen wurden in H&sub2;O gebildet und alle Reaktionen unter Umgebungsbedingungen durchgeführt (sofern nicht anders angegeben).

Pufferzusammensetzung

Die Zusammensetzung des Reaktionspuffers war wie folgt: 20 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5% TRITON X-100, 10 mM Benzamidin (15,7 mg/10 ml), Pefabloc (Pentapharm) in 2,4 mg/10 ml, Aprotinin (Pentapharm, 229.500 KIU/ml) in 50 ul/10 ml und Pepstatin A (Sigma) in 0,2 mg/10 ml.

A. Expression und Reinigung von rekombinierter Human-GAD&sub6;&sub5;

Baculovirus-Zellen, die rekombinierte Human-GAD&sub6;&sub5; exprimieren, wurden in einem Fermenter gezüchtet und geerntet. Das Pellet wurde mit einem Glashomogenisator lysiert. Nach dem Aufbrechen wurde das Zelllysat zentrifugiert und gewaschen und das gewaschene Pellet extrahiert, um membrangebundene GAD&sub6;&sub5; zu erhalten. Dieser Membranextrakt wurde dann auf eine Q Sepharose -Säule geladen und mit einem KCl-Gradienten eluiert. Enzymatisch aktive Fraktionen wurden gesammelt und auf eine Phenyl Sepharose -Säule geladen. Die Elution erfolgte mittels eines reversen Phosphatgradienten. Eluierte Fraktionen wurden hinsichtlich enzymatischer Aktivität und Reinheit auf einer 10% SDS-PAGE untersucht. Fraktionen mit einer Reinheit von fast 95% (durch Proteinfärbung) wurden gesammelt. Der Pool wurde mittels Centriprep-30 (Amicon) aufkonzentriert. Aufkonzentrierte GAD&sub6;&sub5; wurde 50%ig in Glycerin gelöst und bei -70ºC eingefroren.

1. Iodierung von GAD&sub6;&sub5;

Die Iodierungsvorschrift beruhte auf dem im Handel erhältlichen Enzymobead-Set (BioRad), um [¹²&sup5;I]GAD&sub6;&sub5; zu ergeben. Der Inhalt des Einzelreaktionsfläschchens, das mit dem Set verkauft wird, wurde zuerste rehydratisiert. Diesem rehydratisierten Fläschchen wurden 2 ul (1 ul) gereinigte GAD&sub6;&sub5;, 5 ul (0,5 mCi) ¹²&sup5;I, 25 ul 1% β-D-Glucose, 50 ul 0,2 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,2, und 18 ul H&sub2;O zugegeben (Gesamtvolumen 150 ul), gefolgt von Inkubation. Nach der Reaktion mit den Enzymobeads wurde der Inhalt des Fläschchens direkt auf eine Größenausschluss-Gelsäule geladen, und 200 ul-Fraktionen wurden mit PBS, 1 mM AET und 1 mM PLP eluiert. ¹²&sup5;I enthaltende Fraktionen wurden durch Zählen von 1 ul-Aliquoten identifiziert.
Vor der Verwendung im Assay wurde [¹²&sup5;I]GAD&sub6;&sub5; mit gepooltem normalem Humanserum voradsorbiert. 200 ul [¹²&sup5;I]GAD&sub6;&sub5; wurden mit 80 ul Reaktionspuffer, 100 ul eines Pools von 8 negativen IDDM-Vergleichsseren und 20 ul PBS vermischt. Nach Inkubation bei 4ºC über Nacht wurde eine 50%-Suspension von Protein A-Sepharose in PBS zugegeben und 1 h lang bei 4ºC inkubiert. Diese Suspension wurde dann mikrozentrifugiert, der Überstand gesammelt, das Pellet mit 400 ul PBS gewaschen, und die zwei Überstände wurden gesammelt und bei -70ºC in Aliquoten aufbewahrt.

2. Biotinylierung von GAD&sub6;&sub5;

Gereinigte GAD&sub6;&sub5;, 282 ul/450 ul in GAD-Puffer, pH 7,0, wurde mithilfe von 1 ul 6 N NaOH auf einen pH-Wert zwischen 8,0 und 8,2 eingestellt. Die Zusammensetzung des GAD-Puffers war 20 Mol Phosphatpuffer (pH 6,8-7,0), 20 uM PLP, 1 mM AET, 1 mM EDTA, 0,1% TRITON X-100 und 10% Glycerin. Dann wurden 4 ul 10 mM PLP und 5 ul einer 41 mg/ml-Lösung TCEP zugegeben. Nach der Inkubation auf Eis wurde Biotinylierung durchgeführt, indem 5 ul Iodacetyl-LC-Biotin (Pierce) 3 h lang bei 4ºC im Dunkeln zugegeben wurden. Nicht umgesetztes Biotin wurde durch Zentrifugation abgetrennt. Das Biotin-GAD&sub6;&sub5;-Verhältnis betrug etwa 3 bis 5 Mol Biotin/Mol GAD&sub6;&sub5;.

B. Mäuse-Anti-GAD&sub6;&sub5;-Antikörper

Mäuse wurden mit GAD&sub6;&sub5; immunisiert, exprimiert und gereinigt (siehe oben) und MAbs gemäß Standardverfahren gebildet, wie sie z. B. von Milstein und Kohler, siehe oben, beschrieben werden.
Die resultierenden MAbs wurden in einem Standard-ELISA-Format getestet und die besten MAbs auf der Grundlage von Spezifität für GAD&sub6;&sub5; ausgewählt.
Ein Gemisch aus sechs Anti-GAD-MAbs wurde in frühen Assays eingesetzt, um an mit SAV beschichtete Platten gebundene bGAD&sub6;&sub5; mit jedem MAb in 1 pMol/ul in PBS plus 0,2% Natriumazid zu detektieren. Die Endkonzentration jedes MAb betrug 0,2 pMol/ 100 pl/Napf.
Spätere Assays verwendeten nur einen Anti-GAD-MAb, der mit HRP markiert war, wodurch die mit HRP markierten Anti-Maus-MAbs überflüssig wurden.

C. Protein A-Sepharose&supmin;-Suspension

Protein A-Sepharose (CL-4B, Sigma) wurde in PBS und 0,1% Azid in eine 50%ige Suspension übergeführt.

D. MICROTRAK--Plattenwäscher und -Ableser

Der Mikrotiter-Plattenwäscher und -Ableser sind Komponenten des MICROTRAK EIA- Systems (Syva Company). Die eingesetzte Waschlösung war der MICROTRAK Chlamydia EIA-Waschpuffer: 0,559 g/ml Trinatriumcitrat, 0,002 g/nM Citronensäure, 0,0182 ml/ml TWEEN 20, 0,3175 ml/ml Glycerin, pH 6,5-6,9. Jeder Waschzyklus wurde auf 300 pl/Napf · 5 eingestellt.

E. Humanserumproben

Die in diesen Versuchen eingesetzten Humanseren waren entweder Vergleichsproben (keine Antikörper gegen GAD&sub6;&sub5;) oder stammten aus Patienten mit IDDM (Antikörper gegen GAD&sub6;&sub5; waren vorhanden), die Dr. Noel Maclaren von der University of Florida zur Verfügung stellte.

BEISPIEL I

Radioimmungssay für GAD&sub6;&sub5;

Um an Humanseren gebundene [¹²&sup5;I]GAD&sub6;&sub5; zu messen, wurde eine Inkubation über Nacht bei 4ºC angesetzt, umfassend 6 ul Humanseren, 10 ul (etwa 150.000 cpm) [¹²&sup5;I]GAD&sub6;&sub5;, voradsorbiert mit negativen Humanseren in Reaktionspuffer in einem Gesamtvolumen von 25 ul. Nach Inkubation über Nacht wurden 50 ul 50%-Protein A-Sepharose zugegeben und die Inkubation unter leichtem Schütteln 1 h lang bei 4ºC fortgesetzt.
Nach der Prtoein A-Sepharose-Inkubation wurde die Suspension bei RT zentrifugiert, dreimal mit 750 ul eiskaltem 20 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5% TRITON X-100 gewaschen. Jede Waschung wurde in einem Gammazähler gezählt und das Pellet nach der letzten Waschung gezählt.
Die folgende Tabelle fasst typische Counts zusammen, die für jede der drei Waschfraktionen festgestellt werden oder im Pellet mit negativen oder positiven Seren gebunden sind:
Da der RIA einen Überschuss an radiomarkiertem Material verwendet, wird ein sehr geringer Prozentsatz der eingegebenen Counts schließlich in der gebundenen Fraktion erhalten. Dies ist nachstehend als Prozentsatz von radioaktiver gebundener GAD&sub6;&sub5; veranschaulicht:
Serum % gebundener Counts
Neg 1,1
Pos 5,7
Da das verwendete RIA-Format einen hohen Überschuss an radiomarkiertem Material verwendet, war es fast unmöglich, die Messung von ungebundenem Material heranzuziehen, um die Menge an Antikörpern in der Probe genau zu bestimmen. Wenn sich beispielsweise nur 5,7% der [¹²&sup5;I]GAD&sub6;&sub5; an Antikörper in der Probe binden, bleiben 94,3% frei und müssten gemessen werden. Bei Verwendung von 100% [¹²&sup5;I]GAD&sub6;&sub5; als Maß für das Signal, das durch eine negative Probe erzeugt wird, müsste man die Differenz zwischen dem durch 100% erzeugten Signal und dem durch 94,3% erzeugten Signal messen. Es wäre schwierig, einen solchen kleinen Deltawert präzise und zuverlässig zu messen.
Wenn GAD&sub6;&sub5; ausreichend aus der Überstandsflüssigkeit entfernt werden könnte, so dass die Differenz zwischen dem der gesamten Ausgangsmenge und der in Lösung verbleibenden Menge eine große Zahl ist, könnte dieses Format dazu eingesetzt werden, die Mengen an Autoantikörpern in IDDM-Seren zu bestimmen. Die Erfindung erreicht dieses Ziel, indem eine minimale Menge an markiertem Antigen eingesetzt und im We sentlichen das gesamte markierte Material aus dem Überstand "abgeschöpft" wird. Dieses Abschöpfungsformat ermöglicht die Verwendung hoher Serumkonzentrationen in den ersten Reaktionen und erlaubt es, dass die ersten Reaktionen in Lösung sind (ähnlich wie die RIA-Arbeitsvorschriften). Im Gegensatz zu ELISA-Arbeitsvorschriften, die Antikörper detektieren, führt die Detektion von GAD&sub6;&sub5; zu sehr niedrigen Hintergrundwerten (beginnend sogar schon bei 50%-Serumkonzentrationen).
Der Abschöpfungsassay der Erfindung umfasst somit eine Reaktion zwischen Antigen und Antikörpern und die anschließende Detektion von nicht mit Antikörpern komplexiertem Antigen. Somit belässt Vergleichsserum von Gesunden ohne Anti-Antigen-Antikörpern freies Antigen im Reaktionsgemisch, was in nachfolgenden Messungen ein stärkeres Signal ergibt. Serum von Patienten mit Antikörpern gegen das Antigen komplexiert einen Teil oder die gesamte Menge des eingegebenen Antigens, wodurch geringere Mengen an freiem Antigen zurückbleiben. In nachfolgenden Messungen führt dies zu einem schwächeren Signal. Somit konnte man erwarten, dass die Menge an Anti-Antigen-Antikörpern in einer Probe umgekehrt proportional zu A&sub4;&sub5;&sub0;-VVerten im Abschöpfungsassay der Erfindung ist. In der Folge wird in diesem Assay eine Probe als "positiv" bewertet, wenn der A&sub4;&sub5;&sub0;-Wert unter dem Cutoff-Wert liegt, der durch das Mittel (minus 2 oder 3 Standardabweichungen) mehrerer normaler Vergleichsseren bestimmt wird. Dies steht im Gegensatz zum typischen RIA, wo eine Probe mit einem höheren cpm- Wert als dem mittleren Vergleichs-cpm (+2 oder 3 Standardabweichung) als "positiv" eingestuft wird. Am besten wird dies durch das folgende Beispiel veranschaulicht.

BEISPIEL II

Enzymimmungssay auf GAD&sub6;&sub5; (mit Zentrifugation)

Dieses Beispiel beschreibt die allgemeine Leistungsfähigkeit des Assayformats der Erfindung. Die Optimierung der GAD-Antigen-Konzentration wird in nachfolgenden Beispielen erläutert.
12 ul Humanseren wurden mit 10 ul bGAD&sub6;&sub5; (0,2 pMol pro Assay), 10 ul 5 · Reaktionspuffer und 18 ul H&sub2;O in einem Endvolumen von 50 ul vermischt. Die Inkubation erfolgte über Nacht bei 4ºC.
100 ul einer 50%-Suspension von Protein A-Sepharose wurden zugegeben und unter leichtem Schütteln 1 h lang auf Eis inkubiert. Die Zentrifugation erfolgte bei RT.
100 ul Überstandsflüssigkeit (enthielt ungebundene bGAD&sub6;&sub5;) wurde vom Protein A-Sepharose-Pellet abgezogen, verdünnt und auf eine vorgewaschene, mit SAV beschichtete Platte übertragen. Nach 1-stündiger Inkubation bei RT unter leichtem Schütteln wurde die Platte auf dem MICROTRAK-System gewaschen.
100 ul Mäuse-Anti-GAD&sub6;&sub5;-MAbs wurden zugegeben und 1 h lang bei 37ºC inkubiert, gefolgt von Waschen wie oben.
100 ul HRP-markierte Anti-Maus-Antikörper wurden zugegeben und 1 h lang bei 37ºC inkubiert, gefolgt von Waschen wie oben. TMB-Substrat wurde zugegeben und 30 min lang bei RT entwickelt. Die Farbentwicklung wurde mit 1 N H&sub2;SO&sub4; abgebrochen und bei 450 nm abgelesen.
Sieben von neun Patientenseren wurden durch dieses Verfahren korrekt diagnostiziert. Dies steht im Gegensatz zu herkömmlichen ELISA-Techniken, die nur zwei von neun Proben korrekt bewerteten.

BEISPIEL III

Vergleich mit RIA

Um die analytische Leistungsfähigkeit des Assays der Erfindung zu überprüfen, wurde ein Vergleich mit Testseren angestellt, die bereits durch das RIA-Verfahren untersucht wurden. Das Hauptziel bestand darin, die Frage zu klären, ob Ergebnisse aus den zwei Verfahren miteinander korrelieren, und zwar ungeachtet der Beschaffenheit der Seren, d. h. Vergleichs- oder Patientenseren mit einem Bereich von GAD&sub6;&sub5;-Autoantikörpertitern.
Die Assayvorschrift war - mit Ausnahme der folgenden Modifikationen - die gleiche wie in Beispiel II: Serum (24 ul), bGAD&sub6;&sub5; (20 ul enthalten 12 fMol), 5 · Reaktionspuffer (20 jA) und entionisiertes H&sub2;O (36 ul) wurden über Nacht bei 4ºC inkubiert. Protein A- SepharoseTM (200 ul einer 50%-Suspension) wurde zugegeben und 1 h lang bei 4ºC inkubiert. Die Zentrifugation dauerte 2 min lang bei RT. Der Überstand (180 ul) wurde vorsichtig gesammelt, und zwei Aliquote von 90 Pl wurden jeweils zwei mit SAV beschichteten Näpfen in einer Platte zugegeben, um Doppelwerte zu erhalten. Der Rest der Arbeitsvorschrift war wie in Beispiel II beschrieben.
Die resultierenden klinischen Daten zeigten eine hervorragende Korrelation zwischen den Ergebnissen des vorliegenden Assays und den mit RIA erhaltenen Daten.

BEISPIEL IV

Bestimmung des Minimums der Antigen-Konzentration

Eine Standardkurve wurde mit GAD-Antigen in verschiedenen Konzentrationen erstellt; es wurde festgestellt, dass unter den vorliegenden Bedingungen die Kurve bis zu etwa 0,1 pMol Antigen linear war und dass Werte von weniger als 10 fMol leicht detektierbar waren. Die ersten Assays verwendeten 2 pMol des Antigens - weit über dem detektierbaren Minimum. Daher wurde die Antigen-Konzentration allmählich gesenkt, da man hoffte, die Fähigkeit zu verbessern, schwach positive Serumproben zu bestimmen. Der Assay wurde unter Verwendung eines negativen Serums, eines stark positiven Serums und eines schwach positiven Serums (mittels RIA beurteilt) mit 2; 0,2; 0,1 und 0,01 pMol Antigen wiederholt. Es war klar, dass sich die Fähigkeit, schwach positive Proben unter den IDDM-Proben zu detektieren, durch Senken der Konzentration des GAD-Antigens verbesserte.

BEISPIEL V

Optimierung der Antigen-Konzentration

Mehrere Assays wurden unter Anwendung einer ähnlichen Arbeitsvorschrift wie jener aus Beispiel II durchgeführt, außer dass die Vergleichsserumproben eingesetzt wurden, die keine GAD&sub6;&sub5;-Autoantikörper enthielten. Die Ablesungen erfolgten bei 450 nm.
[bGAD&sub6;&sub5;], fMol Signal
0 0,023 ± 0,003
0,075 0,064 ± 0,004
0,15 0,118 ± 0,03
0,20 0,224 ± 0,002
Die Messung bei 0 fMol bGAD&sub6;&sub5; wurde durchgeführt, um den Wert des Hintergrundsignals zu bestimmen. Typischerweise sollte die minimale Menge an Antigen, die zuverlässig detektierbar ist, wenn keine Antikörper in einer Probe vorhanden sind, zumindest drei Standardabweichungen über dem Hintergrundsignal liegen. Im vorliegenden Fall ist die minimale Menge an bGAD&sub6;&sub5;, die zuverlässig detektierbar ist, wenn keine Antikörper in einer Probe vorhanden sind, jene Konzentration, die ein Signal von 0,023 + 3(0,003) oder 0,032 erzeugte. Um ein bestimmtes Ausmaß an Varianz zu ermöglichen, wurde das Doppelte dieser Zahl, d. h. eine GAD-Konzentration, die ein Signal von 0,064 erzeugte, als Wert für die minimale detektierbare Menge von GAD&sub6;&sub5; ausgewählt. Wie aus obiger Tabelle ersichtlich, entspricht ein Signal von 0,064 einer minimalen bGAD&sub6;&sub5;- Konzentration von 0,075 fMol. Zusätzliche Optimierungsassays bestimmten, dass 1,5 fMol besonders gut funktionierten, wobei diese Menge in Beispiel VI eingesetzt wurde. Nachfolgende Untersuchungen der minimalen detektierbaren Menge von GAD&sub6;&sub5; (ähneln den in diesem Beispiel beschriebenen) führten zu einer vierfachen Steigerung gegenüber den oben dargestellten Daten und boten eine minimale detektierbare Menge von GAD&sub6;&sub5;, die etwa viermal kleiner war als die hier erwähnten 0,075 fMol.

BEISPIEL VI

Enzymimmungssay für GAD&sub6;&sub5; (ohne Zentrifugation)

25 ul Humanseren in BSA-Puffer (10 mM KPhos, pH 7,0, 1 mM AET, 1 mM EDTA, 20 uM PLP, 0,1% TRITON X-100, 10% Glycerin und 1 mg/ml proteasefreies BSA) wurden mit 15 ul bGAD&sub6;&sub5; (1,5 fMol pro Assay) und 10 ul 5 · Reaktionspuffer in einem Endvolumen von 50 ul vermischt. Die 2-stündige Inkubation davon erfolgte bei RT.
50 ul Protein A-Dextran (1 : 25 Verdünnung der Stammlösung in PBS) wurden zugegeben und 1 h lang bei RT inkubiert.
80 ul Überstandsflüssigkeit (enthält ungebundene bGAD&sub6;&sub5;) wurde abgezogen und auf eine vorgewaschene, mit SAV beschichtete Platte übertragen. Nach 1-stündiger Inkubation bei RT unter Schütteln wurde die Plätte auf dem MICROTRAK-System gewaschen.
100 pl MAb(6G10)-HRP-Konjugat (1 : 320 Verdünnung in Syva-Konjugat-Verdünner, auf 37ºC vorgewärmt) wurden zugegeben und 1 h lang bei RT unter Schütteln inkubiert, gefolgt von Waschen auf dem MICROTRAK-System.
TBM-Substrat wurde zugegeben und 30 min lang bei RT entwickelt. Die Farbentwicklung wurde mit 1 N H&sub2;SO&sub4; abgebrochen und bei 450 nm abgelesen. Die Leistungsfähigkeit dieses Verfahrens wurde mit jener verglichen, die in Beispiel II für das Verfahren mit Protein A und Sepharose beschrieben wurde.

BEISPIEL VII

Vergleichsbewertung

Eine vergleichende Bewertung mit Blindstudie zahlreicher GAD&sub6;&sub5;-Immungssays wurde in einem Bericht mit dem Titel "Second International GAD Antibody Workshop" (1994) mit Daten präsentiert, die am Royal Melbourne Hospital in Victoria, Australien, gesammelt wurden. 40 Assays wurden mit 101 Blindvergliechen und IDDM-Seren bewertet. Jeder Teilnehmer blieb anonym, identifizierte aber seinen jeweiligen Assay durch das Format (RIA, ELISA und enzymische Immunfällung) und die Art von GAD (Ratte/- Mensch/Schwein und nativ/rekombiniert). Der Assay der Erfindung (wie in Beispiel VI beschrieben) wurde auch zur Bewertung durch diese Blindstudie vorgelegt.
Das Royal Melbourne Hospital stellte allen Teilnehmern Ergebnisse zur Verfügung, wobei die Assays nur durch Format und GAD-Typ identifiziert wurden (siehe oben). Die enzymatischen Immunfällungsassays zeigten schlechte Leistungsfähigkeit, die ELISAs schnitten etwas besser ab, und die RIAs wiesen die beste Leistungsfähigkeit auf. Die Ergebnisse des Assays der Erfindung sind nachstehend gemeinsam mit durchschnittlichen ELISA- und RIA-Ergebnissen dargestellt.
Das Assayverfahren der Erfindung lieferte weniger falsche positive Ergebnisse bei den Vergleichsproben als RIA und ELISA (6,3% im Vergleich zu 10,6% bzw. 16,7%). Ebenso lieferte die Erfindung keine falschen positiven Ergebnisse bei Proben von Patienten mit anderen Autoimmunerkrankungen. RIA und ELISA ergaben 3,8% bzw. 23,7% falsche positive Ablesungen.
Die Erfindung lieferte auch weniger falsche negative Ergebnisse als RIA und ELISA - sie zeigte an, dass 82% bzw. 100% der IDDM-Patientenproben und vorklinischen IDDM- Patientenproben positiv waren. RIA zeigte nur an, dass 76,2% bzw. 97,1% der Proben positiv waren; ELISA zeigt nur an, dass 36,5% bzw. 82,5% der Proben positiv waren.
Die Erfindung wurde zwar unter Bezugnahme auf spezifische Ausführungsformen beschrieben, doch ist es Fachleuten auf dem Gebiet klar, dass die Ausführungsformen nur in beispielhafter Weise beschrieben wurden. Zahlreiche Modifikationen können vorgenommen werden, die einer bestimmten Situation, einem Material, einer Substanzzusammensetzung, einem Verfahren oder einem oder mehreren Verfahrensschritten angepasst werden, wie es Fachleuten auf dem Gebiet klar ist.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis der Gegenwart oder zur Bestimmung der Menge von für ein Antigen spezifischen Antikörpern in einer Probe, von der angenommen wird, dass sie die Antikörper enthält, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:

a) das Vemischen von Folgendem in einem wässrigen Medium, um ein Gemisch zu bilden:

i) der Probe,

ii) eines Antigens, das die Antikörper bindet, um einen Antigen/Antikörper-Komplex zu bilden, wobei die Menge des dem Medium zugesetzten Antigens Z ist, wobei Z im Bereich von X bis nX liegt und geringer als Y ist, wobei n = 5 bis 1000 ist, X die minimale Menge des Antigens ist, die zuverlässig nachgewiesen werden kann, wenn keine Antikörper in einer Probe vorhanden sind, und Y die maximal in der Probe zu erwartende Menge der Antikörper ist, und

iii) eines ersten Bindemittels, das zwar den Komplex, nicht aber das Antigen bindet, wenn das Antigen nicht Teil des Komplexes ist;

b) die Zugabe eines zweiten Bindemittels, das relativ zur Bindung des Komplexes, wenn der Komplex an das erste Bindemittel gebunden ist, selektiv das Antigen bindet, zum Gemisch; und

c) die Detektion des an das zweite Bindemittel gebundenen Antigens, wobei dessen Gegenwart oder Menge mit der Gegenwart oder Menge der Antikörper in der Probe in Zusammenhang steht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das erste Bindemittel aus der aus Antikörpern gegen Immunglobuline, Komplementfaktor, C1q, Rheumafaktor, Protein G und Protein A bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin das erste Bindemittel an eine suspendierbare feste Phase oder ein lösliches Polymer gebunden ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin die suspendierbare teste Phase ein aus der aus Polymeren, Keramik und Glas bestehenden Gruppe ausgewähltes Teilchen ist.

5. Verfahren nach Anspruch 3, worin das lösliche Polymer ein Molekulargewicht von über 250.000 besitzt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Detektionsschritt die Bestimmung von Enzymaktivität, Lumineszenz oder Lichtabsorptionsvermögen umfasst.

7. Verfahren nach Anspruch 1, worin das zweite Bindemittel ein Rezeptor für das Antigen und an einen Träger gebunden ist oder gebunden werden kann.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin das Antigen an eine Komponente eines signalerzeugenden Systems gebunden ist oder gebunden werden kann.

9. Verfahren nach Anspruch 1, worin das zweite Bindemittel ein erster das Antigen bindender Rezeptor ist und das weiters das Kontaktieren des Gemischs mit einem zweiten das Antigen bindenden Rezeptor umfasst, wobei zumindest einer der Rezeptoren direkt oder indirekt an eine Markierung gebunden ist.

10. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Antigen an einen Liganden gebunden und das zweite Bindemittel ein Rezeptor für den Liganden ist, der an einen Träger gebunden ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, das weiters die Abtrennung des Trägers vom Gemisch und das Kontaktieren des Trägers mit einem Rezeptor für das Antigen umfasst.

12. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Antikörper Autoantikörper gegen Glutaminsäure-Decarboxylase oder Insulin sind.

13. Verfahren zum Nachweis der Gegenwart oder zur Bestimmung der Menge von für ein bestimmtes Antigen spezifischen Antikörpern in einer Probe, von der angenommen wird, dass sie die Antikörper enthält, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:

a) das Vemischen von Folgendem in einem wässrigen Medium:

i) der Probe,

b) das Kontaktieren des Mediums mit einem zweiten, an eine teste Phase gebundenen Bindemittel, wobei das zweite Bindemittel ein Rezeptor ist, der zwar das Antigen bindet, um an die feste Phase gebundenes Antigen zu bilden, der jedoch nicht den Antigen/Antikörper-Komplex bindet;

c) die Detektion des an die feste Phase gebundenen Antigens, wobei dessen Gegenwart oder Menge mit der Gegenwart oder Menge der Antikörper in der Probe in Zusammenhang steht.

14. Verfahren nach Anspruch 13, worin das erste Bindemittel aus der aus Antikörpern gegen Immunglobuline, Komplementfaktor, C1q, Rheumafaktor, Protein G und Protein A bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

15. Verfahren nach Anspruch 14, worin das erste Bindemittel an eine suspendierbare feste Phase oder ein lösliches Polymer gebunden ist.

16. Verfahren nach Anspruch 13, worin der Detektionsschritt das Kontaktieren der festen Phase mit einer oder mehreren Komponenten eines signalerzeugenden Systems und das Messen des von den Komponenten des signalerzeugenden Systems erzeugten Signals, wobei dessen Auftreten oder Menge mit der Gegenwart oder Menge der Antikörper in der Probe in Zusammenhang steht.

17. Verfahren nach Anspruch 16, worin zumindest eine der Komponenten des signalerzeugenden Systems aus der aus Fluoreszenzmitteln, Enzymen, Chemilumineszenzmitteln, Photosensibilisatoren und suspensierbaren Teilchen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

18. Verfahren zum Nachweis der Gegenwart oder zur Bestimmung der Menge von Antikörpern in einer Probe, von der angenommen wird, dass sie die Antikörper enthält, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:

a) das Vemischen von Folgendem in einem wässrigen Medium:

i) der Probe,

b) die Zugabe eines zweiten Bindemittels, das aus zwei das Antigen bindenden Rezeptoren besteht, zum Medium, wobei zumindest einer der Rezeptoren sich nicht effektiv an den Komplex binden kann, wenn der Komplex an das Bindemittel gebunden ist; und

c) die Detektion des durch die Bindung des Antigens durch den Rezeptor gebildeten Komplexes.

19. Verfahren nach Anspruch 18, worin das erste Bindemittel aus der aus Antikörpern gegen Immunglobuline, Komplementfaktor, C1q, Rheumafaktor, Protein G und Protein A bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

20. Verfahren nach Anspruch 19, worin das erste Bindemittel an eine suspendierbare teste Phase oder ein lösliches Polymer gebunden ist.

21. Verfahren nach Anspruch 18, worin der Detektionsschritt die Bestimmung von Lumineszenz oder Lichtabsorptionsvermögen umfasst.

22. Verfahren nach Anspruch 21, worin zumindest einer der Rezeptoren an eine aus der aus Fluoreszenzmitteln, Chemilumineszenzmitteln und Photosensibilisatoren bestehenden Gruppe ausgewählte nachweisbare Markierung gebunden ist.

23. Verfahren zum Nachweis der Gegenwart oder zur Bestimmung der Menge von Glutaminsäure-Decarboxylase-Autoantikörpern in einer Probe, von der angenommen wird, dass sie die Antikörper enthält, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:

a) das Vemischen von Folgendem in einem wässrigen Medium:

i) der Probe,

ii) Glutaminsäure-Decarboxylase-Antigen, das die Autoantikörper bindet, um einen Antigen/Autoantikörper-Komplex zu bilden, wobei die Menge des dem Medium zugesetzten Antigens Z ist, wobei Z im Bereich von X bis nX liegt und geringer als Y ist, wobei n = 5 bis 1000 ist, X die minimale Menge des Antigens ist, die zuverlässig nachgewiesen werden kann, wenn keine Antikörper in einer Probe vorhanden sind, und Y die maximal in der Probe zu erwartende Menge der Antikörper ist, und

iii) eines den Komplex bindenden ersten Bindemittels, wobei das erste Bindemittel ein Rezeptor für die Autoantikörper ist und an ein aus der aus einer suspendierbaren festen Phase und einem löslichen Polymer bestehenden Gruppe ausgewähltes Material gebunden ist;

b) die Zugabe eines zweiten Bindemittels, das relativ zur Bindung des Komplexes, wenn der Komplex an das erste Bindemittel gebunden ist, selektiv das Antigen bindet, zum Medium; und

c) die Detektion der Bindung des zweiten Bindemittels an das Antigen, wobei dessen Bindung mit der Gegenwart oder Menge der Antikörper in der Probe in Zusammenhang steht.

24. Verfahren nach Anspruch 23, worin das erste Bindemittel aus der aus Antikörpern gegen Immunglobuline, Komplementfaktor, C1q, Rheumafaktor, Protein G und Protein A bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

25. Verfahren nach Anspruch 24, worin das erste Bindemittel Protein A ist und das lösliche Polymer aus der aus Sepharose und Dextran bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

26. Verfahren nach Anspruch 23, worin der Detektionsschritt die Bestimmung von Enzymaktivität, Lumineszenz oder Lichtabsorptionsvermögen umfasst.

27. Verfahren nach Anspruch 23, worin das zweite Bindemittel ein Rezeptor für das Antigen und an einen Träger gebunden ist oder gebunden werden kann.

28. Verfahren nach Anspruch 27, worin das Antigen an eine Komponente eines signalerzeugenden Systems gebunden ist oder gebunden werden kann.

29. Verfahren nach Anspruch 23, worin das zweite Bindemittel ein Rezeptor für das Antigen ist und das weiters das Kontaktieren des Mediums mit einem zweiten das Antigen bindenden Rezeptor umfasst, wobei zumindest einer der Rezeptoren an eine Komponente eines signalerzeugenden Systems gebunden ist.

30. Verfahren nach Anspruch 23, worin das Antigen an einen Liganden gebunden und das zweite Bindemittel ein Rezeptor für den Liganden ist, der an einen Träger gebunden ist.

31. Verfahren nach Anspruch 30, das weiters die Abtrennung des Trägers vom Medium und das Kontaktieren des Trägers mit einem zweiten Rezeptor für das Antigen umfasst, der an eine Komponente eines signalerzeugenden Systems gebunden ist.

32. Verfahren nach Anspruch 23, worin die Menge des dem Medium zugesetzten Antigens 0,01 bis 12,0 fmol beträgt.

33. Verfahren nach Anspruch 32, worin die Menge des dem Medium zugesetzten Antigens 0,025 bis 7,5 fmol beträgt.

34. Verfahren nach Anspruch 33, worin die Menge des dem Medium zugesetzten Antigens 0,1 bis 2,0 fmol beträgt.

35. Verfahren zum Nachweis der Gegenwart oder zur Bestimmung der Menge von Antikörpern in einer Probe, von der angenommen wird, dass sie die Antikörper enthält, zur Diagnose oder Überwachung einer Krankheit beim Menschen, umfassend die Schritte des Kombinierens der Probe und eines Antigens, das die Antikörper bindet, in einem wässrigen Medium, um ein Gemisch aus einem Antigen/Antikörper-Komplex und freiem Antigen zu bilden; und des Detektierens des freien Antigens, wobei dessen Gegenwart oder Menge mit der Gegenwart oder Menge der Antikörper in der Probe in Zusammenhang steht, wobei die Verbesserung die Verwendung einer Menge an Antigen Z umfasst, wobei Z im Bereich von X bis nX liegt und geringer als Y ist, wobei n = 5 bis 1000 ist, X die minimale Menge des Antigens ist, die zuverlässig nachgewiesen werden kann, wenn keine Antikörper in einer Probe vorhanden sind, und Y die maximal in der Probe zu erwartende Menge der Antikörper ist.

36. Verfahren zum Nachweis der Gegenwart oder zur Bestimmung der Menge von Antikörpern in einer Probe, von der angenommen wird, dass sie die Antikörper enthält, zur Diagnose oder Überwachung einer Krankheit beim Menschen, umfassend die Schritte des Kombinierens der Probe und eines Antigens, das die Antikörper bindet, in einem wässrigen Medium, um ein Gemisch aus einem Antigen/Antikörper-Komplex und freiem Antigen zu bilden; und des Detektierens des freien Antigens, wobei dessen Gegenwart oder Menge mit der Gegenwart oder Menge der Antikörper in der Probe in Zusammenhang steht, wobei die Verbesserung die Zugabe eines ersten Bindemittels, das zwar den Komplex, nicht aber das Antigen bindet, gefolgt von der Zugabe eines zweiten Bindemittels, das zwar das freie Antigen, nicht aber das Antigen als Teil des Komplexes bindet; und worin die Menge des Antigens Z ist, wobei Z im Bereich von X bis nX liegt und geringer als Y ist, wobei n = 5 bis 1000 ist, X die minimale Menge des Antigens ist, die zuverlässig nachgewiesen werden kann, wenn keine Antikörper in einer Probe vorhanden sind, und Y die maximal in der Probe zu erwartende Menge der Antikörper ist.

37. Set zur Verwendung in einem Verfahren zur Detektion von Antikörpern, umfassend eine gemeinsam verpackte Kombination aus:

a) einem Antigen, das die Antikörper bindet, um einen Antigen/Antikörper-Komplex zu bilden, wobei die Menge des Antigens Z ist, wobei Z im Bereich von X bis nX liegt und geringer als Y ist, wobei n = 5 bis 1000 ist, X die minimale Menge des Antigens ist, die zuverlässig nachgewiesen werden kann, wenn keine Antikörper in einer Probe vorhanden sind, und Y die maximal in der Probe zu erwartende Menge der Antikörper ist,

b) einem ersten Bindemittel, das zwar den Komplex, nicht aber das Antigen bindet, wenn das Antigen nicht Teil des Komplexes ist; und

c) einem zweiten Bindemittel, das relativ zur Bindung des Komplexes, wenn der Komplex an das erste Bindemittel gebunden ist, selektiv das Antigen bindet.

38. Set nach Anspruch 37, worin die Antikörper Glutaminsäure-Decarboxylase-Autoantikörper sind, das Antigen Glutaminsäure-Decarboxylase ist und das Bindemittel ein Rezeptor für den Komplex und an ein lösliches Polymer gebunden ist.

39. Set nach Anspruch 37, worin die Antikörper Insulin-Autoantikörper sind, das Antigen Insulin ist und das Bindemittel ein Rezeptor für den Komplex und an ein lösliches Polymer gebunden ist.