DE102004054545A1

DE102004054545A1 - Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen

Info

Publication number: DE102004054545A1
Application number: DE102004054545A
Authority: DE
Inventors: Kirsten Falk; Olaf RÖTZSCHKE
Original assignee: Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Current assignee: Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Priority date: 2004-09-16
Filing date: 2004-11-11
Publication date: 2006-04-06
Also published as: US20070280957A1; WO2006029891A2; EP1789085A2; WO2006029891A3

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen mit Liganden, wobei die Änderung des Beladungszustandes durch eine Verbindung der Formeln I, II, III oder IV1 bis IV3 katalysiert wird. Im weiteren bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung von Verbindungen der Formeln I, II, III oder IV1 bis IV3 oder bzw. auf die Verwendung von mit Liganden beladenen MHC-Molekülen, herstellbar nach einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen oder Zuständen, die mit diversen pathologisch überschießenden oder unterbleibenden Immunantworten verknüpft sind, sowie zur Auslösung tumorspezifischer, pathogenspezifischer oder autoreaktiver Immunantworten. Die Erfindung bezieht sich außerdem auf die Verwendung dieser Verbindungen zur Behandlung von Krebs, Infektionskrankheiten, Autoimmunkrankheiten und zur Abschwächung von aggressiven Immunreaktionen, sowie auf die Herstellung eines Vakzins oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung der genannten Erkrankungen oder Zustände.

Description

Die Initiation der Kaskade der Immunantwort verläuft im wesentlichen über MHC-Moleküle und beruht vor allem auf der spezifischen Detektion und Abwehr pathogener Invasoren durch die Bindung von Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)-assoziierten Peptidantigenen an T-Zell-Rezeptoren (TCR). Die Bildung stabiler MHC-Peptid-Komplexe ist dabei von zentraler Bedeutung für die Auslösung von Immunantworten. Leere MHC-Klasse II Moleküle sind von Natur aus instabil und zerfallen relativ schnell, während MHC-Peptid-Komplexe eine wesentlich größere Halbwertszeit aufweisen. Die Bindung von CLIP bzw. Ii (Class II associated invariant chain peptide (CLIP/Ii_89-102)) unmittelbar nach Expression der MHC-Klasse II Moleküle sorgt u.a. dafür, dass die Komplexe bis zu ihrer Beladung mit antigenen Peptiden stabil bleiben. Die Dissoziation gebundener Peptide insbesondere bei physiologischen pH-Werten dauert allerdings sehr lange und kann abhängig von dem jeweiligen Peptid und von dem MHC-Klasse II-Allel mehrere Stunden dauern. Erste Untersuchungen stellten jedoch fest, dass die in späten endosomalen Vesikeln vorliegenden, niedrigen pH-Werte die Dissoziation von CLIP drastisch beschleunigen und somit die Assoziation anderer Peptide erleichtern (Avva, R.R., and P. Cresswell. 1994, Immunity 1:763-774). Dennoch liegen die Dissoziationsraten für viele MHC-Allele noch so hoch, dass die relativ kurze Verweilzeit in endosomalen Vesikeln nicht ausreichen würde, um den kompletten Austausch gebundenen CLIPs zu gewährleisten. Deshalb ist zur Katalyse des vollständigen Austausches ein physiologischer Kofaktor nötig. Dieser wird als HLA-DM bezeichnet. HLA-DM ist ein Transmembranprotein das ebenfalls im MHC-Klasse II Genlocus kodiert wird und durch Bindung an den Peptid/MHC-Komplex den Ligandenaustausch beschleunigt.

Der Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)-Genlocus kontrolliert eine Vielzahl wichtiger immunologischer Funktionen. Er liegt auf dem kurzen Arm des Chromosoms 6 des menschlichen Genoms und kodiert für mehrere Klassen an MHC-Molekülen. Beim Menschen wird der Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) als HLA (Human Leukocyte Antigen) bezeichnet (Wake, C.T. 1986. Molecular biology of the HLA class I and class II genes. Mol BiolMed 3:1-11).

Die Moleküle der Klasse I werden als HLA-A, -B und -C bezeichnet. Sie beschreiben eine Gruppe an membranständigen hochpolymorphen Glykoproteinen, die zur Präsentation von endogen exprimierten Antigenen an der Zelloberfläche dienen. Sie werden in fast allen Zellen des menschlichen Körpers exprimiert und bilden Heterodimere aus den schweren MHC-Klasse I-Ketten (HLA-A, -B oder -C) und einem nicht im MHC-Genlocus kodierten kleinen Protein, dem β2 Microglobulin (β2m). Die schweren α-Ketten besitzen eine kurze zytoplasmische Domäne, eine Transmembrandomäne und drei extrazelluläre Domänen die nicht kovalent mit β2m verknüpft sind. Die von MHC-Klasse I gebundenen Antigene sind Peptide, die fast ausschließlich eine Länge von 9-11 Aminosäuren besitzen. Die Peptidbindungsstelle wird allein von der α-Kette gebildet und besteht aus einem aus acht Strängen bestehenden β-Faltblatt, auf dem die Peptide zwischen zwei α-Helices eingeklemmt und an den beiden Enden durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den N- bzw. C-Termini des gebundenen Peptids und dem MHC-Komplex fixiert werden.

Die Moleküle der Klasse II beschreiben ebenfalls eine Gruppe an hoch polymorphen membranständigen Glykoproteinen, die zur Antigenpräsentation dienen. Anders als MHC-Klasse I-Moleküle werden diese allerdings nur in einer Gruppe spezieller Antigen-präsentierender Zellen (APC) exprimiert und dienen überwiegend zur Präsentation von Peptiden exogen aufgenommener Proteine. Man unterscheidet im Menschen drei verschiedene Arten von Klasse II Molekülen: HLA-DP, -DQ und -DR, von denen wiederum eine Vielzahl an unterschiedlichen Allelen existiert. Die gebildeten αβ-Heterodimere bestehen aus einer α- und einer β- Kette, die beide im MHC kodiert werden. Beide Ketten besitzen eine kurze zytoplasmische Domäne, eine Transmembran- und zwei extrazelluläre Domänen (α1 und α2 bzw. β1 und β2). Die Peptidbindungsgrube wird dabei von den α1- und β1- Domänen beider Ketten gebildet (Brown, J.H., T.S. Jardetzky, J.C. Gorga, L.J. Stern, R.G. Urban, J.L. Strominger, and D.C. Wiley. 1993. Three-dimensional structure of the human class II histocompatibility antigen HLA-DR1. Nature 364:33-39). Ähnlich wie bei Klasse-I-Molekülen wird das Peptid auch hier auf einem β-Faltblatt zwischen mehreren α-helikalen Strukturen eingebunden. Anders als bei MHC-Klasse-I-Molekülen sind hier allerdings die Enden der Peptidbindungsstelle offen, so dass die Peptide aus dem Komplex herausragen können (Rajnavolgyi, E., A. Horvath, P. Gogolak, G.K. Toth, G. Fazekas, M. Fridkin, and I. Pecht. 1997. Characterizing immunodominant and protective influenza hemagglutinin epitopes by functional activity and relative binding to major histocompatibility complex class II sites. Eur J Immunol 27:3105-3114). In vivo liegt die Größe der gebundenen Peptide normalerweise in einem Bereich zwischen 13 und 25 Aminosäuren (AS) (Chicz, R.M., R.G. Urban, W.S.

Lane, J.C. Gorga, L.J. Stern, D.A. Vignali, and J.L. Strominger. 1992. Predominant naturally processed peptides bound to HLA-DR1 are derived from MHC-related molecules and are heterogeneous in size. Nature 358:764-768, Rudensky, A., P. Preston-Hurlburt, S.C. Hong, A. Barlow, and C.A. Janeway, Jr. 1991. Sequence analysis of peptides bound to MHC class II molecules. Nature 353:622-627), davon sind allerdings nur 13 in der Peptidbindungsfalte des MHC-Moleküls fixiert. Kristallographische Untersuchungen ergaben dabei, dass diese 13 AS in einer langgestreckten Konformation, ähnlich zu einer Polyprolin Typ II Helix, gebunden sind. Die aus der Peptidbindungsgrube herausragenden AS können demgegenüber auch andere Konformationen annehmen (Jardetzky, T.S., J.H. Brown, J.C. Gorga, L.J. Stern, R.G. Urban, J.L. Strominger, and D.C. Wiley. 1996. Crystallographic analysis of endogenous peptides associated with HLA-DR1 suggests a common, polyproline II-like conformation for bound peptides. Proc Natl Acad Sci U S A 93:734-738). Nähere Untersuchungen der Peptidbindung ergaben, dass 9 AS des Peptids für die Affinität der Bindung verantwortlich sind (Hill, J.A., S. Southwood, A. Sette, A.M. Jevnikar, D.A. Bell, and E. Cairns. 2003. Cutting Edge: The Conversion of Arginine to Citrulline Allows for a High-Affinity Peptide Interaction with the Rheumatoid Arthritis-Associated HLA-DRB1*0401 MHC Class II Molecule. J Immunol 171:538-541). Eine Verlängerung der Peptide in jedweder Richtung erhöht dabei nicht die Affinität der Bindung (Siklodi, B., A.B. Vogt, H. Kropshofer, F. Falcioni, M. Molina, D.R. Bolin, R. Campbell, G.J. Hammerling, and Z.A. Nagy. 1998. Binding affinity independent contribution of peptide length to the stability of peptide-HLA-DR complexes in live antigen presenting cells. Hum Immunol 59:463-471). Experimente mit unterschiedlichen Allelen des MHC-Klasse II Moleküls HLA-DR identifizierten über den Verlauf der Bindungsfalte mehrere „Bindungstaschen", die für die Affinität des Peptids zu dem jeweiligen Allel entscheidend sind (O'Sullivan, D., T. Arrhenius, J. Sidney, M.F. Del Guercio, M. Albertson, M. Wall, C. Oseroff, S. Southwood, S.M. Colon, F.C. Gaeta, and et al. 1991. On the interaction of promiscuous antigenic peptides with different DR alleles. Identification of common structural motifs. J Immunol 147:2663-2669; und Sette, A., J. Sidney, C. Oseroff, M.F. del Guercio, S. Southwood, T. Arrhenius, M.F. Powell, S.M. Colon, F.C. Gaeta, and H.M. Grey. 1993. HLA DR4w4-binding motifs illustrate the biochemical basis of degeneracy and specificity in peptide-DR interactions. J Immunol 151:3163-3170). Dabei scheint für alle allelischen Formen des HLA-DR die Bindung in der ersten Tasche nahe des N-terminalen Endes des Peptids ausschlaggebend für die Stabilität des ganzen Komplexes zu sein (Hammer, J., P. Valsasnini, K. Tolba, D. Bolin, J. Higelin, B. Takacs, and F. Sinigaglia. 1993. Promiscuous and allele-specific anchors in HLA-DR-binding peptides. Cell 74:197-203). Aber auch die Taschen an den relativen Positionen P3, P4, P6, P7 und P9 sowie Taschen an anderen Positionen der Bindungsfalte scheinen, in einer allelspezifischen Weise, von großer Bedeutung für die Affinität gebundener Peptide zu sein (Southwood, S., J. Sidney, A. Kondo, M.F. del Guercio, E. Appella, S. Hoffman, R.T. Kubo, R.W. Chesnut, H.M. Grey, and A. Sette. 1998. Several common HLA-DR types share largely overlapping peptide binding repertoires. J Immunol 160:3363-3373). Allerdings erlauben alle Allele selbst in der stringentesten Position die Bindung verschiedener Aminosäureseitenketten des gebundenen Peptids, so dass eine Vielzahl unterschiedlichster Peptide auf demselben HLA-Allel gebunden werden können (McFarland, B.J., and C. Beeson. 2002. Binding interactions between peptides and proteins of the class II major histocompatibility complex. Med Res Rev22:168-203). Die Stabilität der Bindung wird neben diesen allelspezifischen Bindungstaschen noch durch eine Reihe an Wasserstoffbrückenbindungen von hochkonservierten Teilen des MHC-Moleküls zum Peptidrückgrat des Antigens bestimmt. Anders als bei MHC-Klasse-I Komplexen sind diese über die gesamte Peptidbindungsgrube verteilt (Batalia, M.A., and E.J. Collins. 1997. Peptide binding by class I and class II MHC molecules. Biopolymers 43:281-302).

Ausgehend von den bisherigen Erkenntnissen erscheint die Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen mit Antigenen ein vielversprechender Ansatz zur Therapie pathologischer, sowie diverser pathologisch überschießender oder unterbleibender Immunantworten zu sein. Verschiedenste in vitro Ansätze zur Beschleunigung dieser Prozesse erbrachten bislang jedoch noch keine praktikablen Beladungsraten von MHC-Molekülen oder führten zu Erkenntnissen, die auf eine entsprechende Verwendbarkeit von solchen MHC-Molekülen schließen lassen.

Beispielsweise beschreiben Jensen et al. (Jensen et al., J. Exp. Med., 1990, 171 :1779-84), die Erhöhung der Beladung von MHC-Klasse II Molekülen durch die Absenkung des pH-Wertes. Jensen et al. (1990, supra) stellten die Hypothese auf, dass Peptidaustauschreaktionen auf der Zelloberfläche von aktivierten APCs auftreten könnten. Im Rahmen einer Infektion könnte dadurch die Dichte an präsentierten, normalerweise editierten Selbstpeptiden ansteigen, die sonst unterhalb des Grenzwertes zur Aktivierung autoreaktiver T-Zellen präsentiert werden. Als mögliche Ursache für solche extrazellulären Austauschreaktionen vermuteten Jensen et al. (1990, supra) lokale Erniedrigungen des pH-Wertes. Die lokale Erniedrigung des pH-Wertes ist jedoch im wesentlichen nur bei MHC-Molekülen möglich, die bei einem solchen pH löslich sind, nicht jedoch bei MHC-Molekülen, die bei einem solchen pH bereits unlöslich vorliegen. Eine Beladung von MHC-Molekülen mit Antigenen durch Absenkung des pH-Wertes kann weiterhin aufgrund der zellschädigenden nicht-physiologischen Wirkung nur sehr kurz oder lediglich nach Fixierung der Zellen angewendet werden. Für in vivo Situationen ist daher eine Anwendung des nach Jensen et al. (1990, supra) beschriebenen Verfahrens nicht möglich.

Ein weiterer Ansatz zur Beladung von MHC-Molekülen mit Antigenen erfolgt über die Verwendung des für den MHC-Ligadenaustausch natürlichen Katalysators HLA-DM (Weber et al., J. Immunol., 2001, 167:5167-74). Das von Weber et al. beschriebene Verfahren ermöglicht prinzipiell sehr effiziente Beladungen, jedoch ist die Herstellung des HLA-Proteins sehr aufwendig und teuer und somit kommerziell nicht erhältlich. Weiterhin erfordert die Beladung von MHC-Molekülen mit Antigenen die Anwesenheit von Detergenzien und kann lediglich bei einem niedrigen pH-Wert effizient durchgeführt werden. Da durch die Verwendung eines niedrigen pH-Wertes und die Verwendung von Detergenzien bei Weber et al. (2001, supra) zu nicht-physiologischen Bedingungen führen, ist ein in vivo Einsatz der durch dieses Verfahren erhaltenen beladenen MHC-Moleküle ausgeschlossen.

Eine weitere Alternative zur Beladung von MHC-Molekülen mit Antigenen ist die Verwendung von destabilisierenden Detergenzien, die vermutlich aufgrund ihres komplexdestabilierenden Einflusses die Beladung von MHC-Klasse II Molekülen beschleunigen können (siehe Roof et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1990, 87:1735-9; Avva und Cresswell, Immunity, 1994, 1:763-74). Destabilisierende Detergenzien zeigen jedoch nur eine verhältnismäßig geringe Aktivität bei der Beladung von MHC-Molekülen und besitzen den evidenten Nachteil, sich nach Zugabe nicht mehr oder nur extrem schwer von den MHC-Molekülen abtrennen zu lassen. Eine Auftrennung von destabilisierenden Detergenzien und beladenen MHC-Molekülen erscheint daher unter in vivo Bedingungen nicht möglich und mit Hilfe von destabilisierenden Detergenzien beladene MHC-Moleküle könnten daher nur zusammen mit den verwendeten destabilisierenden Detergenzien in vivo eingebracht werden. Da jedoch die Verwendung dieser Detergenzien zur Auflösung oder teilweisen Auflösung von Zellen führt, ist ein Einsatz der nach dem von Roof et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1990, 87:1735-9) oder Avva und Cresswell (Immunity, 1994, 1:763-74) beschriebenen Verfahren erhaltenen beladenen MHC-Moleküle in vivo nicht denkbar.

Die bislang besten Ergebnisse bei der Beladung von MHC-Molekülen mit Antigenen wurde durch die Verwendung von niedermolekularen Verbindungen erreicht, wie sogenannte Kleinmoleküle wie z. B. para-Chlorphenol, die als H-Donoren agieren (siehe Falk et al., J. Biol. Chem., 2002, 277:2709-15; und Marin-Esteban et al., J. Autoimmun., 2003, 20:63-9; und WO 03/016512). In diesen Studien wurde gezeigt, dass sogenannte Kleinmoleküle mit H-Donor-Eigenschaften die Fähigkeit besitzen, die Beladung von MHC-Klasse I und II Molekülen mit Peptiden bei physiologischem pH-Wert zu katalysieren bzw. gebundene Antigene auf der Oberfläche von APCs bei physiologischem pH-Wert auszutauschen. Alle in diesen Studien identifizierten Substanzen, die in der Lage sind, die MHC-Klasse II-Liganden Wechselwirkungen zu beeinflussen, können allerdings nur bei relativ hohen, nicht physiologischen Konzentrationen eingesetzt werden. Beispielsweise erfordert die Verwendung von Phenol eine Konzentration von 30 mM, n-Propanol sogar eine Konzentration von über 200 mM, Konzentrationen, die in vivo bereits erheblich toxisch wirken. Um ihre Wirksamkeit zu entfalten, müssten in vivo toxische Konzentrationen eingesetzt werden, so dass eine Überprüfung ihrer Wirksamkeit in Tiermodellen und damit ihre potenzielle Verknüpfung mit diversen pathologisch überschießenden oder unterbleibenden Immunantworten weder möglich noch denkbar ist.

Im Stand der Technik ist das Problem der Katalyse zur effizienten Beladung von MHC-Molekülen mit Liganden unter Verwendung geringstmöglicher Konzentrationen an Katalysatorverbindungen noch nicht gelöst.

Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe ist daher die Bereitstellung eines Verfahrens zur Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen mit Liganden, welches sowohl eine effiziente Beladung der MHC-Molekülen mit Liganden, den Austausch von Liganden auf der Oberfläche von MHC-Molekülen, die Verringerung oder Entfernung von Liganden auf der Oberfläche von MHC-Molekülen, sowie deren späteren in vivo Einsatz ermöglicht.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Therapeutika bzw. mit diesen Therapeutika durchführbaren Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen oder Zuständen, die mit diversen pathologisch überschießenden oder unterbleibenden Immunantworten verknüpft sind.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen mit Liganden gelöst. Dieses Verfahren umfasst die folgende Schritte:

a) Bereitstellung einer Zusammensetzung enthaltend MHC-Moleküle; und
b) Zugabe eines Katalysators ausgewählt aus einer Verbindung der Formel I mit der folgenden Struktur:
wobei: R¹, R², R³, R⁴, R⁵ und R⁶ eine Bindung sein können oder gemeinsam oder unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus: H, O, S, N, OH, OR¹, SH, SO, SO₂, SO₃, HSO₃, SR¹, SR¹R², X, CX₃, CHX₂, CH₂X, CR¹X₂, CR₂ ¹X, CR₃ ¹, wobei X = Halogen, oder CH, CO, COOH, COOR¹, NH, NH₂, NHR¹, NR¹R², NO, NO₂, NOH, NOR¹, oder CH₃, (CH₂)_n, (CH₂)_nCH₃; (CH₂)_n R¹, OCH₃, O(CH₂)_n, O(CH₂)_nCH₃; O(CH₂)_n R¹, (CH₂)_nOH, wobei R¹ und R² wie hier definiert sind und n = 1-6, oder einem verzweigten oder unverzweigten C₁-C₂₀-Alkyl, C₁-C₂₀-Alkenyl, C₁-C₂₀-Heteroalkyl, C₁-C₂₀-Heteroalkenyl, C₁-C₂₀-Alkoxy, C₁-C₂₀-Alkenoxy, C₁-C₂₀-Acyl, C₃-C₈-Cycloalkyl, C₃-C₈-Cycloalkenyl, C₅-C₂₀-Aryl, C₅-C₂₀-Heteroaryl, Arylalkyl, Arylalkenyl, C_5-20-Aryloxy, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkenyl, Heterocycloalkyl, Heterocycloalkenyl, Carboxamido-, Acylamino-, Amidino-, oder Heteroaryloxyrest; und
c) Änderung des Beladungszustandes der MHC-Moleküle; und
d) Isolierung der MHC-Moleküle, deren Beladungszustand verändert wurde.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Verbindungen der Formel I wie folgt definiert:
R¹, R², R³, R⁴, R⁵ und R⁶ können gemeinsam oder unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden bestehend aus:
H, O, S, N,
OH, OR¹, SH, SO, SO₂, SO₃, HSO₃, SR¹, SR¹R²,
X, CX₃, CHX₂, CH₂X, CR¹X₂, CR₂ ¹X, CR₃ ¹, X = Halogen, oder
CH, CO, COOH, COOR¹,
NH, NH₂, NHR¹, NR¹R², NO, NO₂, NOH, NOR¹,
CH₃, (CH₂)_n, (CH₂)_nCH₃, (CH₂)_nR¹, OCH₃, O(CH₂)_n, O(CH₂)_nCH₃, O(CH₂)_n R¹, (CH₂)_nOH,
Adamantyl,
CH(OH)CH₃, C₆H₄SO₂NH,
(CNNHC(CONHNH₂)CH₂); oder
C₆H₄(NHCOOH₃),
wobei n = 1-6 und alle X, R¹, R², R³, R⁴, R⁵ und R⁶ wie oben definiert sind.

In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Verbindungen der Formel I durch die folgenden Strukturen I1 bis I16 definiert:

In einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die zugrundeliegende Aufgabe durch ein Verfahren zur Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen mit Liganden gelöst, umfassend die folgenden Schritte:

a) Bereitstellung einer Zusammensetzung enthaltend MHC-Moleküle; und
b) Zugabe eines Katalysators ausgewählt aus einer Verbindung der Formel II mit der folgenden Struktur:
wobei: R^1', R^2', R^3' und R^4' eine Bindung sein können oder gemeinsam oder unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus: H, O, S, N, OH, OR^1', SH, SO, SO₂, SO₃, HSO₃, SR^1', SR^1'R^2', X, CX₃, CHX₂, CH₂X, CR¹X₂, CR₂ ¹X, CR₃ ^1' wobei X = Halogen, oder CN, CO, COOH, COOR¹, NH, NH₂, NHR^1', NR^1'R^2', NO, NO₂, NOH, NOR^1', oder CH₃, (CH₂)_n, (CH₂)_nCH₃, (CH₂)_nR^1', OCH₃, O(CH₂)_n, O(CH₂)_nCH₃, O(CH₂)_n R^1', (CH₂)_nOH, wobei n = 1-6 und R^1' und R^2' wie hier definiert sind, oder einem verzweigten oder unverzweigten C₁-C₂₀-Alkyl, C₁-C₂₀-Alkenyl, C₁-C₂₀-Heteroalkyl, C₁-C₂₀-Heteroalkenyl, C₁-C₂₀-Alkoxy, C₁-C₂₀-Alkenoxy, C₁-C₂₀-Acyl, C₃-C₈-Cycloalkyl, C₃-C₈-Cycloalkenyl, C₅-C₂₀-Aryl, C₅-C₂₀-Heteroaryl, Arylalkyl, Arylalkenyl, C_5-20-Aryloxy, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkenyl, Heterocycloalkyl, Heterocycloalkenyl, Carboxamido-, Acylamino-, Amidino-, Adamantyl- oder Heteroaryloxyrest, oder R^1' und R^2' gemeinsam eine verbrückte Struktur ausbilden können, ausgewählt aus OR^1', SR^1', SR^1'R^2', CR^1'X₂, CR₂ ^1'X, wobei X = Halogen, oder COOR^1', NHR^1', NR^1'R^2', NOR^1', oder (CH₂)_n, (CH₂)_nR^1', O(CH₂)_n, O(CH₂)_nR^1', wobei n = 1-6 und R^1' und R^2' wie hier definiert sind, oder einem verzweigten oder unverzweigten C₁-C₂₀-Alkyl, C₁-C₂₀-Alkenyl, C₁-C₂₀-Heteroalkyl, C₁-C₂₀-Heteroalkenyl, C₁-C₂₀-Alkoxy, C₁-C₂₀-Alkenoxy, C₁-C₂₀-Acyl, C₃-C₈-Cycloalkyl, C₃-C₈-Cycloalkenyl, C₅-C₂₀-Aryl, C₅-C₂₀-Heteroaryl, Arylalkyl, Arylalkenyl, C_5-20-Aryloxy, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkenyl, Heterocycloalkyl, Heterocycloalkenyl, Carboxamido-, Acylamino-, Amidino-, Adamantyl- oder Heteroaryloxyrest; und
c) Änderung des Beladungszustandes der MHC-Moleküle; und
d) Isolierung der MHC-Moleküle, deren Beladungszustand verändert wurde.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Substituenten der Formel II wie folgt definiert.
R^1', R^2', R^3' oder R^4' können eine Bindung sein oder gemeinsam oder unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus:
H, O, S, N,
OH, OR^1', SH, SO, SO₂, SO₃, HSO₃, SR^1', SR^1'R^2',
X, CX₃, CHX₂, CH₂X, CR^1'X₂, CR₂ ^1'X, CR₃ ^1', wobei X = Halogen, oder
CN, CO, COOH, COOR^1',
NH, NH₂, NHR^1', NR^1'R^2', NO, NO₂, NOH, NOR^1',
CH₃, (CH₂)_n, (CH₂)_nCH₃, (CH₂)_nR^1', OCH₃, O(CH₂)_n, O(CH₂)_nCH₃, O(CH₂)_nR^1', (CH₂)_nOH,
Adamantyl,
COOC₂H₅, oder
(CNOC(COOCH₃)CH), und/oder
R^1', R^2' können gemeinsam eine verbrückte Struktur ausbilden, ausgewählt aus
OR^1', SR^1', SR^1'R^2',
CR^1'X₂, CR₂ ^1'X, CR₃ ^1', wobei X = Halogen, oder
COOR^1', oder
NHR^1', NR^1'R^2', NOR^1',
(CH₂)_n, (CH₂)_nR^1', O(CH₂)_n, O(CH₂)_nR^1',
C₅H₁₀,
C₅H₉(CH₃);
C₅H₉(NOH),
wobei n = 1-6 und alle X, R^1', R^2', R^3' und R^4' wie oben definiert sind.

In einer stärker bevorzugten Ausführungsform der folgenden Erfindung werden die Verbindungen der Formel II aus folgenden Strukturen ausgewählt:

In einer weiteren alternativen Ausführungsform wird die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe durch ein Verfahren zur Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen mit Liganden gelöst, umfassend die folgende Schritte:

a) Bereitstellung einer Zusammensetzung enthaltend MHC-Moleküle; und
b) Zugabe eines Katalysators ausgewählt aus einer Verbindung der Formel III mit der folgenden Struktur:
wobei: R^1'' und R^2'' eine Bindung sein können oder gemeinsam oder unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus: H, O, S, N, OH, OR^1'', SH, SO, SO₂, SO₃, HSO₃, SR^1'', SR^1''R^2'', X, CX₃, CHX₂, CH₂X, CR^1' ^'X₂, CR₂ ^1''X wobei X = Halogen, oder CN, CO, COOH, COOR^1'', NH, NH₂, NHR^1'', NR^1''R^2'', NO, NO₂, NOH, NOR^1'', CH₃, (CH₂)_n, (CH₂)_nCH₃, (CH₂)_nR^1'', OCH₃, O(CH₂)_n, O(CH₂)_nCH₃; O(CH₂)_nR^1'', (CH₂)_nOH, wobei n = 1-6 und R^1'' und R^2'' wie hier definiert sind, oder einem verzweigten oder unverzweigten C₁-C₂₀-Alkyl, C₁-C₂₀-Alkenyl, C₁-C₂₀-Heteroalkyl, C₁-C₂₀-Heteroalkenyl, C₁-C₂₀-Alkoxy, C₁-C₂₀-Alkenoxy, C₁-C₂₀-Acyl, C₃-C₈-Cycloalkyl, C₃-C₈-Cycloalkenyl, C₅-C₂₀-Aryl, C₅-C₂₀-Heteroaryl, Arylalkyl, Arylalkenyl, C_5-20-Aryloxy, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkenyl, Heterocycloalkyl, Heterocycloalkenyl, Carboxamido-, Acylamino-, Amidino-, Adamantyl- oder Heteroaryloxyrest, und R^3'' und R^4'' eine Bindung sein können oder gemeinsam oder unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus: H, O, S, N, SH, SO, SO₂, SO₃, HSO₃, SR^1'', SR^1''R^2'', Br, CX₃, CHX₂, CH₂X, CR^1''X₂, CR₂ ^1''X, CR₃ ^1'' wobei X = Halogen, oder CN, CO, COOH, COOR^1'', NH, NH₂, NHR^1'', NR^1''R^2'', NO, NO₂, NOH, NOR^1'', CH₃, (CH₂)_n, (CH₂)_nCH₃, (CH₂)_nR^1'', OCH₃, O(CH₂)_n, O(CH₂)_nCH₃; O(CH₂)_nR^1'', (CH₂)_nOH, wobei n = 1-6 und R^1'' und R^2'' wie oben definiert sind, oder einem verzweigten oder unverzweigten C₁-C₂₀-Alkyl, C₁-C₂₀-Alkenyl, C₁-C₂₀-Heteroalkyl, C₁-C₂₀-Heteroalkenyl, C₁-C₂₀-Alkoxy, C₁-C₂₀-Alkenoxy, C₁-C₂₀-Acyl, C₃-C₈-Cycloalkyl, C₃-C₈-Cycloalkenyl, C₅-C₂₀-Aryl, C₅-C₂₀-Heteroaryl, Arylalkyl, Arylalkenyl, C_5-20-Aryloxy, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkenyl, Heterocycloalkyl, Heterocycloalkenyl, Carboxamido-, Acylamino-, Amidino-, Adamantyl- oder Heteroaryloxyrest, oder R^3'' und R^4''gemeinsam eine verbrückte Struktur ausbilden können, ausgewählt aus OR^1'', SR^1'', SR^1''R^2'', CR^1''X₂, CR₂ ^1''X, wobei X = Halogen, oder COOR^1'', O(CH₂)_nR^1'', NHR^1'', NR^1''R^2'', NOR^1'', (CH₂)_n,(CH₂)_nR^1'', O(CH₂)_n, O(CH₂)_nR^1'', wobei n = 1-6 und R^1'' und R^2'' wie oben definiert sind, oder einem verzweigten oder unverzweigten C₁-C₂₀-Alkyl, C₁-C₂₀-Alkenyl, C₁-C₂₀-Heteroalkyl, C₁-C₂₀-Heteroalkenyl, C₁-C₂₀-Alkoxy, C₁-C₂₀-Alkenoxy, C₁-C₂₀-Acyl, C₃-C₈-Cycloalkyl, C₃-C₈-Cycloalkenyl, C₅-C₂₀-Aryl, C₅-C₂₀-Heteroaryl, Arylalkyl, Arylalkenyl, C_5-20-Aryloxy, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkenyl, Heterocycloalkyl, Heterocycloalkenyl, Carboxamido-, Acylamino-, Amidino-, Adamantyl- oder Heteroaryloxyrest; und
c) Änderung des Beladungszustandes der MHC-Moleküle; und
d) Isolierung der MHC-Moleküle, deren Beladungszustand verändert wurde.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Substituenten der Formel III wie folgt definiert:
R^1'' und R^2'' können eine Bindung sein oder gemeinsam oder unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus:
H, O, S, N,
OH, OR^1'', SH, SO, SO₂, SO₃, HSO₃, SR^1'', SR^1''R^2'',
X, CX₃, CHX₂, CH₂X, CR^1''X₂, CR₂ ^1''X, CR₃ ^1'', wobei X = Halogen, oder
CN, CO, COOH, COOR^1'',
NH, NH₂, NHR^1'', NR^1''R^2'', NO, NO₂, NOH, NOR^1'',
CH₃, (CH₂)_n, (CH₂)_nCH₃, (CH₂)_nR^1'', OCH₃, O(CH₂)_n, O(CH₂)_nCH₃; O(CH₂)_nR^1'', (CH₂)_nOH,
Adamantyl, und
R^3'' und R^4'' können eine Bindung sein oder gemeinsam oder unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus:
H, O, S, N,
SH, SO, SO₂, SO₃, HSO₃, SR^1'', SR^1''R^2'',
Br, CX₃, CHX₂, CH₂X, CR^1''X₂, CR₂ ^1''X, CR₃ ^1'', wobei X = Halogen, oder
CN, CO, COOH, COOR^1'',
NH, NH₂, NHR^1'', NR^1''R^2'', NO, NO₂, NOH, NOR^1'', CH₃, (CH₂)_n, (CH₂)_nCH₃, (CH₂)_nR^1'', OCH₃, O(CH₂)_n, O(CH₂)_nCH₃;
O(CH₂)_nR^1'', (CH₂)_nOH,
Adamantyl,
C₆H₁₀OH,
SO₂CF₃,
S(CCH(CH₃)N(OH)NC(CH₃)),
(CNONC)NHCH₂(N₄CH),
NHC(O)(C₄H₂O(CH₃)),
CH₂(C₂N₂H₅(CO)₂),
SCFCF₃COOCH₃,
SCH₂(C₂NSH(NH₂))
C₃N₂H₃,
C(CH₃)C(O)NHC(O)CH₂,
C(CH₃)CH₂NHC(O)S,
C₆H₅,
NHC(O)CHNOH,
S(CH₂)₂(C₅H₄N),
CHC(CN)(COOCH₃),
C₃H₄N,
S(C(CH₃)NHNC(CH₃)),
NH(C₆H₃N₂O),
C₆H₄S(O)₂NH,
C₆H₄NHC(O)CH₃, oder
NHC(O)CHNOH; oder
R^3'' und R^4'' können gemeinsam eine verbrückte Struktur ausbilden, ausgewählt aus
OR^1'', SR^1'', SR^1''R^2'',
CR^1''X₂, CR₂ ^2''X, CR₃ ^1'', wobei X = Halogen, oder
COOR^1'',
NHR^1'', NR^1''R^2'', NOR^1'',
(CH₂)_n, (CH₂)_nR^1'', O(CH₂)_n, O(CH₂)_nR^1'',
(NHCHC)(C₃NOH)COOCH₃,
(OCH₂CH(CF₃)S(O)₂)
(OCH₂C(NOH)),
(C(O)N(CH₂)₂(C₆H₉))C(O)),
(OC(S)S),
(O(CH₂)₂C(NOH)),
(OC(O)CHC(CH₂COOH)), oder
(NCHC(COOC₂H₅)C(OH));
wobei n = 1-6 und alle X, R^1'', R^2'', R^3'' und R^4'' wie zuvor definiert sind.

In einer stärker bevorzugten Ausführungsform werden die Verbindungen nach Formel III aus den folgenden Strukturen ausgewählt:

a) Bereitstellung einer Zusammensetzung enthaltend MHC-Moleküle; und
b) Zugabe eines Katalysators ausgewählt aus einer Verbindung der Formeln IV1 bis IV3; und
c) Änderung des Beladungszustandes der MHC-Moleküle; und
d) Isolierung der MHC-Moleküle, deren Beladungszustand geändert wurde.

Die Verfahrensschritte (a), (b) und gegebenenfalls (c) der zuvorgenannten erfindungsgemäßen Verfahren zur Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen mit Liganden können in beliebiger Reihenfolge oder parallel erfolgen. Beispielsweise können die Schritte (b) und (c) parallel stattfinden. Auch kann anstelle der Bereitstellung der Zusammensetzung enthaltend MHC-Moleküle zunächst der Katalysator, vorzugsweise in Lösung, in einem Verfahrensschritt (a) vorgelegt werden und dann die jeweils anderen Substanzen hinzugegeben werden.

Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die oben genannten Substituenten bevorzugt wie folgt definiert:
Ein Alkyl gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst lineare, verzweigte oder zyklische C₁-C₂₀, bevorzugt C₁-C₆ Kohlenwasserstoffstrukturen sowie Kombinationen daraus. „Niedere Alkyle" beziehen sich auf Alkylgruppen mit 1-6 Kohlenstoffatomen. Beispiele niederer Alkylgruppen schließen Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, s-und t-Butyl- und ähnliches mit ein. Cycloalkyle sind eine Untergruppe der Alkyle und schließen zyklische Kohlenwasserstoffgruppen von 3 bis 8 Kohlenstoffatomen mit ein. Beispiele von Cycloalkylgruppen schließen Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Norbornyl und ähnliches mit ein.

Ein Alkenyl gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst lineare, verzweigte oder zyklische ungesättigte C₁-C₂₀, bevorzugt C₁-C₆ Kohlenwasserstoffstrukturen sowie Kombinationen daraus. „Niedere Alkenyle" beziehen sich auf Alkenylgruppen mit 1-6 Kohlenstoffatomen. Beispiele niederer Alkenylgruppen schließen Methenyl-, Ethenyl-, Propenyl-, Isopropenyl-, Butenyl-, s-und t-Butenyl- und ähnliches mit ein. Cycloalkenyle sind eine Untergruppe der Alkenyle und schließen zyklische Kohlenwasserstoffgruppen von 3 bis 20 Kohlenstoffatomen, bevorzugt von 3 bis 8 Kohlenstoffatomen mit ein. Beispiele von Cycloalkenylgruppen schließen Cyclopropenyl, Cyclobutenyl, Cyclopentenyl und ähnliches mit ein.

Ein Heteroalkyl oder Heteroalkenyl der vorliegenden Verbindung umfasst ein wie oben definiertes Alkyl oder Alkenyl, in welchem ein oder zwei Kohlenstoffe gegen ein Heteroatom wie beispielsweise Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefel ausgetauscht sind.

Alkoxy- oder Alkoxyl-Gruppen gemäß der vorliegenden Erfindung beziehen sich auf Gruppen aus 1 bis 20 Kohlenwasserstoffatomen, bevorzugt aus 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, einer unverzweigten, einer verzweigten oder einer zyklischen Konfiguration sowie Kombinationen davon, die über ein Sauerstoffatom mit der Hauptverbindung verknüpft sind. Beispiele schließen Methoxy-, Ethoxy-, Propoxy-, Isopropoxy-, Cyclopropyloxy-, Cyclohexyloxy- und ähnliche Gruppen mit ein. Niedere Alkoxy- oder Alkoxyl-Gruppen beziehen sich auf Gruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen.

Alkenoxy- oder Alkenoxyl-Gruppen gemäß der vorliegenden Erfindung beziehen sich auf Gruppen aus 1 bis 20 Kohlenwasserstoffatomen, bevorzugt aus 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, einer unverzweigten, einer verzweigten oder einer zyklischen ungesättigten Konfiguration sowie Kombinationen davon, die über ein Sauerstoffatom mit der Hauptverbindung verknüpft sind. Beispiele schließen Methenoxy, Ethenoxy, Propenoxy, Isopropenoxy, Cyclopropenyloxy, Cyclohexenyloxy und ähnliches mit ein. Niedere Alkenoxy- oder Alkenoxyl-Gruppen beziehen sich auf Gruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen.

Aryle und Heteroaryle gemäß der vorliegenden Erfindung beziehen sich auf einen 5 oder 6-gliedrigen aromatischen oder heteroaromatischen Ring enthaltend 0-3 Heteroatome ausgewählt aus O, N, oder S; ein bicyclisches 9-oder 10-gliedriges aromatisches oder heteroaromatisches Ringsystem enthaltend 0-5 Heteroatome ausgewählt aus O, N, oder S; oder ein tricyclisches 13-or 14-gliedriges aromatisches oder heteroaromatisches Ringsystem enthaltend 0-7 Heteroatome ausgewählt aus O, N, oder S. Die aromatischen 6- bis 14-gliedrigen Ringsysteme schließen beispielsweise mit ein Benzol, Naphthalen, Indan, Tetralin, und Fluoren und die 5-bis 10-gliedrigen aromatischen heterocyclischen Ringe, schließen beispielsweise mit ein Imidazol, Pyridin, Indol, Thiophen, Benzopyranon, Thiazol, Furan, Benzimidazol, Chinolin, Isochinolin, Chinoxalin, Pyrimidin, Pyrazin, Tetrazol und Pyrazol.

Ein Arylalkyl oder Aralkyl gemäß der vorliegenden Erfindung bedeutet einen wie oben definierten Alkylrest, der an ein wie oben definiertes Aryl gebunden ist. Beispiele von Aralkylresten sind Benzyl, Phenethyl und ähnliche. Heteroarylalkyl bedeutet einen wie oben definierten Alkylrest, der an einen wie oben definierten Heteroarylring gebunden ist. Heteroarylalkenyl bedeutet einen wie oben definierten Alkyenlrest, der an einen wie oben definierten Heteroarylring gebunden ist Beispiele schließen mit ein, Pyridinylmethyl, Pyrimidinylethyl und Ähnliches.

Ein Heterocyclus gemäß der vorliegenden Erfindung repräsentiert einen wie oben definierten Cycloalkyl- oder Arylrest, in welchem ein oder zwei Kohlenstoffe gegen ein Heteroatom wie beispielsweise Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefel ausgetauscht sind.

Heteroaryle bilden eine Untergruppe der Heterocyclen. Beispiele von Heterocyclen, die unter den Schutzbereich dieser Erfindung fallen, schließen Pyrrolidin, Pyrazol, Pyrrol, Indol, Chinolin, Isochinolin, Tetrahydroisochinolin, Benzofuran, Benzodioxan, Benzodioxol (allgemein als Methylendioxyphenyl bezeichnet, wenn es als Substituent auftritt), Tetrazol, Morpholin, Thiazol, Pyridin, Pyridazin, Pyrimidin, Thiophen, Furan, Oxazol, Oxazolin, Isoxazol, Dioxan, Tetrahydrofuran und Ähnliches mit ein.

Acyle gemäß der vorliegenden Erfindung beziehen sich auf Gruppen aus 1 bis 20 Kohlenwasserstoffatomen der Form RCO, bevorzugt aus 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, wobei R jede der oben genannten Gruppen sein kann. Beispielhafte Acylgruppen der vorliegenden Erfindung sind Methanoyl-, Acetyl-, Ethanoyl-, Propanoyl-, Butanoyl-, Malonyl-, Benzoyl-, und Ähnliche.

Alle Alkyl, Alkenyl, Heteroalkyl, Heteroalkenyl, Alkoxy, Alkenoxy, Acyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Arylalkenyl, Aryloxy, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkenyl, Heterocycloalkyl, Heterocycloalkenyl, Carboxamido-, Acylamino-, Amidino-, Adamantyl- oder Heteroaryloxyreste gemäß der vorliegenden Erfindung können substituiert sein. Substituierte Alkyl, Alkenyl, Heteroalkyl, Heteroalkenyl, Alkoxy, Alkenoxy, Acyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Arylalkenyl, Aryloxy, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkenyl, Heterocycloalkyl, Heterocycloalkenyl, Carboxamido-, Acylamino-, Amidino-, Adamantyl- oder Heteroaryloxyreste beziehen sich auf Alkyl, Alkenyl, Heteroalkyl, Heteroalkenyl, Alkoxy, Alkenoxy, Acyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Arylalkenyl, Aryloxy, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkenyl, Heterocycloalkyl, Heterocycloalkenyl, Carboxamido-, Acylamino-, Amidino-, Adamantyl- oder Heteroaryloxyreste, wobei 1 bis 10 H Atome mit einem SH, SO, SO₂, SO₃, HSO₃, SR¹, SR^1''R^2'', Br, CX₃, CHX₂, CH₂X, CR^1''X₂, CR₂ ^1''X, CR₃ ^1''CN, CO, COOH, COOR^1'', NH, NH₂, NHR^1'', NR^1''R^2'', NO, NO₂, NOH, NOR^1'', CH₃, (CH₂)_n, (CH₂)_nCH₃; (CH₂)_nR^1'', OCH₃, O(CH₂)_n, O(CH₂)_nCH₃; O(CH₂)_nR^1'', (CH₂)_nOH, einem niederen Alkyl-, Carboxy-, Carboalkoxy-, Carboxamido-, Cyano-, Carbonyl-, Alkylthio, Sulfoxid, Sulfon, Acylamino-, Amidino-, Phenyl-, Benzyl-, Heteroaryl-, Phenoxy-, Benzyloxy-, Heteroaryloxy-, oder einem substituierten Phenyl-, Benzyl-, Heteroaryl-, Phenoxy-, Benzyloxy-, oder einem Heteroaryloxyrest substituiert sein können.

Ein Halogen X umfasst typischerweise die Halogene F, Cl, Br, und I. Alternativ können anstelle der genannten Halogene auch die Pseudohalogene CN oder CO eingesetzt werden.

Alle gemäß der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verbindungen können ein oder mehrere asymmetrische Zentren enthalten und daher Enantiomere, Diastereomere, und andere stereomere Formen ausbilden, die gemäß den Begriffen der absoluten Stereochemie mit (R)-oder (S)- bezeichnet werden. Die vorliegende Erfindung umfasst solche möglichen Isomere, sowie deren reine und racemische Formen. Optisch aktive (R)-oder (S)-Isomere können unter Verwendung von Synthosan oder chiralen Reagenzien hergestellt werden oder unter Verwendung von Standardverfahren aufgetrennt werden. Enthalten die hier beschriebenen Verbindungen olefinische Doppelbindungen oder andere Zentren geometrischer Asymmetrie, werden, soweit nicht anders beschrieben, sowohl geometrische E und Z Isomere mit umfasst. In analoger Weise werden erfindungsgemäß alle tautomeren Formen mit umfaßt.

Verbindungen der Formeln I, II, III und IV1 bis IV3 können aus Substanzbibliotheken isoliert werden. In den Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung wurden beispielsweise Kleinmoleküle aus einer Substanzbibliothek mit 20.000 Kleinmolekülen von Chemical Diversity Labs Inc., San Diego, USA gescreent. Alternativ können für die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Verbindungen Substanzen aus jeder anderen Substanzbibliothek verwendet werden, die Verbindungen der Formeln I, II, III und IV1 bis IV3 enthält, beispielsweise Substanzbibliotheken der Cambridge Small Compound Library, der Aldrich Library of Rare Chemicals oder Substanzbibliotheken von Reaction Biology Corp. (RBC), ActiMol, AnalytiCon Discovery, Biofocus, BIOMOL Research Laboratories, Chembridge, Comgenex, Microsource/MSDI, Polyphor, Prestwick Chemical, SPECS and Biospecs, TimTec, Tripos, usw..

MHC-Moleküle, die in einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, können aus verschiedenen natürlichen Quellen oder über rekombinante Verfahren gewonnen werden. Natürliche Quellen von MHC-Molekülen im Sinne der vorliegenden Erfindung sind beispielsweise Zellen oder Gewebe humanen oder tierischen Ursprungs, noch stärker bevorzugt körpereigene oder nicht-körpereigene dendritische Zellen wie beispielsweise maturierte und nichtmaturierte dendritische Zellen, sowie B-Zellen oder Makrophagen. Natürliche Quellen von MHC-Molekülen im Sinne der vorliegenden Erfindung umfassen ebenfalls bevorzugt Körperflüssigkeiten, enthaltend die zuvor definierten Zellen, beispielsweise Blut, Lymphe, oder Gewebe, etc..

MHC-Moleküle, die aus natürlichen Quellen gewonnen und in einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, können in isolierter Form oder zusammen mit den Zellen eingesetzt werden, mit denen sie assoziiert sind.

Einerseits können MHC-Moleküle aus natürlichen Quellen, d.h. aus Zellen, Körperflüssigkeit, Lymphe, etc. gewonnen und über biochemische Aufreinigungsverfahren, bspw. chromatographische Verfahren, Zentrifugationsverfahren, Dialyseverfahren, Antikörperbindungsverfahren, etc. isoliert werden. Dies erfolgt z.B. durch Abspaltung des extrazellulären Anteils der darin enthaltenen Zellen durch Waschschritte und/oder Abspaltung mit Proteasen von den z.B. in Körperflüssigkeiten oder Lymphe enthaltenen, mit MHC-Molekülen assoziierten Zellen. Anschließend werden bevorzugt die MHC-Moleküle aus der abgespaltenen extrazellulären Fraktion durch biochemische Aufreinigungsverfahren, z.B. über Antikörperbindungsverfahren, isoliert. Diese so gewonnenen isolierten MHC-Moleküle können anschließend in einem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden.

Alternativ können MHC-Moleküle aus natürlichen Quellen zusammen mit ihren assoziierten Zellen ohne weitere Isolierung der MHC-Moleküle in einem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden. Typischerweise werden dazu die Zellen als solche zusammen mit den MHC-Molekülen isoliert. Verfahren zur Gewinnung von Zellen sind einem Fachmann bekannt. Beispielsweise können zur Gewinnung von MHC-Molekülen im Sinne der vorliegenden Erfindung aus natürlichen Quellen einem Patienten bevorzugt dendritische Zellen, besonders bevorzugt maturierte und/oder nichtmaturierte dendritische Zellen, oder B-Zellen oder Makrophagen, oder andere MHC-Moleküle exprimierende Zellen, einzeln oder in Ansammlungen von mehreren Zellen entnommen und aufgereinigt werden. Aufreinigungsverfahren für Zellen sind einem Fachmann ebenfalls aus dem Stand der Technik bekannt. Beispielsweise werden für die Aufreinigung von Zellen die Bestandteile einer Zell- oder Gewebeprobe aus einer natürlichen Quelle einer Auftrennung anhand ihrer Dichte unterworfen. Eine Auftrennung anhand der Dichte kann mittels chromatographischen Verfahren, beispielsweise durch Ausschlusschromatographie oder FPLC, oder anhand einer Zentrifugation, bevorzugt einer Dichte-Gradienten-Zentrifugation beispielsweise über eine Ficoll-Trennlösung, erfolgen. Nach Auftrennung der Bestandteile anhand ihrer Dichte werden die Zellen typischerweise durch Adhärenz der gesuchten Zielzellen an eine Matrix oder eine Festphase, beispielsweise an Nylonwolle, angereichert und unerwünschte Zellen depletiert. Eine Festphase oder eine Matrix im Sinne des vorliegenden Verfahrens ist dabei jede Oberfläche, an die sich MHC-Moleküle direkt, über einen Linker, eine Markierung oder über ihre Affinität, binden lassen. Alternativ können die Zellen durch chromatographische Verfahren, beispielsweise durch chromatographische Ausschlussverfahren oder FPLC-Verfahren angereichert werden. Falls erforderlich, kann nach einer ersten Anreicherung die in der Zellsupension vorhandene Zellzahl bestimmt werden. Anschließend werden die Zellen typischerweise aus der erhaltenen Zellsuspension durch chromatographische Verfahren, durch Bindung an eine Festphase, durch magnetische Sortierung mittels eines MACS-Verfahren (Magnetic Activated Cell Sort), oder durch vergleichbare Verfahren aufgetrennt. Eine magnetische Sortierung von Zellen ermöglicht beispielsweise die quantitative Ausbeute hochreiner Zellpopulationen aus verschiedenen Geweben. Die Zellen werden bei der Auftrennung bevorzugt negativ sortiert, d. h. alle nicht gewünschten Zellen werden aus dem Zellgemisch depletiert. Alternativ können die gewünschten Zellen ebenfalls bevorzugt positiv direkt aus dem Zellgemisch sortiert werden. In beiden Fällen können die Zellen bevorzugt mit einem für den Zelltyp spezifischen monoklonalen Antikörper markiert werden, der an eine Festphase oder an Partikel, beispielsweise an superferromagnetische Partikel (microbeads), gebunden sein kann. Alternativ kann ein erster spezifischer monoklonaler Antikörper von einem zweiten Antikörper erkannt werden, der an eine Festphase, üblicherweise microbeads, gebunden ist und den Fc-Anteil des ersten Antikörpers erkennt. Nach einem chromatographischen Verfahren oder der Bindung an eine Festphase können die Zellen von der Säule oder der Festphase getrennt werden, typischerweise durch Elution. Nach einer magnetischen Sortierung mittels eines MACS-Verfahrens und der Bindung an Microbeads, können die Zellen typischerweise in einem magnetischen Feld über eine Säule aufgetrennt werden. Methodische Einzelheiten sind aus den Angaben des Herstellers der verwendeten Microbeads ersichtlich (z.B. Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Deutschland). Die Aufreinigung der Zellen findet typischerweise zu jedem Zeitpunkt unter Kühlung statt, bevorzugt unter Kühlung auf Eis. Falls erforderlich, werden die erhaltenen Zellsuspensionen zu jedem Zeitpunkt der Aufreinigung einmalig oder mehrmals mit geeigneten Pufferlösungen, beispielsweise PBS, gewaschen. Nach erfolgter Aufreinigung werden die erhaltenen Zellen entweder gelagert oder direkt eingesetzt. Die Zellen werden üblicherweise in einem Puffer gelagert, der die Zellen unter physiologischen Bedingungen hält und keinen osmotischen Druck verursacht. Geeignete Puffer sind beispielsweise PBS Puffer, RSA-PBS Puffer (PBS Puffer mit Rinder-Serum-Albumin (RSA)), FKS-PBS Puffer (PBS Puffer mit Fötalem Kälberserum (FKS)), Phosphat-Puffer, TRIS-HCl Puffer, Tris-Phosphat-Puffer, oder weitere geeignete Puffer, wie Dulbeccos's modified Eagle Medium (DMEM) oder RPIM mit 5-10%FKS., wobei die beiden zuletzt genannten insbesondere auch zur Lagerung von Zellen geeignet sind Gegebenenfalls können die Zellen in Nährmedium gelagert und/oder eingesetzt werden, beispielsweise FKS/10% DMSO.

MHC-Moleküle zur Verwendung in einem der erfindungsgemäßen Verfahren können auch durch rekombinante Verfahren zur Verfügung gestellt werden. Verfahren zur rekombinanten Herstellung von MHC-Molekülen sind einem Fachmann bekannt (siehe beispielsweise J. Sambrook; E. F. Fritsch; T. Maniatis, 2001, „Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbor, NY : Cold Spring Harbor Laboratory Press). Typischerweise werden dazu Vektoren, die MHC-Moleküle kodieren, in geignete Zellexpressionssysteme, eingebracht, die MHC-Moleküle exprimiert, anschließend geerntet, und die MHC-Moleküle mit Hilfe von biochemischen Aufreinigungsverfahren, beispielsweise chromatographischen Verfahren, Zentrifugationsverfahren, Dialyseverfahren, etc. aufgereinigt.

In einem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte MHC-Moleküle sind typischerweise MHC Monomere oder Multimere, bevorzugt MHC Monomere oder Multimere der Klassen I und II. MHC-Moleküle, die über ein rekombinantes Verfahren gewonnen werden, liegen typischerweise in einer monomeren Form vor. MHC-Moleküle, die aus einer natürlichen Quelle gewonnen werden, liegen üblicherweise ebenfalls monomer vor. Um solche monomeren MHC-Moleküle in eine multimere Form zu überführen, können aus natürlichen Quellen isolierte oder rekombinant hergestellte MHC-Moleküle biotinyliert und anschließend gebunden werden. Durch die Bindung der biotinylierten MHC-Moleküle an fluoreszenzmarkierte Streptavidin-Moleküle entstehen multimere MHC-Komplexe, bevorzugt tetramere Komplexe, da am Streptavidin 4 Bindungsstellen für Biotin existieren. Alternativ können aus natürlichen Quellen isolierte oder rekombinant hergestellte MHC-Moleküle durch eine sich selbst anordnende „coiled-coil"-Domäne multimerisiert werden, bevorzugt in MHC-Tetramere oder Pentamere der Klassen I und II: Dazu wird bevorzugt eine sich selbst anordnende „coiled-coil"-Domäne zusammen mit einem rekombinanten MHC-Molekül coexprimiert. Alternativ zu den hier beschriebenen Multimerisierungsverfahren kann jedes weitere bekannte Verfahren zur Multimerisierung von MHC-Molekülen eingesetzt werden. Einem Fachmann im Stand der Technik sind solche Verfahren bekannt. Eine weitere Möglichkeit der Multimerisierung besteht in der kovalenten oder nicht-kovalenten Bindung der Moleküle an Oberflächen, wie z.B. Kulturplatten oder sogenannte Mikrobeads. Beides wird bereits zur Stimulierung von T Zellen eingesetzt, wobei die Mikrobeads für den Fall, dass sie einen Eisenkern enthalten (z.B. Dynabeads, Dynal Biotech GMBH), auch für die selektive Aufreinigung der Zellen mittels Magneten eingesetzt werden können. Für letztere Zwecke können auch an sogenannte nanobeads gekoppelte monomere MHC-Moleküle eingesetzt werden (z.B. Miltenyi Biotec). Multimere MHC-Moleküle können ebenfalls kommerziell erworben werden. Beispielsweise können Tetramere von der Firma Becton Dickinson, Beckman Coulter und Pentamere von der Firma Proimmune bezogen werden. Nach einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung mit Liganden beladene MHC Multimere sind bevorzugt in der Lage, selektiv an T-Zellen zu binden, deren T-Zellrezeptor spezifisch den auf den Komplex geladenen Liganden erkennt.

MHC-Moleküle, die in einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, können markiert sein. Die MHC-Moleküle, deren Beladungszustand gemäß einem Verfahren der vorliegenden Erfindung verändert wird, bevorzugt MHC Multimere, werden dazu bevorzugt vor der Änderung ihres Beladungszustandes markiert. Bevorzugt enthalten die MHC-Moleküle Markierungen, die die Erzeugung eines direkt oder indirekt nachweisbaren Signals erlauben. Dem Fachmann sind dabei folgende Modifikationen bekannt:

(i) radioaktive Modifikationen, z.B. radioaktive Phosphorylierung oder radioaktive Markierung mit Schwefel, Wasserstoff, Kohlenstoff, Stickstoff,
(ii) farbige Gruppen (z.B. Digoxygenin, etc.),
(iii) fluoreszierende Gruppen (z.B. Fluorescein, etc.),
(iv) chemolumineszierende Gruppen,
(v) Gruppen zur Immobilisierung an einer festen Phase (z.B. Biotin, Streptag, Antikörper, Antigene, etc.),

oder Kombinationen von Modifikationen gemäß zwei oder mehr der unter (i) bis (v) genannten Modifikationen.

MHC-Moleküle, die in einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, treten typischerweise in einer geschlossenen, unbeladenen, nicht-rezeptiven oder in einer offenen rezeptiven Konformation auf. In der geschlossenen nicht-rezeptiven Konformation ist das MHC-Molekül bevorzugt nicht in der Lage, Liganden aufzunehmen oder abzugeben. Ein Übergang zwischen diesen verschiedenen Konformationen eines MHC-Moleküls findet typischerweise durch eine entsprechende Verschiebung des Gleichgewichts der Reaktion statt, d.h. eine Gleichgewichtsverschiebung zwischen der geschlossenen, unbeladenen, nichtrezeptiven Konformation; der offenen, unbeladenen, rezeptive Konformation; und der offenen, beladenen, rezeptiven Konformation. In den erfindungsgemäßen Verfahren werden die MHC-Moleküle durch die verwendeten Verbindungen der Formeln I, II, III und IV1 bis IV3 bevorzugt von einer geschlossenen, unbeladenen, nicht-rezeptiven Konformation in eine offene, unbeladene, rezeptive Konformation überführt. Alternativ werden die MHC-Moleküle direkt von einer geschlossenen, unbeladenen, nicht-rezeptiven Konformation in eine offene, beladene, rezeptive Konformation überführt. Geht das MHC-Molekül infolge der katalysatorischen Wirkung der Verbindungen der Formeln I, II, III und IV1 bis IV3 in einen offenen rezeptiven Zustand über oder liegt es in einem offenen rezeptiven Zustand vor, können die MHC-Moleküle mit Liganden beladen werden oder es kann am MHC-Molekül ein Austausch von Liganden stattfinden. Anders formuliert ist das MHC-Molekül in der offenen, unbeladenen, rezeptiven Konformation bevorzugt in der Lage, einen Liganden aufzunehmen. Alternativ kann der Ligand eines MHC-Molekül in der offenen, beladenen, rezeptiven Konformation ausgetauscht werden. In einer weiteren Alternative kann auch direkt eine Beladung des MHC-Moleküls mit Liganden aus der geschlossenen, unbeladenen, nicht-rezeptiven Konformation unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen der Formeln I, II, III und IV1 bis IV3 durchgeführt werden.

Monomere oder multimere MHC-Moleküle, die in einem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden, können unbeladen oder bereits mit Liganden beladen sein. Im Falle der Herstellung durch rekombinante Verfahren sind die MHC-Moleküle nach ihrer Aufreinigung typischerweise unbeladen. Es können jedoch ebenfalls aus natürlichen Quellen isolierte MHC-Moleküle oder die zusammen mit ihren assoziierten Zellen isolierten MHC-Moleküle, nach ihrer Aufreinigung unbeladen sein. Solche unbeladenen MHC-Moleküle können nach einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung mit gewünschten Liganden beladen werden. Eine Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen mit Liganden bedeutet in diesem Fall daher bevorzugt die Beladung von (vorher unbeladenen) MHC-Molekülen mit Liganden. Alternativ können MHC-Moleküle sowohl nach ihrer rekombinanten Herstellung als auch nach ihrer Isolierung aus natürlichen Quellen bereits mit Liganden beladen sein. Die Anzahl der Liganden auf der Oberfläche solcher beladenen MHC-Moleküle, kann in einem erfindungsgemäßen Verfahren verringert oder die Liganden ganz entfernt werden. Eine Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen mit Liganden bedeutet in diesem Fall daher bevorzugt die Verringerung des Beladungszustandes von (vorher beladenen) MHC-Molekülen mit Liganden, gegebenfalls die vollständige Entfernung der Liganden von (vorher beladenen) MHC-Molekülen. In einer weiteren Alternative können mit Hilfe der erfindungsgemäßen Verfahren Liganden von (vorher beladenen) MHC-Molekülen gegen andere gewünschte Liganden ausgetauscht werden. Eine Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen mit Liganden bedeutet in diesem Fall daher bevorzugt den Austausch von Liganden von (vorher beladenen) MHC-Molekülen gegen gewünschte Liganden. Typischerweise findet zu diesem Zweck vorgeschaltet eine Entfernung oder Verringerung von bereits vorhanden Liganden auf dem MHC-Molekül gemäß einem erfindungsgemäßen Verfahren statt, und anschließend die erneute Beladung von MHC-Molekülen mit gewünschten Liganden gemäß einem erfindungsgemäßen Verfahren.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Liganden von MHC-Molekülen native und nicht-native Verbindungen, die an MHC-Moleküle unter physiologischen Bedingungen binden. Besonders bevorzugt sind in diesem Zusammenhang Liganden von MHC-Molekülen Antigene, insbesondere tumor- oder pathogenspezifische Antigene, Peptidantigene, gewebsspezifische Selbstantigene, oder Fragmente solcher Antigene, bevorzugt mit einer Länge von 8-25 Aminosäuren, stärker bevorzugt mit einer Länge von 8-15 Aminosäuren, besonders bevorzugt mit einer Länge von 8-11 Aminosäuren. Ebenfalls bevorzugt sind Liganden von MHC-Molekülen größerer Peptidfragmente, Proteindomänen, vollständige Proteine, Proteingemische, komplexe Proteingemische und/oder Zelllysate, bevorzugt Tumorzelllysate.

In einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Gegenstandes kann die in einem erfindungsgemäßen Verfahren bereitgestellte Zusammensetzung in Schritt (a) eine wäßrige Zusammensetzung sein. Bevorzugt enthält die Zusammensetzung zusätzlich zu den MHC-Molekülen einen Puffer. Beispielsweise können folgende Puffer eingesetzt werden: PBS Puffer (beispielsweise pH 5,0-8,5, bevorzugt pH 7,0-8,0, 50-200 mM NaCl, bevorzugt etwa 137,0 mM NaCl, 0,5-5 mM KCl, bevorzugt 2,7 mM KCl, bevorzugt 1-10 mM Na₂HPO₄, bevorzugt 4,3 mM Na₂HPO₄, 0,1-5 mM KHPO₄, bevorzugt 1,4 mM KHPO₄), RSA-PBS Puffer (beispielsweise pH 5,0-8,5, 1-15 Gew.-% Rinder-Serum-Albumin (RSA), bevorzugt pH 5,0-8,0, 50-200 mM NaCl, bevorzugt etwa 137,0 mM NaCl, 0,5-5 mM KCl, bevorzugt 2,7 mM KCl, bevorzugt 1-10 mM Na₂HPO₄, bevorzugt 4,3 mM Na₂HPO₄, 0,1-5 mM KHPO₄, bevorzugt 1,4 mM KHPO₄), FKS-PBS Puffer (beispielsweise pH 5,0-8,5, 1-15 Gew.-% Fötales Kälberserum (RSA), bevorzugt pH 5,0-8,0, 50-200 mM NaCl, bevorzugt etwa 137,0 mM NaCl, 0,5-5 mM KCl, bevorzugt 2,7 mM KCl, bevorzugt 1-10 mM Na₂HPO₄, bevorzugt 4,3 mM Na₂HPO₄, 0,1-5 mM KHPO₄, bevorzugt 1,4 mM KHPO₄), Phosphat-Puffer (beispielsweise pH 5,0-8,5, bevorzugt pH 7,0, 20-80 mM Na₂HPO₄, bevorzugt 57,7 mM Na₂HPO₄, 10-60 mM NaH₂PO₄, bevorzugt 42,3 mM NaH₂PO₄), TRIS-HCl Puffer (beispielsweise 0,5-3,0 M TRIS mit HCl(konz.), bevorzugt 1-1,5 M TRIS mit HCl(konz.) auf pH 6,8-8,0 eingestellt), Tris-Phosphat-Puffer (beispielsweise 20-80 mM Na₂HPO₄, 10-60 mM NaH₂PO₄, 0,5-3,0 M TRIS mit HCl(konz.) auf pH 6,0-8,5 eingestellt), oder weiteren geeigneten Puffer. Die genannten Konzentrationen sind bevorzugt die Konzentrationen in den Pufferlösungen vor deren Zugabe zur Zusammensetzung. Zur Zusammensetzung werden typischerweise 0 bis 15,0 Vol.-% zugegeben. Die im erfindungsgemäßen Verfahren bereitgestellte Zusammensetzung kann ebenfalls organische Lösungsmittel enthalten. Organische Lösungsmittel werden bevorzugt aus folgender Gruppe ausgewählt: DMSO, Ethanol, Methanol, Aceton und ähnliche, besonders bevorzugt 0,1-1% DMSO. Der pH der Zusammensetzung beträgt typischerweise 6,0-8,5, bevorzugt 6,5-7,5. Optional kann die Zusammensetzung zusätzlich zu der wäßrigen Lösung oder dem organischen Lösungsmittel ein polares Lösungsmittel enthalten, beispielsweise Dimethylsulfoxid (DMSO), Dimethylformamid (DMF), TFE (Tetrafluorethylen), Hexamethylphosphorsäuretrisamid (HMPT), Hexamethylphosphoramid (HMPA), oder ähnliche. Die Endkonzentration des polaren Lösungsmittels in der Zusammensetzung kann bevorzugt 0,05-15 Gew.-%, stärker bevorzugt 0,1-5 Gew.-%, und noch stärker bevorzugt 0,5-2 Gew.-% betragen. Ebenfalls bevorzugt wird die Beladung in DMEM oder RPMI-Puffern durchgeführt.

Typischerweise wird in Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens zur bereitgestellten Zusammensetzung aus Schritt (a) ein Katalysator zugegeben, ausgewählt aus einer der Verbindungen I, II, III oder IV1 bis IV3 in einer Konzentration von 0,001-500 mM, bevorzugt in einer Konzentration von 0,001-250 mM, noch stärker bevorzugt in einer Konzentration von 0,001-100 mM. Typischerweise beträgt das molare Verhältnis MHC-Molekül zu Ligand 0,1 : 10 bis 10 : 0,1. Bevorzugt beträgt das molare Verhältnis von Ligand zu MHC-Molekül 0,5 5 bis 5 : 0,5, besonders bevorzugt 0,75 : 2,5 bis 2,5 : 0,75. In einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird Beladung der MHC-Moleküle mit Liganden oder der Ligandenaustausch der MHC-Moleküle bevorzugt bei einer Temperatur von 20-40°C, noch stärker bevorzugt bei einer Temperatur von 24-39°C und am stärksten bevorzugt bei einer Temperatur von 36-38°C.

Bei der Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen mit Liganden in Schritt (c) nach einem erfindungsgemäßen Verfahren wird bevorzugt die Menge der durch das erfindungsgemäße Verfahren auf ein MHC-Molekül geladenen oder ausgetauschten Liganden gesteuert. Beispielsweise kann durch das erfindungsgemäße Verfahren, bevorzugt in vitro, ein Beladungszustand erzielt werden, der zu einer gleichen Beladung, zu einer Erhöhung oder alternativ zu einer Erniedrigung der Beladung von MHC-Molekülen mit Liganden im Vergleich zu der Beladung von MHC-Molekülen unter in vivo Bedingungen führt, bzw. im Vergleich zu der Beladung der vor Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens in der Zusammensetzung enthaltenen MHC-Moleküle. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen mit Liganden zu einer Neubeladung vorher nicht beladener MHC-Moleküle, zu einer teilweisen oder vollständigen Entfernung bereits vorhandener Liganden, oder zum Austausch bereits vorhandener Liganden gegen andere, gewünschte Liganden führen. Verfahren zur Bestimmung von Beladungszuständen unter in vivo und in vitro Bedingungen sind einem Fachmann bekannt.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in Schritt (c) eine Änderung des Beladungszustandes von (nicht-beladenen) MHC-Molekülen mit Liganden durch Zugabe von potentiellen Liganden, insbesondere Papteiden, z.B. Peptidliganden, zu der Zusammensetzung, enthaltend MHC-Moleküle gemäß Verfahrensschritt (a), und Verbindungen der Formeln I, II, III und IV1 bis IV3 (Katalysator) gemäß Verfahrensschritt (b), erreicht. Die Konzentrationen von MHC-Molekülen, Liganden und Katalysatoren sind dabei bevorzugt wie oben beschrieben. Die Verfahrensschritte (a), (b) und (c) des hier beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens zur Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen mit Liganden können in beliebiger Reihenfolge oder parallel erfolgen. Beispielsweise können die Schritte (b) und (c) parallel stattfinden. Auch können anstelle der Bereitstellung der Zusammensetzung, enthaftend MHC-Moleküle, zunächst die Verbindungen der Formeln I, II, III oder IV1 bis IV3, vorzugsweise in Lösung, in einem Verfahrensschritt vorgelegt werden und dann die jeweils anderen Verfahrensschritte durchgeführt werden, wie bspw. Zugabe von Liganden und/oder MHC-Molekülen. Ebenfalls können alle Schritte (a), (b) und (c) gleichzeitig durchgeführt werden.

In einer anderen alternativen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in einem Schritt (c') eine Änderung des Beladungszustandes von bereits mit Liganden beladenen MHC-Molekülen durch einen teilweisen oder vollständigen Austausch bereits auf dem MHC-Molekül vorhandener Liganden gegen andere gewünschte Liganden erreicht. Dazu wird bevorzugt in einem ersten Schritt (i) eine Verringerung der Beladungsdichte von Liganden der MHC-Moleküle bis zu einem gewünschten Beladungszustand hin (bevorzugt analog zu dem weiter unten genauer beschriebenen alternativen Verfahrensschritt (c'')) erreicht. Typischerweise werden dafür die bereits auf dem MHC-Molekül gebundenen Liganden unter Verwendung der Verbindungen der Formeln I, II, III oder IV1 bis IV3 (Katalysatoren) teilweise oder gegebenenfalls vollständig durch einen Waschschritt entfernt. Die MHC-Moleküle können dabei an einer Festphase, z.B. Sepharose, Beads, Microbeads, etc. oder über im Stand der Technik erhältliche Linker, z.B. tags wie einen His-Tag, immobilisiert werden. In den Waschschritten kann jeder geeignete, zuvor beschriebene Puffer verwendet werden. Danach wird in einem zweiten Schritt (ii) typischerweise der gewünschte Ligand und gegebenenfalls eine weitere Menge der Verbindungen der Formeln I, II, III oder IV1 bis IV3 (Katalysatoren) zu der Zusammensetzung zugegeben und zusammen mit dem MHC-Molekül inkubiert. Alternativ kann parallel zu Schritt 1 des Verfahrensschrittes (c') bereits der gewünschte neue Ligand zur Zusammensetzung hinzugegeben werden. Dabei bindet der neue Ligand, bevorzugt durch eine Verschiebung des Konzentrationsgleichgewichtes, an das MHC-Molekül, d.h. der neue Ligand liegt bevorzugt in einer solche Konzentration vor, dass eine Verdrängung des vorher gebundenen Liganden durch den neuen Liganden unter Verwendung der Verbindungen der Formeln I, II, III oder IV1 bis IV3 (Katalysatoren) stattfindet. Die Verfahrensschritte (a) und (b) und der hier beschriebene alternative Schritt (c') des erfindungsgemäßen Verfahrens können daher in beliebiger Reihenfolge oder parallel erfolgen. Beispielsweise können die Schritte (a), (b) und (c') parallel stattfinden. Auch kann anstelle der Bereitstellung der Zusammensetzung, enthaltend MHC-Moleküle, zunächst der Katalysator, vorzugsweise in Lösung, in einem Verfahrensschritt (a) vorgelegt werden und dann Schritt (b) durchgeführt werden. Schritt (c') wird typischerweise nach den Schritten (a) und (b) durchgeführt, kann jedoch auch alternativ parallel mit den Schritten (a) und (b) durchgeführt werden.

In einer alternativen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens führt in einem anderen alternativen Schritt (c'') eine Änderung des Beladungszustandes von bereits mit Liganden beladenen MHC-Molekülen zu einer Verringerung der Beladungsdichte von Liganden der MHC-Moleküle. Dazu werden typischerweise die bereits auf dem MHC-Molekül gebundenen Liganden unter Verwendung der Verbindungen der Formeln I, II, III oder IV1 bis IV3 (Katalysatoren) teilweise oder gegebenenfalls vollständig entfernt. Bevorzugt wird dazu nach Bereitstellung der Zusammensetzung, enthaltend MHC-Moleküle gemäß Verfahrensschritt (a), und Zugabe der erfindungsgemäßen Katalysatoren gemäß Verfahrensschritt (b), ein Waschschritt durchgeführt, der die mit Hilfe der Verbindungen der Formeln I, II, III oder IV1 bis IV3 vom MHC-Molekül gelösten Liganden von den MHC-Molekülen abtrennt. Die MHC-Moleküle können dazu an einer Festphase, z.B. Sepharose, Beads, Microbeads, z.B. über im Stand der Technik erhältliche Linker, z.B. tags wie einen His-Tag, etc., immobilisiert werden. In den Waschschritten kann jeder geeignete, zuvor beschriebene Puffer verwendet werden. Die Verfahrensschritte (a), (b) und (c'') der hier beschriebenen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens können in beliebiger Reihenfolge oder parallel erfolgen. Beispielsweise können die Schritte (b) und (c'') parallel stattfinden. Auch kann anstelle der Bereitstellung der Zusammensetzung, enthaltend MHC-Moleküle, zunächst der Katalysator, vorzugsweise in Lösung, in einem Verfahrensschritt vorgelegt werden und dann die jeweils anderen Schritte (b) und (c'') durchgeführt werden, wie bspw.

Zugabe von Liganden und/oder MHC-Molekülen. Ebenfalls können alle Schritte (a), (b) und (c'') gleichzeitig durchgeführt werden.

In einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen mit Liganden in einem der Schritte (c), (c') oder (c'') typischerweise auf einem MHC-Molekül der Klassen I oder II, an einer Peptidbindungsregion des MHC-Moleküls vorgenommen. Bei der Peptidbindungsregion handelt es sich vorzugsweise um eine Peptidbindungsregion eines MHC Klasse I- oder MHC-Klasse II-Moleküls. Typischerweise wird die Peptidbindungsregion eines MHC I-Moleküls durch die α-Kette des MHC Klasse I-Moleküls gebildet und besteht aus einem aus acht Strängen gebildeten β-Faltblatt, auf dem die Peptide zwischen zwei α-Helices eingeklemmt und an den beiden Enden durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den N- bzw. C-Termini und dem MHC Klasse I-Molekül fixiert werden. Die Peptidbindungsregion des MHC Klasse I-Moleküls enthält üblicherweise mehrere Bindungstaschen. Die Spezifität eines Liganden an die Peptidbindungsregion eines MHC Klasse I-Moleküls wird typischerweise durch eine Bindung der Aminosäureseitenketten mit jeweils einer dieser Bindungstaschen hergestellt. Im Fall des MHC I-Moleküls wird die Bindungstasche bevorzugt ausgewählt aus den Bindungstaschen A, B, C, D, E und F, die vorzugsweise die Seitenketten der Liganden aufnehmen. Die Peptidbindungsregion eines MHC II-Moleküls wird typischerweise durch die α, und β₁-Domänen der die MHC II-Moleküle bildenden α- und β-Kette gebildet. Die Peptidbindungsregion des MHC II-Moleküls enthält ebenfalls üblicherweise eine bis mehrere Bindungstaschen. Im Fall des MHC II-Moleküls wird die Bindungstasche bevorzugt ausgewählt aus den Bindungstaschen P1, P3, P4, P6, P7 und P9, die vorzugsweise die Seitenketten der Liganden aufnehmen. Ebenfalls bevorzugt wird die Spezifität des Liganden an die Peptidbindungsregion, oder vorzugsweise an eine Peptidbindungstasche durch eine Bindung der Aminosäureseitenketten mit der beschriebenen Bindungstasche hergestellt. Üblicherweise wird die Bindung des Liganden insbesondere durch eine Bindung an die Bindungstasche P1 eines MHC-Moleküls der Klasse II hergestellt, welche sich bei HLA-DR Molekülen jeweils nur durch die Besetzung des dimorphen Restes β86 unterscheidet. Die Bindung der Liganden bzw. die Stabilität der Komplexe kann darüber hinaus auch durch weitere Regionen beeinflusst werden, welche außerhalb der eigentlichen Peptidbindungsregion liegen. So ist beispielsweise die pH-abhängige Destabilisierung maßgeblich von einer Region beeinflusst, welche unterhalb der Bindungsgrube liegt. An dieser Stelle ist ein Histidinrest lokalisiert (His33), welcher die α₁-Domäne mit der β₁-Domäne verbrückt und direkt durch Protonen und möglicherweise auch anderen H-Donoren beeinflusst wird (Rötzschke et al. PNAS, 2002, 99: 16946-16950)

In einem Schritt d) des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Isolierung der mit Liganden beladenen MHC-Moleküle beispielsweise über ein biochemisches oder biophysikalische Isolierungsverfahren oder über ein Verfahren zur Isolierung von Zellen, wie zuvor beschrieben.

Biophysikalische und biochemische Nachweisverfahren oder Isolierungsverfahren im Sinne der vorliegenden Erfindung sind bevorzugt spektroskopische Verfahren, Sequenzierungsreaktionen, immunologische Verfahren, oder chromatographische Verfahren. Im Sinne der vorliegenden Erfindung werden spektroskopische Verfahren bevorzugt ausgewählt aus einem NMR-, Lichtstreuungs-, Raman-, UV-, VIS-, IR-, Circulardichroismus-Verfahren, einer massenspektrometrischen Analyse (MS) oder einer Röntgenstrukturanalyse. Unter einer Sequenzierungereaktion werden bevorzugt Peptid- oder Nukleinsäuresequenzierungen verstanden. Immunologische Verfahren werden bevorzugt ausgewählt aus ELISA-Verfahren, Antikörperbindungsassays, Immunfluoreszenzdetektionsverfahren oder Western Blots. Chromatographische Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung sind bevorzugt eine Adsorptionschromatographie, eine Verteilungschromatographie, eine Ionenaustausch-chromatographie, eine Ausschlußchromatographie oder eine Affinitätschromatographie. Bevorzugt wird im weiteren eine Chromatographie mittels Ni-NTA-Agarose, eine HPLC, eine FPLC, oder eine Reversed-Phase (RP-Umkehrphasen)-Chromatographie durchgeführt.

Einen weiteren Gegenstand gemäß der vorliegenden Erfindung betrifft die erfindungsgemäße Verwendung der Verbindungen der Formeln I, II, III oder IV1 bis IV3 alleine oder optional zusammen mit einem oder mehreren Liganden, z.B. Peptiden, zur Herstellung von Vakzinen. In einer alternativen Ausführungsform können Verbindungen der Formeln I, II, III oder IV1 bis IV3 zusammen mit Liganden, z.B. Peptiden als Peptidvakzin zur Herstellung von Vakzinen, insbesondere Peptidvakzinen, verwendet werden. In einer anderen alternativen Ausführungsform können MHC-Moleküle, deren Beladungszustand verändert wurde, zur Herstellung von Vakzinen verwendet werden.

Vakzine bilden ebenfalls einen Gegenstand der vorliegenden Erfindung. In einer Ausführungsform umfassen die Vakzine der vorliegenden Erfindung typischerweise Verbindungen der Formeln I, II, III oder IV1 bis IV3 (Katalysatoren) alleine oder optional zusammen mit einem oder mehreren Liganden, z.B. Peptiden, vor allem antigene Peptide, insbesondere Peptide von Tumorenantigenen. Solche Vakzine sind insbesondere bei den unten genannten Indikationen anwendbar, vor allem bei bei Antikrebstherapien, und können einem Patienten in vitro oder in vivo verabreicht werden. Z.B. kann ein solches erfindungsgemäßes Vakzin direkt einem Patienten intravenös oder subkutan verabreicht werden. Die Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen mit Liganden findet bevorzugt in vivo statt, d.h. die Beladung mit Liganden, der Austausch von Liganden oder die Verringerung von Liganden auf MHC-Molekülen findet, durch Verabreichung des Vakzins, typischerweise im Patienten statt. Solche erfindungsgemäßen Vakzine können ebenfalls mittels eines Dialyseverfahrens verabreicht werden. Die Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen findet dabei ebenfalls bevorzugt in vivo statt. Alternativ zur in vivo Beladung können dem Patienten Zellen, Körperflüssigkeiten, etc., z.B. aus der Lymphe, entnommen werden und in vitro mit einem erfindungsgemäßen Vakzin versetzt werden. Die Änderung des Beladungszustandes der mit diesen Zellen, Körperflüssigkeiten, etc. assozierten MHC-Moleküle findet dabei ebenfalls bevorzugt in vitro statt. Nach Änderung des Beladungszustandes der MHC-Moleküle in vitro können die Zellen, z.B. mittels eines Dialyse-Verfahrens oder durch intravenöse oder subkutane Injektion, in den Patienten rückgeführt werden.

In einer alternativen Ausführungsform können Vakzine mit Liganden beladene oder unbeladene MHC-Moleküle, deren Beladungszustand vorzugsweise nach einem erfindungsgemäßen Verfahren verändert wurde, optional zusammen mit einem oder mehreren Liganden und/oder mit einer der Verbindungen der Formeln I, II, III oder IV1 bis IV3 enthalten. In einer besonderen Ausführungsform dieser Alternative können Vakzine Verbindungen der Formeln I, II, III oder IV1 bis IV3 enthalten, sowie zusätzlich mit Liganden beladene oder unbeladene MHC-Moleküle, deren Beladungszustand vorzugsweise nach einem erfindungsgemäßen Verfahren verändert wurde. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform dieser Alternative können Vakzine Verbindungen der Formeln I, II, III oder IV1 bis IV3, Liganden und zusätzlich mit Liganden beladene oder unbeladene MHC-Moleküle enthalten, deren Beladungszustand nach einem erfindungsgemäßen Verfahren verändert wurde. Vorzugsweise werden für die erfindungsgemäßen Vakzine solche MHC-Moleküle eingesetzt, deren Beladungszustand nach einem erfindungsgemäßen Verfahren verändert wurde. Dies sind z.B. solche MHC-Moleküle, die nach einem erfindungsgemäßen Verfahren nit Peptiden beladen wurden, vor allem mit antigenen Peptiden, insbesondere Peptiden eines Tumorenantigens, oder Peptiden die unter physiologischen Bedingungen eine Immunantwort auslösen. Die Anwesenheit von Liganden und/oder Katalysatoren zusammen mit den im Vakzin bereits enthaltenen MHC-Molekülen ermöglicht dabei eine Kontrolle der Beladungsdichte der MHC-Moleküle im Vakzin durch eine entsprechende Einstellung des Gleichgewichts in der Lösung. Dies ist insbesondere von Interesse, wenn Vakzine nicht unmittelbar nach Herstellung eingesetzt sondern zunächst gelagert werden. Weiterhin kann durch ein solches Vakzin in vivo und/oder in vitro gegebenfalls eine verstärkte Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen mit bestimmten (z.B. gewünschten) Liganden erreicht werden.

Vakzine werden typischerweise in flüssiger oder fester Form formuliert. Bei flüssigen Vakzinen liegt die Konzentrationen der enthaltenen Katalysatoren typischerweise in einem wie oben beschrieben Bereich., d.h. in einer Konzentration von 0,001-500 mM, bevorzugt in einer Konzentration von 0,001-250 mM, noch stärker bevorzugt in einer Konzentration von 0,001-100 mM. Die in den erfindungsgemäßen Vakzinen verwendeten Liganden sind typischerweise die zuvor in dieser Beschreibung definierten Liganden. Das in den Vakzinen enthaltenen MHC-Molekül wird typischerweise unbeladen eingesetzt oder vor dem Einsatz mit einem wie oben definierten Liganden beladen, noch stärker bevorzugt mit Peptidantigenen oder mit Fragmenten solcher Antigene, bevorzugt mit einer Länge von 8-25 Aminosäuren, stärker bevorzugt mit einer Länge von 8-15 Aminosäuren, besonders bevorzugt mit einer Länge von 8-11 Aminosäuren. Ebenfalls bevorzugt im Sinne des erfindungsgemäßen Gegenstandes kann das zur Herstellung eines Vakzins verwendete MHC-Molekül ein wie oben beschriebenes MHC Monomer oder ein MHC Multimer sein. Besonders bevorzugt ist das MHC Monomer oder MHC Multimer ein wie oben beschriebenes MHC Monomer oder MHC Multimer, bzw. ein MHC-Tetramer oder Pentamer, aus den MHC-Klassen I oder II.

Zusätzlich zu den oben beschriebenen Komponenten eines Vakzins, z.B. durch die erfindungsgemäßen Verfahren mit Liganden beladenen MHC-Moleküle, oder erfindungsgemäße Verbindungen der Formeln I, II, III oder IV1 bis IV3 zusammen mit einem oder mehreren Liganden wie in der vorliegenden Erfindung definiert, können die Vakzine gemäß der vorliegenden Erfindung einen pharmazeutisch geeigneten Träger enthalten. Die Wahl eines pharmazeutisch geeigneten Trägers wird grundsätzlich durch die Art bestimmt, durch die die erfindungsgemäßen Vakzine verabreicht werden. Die nach einem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Vakzine können systemisch verabreicht werden. Routen zur Verabreichung schließen transdermale, orale, parenterale, einschließlich subkutane oder intravenöse Injektionen, topische und/oder intranasale Routen mit ein.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der nach einem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Vakzine für therapeutische Zwecke. Dazu können in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zuvor einem Patienten, wie bereits oben beschrieben, Zellen oder Gewebe, bevorzugt dendritische Zellen, besonders bevorzugt maturierte und nicht-maturierte dendritische Zellen, einzeln oder in Ansammlungen von mehreren Zellen entnommen und isoliert werden. Die dabei verwendeten Isolierungsverfahren wurden zuvor beschrieben. Die MHC-Moleküle, die nach einem solchen Verfahren zusammen mit den körpereigenen Zellen eines Patienten gewonnen werden, können anschließend bevorzugt nach einem erfindungsgemäßen Verfahren mit Liganden beladen werden oder die bereits vorhandenen Liganden des MHC-Moleküls können gegen gewünschte Liganden ausgetauscht oder die Anzahl der vorhandenen Liganden verringert werden. Bevorzugt sind solche gewünschten Liganden Antigene, noch stärker bevorzugt Peptidantigene, Proteinantigene oder Tumorantigene, insbesondere aus Tumorzellysaten. In einem weiteren Schritt werden bevorzugt die so beladenen MHC-Moleküle zusammen mit den dendritischen Zellen dem Patienten in einem anschließenden Vakzinierungsverfahren wieder zugeführt z.B. via Reinjektion oder Dialyse. Die so nach einem erfindungsgemäßen Verfahren beladenen dendritischen Zellen oder MHC-Moleküle lösen dann bevorzugt im Patienten tumor-spezifische Immunantworten aus, welche zur Abstoßung und Zerstörung des transformierten Gewebes führen. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses erfindungsgemäßen Gegenstandes können die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formeln I, II, III oder IV1, bis IV3 zusammen mit einem oder mehreren Liganden oder die MHC-Moleküle, deren Beladungszustand nach einem erfindungsgemäßen Verfahren verändert wurde, einem Patienten, bevorzugt in Form eines Vakzins verabreicht werden.

Gemäß einem weiteren bevorzugten Gegenstand der vorliegenden Erfindung werden die erfindungsgemäßen Vakzine zur Behandlung von im folgenden genannten beispielhaften Indikationen eingesetzt. Mit Vakzinen gemäß der vorliegenden Erfindung können beispielsweise solche Erkrankungen oder Zustände behandelt werden, die mit diversen pathologisch überschießenden oder unterbleibenden Immunantworten verknüpft sind. Bevorzugt werden solche erfindungsgemäßen Vakzine eingesetzt, um tumorspezifische oder pathogenspezifische Immunantworten auszulösen. Gemäß einer anderen Ausführungsform dieses erfindungsgemäßen Gegenstandes können solche Vakzine gemäß der vorliegenden Erfindung, die beispielsweise erfindungsgemäßen Verbindungen der Formeln I, II, III und IV1 bis IV3 optional zusammen mit einem oder mehreren Liganden enthalten, oder wahlweise die nach einem erfindungsgemäßen Verfahren mit Liganden beladenen MHC-Moleküle, bevorzugt mit Liganden beladene MHC-Multimere, besonders bevorzugt mit Liganden beladene MHC-Multimere der Klasse II, bei denen der Beladungszustand erniedrigt wurde oder bei denen die Liganden entfernt oder ausgetauscht wurden, zur Abschwächung von aggressiven Immunreaktionen eingesetzt werden. In einer ebenfalls bevorzugten Ausführungsform werden zur Auslösung, zur Abschwächung oder zur Unterdrückung von Immunantworten antigenpräsentierende Zellen (APC) mit Liganden beladen. In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform werden die antigenpräsentierenden Zellen ausgewählt aus körpereigenen oder nicht-körpereigenen maturierten und nichtmaturierten dendritischen Zellen, ODO + DC-Zellen, B-Zellen oder Makrophagen. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die nach einem erfindungsgemäßen Verfahren mit Liganden beladenen MHC-Moleküle zur Behandlung von Krebs, bevorzugt ausgewählt aus Kolonkarzinomen, Melanomen, Nierenkarzinomen, Lymphomen Akute myeloide Leukämie (AML), Akute Lymphoide Leukämie (ALL), chronische myeloide Leukämie (CML), chronische lymphozytische Leukämie (CLL), Gastrointestinale Tumoren, Lungenkarzinome, Gliome, Schilddrüsentumoren, Mammakarzinome, Prostatatumore, Hepatome, diverse virusinduzierte Tumoren wie z.B. Papillomvirus-induzierte Karzinome (z.B. Cervixkarzinom), Adenokarzinome, Herpesviren-induzierte Tumore (z.B. Burkitt's Lymphom, EBV-induziertes B Zelllymphom), Hepatitis B-induzuierte Tumore (Hepatozellkarzinome), HTLV-1 und HTLV-2 induzierte Lymphome, Akustikusneurinom, Gebärmuttehalskrebs, Lungenkrebs, Rachenkrebs, Analkarzinom, Glioblastom, Lymphome, Rektumkarzinom, Astrozytom, Hirntumore, Magenkrebs, Retinoblastom, Basaliom, Hirnmetastasen, Medulloblastome, Scheidenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Hodenkrebs, Melanom, Schilddrüsenkarzinom, Blasenkrebs, Hodgkin-Syndrom, Meningeome, Schneeberger Krankheit, BronchialkarzinomHypophysentumor, Mycosis fungoides, Speiseröhrenkrebs, Brustkrebs, Karzinoide, Neurinom, Spinaliom, Burkitt-Lymphom, Kehlkopfkrebs, Nierenkrebs, Thymom, Corpuskarzinom, Knochenkrebs, Non-Hodgkin-Lymphome, Urethrakrebs, CUP-Sysndrom, Kopf-Hals-Tumore, Oligodendrogliom, Vulvakrebs, Darmkrebs, Kolonkarzinom, Ösphaguskarzinom, Warzenbeteiligung, Dünndarmtumore, Kraniopharyngeome, Ovarial-Karzinom, Weichteiltumore, Eierstockkrebs, Leberkrebs, Pankreaskarzinom, Zervixkarzinom, Endometriumkarzinom, Lebermetastasen, Peniskrebs, Zungenkrebs, Gallenblasenkrebs, Leukämie, Plasmozytom, Gebärmutterkrebs, Lidtumor, Prostatakrebs, etc., oder zur Behandlung von Infektionskrankheiten, ausgewählt aus Influenza, Malaria, SARS, Gelbfieber, AIDS, Lyme-Borreliose, Leischmaniasis, Anthrax, Meningitis, viralen Infektionskrankheiten wie AIDS, Condyloma acuminata, Dellwarze, Dengue-Fieber, Dreitagefieber, Ebolavirus, Erkältung, Frühsommermeningoenzephalitis (FSME), Grippe, Gürtelrose, Hepatitis, Herpes-Simplex Typ I, Herpes-Simplex Typ II, Herpes zoster, Influenza, Japanische Enzephalitis, Lassafieber, Marburg-Virus, Masern, Maul- und Klausenseuche, Mononukleose, Mumps, Norwalk-Virus-infektion, Pfeifersches-Drüsenfieber, Pocken, Polio (Kinderlähmung), Pseudokrupp, Ringelröteln, Tollwut, Warzen, West-Nil-Fieber, Windpocken, Zytomegalie-Virus (CMV), bakteriellen Infektionskrankheiten wie Abort (Prostataentzündung), Anthrax, Appendizitis(Blinddarmentzündung), Borreliose, Botulismus, Camphylobacter, Chlamydia trachomatis (Harnröhren-, Bindehautentzündung), Cholera, Diphterie, Diphterie; Donavanosis, Epiglottitis, Fleckfieber, Flecktyphys, Gasbrand, Gonorhoe, Hasenpest, Heliobakter pylori, Keuchhusten, klimatischer Bubo, Knochenmarksentzündung, Legionärskrankheit, Lepra, Listeriose, lungenentzündung, Meningitis, Bakterielle Gehirnhautentzündung, Milzbrand, Mittelohrentzündung, Mycoplasma hominis, Neugeborenensepsis (Chorioamnionitis), Noma, Paratyphus, Pest, Reitersyndrom, Rocky Mountain spotted fever, Salmonellen-Paratyphus, Salmonellen-Typhus, Scharlach, Syphilis, Tetanus, Tripper, Tsutsugamushi, Tuberkulose, Typhus, Vaginitis (Kolpitis), Weicher Schanker und durch Parasiten, Protozoen oder Pilze hervorgerufene Inkektionskrankheiten wie Amöbenruhr, Bilharziose, Chagas-Krankheit, Echinococcus, Fischbandwurm, Fischvergiftung (Ciguatera), Fuchsbandwurm, Fußpilz, Hundebandwurm, Kandiose, Kleienpilzflechte, Krätze (Skabies), Kutane Leishmaniose, Lamblienruhr (Giadiasis), Läuse, Malaria, Mikroskopie, Onchozerkose (Flussblindheit), Pilzerkrankungen, Rinderbandwurm, Schistosomiasis, Schlafkrankheit, Schweinebandwurm, Toxoplasmose, Trichomoniasis, Trypanosomiasis (Schlafkrankheit), Viszerale Leishmaniose, Windeldermatitis, Zwergbandwurm, zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten, wie beispielsweise Autoimmunerkrankungen ausgewählt werden, wie Multiple Sklerose (MS), Rheumatoide Arthritis, Diabetes, Diabetes Typ I, Systemische Lupus Erythematosus (SLE), Chronische Polyarthritis, Basedowsche Krankheit, Autoimmune Formen der chronischen Hepatitis, Colitis Ulcerosa, Allergie Typ I-Erkrankungen, Allergie Typ II-Erkrankungen, Allergie Typ III-Erkrankungen, Allergie Typ IV-Erkrankungen, Fibromyalgie, Haarausfall, Morbus Bechterew, Morbus Crohn, Myasthenia gravis, Neurodermitis, Polymyalgia rheumatica, Progressive Systemische Sklerose (PSS), Psiorasis, Reiter-Syndrom, Rheumatische Arthritis, Schuppenflechte, Vaskulitis, etc. eingesetzt werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von mit Liganden beladenen MHC-Molekülen, herstellbar nach einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung der oben genannten Indikationen.

Pharmazeutische Zusammensetzungen bilden einen weiteren Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen typischerweise eine sichere und effektive Menge der erfindungsgemäßen Verbindungen der Formeln I, II, III und IV1 bis IV3, bevorzugt wie oben definiert, optional zusammen mit einem oder mehreren liganden, wie in der vorliegenden Erfindung definiert, z.B. Peptiden, und optional einen pharmazeutisch geeigneten Träger sowie weitere Hilfs- und Zusatzstoffe. Alternativ umfassen pharmazeutischen Zusammensetzungen bevorzugt eine sichere und effektive Menge der MHC-Moleküle, deren Beladungsszustand mit Liganden nach einem erfindungsgemäßen Verfahren verändert wurde, und optional einen pharmazeutisch geeigneten Träger sowie weitere Hilfs- und Zusatzstoffe. Wie hier verwendet bedeutet "sichere und effektive Menge" eine solche Menge einer Verbindung, die ausreichend ist, um signifikant eine positive Modifikation des zu behandelnden Zustands zu induzieren, jedoch gering genug, um schwerwiegende Nebeneffekte zu vermeiden (mit einem vernünftigen Verhältnis von Vorteil/Risiko), innerhalb des Bereichs vernünftiger medizinischer Urteilskraft. Eine sichere und effektive Menge einer Verbindung wird im Zusammenhang mit dem besonderen zu behandelnden Zustand variieren, sowie dem Alter und dem physischen Zustand des zu behandelnden Patienten, der Schwere des Zustandes, der Dauer der Behandlung, der Natur der begleitenden Therapie, des verwendeten besonderen pharmazeutisch geeigneten Trägers und ähnlichen Faktoren innerhalb des Wissens und der Erfahrung des begleitenden Arztes. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können weiterhin für humane und wie auch für veterinärmedizinische Zwecke eingesetzt werden.

Zusätzlich zu den erfindungsgemäßen Verbindungen der Formeln I, II, III und IV1 bis IV3, optional zusammen mit einem oder mehreren Liganden, oder alternativ zusätzlich zu den MHC-Molekülen, deren Beladungsszustand mit Liganden nach einem erfindungsgemäßen Verfahren verändert wurde, können die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung einen pharmazeutisch geeigneten Träger enthalten. Der hier verwendete Begriff "pharmazeutisch geeigneter Träger" umfasst bevorzugt einen oder mehrere kompatible feste oder flüssige Füllstoffe, bzw. Verdünnungsmittel oder einkapselnde Verbindungen, welche für die Verabreichung an eine Person geeignet sind. Der Begriff "kompatibel", wie hier verwendet, bedeutet, dass die Bestandteile der Zusammensetzung in der Lage sind, mit der Verbindung und miteinander in einer solchen Art zusammengemischt zu werden, dass keine Interaktion auftritt, welche wesentlich die pharmazeutische Effektivität der Zusammensetzung unter gewöhnlichen Verwendungsbedingungen reduzieren würde. Pharmazeutisch geeignete Träger müssen selbstverständlich eine ausreichend hohe Reinheit und eine ausreichend geringe Toxizität aufweisen, um sie für die Verabreichung an eine zu behandelnde Person geeignet zu machen.

Einige Beispiele von Verbindungen, welche als pharmazeutisch geeignete Träger oder Bestandteile davon dienen können, sind Zucker, wie beispielsweise Lactose, Glucose und Sukrose; Stärken wie beispielsweise Kornstärke oder Kartoffelstärke; Cellulose und seine Derivate, wie beispielsweise Natriumcarboxymethylcellulose, Ethylcellulose, Celluloseacetat; pulverisiertes Tragacanth; Malz; Gelatine; Talg; feste Gleitmittel, wie beispielsweise Stearinsäure, Magnesiumstearat; Kalziumsulfat; vegetabile Öle, wie beispielsweise Erdnussöl, Baumwollsamenöl, Sesamöl, Olivenöl, Kornöl und Öl aus Theobroma; Polyole, wie beispielsweise Polypropylenglycol, Glycerin, Sorbitol, Mannitol und Polyethylenglycol; Algininsäure; Emulgatoren, wie beispielsweise die Tweene^®; Benetzungsmittel, wie beispielsweise Natriumlaurylsulfat; färbende Agenzien; geschmacksvermittelnde Agenzien, Arzneistoffträger; tablettenbildende Agenzien; Stabilisatoren; Antioxidantien; Konservierungsmittel; pyrogen-freies Wasser; isotonische Salzlösung und phosphatgepufferte Lösungen.

Die Wahl eines pharmazeutisch geeigneten Trägers, der zusammen mit erfindungsgemäßen Verbindungen der Formeln I, II, III und IV1 bis IV3, optional zusammen mit einem oder mehreren Liganden, oder alternativ zusätzlich zusammen mit MHC-Molekülen, deren Beladungsszustand mit Liganden nach einem erfindungsgemäßen Verfahren verändert wurde, verwendet werden soll, wird grundsätzlich durch die Art bestimmt, durch die die nach einem erfindungsgemäßen Verfahren mit Liganden beladenen MHC-Moleküle verabreicht werden. Die nach einem erfindungsgemäßen Verfahren mit Liganden beladenen MHC-Moleküle können systemisch verabreicht werden. Routen zur Verabreichung schließen transdermale, orale, parenterale, einschließlich subkutane oder intravenöse Injektionen, topische und/oder intranasale Routen mit ein.

Die geeignete Menge der zu verwendenden erfindungsgemäßen Verbindungen der Formeln I, II, III und IV1 bis IV3, optional zusammen mit einem oder mehreren Liganden, oder alternativ der MHC-Moleküle, deren Beladungsszustand mit Liganden nach einem erfindungsgemäßen Verfahren verändert wurde, kann durch Routineexperimente mit Tiermodellen bestimmt werden. Solche Modelle schließen, ohne jedoch darauf begrenzt zu sein, Modelle von Kaninchen, Schaf, Maus, Ratte, Hund und nichthumane Primatenmodelle mit ein.

Bevorzugte Einheitsdosisformen zur Injektion schließen sterile Lösungen von Wasser, physiologischer Salzlösung oder Mischungen davon mit ein. Der pH solcher Lösungen sollte auf etwa 7,4 eingestellt werden. Geeignete Träger zur Injektion oder zur chirurgischen Implantation schließen Hydrogele, Vorrichtungen zur kontrollierten oder verzögerten Freigabe, polylaktische Säure und Collagenmatrizen mit ein.

Geeignete pharmazeutisch-geeignete Träger zur topischen Anwendung schließen solche mit ein, die zur Verwendung in Lotionen, Cremes, Gels u.ä. geeignet sind. Falls die Verbindung peroral verabreicht werden soll, sind Tabletten, Kapseln u.ä. die bevorzugte Einheitsdosisform. Die pharmazeutische geeigneten Träger zur Herstellung von Einheitsdosisformen, die für die orale Verabreichung verwendbar sind, sind im Stand der Technik gut bekannt. Ihre Auswahl wird von sekundären Überlegungen wie Geschmack, Kosten und Lagerfähigkeit abhängen, welche für die Zwecke der vorliegenden Erfindung nicht kritisch sind, und ohne Schwierigkeiten durch einen Fachmann durchgeführt werden können.

Ein ebenfalls bevorzugter Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von erfindungsgemäßen Verbindungen der Formeln I, II, III und IV1 bis IV3, optional zusammen mit einem oder mehreren Liganden, oder alternativ von MHC-Molekülen, deren Beladungsszustand mit Liganden nach einem erfindungsgemäßen Verfahren verändert wurde, bevorzugt MHC-Multimeren, für Screeningverfahren und diagnostische Verfahren zur Suche und Identifizierung von neuen Antigenen, insbesondere von Tumorantigenen, Pathoantigenen und Autoantigenen, sowie zum Nachweis spezifischer T-Zellen, beispielsweise autoreaktiven T-Zellen oder zytotoxischen T-Zellen, oder zum Monitoring einer spezifischen T-Zell-Antwort. Typischerweise wird dazu in einem ersten Schritt eine Zusammensetzung mit erfindungsgemäßen Verbindungen der Formeln I, II, III und IV1 bis IV3, optional zusammen mit einem oder mehreren Liganden, oder alternativ von MHC-Molekülen, deren Beladungsszustand mit Liganden nach einem erfindungsgemäßen Verfahren verändert wurde, bereitgestellt. MHC-Moleküle sind dabei wie oben definierte MHC-Moleküle. Die hier verwendeten Zusammensetzungen können den in den Verfahren zur Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen bereitgestellten Zusammensetzungen entsprechen. Die im vorliegenden Fall verwendeten MHC-Moleküle können mit Liganden beladen oder unbeladen sein. Die Liganden entsprechen bevorzugt den zuvor in der Beschreibung definierten Liganden und werden in Abhängigkeit der zugrundeliegenden Aufgabe gezielt ausgewählt. Bevorzugt werden solche Liganden auf MHC-Moleküle aufgeladen, die auch unter physiologischen Bedingungen zu einer Immunantwort führen. Die in dem Screeningverfahren oder diagnostischen Verfahren verwendeten und/oder identifizierten Liganden sind bevorzugt wie oben definierte Liganden von MHC-Molekülen, noch stärker bevorzugt Liganden tumor- oder pathogenspezifischer Antigene. Beispielsweise können durch die gezielte Bindung von Antigenen auf MHC-Molekülen mit Hilfe des erfindungsgemäßen Screening- oder Diagnoseverfahrens die Bildung von spezifischen T-Zellrezptoren oder T-Zellen auf dieses Antigen hin in einem Patienten überprüft werden. Die mit dem Screening gegebenfalls erhaltene Immunantwort kann anschließend mit einer Indikation in direkten Zusammenhang gebracht werden. Typischerweise wird nach einem erfindungsgemäßen Verfahren eine solche Menge an Liganden auf das MHC-Molekül geladen, dass die Menge an Liganden auf den MHC-Molekülen zur Stimulierung einer Immunantwort, bevorzugt einer T-Zellantwort ausreicht. In einem weiteren Schritt kann das MHC-Molekül an eine Festphase oder an eine Matrix gebunden werden. Eine Festphase oder eine Matrix im Sinne des vorliegenden Verfahrens ist dabei bevorzugt jede Oberfläche, an die sich MHC-Moleküle direkt, über einen Linker, über eine Markierung oder über ihre Affinität, binden lassen. Die MHC-Moleküle können für die Bindung an eine Festphase wie oben beschrieben markiert sein. Für die Bindung an eine Festphase oder an eine Matrix können der Zusammensetzung geeignete Puffer zugesetzt werden. Geeignete Puffer sind einem Fachmann bekannt. Geeignete Puffer im Sinne des vorliegenden Verfahrens sind beispielsweise PBS Puffer, RSA-PBS Puffer (PBS Puffer mit Rinder-Serum-Albumin (RSA)), FKS-PBS Puffer (PBS Puffer mit Fötalem Kälberserum (FKS)), Phosphat-Puffer, TRIS-HCl Puffer, Tris-Phosphat-Puffer, oder weitere geeignete Puffer. Die Konzentrationen und Mengen der einzusetztenden Puffer entsprechen bevorzugt den zuvor in der Beschreibung genannten. In einem weiteren Schritt kann eine zu untersuchende Substanz, beispielsweise eine Körperflüssigkeit oder ein homogenisiertes Gewebe, bevorzugt Blut oder Gewebe, gegebenfalls in einem der zuvor beschriebenen Puffer zugegeben werden. Die in der zugegebenen Substanz enthaltenen physiologischen Bindungspartner binden üblicherweise an die immobilisierten, gegebenfalls nach einem erfindungsgemäßen Verfahren mit Liganden beladenen, MHC-Moleküle. Nach der Bindung der enthaltenen physiologischen Bindungspartner an die MHC-Moleküle wird üblicherweise die Festphase oder Matrix mit einem Puffer, bevorzugt einem der zuvor beschriebenen Puffer, gewaschen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der physiologische Bindungspartner bevorzugt eine T-Zelle, besonders bevorzugt eine solche T-Zelle, die eine hohe Affinität zu einem Antigen besitzt, noch stärker bevorzugt eine T-Zelle mit einer hohen Affinität zu einem tumor- oder pathogenspezifischen Antigen. Ebenfalls besonders bevorzugt ist die in einem Screeningverfahren oder diagnostischen Verfahren erzeugte Immunantwort eine antigenspezifische T-Zellantwort. In einem abschließenden Schritt können die an die MHC-Moleküle gebundenen physiologischen Bindungspartner der gegebenfalls mit Liganden beladenen MHC-Moleküle durch ein wie oben beschriebenes biophysikalisches oder biochemisches Nachweis- oder Isolierungsverfahren, bevorzugt mittels FACS oder MACS, identifiziert und isoliert werden. Gemäß einer ebenfalls bevorzugten Ausführungsform können in solchen Verfahren unter Verwendung von MHC Klasse II tragenden magnetischen beads T-Zellen antigenspezifisch mittels MACS isoliert werden. Die im zuvorgenannten Screeningverfahren oder diagnostischen Verfahren genannten Schritte können in geeigneter Reihenfolge geändert werden. Screeningverfahren oder diagnostische Verfahren gemäß dem hier vorliegenden Erfindung schließen bevorzugt in vitro T-Zell Assays, besonders bevorzugt Proliferationsassays, ELISPOTS, ELISA-Verfahren, Chromium-Release-Assays, High-Throughput Screeningverfahren (HTS), etc. mit ein.

Eine besondere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Screening- oder Diagnostiziervefahrens betrifft ein Verfahren zur Suche und Identifizierung von neuen Tumorantigenen, zum Nachweis spezifischer zytotoxischer T-Zellen oder zum Monitoring einer spezifischen T-Zell-Antwort umfassend die folgenden Schritte:

a) Bereitstellung einer Zusammensetzung enthaltend MHC-Moleküle, deren Beladungszustand mit Liganden nach einem erfindungsgemäßen Verfahren verändert wurde; und
b) Bestimmung der Wechselwirkung von MHC-Molekülen, deren Beladungszustand mit Liganden nach einem erfindungsgemäßen Verfahren verändert wurde, mit einem physiologischen Bindungspartner der MHC-Moleküle mit Hilfe eines biochemischen oder biophysikalischen Nachweisverfahrens; und
c) Optional Identifizierung und Isolierung des physiologischen Bindungspartners der MHC-Moleküle, deren Beladungszustand mit Liganden nach einem erfindungsgemäßen Verfahren verändert wurde, mit Hilfe eines biochemischen oder biophysikalischen Nachweis- oder Isolierungsverfahrens.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können in einem Screeningverfahren oder diagnostischen Verfahren die MHC-Moleküle, deren Beladungszustand mit Liganden nach einem erfindungsgemäßen Verfahren verändert wurde, bevorzugt MHC Multimere, zur antigenspezifischen Identifizierung von T-Zellen, bevorzugt von tumorspezifischen T-Zellen oder Tumorantigenen eingesetzt werden. Bevorzugt werden als Liganden solche Antigene ausgewählt, die mit einer der zuvor genannten Indikationen in Zusammenhang stehen.

Figurenbeschreibung:

1: stellt die Katalyse der Beladung löslicher HLA-DR1 Moleküle durch Phenol- und Adamantylverbindungen dar. Feld A) zeigt Strukturformeln von p-Chlorphenol (pCP), 2-(1-Adamantyl)-Ethanol (AdEtOH) und 3-(1-Adamantyl)-5-Carbohydrazidpyrazol (AdCaPy), die in den erfindungsgemäßen Experimenten eingesetzt wurden. Feld B) zeigt die Beladung von leeren löslichen HLA-DR1 Molekülen mit dem HA306-318 Peptid. Die Beladung wurde unter Verwendung von biotinyliertem Peptid im ELISA bestimmt. Die Höhe der Balken des gezeigten Balkendiagramms im linken Feld repräsentiert die Zahl der gebildeten Peptid/MHC Komplexe nach 60 Minuten. Schwarze Balken repräsentieren dabei die unkatalysierte Beladungsreaktion, wobei (+) die Spontanbeladung und (-) das Hintergrundsignal in Abwesenheit des Peptids darstellt. Die Höhe der grauen Balken markiert die Zahl der gebildeten Komplexe der katalysierten Reaktionen, welche in Anwesenheit von 250 μM pCP, AdEtOH oder AdCaPy durchgeführt wurden. In der rechten Abbildung sind die entsprechenden Dosis-Wirkungskurven dargestellt. Wie aus dieser Abbildung deutlich hervorgeht, sind alle drei Katalysatoren grundsätzlich in der Lage, die Reaktion zu beschleunigen. Verglichen mit der pCP Kurve sind die entsprechenden Kurven der Adamantylverbindungen jedoch um mehr als eine Zehnerpotenz nach links verschoben, d.h. sie sind 10-fach aktiver als pCP.

2: zeigt die Katalyse der Beladung von HLA-DR Molekülen auf der Zelloberfläche anhand von Dosis-Wirkungskurven der Beladung von Fibroblastenzellen mit dem HA306-318 Peptid. Die Zellen wurden dafür mit dem Peptid sowie mit p-Chlorphenol (pCP), 2-(1-Adamantyl)-Ethanol (AdEtOH) und 3-(1-Adamantyl)-5-Carbohydrazidpyrazol (AdCaPy) inkubiert. Durch Verwendung eines biotinylierten Peptides konnte anschließend nach Färbung der Zellen mit fluoreszierendem Streptavidin die Menge an gebundenem Peptid L243.6, welche HLA-DR1 (DRB1*0101) bzw HLA-DR4 (DRB1*0401) exprimieren, zwei MHC Klasse II Moleküle, welche das HLA306-318 Peptid präsentieren können. Das Fehlen jeglicher Färbung der L929 Zellen zeigt an, dass alle Katalysatoren selektiv die Bindung an die MHC-Moleküle verstärken. Ein Vergleich der Dosis-Wirkungskurven bestätigt dabei das Ergebnis mit den löslichen MHC-Molekülen (siehe auch 1). Auch hier erweisen sich die getesteten Adamantylverbindungen wesentlich aktiver als pCP und beschleunigen die Beladung der Zellen bereits bei einer Konzentration von deutlich weniger als einem Zehntel der entsprechenden pCP Konzentration.

3: zeigt die Verstärkung der T-Zellantwort durch die Katalyse der Beladung von HLA-exprimierenden Zellen anhand der Dosis-Wirkungskurven der Immunantwort von zwei verschiedenen HLA-DR1-restringierten T-Zellen. Als Peptidantigen wurde dabei entweder HA306-318 (linkes Feld) oder CO260-273 (rechtes Feld) verwendet. In beiden Fällen wird die Immunantwort der T-Zellen durch die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Verbindungen AdEtOH oder AdCaPY deutlich verstärkt. Der Vergleich der Dosiswirkungen ergibt, dass ebenfalls bezüglich der T-Zellantwort die Adamantylverbindungen etwa 10-100-fach effektiver sind als pCP.

4: zeigt die allelspezifische Wirkung der Katalyse durch Adamantylverbindungen durch einen Vergleich der Dosis-Wirkungskurven einer HLA-DR4- (linkes Feld) und einer HLA-DR2-restringierten T-Zellantwort (rechtes Feld). HLA-DR4 (DRB1*0401) und HLADR2 (DRB1*1501)-exprimierende Zellen wurden, wie unter Vergleichsversuch 3.4 beschrieben, unter Anwesenheit der Katalysatoren mit HA306-318 bzw. MPB86-100 beladen und anschließend im T-Zellassay eingesetzt. Während die Dosis-Wirkungskurven der HLA-DR4-restringierten 8475/94 T-Zellen denen der zuvor in Vergleichsversuch 3.3 beschriebenen HL-DR1-restringierten T-Zellen entspricht, ist bei den Kurven der HLA-DR2 restringierten 08073 T-Zellen ein deutlicher Unterschied zu erkennen. Im Gegensatz zum pCP, das auf allen untersuchten HLA-DR Molekülen verstärkend wirken kann, wirken die Adamantylverbindungen offensichtlich auf HLA-DR1 (DRB1*0101) und HLA-DR4 (DRB1*0401), nicht jedoch auf HLADR2 (DRB1*1501). Die Wirkung der Adamantylverbindung ist daher offensichtlich allelspezifisch.

5: zeigt einen Vergleich der Dosis-Wirkungskurven der Katalyse der Bindung von MBP86-100 an das HLA-DR2 Wildtyp Molekül (linke Abb.) und an das mutierte HLA-DR2 Molekül, bei dem der Valinrest an der Position 86 durch Glycin ersetzt wurde (rechte Abb.). Während Adamantanethanol am unmutierten HLA-DR2 Molekül der Fibroblastenzellen keine Katalyse bewirken kann wie an den in Vergleichsversuch 3.4 beschriebenen MGAR Zellen, bewirkt die V->6 Substitution, dass das mutierte HLA-DR2 Molekül wieder für die Adamantyl-vermittelte Katalyse empfänglich wird. Da der Glycin/Valin-Dimorphismus die Tiefe der Bindungstasche P1 bestimmt, wobei β86G mit einer tiefen Tasche korreliert, vermitteln Adamantylverbindungen ihre katalytische Aktivität offensichtlich durch ihre Bindung an eine tiefe P1 Tasche.

6: zeigt Dosis-Wirkungskurven der Katalyse einer HLA-DR1 (DRB1*O101)-restringierten T Zellantwort. Das Experiment wurde analog der Beschreibung zu Vergleichsversuch 3.3 durchgeführt, wobei das Peptidantigen HA306-318 auf 721.221 Zellen geladen wurde, um damit EvHA/X5 T Zellen zu stimulieren. Die Dosis- Wirkungskurven zeigen, dass alle aufgeführten Adamantylverbindungen eine katalytische Aktivität besitzen. Der unterschiedliche chemische Charakter der Seitenketten zeigt, dass die Wirkung im wesentlichen durch die Adamantylgruppierung vermittelt wird. Da die Lage der Dosis-Wirkungskurven offensichtlich jedoch auch von der Seitenkette bestimmt wird, kann ihr jedoch zumindest eine modulierende Wirkung zugesprochen werden.

7: zeigt durchflußzytometrische Messungen von NLA-DR1-restringierten humanen T Zellen (PD2), welche mit fluoreszenzmarkierten peptidbeladenen NLA-DR1 Tetrameren gefärbt wurden. Folgende Tetramere wurden hierbei eingesetzt: HA-Tetramere, HLA-DR1 – Tetramere, die vom Hersteller (Proimmune Ltd.) bereits mit dem T Zellantigen HA306-318 beladen bezogen wurden und IC-Tetramere, welche das nichtrelevante Peptid IC106-120 tragen. In Feld A) werden durchflußzytometrische Messungen gezeigt, welche durch Beladung von IC-Tetrameren mit HA306-318 unter Anwesenheit von Adamantylverbindungen (AdEtOH) hergestellt wurden. Als Kontrolle wurde zudem eine Beladung mit einem nicht-relevanten Peptid (ABL) durchgeführt. Die durchflußzytometrische Analyse nach Färbung der Zellen mit den Komplexen ergab, dass die PD2 T-Zellen, welche mittels Adamantylethanol beladenen Tetrameren gefärbt wurden, ein ähnlich hohes Signal lieferten, wie die vorgefertigten HA- Tetramere. In Feld B) wird der Ligandenaustausch in Anwesenheit sowie in Abwesenheit des Adamantylethanols dargestellt. Wie aus dem Balkendiagramm ersichtlich ist, werden auch in diesem Experiment die HA306-318-spezifischen PD2 T-Zellen mit den durch Adamantylethanol katalysierten Tetrameren gefärbt. Dagegen wird keine nennenswerte Färbung mit den Komplexen beobachtet, bei denen eine Beladung ohne Katalysator versucht wurde. Die mit Hilfe des Adamantylethanols entstandenen Komplexe weisen zudem die geforderte Antigenspezifität auf, da A 10 T-Zellen im Gegensatz zu den PD2 nicht gefärbt werden.

8 stellt Dosis-Wirkungskurven weiterer Verbindungen dar, die ebenfalls über die tiefe P1 Tasche wirken. In Feld A) sind die untersuchten Strukturen dargestellt (2-(7,7-Dichlor-6-methyl-bicyclo[4.1.0]heptan-3-yl)-propan-2-ol (#4230) und 6-Methoxybenzofuran-3(2H)-on-oxim (#3651)). Trotz sehr unterschiedlicher chemischer Struktur weist dabei zumindest #4230 eine Raumstruktur auf, welche der der Adamantylgruppe sehr ähnlich ist. In Feld B) wird die Aktivität und Allelspezifität mit den HLA-DR1-restringierten HA306-318-spezifischen EvHA/X5 T Zellen (linke Abb.) und den HLA-DR2-restringierten MBP86-100 spezifischen 08073 T Zellen dargestellt. Auf HLA-DR1 weist #4230 eine katalytische Aktivität auf, welche ungefähr der des Adamantylethanols entspricht. #3651 ist dagegen schwächer, weist jedoch immer noch höhere Aktivität auf als pCP. Auf HLA-DR2 weisen beide Verbindungen keine Aktivität auf, weshalb sie offensichtlich, ähnlich wie die Adamantylverbindungen, ihre katalytische Wirkung durch die Bindung an die tiefe P1 Tasche vermitteln.

9 stellt Dosis-Wirkungskurven verschiedener katalytisch aktiver Phenol-/Anilinverbindungen dar. In Feld A) sind Strukturformeln einiger katalytisch aktiver Phenol- und Anilinverbindungen dargestellt. Die katalytische Aktivität der bislang identifizierten aktiven Verbindungen dieser Verbindungsklasse liegen deutlich unter der der Adamantylverbindungen. Der Mechanismus der Katalyse ähnelt offensichtlich jedoch dem der Adamantylverbindungen, da auch hier eine rezeptive Konformation ausgelöst wird. B) Die katalytische Aktivität der Beispielsubstanzen ist hier an der beschleunigten Beladung von löslichen HLA-DR1 Molekülen mit dem HA306-318 demonstriert. Ein Vergleich der Dosis-/Wirkungskurven mit pCP zeigt, dass alle Verbindungen in einem sehr ähnlichen Wirkungsbereich liegen, wobei insbesondere DCC und pHDP leicht erhöhte Aktivität zeigen.

10 stellt Dosis-Wirkungskurven der Katalyse der HLA-DR Beladung durch pCP und Adamantylethanol dar. Die Daten wurden mittels T-Zellassays wie in Vergleichsversuch 3.3 beschrieben bestimmt und illustrieren die Wirkung der beiden Katalysatoren auf HLA-DR Molekülen mit tiefer oder flacher P1 Tasche {86G bzw. 86V} sowie auf die Maus MHC Klasse II Moleküle H2-E^k und H2-A^k. Die unterbrochenen Linien repräsentieren dabei die Stärke der unkatalysierten T Zellantwort. Wie bereits in Vergleichsversuch 3.5 beschrieben, ist die Wirkung des Adamanthylethanols verglichen mit pCP stärker, jedoch auf solche HLA-DR Moleküle gerichtet, welche die tiefe P1 Tasche besitzen. Dafür ist das Wirkungsspektrum des pCP weniger spezifisch. Es existiert keine Abhängigkeit vom 86-Dimorphismus und bislang wurden auch keine sonstigen allelspezifischen Beschränkungen der Wirkung von pCP auf HLA-DR Molekülen beobachtet. pCP besitzt keinen Effekt auf alle bislang untersuchten H2-A Moleküle, die Homologe zu den humanen HLA-DP Molekülen sind.

11 stellt Dosis-Wirkungskurven verschiedener katalytisch aktiver Thiophenverbindungen dar. In Feld A) sind Strukturformeln einiger katalytisch aktiver Thiophenverbindungen dargestellt. Die katalytische Aktivität der bislang identifizierten aktiven Verbindungen dieser Verbindungsklasse ist zumeist etwas stärker als die des pCP. Die Aktivität von drei Beispielverbindungen ist hier anhand der Dosis/Wirkungskurven der Stimulation HLA-DR1-restringierten EvHA/XS T Zellen gezeigt. Das Experiment wurde wie unter Vergleichsversuch 3.3 beschrieben durchgeführt. In Feld B) sind die vergleichenden Dosis-Wirkungskurven von pCP, AdEtOH und ATC dargestellt. Ähnlich wie bei den aktiven Phenol/Anilinverbindungen ist auch hier die Aktivität offensichtlich unabhängig vom β86-Dimorphismus der HAL-DR Moleküle. Wie in Vergleichsversuch 3.11 gezeigt, wird mit der Verbindung ATC die Peptidbeladung sowohl von Fibroblasten katalysiert, welche entweder HLA-DR1 (DRB1*0101; β86G) oder auch HLA-DR2 (DRB1*1S01; β86V) exprimieren. Die Tiefe der P1 Tasche spielt demnach bei den Thiophenverbindungen offensichtlich keine Rolle.

Ausführungsbeispiele:
Die folgenden nicht begrenzenden Beispiele beschreiben die vorliegende Erfindung und schränken die Erfindung in keiner Weise ein. Die Beispiele stellen sie dem Fachmann eine Anleitung zur Verwendung der Verbindungen und Verfahren der Erfindung zur Verfügung. In jedem Fall können andere Verbindungen innerhalb der Erfindung gegen diejenigen der unten gezeigten Beispielverbindung mit ähnlichen Ergebnissen ausgetauscht werden. Der erfahrene Praktiker wird es bevorzugen, dass die Beispiele eine Anleitung bereitstellen und aufgrund der unterschiedlichen zu verwendenden Verbindungen variiert werden können.
1. In vitro-Verfahren
1.1. Analyse synthetischer Katalysatoren in vitro
1.1.1 Rekombinante lösliche HLA-DR Komplexe
Lösliche MHC-Klasse II Moleküle HLA-DR1 (DRA1*0101, DRB1*0101), HLA-DR2 (DRA1*0101, DRB1*1501) und HLA-DR4 (DRA1*0101, DRB1*0401) wurden in S2-Insektenzellen produziert. Diese waren stabil mit Vektoren, die für verkürzte α- und -Ketten ohne den cytoplasmatischen und transmembranen Teil des MHC-Moleküls im Anschluß an einen Metallothionin-Promotor kodieren, transfiziert worden. Die HLA-DR produzierenden Zellen wurden in serumfreiem HyQ-SFX-Insektenmedium (HyClone) bei 26°C in Schüttelkultur kultiviert. Die Induktion der HLA-DR-Produktion erfolgte bei einer Zelldichte von 6-8 × 10⁶/ml durch Zugabe von 1 mM CuSO₄. Die Produktion erfolgte dann für einen Zeitraum von 5 Tagen.
1.2.2 Aufreinigung löslicher HLA-DR Komplexe aus Zellkulturmedien
Die Zellüberstände der HLA-DR produzierenden Zellen wurden für mehrere Tage im Zyklus mit Hilfe einer Peristaltikpumpe mit einem Fluss von 1,6ml/min über drei in Reihe geschaltete 25ml-Affinitätssäulen geleitet. Die erste Säule enthielt reine Protein A-Agarose und die zweite Protein G-Agarose. Die dritte Säule enthielt Protein A-Agarose an die LB3.1 anti-HLA-DR Antikörper gekopppelt worden war.
Anschließend wurden zunächst alle drei Säulen mit 500ml PBS-0,02%Natriumazid gewaschen und die Antikörper gekoppelte Säule danach nochmals einzeln mit 200ml. Diese Säule wurde anschließend in einem BiologicHR Chromatography System mit 50ml 10mM NaH₂PO₄ equilibriert und gebundenes HLA-DR mit 50mM CAPS (pH 11,5) eluiert. Die Elution wurde durch Messung der Absorption bei 280nm überwacht und das Eluat während eines Peaks in 1 ml 600mM NaH₂PO₄ aufgefangen. Zum Schluss wurde die Säule durch Waschen mit 50ml 300mM NaH₂PO₄ neutralisiert. Die Proteinkonzentration in dem aufgefangenen Eluat wurde mit Hilfe der Proteinbestimmung nach Bradford ermittelt.
1.2.3 MHC-Klasse II Beladungsexperimente
Um die Katalyse der Beladung von HLA-DR-Molekülen durch Verbindungen der Formeln I, II, III und IV1 bis IV3 zu verfolgen, wurden leere, lösliche DR-Moleküle mit biotinyliertem, hochaffinem Peptid inkubiert und diese dann in einem Sandwich ELISA auf den MHC-Komplexen nachgewiesen.
Dazu wurden ca. 0.5 μg an HLA-DR auf Eis mit 1 μg an hochaffinem, biotinyliertem Peptid (HA-biot. (biot. HA306-318) in HLA-DR1&DR4- und MBP-biot. (MBP86-100) in HLA-DR2-Beladungsexperimeneten) und der in den jeweiligen Versuchen angegebenen Konzentration an Katalysatorsubstanz vermischt. Alle Ansätze wurden dann mit 2%RSA-PO₄ ^3–-Puffer (im Falle von HLA-DR1 nur mit PO₄ ^3–-Puffer) auf ein Endvolumen von 10 μl eingestellt. Die Reaktion wurde durch Inkubation bei 37°C in einem Thermocycler gestartet. Nach 40min wurde die Inkubation abgebrochen und die Beladungsreaktion durch Lagerung auf Eis und Zugabe von 50 μl eiskaltem 1%-RSA-PBS gestoppt.
Die Detektion gebundenen Peptids erfolgte mit Hilfe eines Sandwich ELISAs. Dazu wurden 96-well-Maxisorp-Platten über Nacht mit 80μl/Vertiefung α-HLA-DR-Antikörper (Klon L243 (1 mg/ml) vedünnt 1:500 in 100mM NaHCO₃-Lösung) beschichtet und anschließend mit 200μl/Vertiefung 2%-RSA-PBS bei 37°C für mindestens eine Stunde geblockt. Zwischen diesen Schritten wurde die Platte zweimal mit Hilfe eines PW-Plattenwaschgeräts (Tecan Industries) mit PBS-0,05%Tween gewaschen und, vor dem Befüllen mit neuer Lösung, alle verbleibenden Flüssigkeitsreste durch Ausklopfen auf Scott^®Natura Papierhandtüchern (Halke-Kimberly Deutschland GmbH) entfernt. Nach dem Blockieren unspezifischer Bindungsstellen wurde die Platte dreimal gewaschen und mit 50μl/Vertiefung 1%RSA-PBS befüllt. Zweimal 25μl je Reaktionsansatz wurden als Doppelwerte auf die Platte transferiert und dort sorgfältig vermischt (Gesamtvolumen je well: 75μl). Aus jeder befüllten Reihe wurden dann nochmals 25μl/Vertiefung in einer seriellen, zweistufigen Verdünnungsreihe auf der Platte titriert (Endvolumen je well: 50μl). Die so befüllten Platten wurden dann bei 4°C für 2h ruhig gelagert. Anschließend wurde jede Platte sechsmal wie oben beschrieben gewaschen und mit 80μl/Vertiefung Eu³⁺-Streptavidin-Färbelösung (Europium-Streptavidin-Stammlösung 1:10.000 mit 1%-RSA-PBS verdünnt) befüllt und für 30min bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Nach weiterem achtmaligem Waschen wurden dann 100μl/Vertiefung Fluoreszenz-aktivierende Lösung (Enhancer) zugegeben und das Signal mit einem Victor²-multilabelcounter (Wallac Oy) bei einer Anregungswellenlänge von 340nm und einer Emissionswellenlänge von 615nm im zeitauflösenden Modus gemessen.
1.2.4 Analyse der Substanzbibliothek
Die zu testenden Verbindungen der Formeln I, II, III und IV1 bis IV3 wurden in 384-well-Platten als 160mM Ausgangsbibliothek, gelöst in DMSO, geliefert, aus der eine Aliquotbibliothek angefertigt werden musste. Durch manuelle Abnahme von 2μl/Vertiefung und Verdünnung mit 38μl/Vertiefung DMSO wurde eine 8mM Stammbibliothek angefertigt, die für alle weiteren Untersuchungen verwendet wurde. Zur Analyse der enthaltenen Verbindungen der Formeln I, II, III und IV1 bis IV3 auf ihren Effekt auf MHC-Klasse II Moleküle wurde ein Hochdurchsatzverfahren auf der Basis eines HLA-DR1-Beladungsversuchs verwendet. Dazu wurden pro Bibliotheksplatte zwei 384-Vertiefung-Nunc-Maxisorp-Platten (ELISA-Platten) mit 60μl/Vertiefung monoklonalem anti-HLA-DR-Antikörper (L243-Stammlösung (1 mg/ml) 1:500 verdünnt in 100mM NaHCO₃) über Nacht bei 4°C beschichtet. Anschließend wurden die Platten dreimal durch Eintauchen in PBS-0,05%Tween-Lösung und Entfernen von Luftblasen durch Stoßen der Platte gegen die Waschgefäßwand gewaschen. Verbleibende Waschlösung wurde durch Ausklopfen der Platten auf Papiertüchern entfernt und 80μl/Vertiefung 2% RSA-PBS eingefüllt. Durch Inkubation bei 37°C für mindestens eine Stunde sollten unspezifische Bindungen verhindert werden. Währenddessen wurde je Bibliotheksplatte eine 384-well-NUNC-Polystyren-Platte (Analysen-Platte) mit 22μl/Vertiefung DR1-Analyselösung (ca.12μg/ml HLA-DR1 in PO₄ ^3–-puffer) befüllt und kühl gelagert. Anschließend wurde mit Hilfe eines 384-well-Pipettier-roboters 1 μl/Vertiefung aus der Bibliotheksplatte in die Analysen-Platte überführt (Endvolumen 23μl/well) und die Spitzen des Roboters gewaschen. Dies geschah durch fünfmaliges Auf und Abziehen von 20μl Lösung nacheinander in einem DMSO-, einem Wasser- und einem Ultraschalldurchflussbad gefüllt mit destilliertem Wasser. Nach Ausblasen etwaiger, in den Spitzen verbliebener Flüssigkeit, wurden 2μl/Vertiefung aus einer 384-well Platte gefüllt mit HA-biot.-Lösung (1 mg/ml HA-biot. gelöst in PBS) in die Analysen-Platte überführt, und dort sorgfältig durch Auf- und Abpipettieren von 15μl/Vertiefung mit dem HLA-DR- Gemisch mit Verbindungen der Formeln I, II, III und IV1 bis IV3 vermengt (Endvolumen 25μl/Vertiefung). Die so befüllte Analysenplatte wurde dann für 40min bei 37°C inkubiert und die Spitzen des Roboters wie oben beschrieben gewaschen (Anstatt DMSO wurde hier ein weiteres Wasserbad verwendet!). Kurz vor Ablauf dieser Zeitspanne wurden die beiden ELISA-Platten fünfmal wie beschrieben gewaschen, verbliebene Waschlösung entfernt und mit Hilfe des Roboters 30μl/Vertiefung 1%-RSA-PBS-lösung eingefüllt. Nach den 40 Minuten Inkubation wurden dann mit Hilfe des Pipettierroboters 40μl/Vertiefung 1%-RSA-PBS zusätzlich in die Analysen-Platte eingefüllt und mit der Reaktionslösung durch fünfmaliges Auf- und Abpipettieren von 30μl/Vertiefung vermischt (Endvolumen in der Analysen-Platte ca. 65μl/Vertiefung). Aus diesem Reaktions-RSA-PBS-Gemisch überführte der Roboter dann zweimal je 30μl/Vertiefung in die beiden ELISA-Platten und vermengte sie mit der vorgelegten RSA-PBS-lösung durch erneutes Auf- und Abpipettieren von 30μl/Vertiefung (Endvolumen in den ELISA-Platten 60μl/Vertiefung). Die so befüllten ELISA-Platten wurden dann für zwei Stunden bei 4°C gelagert und die Spitzen des Roboters in drei Wasserbädern durch zehnmaliges Auf- und Abziehen von 40μl gewaschen. Anschließend wurden die beiden ELISA-Platten sechsmal wie bereits beschrieben gewaschen und von Hand mit 60μl/Vertiefung Eu³⁺-Färbelösung befüllt. Um eine ausreichende Markierung des gebundenen biotinylierten Peptids zu gewährleisten wurden die Platten dann für mindestens 30min bei RT ruhig gelagert. Daraufhin wurde überschüssige Färbelösung durch achtfaches Waschen mit PBS-0.05%Tween entfernt und 80μl/Vertiefung fluoreszenzaktivierende Lösung (Enhancer) manuell zupipettiert. Die Detektion des Signals erfolgte dann wie im vorhergehenden Kapitel beschrieben.
1.2.5 Validierung in der Bibliothek identifizierter Katalysatoren
1,2μl der jeweiligen Substanz aus der Bibliotheksplatte wurden mit 4,8μl PO₄ ^3–-Puffer vermischt und daraus 1 μl in ein neues Eppendorfgefäß überführt und dort wieder mit 5μl PO₄ ^3–-Puffer vermengt. In einem weiteren Verdünnungsschritt wurde dann aus dieser zweiten Verdünnungsstufe noch einmal 1μl entnommen und mit 7μl PO₄ ^3–-Puffer vermischt. Alle drei Verdünnungsstufen wurden dann auf Eis mit je 0,5μg HLA-DR1 und 1μg HA-biot. versetzt und mit PO₄ ^3–-Puffer auf ein Endvolumen von 10μl eingestellt. Dadurch entstanden eine 1:10-, eine 1:50- und eine 1:300-Verdünnung der Substanz aus der Bibliothek. Als Kontrolle wurde mit DMSO und einer 10mM-Stocklösung an 1,2-Dichlor-4,5-Dihydroxybenzol/Dichlorcatechol (s. z.B. 9) ebenso wie für die Bibliothekssubstanzen beschrieben verfahren. Die weitere Analyse erfolgte wie unter MHC-Klasse II Beladungsexperimente beschrieben.
1.3 Untersuchung natürlicher Katalysatorquellen
1.3.1 Gewinnung und Extraktion von humanem Plasma
Patienten wurden Blutproben entnommen und in HEPES-beschichtete Röhrchen gegeben. Das frisch entnommene Blut wurde sofort bei 1500rpm für 15min zentrifugiert und das Plasma abgenommen.
Die Extraktion des Plasmas wurde im Wesentlichen wie von Gamache et al. (1998, Proc Soc Exp Biol Med 217:274-280) beschrieben ausgeführt. Im Einzelnen wurde 0.4ml humanes Plasma mit 1.6ml EtOH versetzt und durch Vortexen auf höchster Stufe für 5min auf einem MS2 Minishaker vermischt. Durch Zentrifugation für 10min bei 13.200g in einer 5804 R Zentrifuge von Eppendorf wurde präzipitiertes Protein abgetrennt und der Überstand in ein frisches Eppendorfgefäß aufgenommen. Der so entstandene Extrakt wurde dann in einer SPD111V SpeedVac unter reduziertem Druck und bei ca. 40°C für 2h auf ein Endvolumen von ca 100μl eingeengt. 50μl von diesem Konzentrat wurden dann direkt in der HPLC-Analyse eingesetzt.
1.3.2 HPLC-Analyse
Analytische Hochdruckffüssigchromatographie (HPLC) wurde in einem Pharmacia Biotech Smart^TMSystem, ausgestattet mit einer C2/C18 SC2.1/10 RP (reverse phase) Chromatographiesäule, durchgeführt. Enthaltene Substanzen wurde mit Hilfe eines UV-Detektors nachgewiesen, der gleichzeitig die Absorption bei 214nm, 260nm und 280nm bei RT aufzeichnete. Die mobile Phase bestand aus 0,096% Trifluoressigsäure (TFA) in H₂O bzw. aus 0,104% TFA in Acetonitril. Eluate wurden durch zeitabhängige Fraktionierung mit einem Volumen von 1 ml gesammelt. Das Lösungsmittel wurde daraufhin komplett unter erniedrigtem Druck bei 40°C in einer SPD111V SpeedVac (Savant Instruments Inc.) entfernt und das Pellet in 5μl DMSO resuspendiert. Die weitere Untersuchung der Fraktionen erfolgte durch HLA-DR1-Beladungsexperimente.
1.4 Toxizitätsanalysen
Zur Bestimmung der Toxizität der gefundenen Substanzen wurden 50.000- 100.000 Zellen (L57.23) in 100μl DMEM mit 50μl der Katalysatoren in den jeweils angegebenen Konzentrationen (gelöst in DMEM bei einer maximalen Konzentration von 3% DMSO) vermengt und für vier Stunden bei 37°C und 10% CO₂ in einem Feuchtbrutschrank inkubiert. Als Kontrolle wurden Zellen nur mit 50μl DMEM versetzt. Anschließend wurden die Zellen bei 1300rpm für 5min abzentrifugiert und das überstehende Medium vorsichtig ausgeworfen. Die Zellpellets wurden dann durch kurzes vortexen der ganzen Platte auf niedriger Stufe angelöst, mit 100μl/Vertiefung 5%-FKS-PBS resuspendiert und erneut bei 1300rpm für 5min zentrifugiert. Daraufhin wurde der Überstand erneut verworfen und die Zellpellets in 100μl/Vertiefung Propidiumiodid-Färbelösung (25pg/ml) gelöst. Anschließend wurde die Zellsuspension in zuvor mit 300μl 5%-FKS-PBS befüllte Falcon^® 5ml-Rundbodenröhrchen überführt und dann im BD FACSCalibur^TMSystem Durchflußzytometer analysiert.
1.5 Beladung von MHC-Klasse II Molekülen auf der Oberfläche von Zellen
Die katalytischen Eigenschaften gefundener Substanzen auf die Beladung zellständiger MHC-Klasse II Moleküle wurde in Zellbeladungsexperimenten ermittelt. Dazu wurden 50.000-100.000 Zellen in 50μl DMEM mit 50μl 24μM HAbiot. gelöst in DMEM und 50μl Katalysatorlösung (verschiedene Konzentrationen gelöst in DMEM mit einem maximalen DMSO-Gehalt von 3%) vermischt und für 4h bei 37°C und 10%CO₂ inkubiert. Als Kontrollen wurden in mehreren Ansätzen Zellen nur mit 50μl Peptidlösung und 50μl DMEM versetzt. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Zellen bei 1300rpm für 5min abzentrifugiert und überstehendes Medium abgenommen. Die Zellpellets wurden dann durch kurzes Vortexen der Platte angelöst, in 100μl/Vertiefung 5%-FKS-PBS resuspendiert und erneut bei 1300rpm für 5min zentrifugiert. Nach Abnahme des Überstands wurden die Zellpellets erneut angelöst und in 50μl/Vertiefung Streptavidin-Phycoerythrinlösung (SA-PE-Stammlösung(1 mg/ml verdünnt 1:200 mit 2%FKS-PBS) aufgenommen. Die Färbung erfolgte für 30min bei 4°C unter Lichtausschluss um übermäßigen Zerfall der Fluoreszenzfarbstoffe zu vermeiden. Die gefärbten Zellen wurden daraufhin noch einmal wie bereits beschrieben abzentrifugiert mit 2%-FKS-PBS gewaschen und in 100μl/Vertiefung 2%FKS-PBS aufgenommen und in zuvor mit 300μl 2%-FKS-PBS befüllte Falcon^® 5ml-Rundbodenröhrchen überführt. Anschliessend wurden die Zellen im Durchflusszytometer analysiert. Die Expression von MHC-Molekülen auf der Oberfläche der Zellen wurde in Kontrollansätzen durch Färbung mit α-HLA-DR-Antikörper (markiert mit PE, Stammlösung (1 mg/ml) 1:75 verdünnt mit 2%-FKS-PBS) bzw. als Isotypenkontrolle mit IgG2a-Maus-Antikörper (markiert mit PE, Stammlösung (1 mg/ml) verdünnt 1:75 mit 2% FKS-PBS) statt mit SA-PE (Streptavidin-PE) überprüft.
1.6 Durchflusszytometrie
Die Durchflusszytometrischen Analysen wurden auf einem BD FACSCalibur^TMSystem von Becton Dickinson durchgeführt. Zur Färbung wurden Phycoerythrin markiertes Streptavidin (CALTAG Laboratories), α-HLA-DR Antikörper und IgG2a-Maus-Antikörper (BD-Biosciences) beide markiert mit Phycoerythrin sowie Propidiumiodid (Sigma-Aldrich-GmbH) verwendet. Alle weiteren zur Messung nötigen Materialien wurden von BD Biosciences, Bedford, USA bezogen.
1.7 Analyse der Substanz-Bibliothek
Zur Identifikation neuer Substanzen oder Substanzklassen, die in der Lage sind, die Wechselwirkungen zwischen MHC-Klasse II Molekülen und deren Liganden, ähnlich wie HLA-DM jedoch bei physiologischen pH-Werten, zu beeinflussen, wurde eine 20.000-Komponenten-Kleinmolekül-Bibliothek (Chemical Diversity Labs, Inc.) mit Hilfe eines Hochdurchsatzanalyseverfahrens auf Verbindungen hin untersucht, die die Beladung leerer, löslicher HLA-DR1-Komplexe mit hoher Effizienz katalysieren. Als Referenzsubstanz wurde 1,2-Dichlor-4,5- Dihydroxybenzol/Dichlorcatechol (s. z.B. 9) verwendet, eine Substanz, die bei geringen Konzentrationen noch Aktivität zeigte.
1.8.1 Hochdurchsatz Analyse der 20.000 Komponenten Bibliothek
Die Analyse der in 384-well-Platten vorliegenden Bibliothek erfolgte mit Hilfe eines Quadra-384 Pipettier-Roboters. Da auf den Bibliotheksplatten alle Vertiefungen mit Substanz gefüllt waren, wurde als Kontrolle eine Extraplatte angelegt, die hauptsächlich mit DMSO und in einigen Vertiefungen mit pCP und 1,2-Dichlor-4,5-Dihydroxybenzol/Dichlorcatechol (s. z.B. 9) in unterschiedlichen Konzentrationen befüllt war. Diese Kontrollplatte wurde dann parallel zu den eigentlichen Bibliotheksplatten in die Analyse nach aktiven Substanzen eingeschlossen. Die Analyse der Bibliothek beruht auf einem oben beschriebenen Hochdurchsatz-Analyseverfahren. Die meisten Substanzen liegen hierbei in einem relativ engen Bereich, während einzelne Substanzen über diese Hintergrundbeladung hinausragen. Der Vergleich mit den für die Kontrollplatte erzielten Werte lieferte einen Schwellenwert von 15.000 gezählten Ereignissen, da dieser Wert von 1,2-Dichlor-4,5-Dihydroxybenzol/Dichlorcatechol (s. z.B. 9) bei einer Endkonzentration von 0,4mM (entspricht in etwa der Konzentration der aus der Bibliothek eingesetzten Verbindungen) erreicht wird. Alle Substanzen die eine höhere Beladung katalysieren konnten wurden als katalytisch aktiver als 1,2-Dichlor-4,5-Dihydroxybenzol/Dichlorcatechol (s. z.B. 9) eingestuft und in nachfolgenden Experimenten weiter untersucht.
1.8.2 Validierung der in der Bibliothek identifizierten Verbindungen
Die aus der Analyse der Bibliothek gewonnenen Ergebnisse wurden zunächst für alle als katalytisch aktiv bewerteten Substanzen bestätigt. Zur Erweiterung der mit diesem Experiment erzielten Ergebnisse wurden die Katalysatoren dabei titriert und in den Verdünnungsstufen 1:10, 1:50 und 1:300 eingesetzt. Als Referenz dienten 1,2-Dichlor-4,5-Dihydroxybenzol/Dichlorcatechol (s. z.B. 9) und DMSO. Als Maßstab wurde festgelegt, dass alle Verbindungen als positiv bewertet werden, die in der ersten Stufe ein wesentlich stärkeres Signal als 1,2-Dichlor-4,5-Dihydroxybenzol/Dichlorcatechol (s. z.B. 9) lieferten und danach abfielen, oder über den Verlauf der drei Verdünnungen eine mindestens ebenso hohe oder höhere Beladung katalysierten.
Die Untersuchungen ermittelten Substanzen, deren katalytische Aktivität als entweder ebenso hoch wie die von 1,2-Dichlor-4,5-Dihydroxybenzol/Dichlorcatechol (s. z.B. 9), oder sogar als höher eingestuft wurde. Die Strukturformeln der so beispielhaft ermittelten Verbindungen sind in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1: Strukturformeln von beispielhaften, aus der Bibliothek identifizierten Katalysatoren. Die Graphiken wurden mit Hilfe des Programms ISIS^TM/Draw2.4 (MDL Information Systems, Inc., USA) erstellt. Die angegebenen IUPAC-Bezeichnungen wurden durch das beigefügte Plugln AutoNom Standard ermittelt.
Um das System der Analyse zu überprüfen, wurden die bestimmten Verbindungen der Formeln I, II, III und IV1 bis IV3 in einem HLA-DR1-Beladungsansatz auf ihre Aktivität hin untersucht. In Tabelle 2 sind die zu Adamantanethanol (I1) homologen Verbindungen, von denen auch die Position in der Bibliothek ermittelt werden konnte, abgebildet.. Wie sich zeigt, treten Unterschiede in der Aktivität auf. Dabei spielt offensichtlich vor allem die Ladung der Substituenten eine Rolle, da die Säureamid substituierte Form des Adamantan (I2) erneut erhöhte katalytische Aktivität aufweist. Die leicht verminderte Aktivität von Verbindung I3 könnte auf sterische Effekte zurückzuführen sein. Daher ist offensichtlich die Adamantylstruktur entscheidend für die katalytische Aktivität, während der Seitenkette modulierende Eigenschaften zugesprochen werden können.
Tabelle 2: Analyse homologer Verbindungen am Beispiel von Adamantanethanol. Strukturformeln des durch die Analyse identifizierten Katalysators Adamantanethanol und sechs homologer, in der Bibliothek enthaltenen Verbindungen.
1.8.3 Additive Effekte
Die Beobachtung, dass die identifizierten Verbindungen der Formeln I, II, III oder IV1 bis IV3 sich unterschiedlich auf die einzelnen allelischen Varianten auswirken, könnte den Rückschluss erlauben, dass die getesteten Verbindungen verschiedene katalytische Zentren auf dem MHC-Komplex angreifen. Für diese Annahme könnte auch die große strukturelle Diversität der gefundenen Substanzen sprechen. Sollte dies tatsächlich zutreffen, so könnte sich die Wirkung der einzelnen Katalysatoren bei gemeinsamer Inkubation addieren, bzw. sogar potenzieren. Deshalb wurde folgendes Experiment durchgeführt. In einem Ansatz zur Beladung von HLA-DR1 mit HA-biot. wurde je ein Katalysator in der fixen Konzentration von 0,05mM vorgelegt. Pro Ansatz wurde dann dieselbe Konzentration an einem zweiten Katalysator zugegeben. Als Kontrollen wurde einmal 1%DMSO addiert und als Negativkontrolle wurde eine Reaktion mit zweimal 1%-DMSO angesetzt. Die Reaktionen wurden dann wie bereits beschrieben für 40min inkubiert und die Beladung in einem Sandwich-ELISA gemessen.
Im Ergebnis ergibt sich in diesem Versuch eine relative Erhöhung der Beladung um ca. 10%(+DMSO). Verdoppelt man die Menge an 2-HBP (+2-HBP) erhöht sich dieser Wert erwartungsgemäß, da, wie bereits gezeigt wurde, der Effekt konzentrationsabhängig ist. Die Zugabe von 0,05mM AdaEtOH steigert die Beladung allerdings bis auf fast 50% und deutet damit eine drastische Verstärkung des katalytischen Effekts an.
2. Versuche auf zellulärer Ebene
2.1 Analyse der Wirkung auf MHC exprimierende Zellen
Für den Nachweis einer möglichen physiologischen Relevanz solcher Verbindungen wurde die Aktivität der zuvor identifizierten Verbindungen auf Zellen analysiert.. Dafür wurde im Folgenden der Einfluss von AdaEtOH, DPHIA und 4-HBP auf MHC-Klasse II exprimierende Zelllinien untersucht.
2.1.1 Toxizität
Neben der Anforderung, dass die in der Bibliothek identifizierten Substanzen eine erhöhte katalytische Aktivität aufweisen sollten, wurde als zweites Kriterium zur Beurteilung eine verminderte oder äquivalente Toxizität verglichen mit pCP gefordert. Für AdaEtOH wurde zwar eine toxische Wirkung gezeigt, jedoch zeigt AdaEtOH im ELISA eine wesentlich größere katalytische Aktivität. Das bedeutet, dass es eventuell in Konzentrationen eingesetzt werden könnte, die um einen so großen Faktor erniedrigt sind, dass toxische Effekte ausgeschlossen werden können. Der Einsatz von Konzentrationen an AdaEtOH im unteren μM-Bereich, wie er im ELISA nachgewiesen werden konnte, würde dafür geeignete Voraussetzungen bieten. Das gleiche gilt auch für DPHIA, das sogar noch geringere toxische Effekte als AdaEtOH oder 4-HBP aufweist und im ELISA ähnlich gute Ergebnisse lieferte wie AdaEtOH.
2.1.2 Beladung membranständiger MHC-Komplexe
Aufgrund der aus den vorhergehenden Experimenten erhaltenen Ergebnisse, wurden im folgenden Zellbeladungsexperimente mit L57.23 (HLA-DR1, DRB1*0101) und L243.6 Zellen (HLA-DR4, DRB1*0401) angesetzt. Dabei wurde die Beladung der Zellen mit 8μM HA-biot. durch AdaEtOH, DPHIA, und 1,2-Dichlor-4,5-Dihydroxybenzol/Dichlorcatechol (s. z.B. 9) in den Konzentrationen 0,1 mM, 0,05mM und 0,025mM katalysiert. Als Kontrolle wurde die Beladung mit pCP in den Konzentrationen 1 mM, 0,5mM und 0,25mM verwendet. Zur Einstellung des Systems wurde wiederum die Expression der MHC-Komplexe auf der Zelloberfläche gemessen. Das Ergebnis der Beladungen für pCP und AdaEtOH ergibt, dass AdaEtOH eine fast ebenso hohe Beladung der membranständigen HLA-DR1-Komplexe im Vergleich zu pCP bei zehnfach niedrigeren Konzentrationen katalysiert. Die Beladung von HLA-DR4-Komplexen ergibt sogar eine erhöhte Beladung im Vergleich zu pCP bei einem Zehntel der Konzentration. Damit konnte sowohl in vitro, als auch in vivo eine drastische Verbesserung der katalytischen Aktivität im Vergleich zu pCP erzielt werden.
3. Vergleichsversuche
3.1 Katalyse der Beladung löslicher HLA-DR1 Moleküle durch Adamantylverbindungen
Im vorliegenden Experiment wurden p-Chlorphenol (pCP), 2-(1-Adamantyl)-Ethanol (AdEtOH) und 3-(1-Adamantyl)-5-Carbohydrazidpyrazol (AdCaPy) zur Katalyse der Beladung von leeren löslichen HLA-DR1 Molekülen mit dem HA306-318 Peptid eingesetzt. Die Reaktionen wurden in Anwesenheit von 250 μM pCP, AdEtOH oder AdCaPy durchgeführt. Die erhaltene Beladung wurde anschließend unter Verwendung von biotinyliertem Peptid im ELISA bestimmt (siehe 1). Wie aus 1 deutlich hervorgeht, sind alle drei Katalysatoren grundsätzlich in der Lage, die Reaktion zu beschleunigen. Verglichen mit der pCP Kurve sind die entsprechenden Kurven der Adamantylverbindungen jedoch um mehr als eine Zehnerpotenz nach links verschoben, d.h. sie sind mindestens 10-fach aktiver als pCP.
3.2 Katalyse der Beladung von HLA-DR Molekülen auf der Zelloberfläche
Im vorliegenden Versuch wurde die Katalyse der Beladung von HLA-DR Molekülen auf der Zelloberfläche untersucht und Dosis-Wirkungskurven zur Beladung von Fibroblastenzellen mit dem HA306-318 Peptid erstellt. Die Zellen wurden dafür 4 h mit dem Peptid sowie mit titrierten Mengen an pCP, AdEtOH oder AdCaPy bei 37°C in Kulturmedium inkubiert. Durch Verwendung eines biotinylierten Peptides konnte anschließend nach Färbung der Zellen mit fluoreszierendem Streptavidin die Menge an gebundenem Peptid L243.6, welche HLA-DR1 (RB1*0101) bzw HLA-DR4 (DRB1*0401) exprimieren, zwei MHC Klasse II Moleküle, welche das HLA306-318 Peptid präsentieren können. Das Fehlen jeglicher Färbung der L929 Zellen zeigt an, dass alle Katalysatoren selektiv die Bindung an die Oberflächen-MHC-Moleküle verstärken. Ein Vergleich der Dosis-Wirkungskurven bestätigt dabei das Ergebnis mit den löslichen MHC-Molekülen (siehe auch 1). Auch hier erweisen sich die getesteten Adamantylverbindungen wesentlich aktiver als pCP und beschleunigen die Beladung der Zellen bereits bei einer Konzentration von deutlich weniger als einem Zehntel der entsprechenden pCP Konzentration.
3.3 Verstärkung der T-Zellantwort durch die Katalyse der Beladung von HLA-exprimierenden Zellen.
Im vorliegende Vergleichsversuch wurde die Verstärkung der T-Zellantwort durch die Katalyse der Beladung von HLA-exprimierenden Zellen untersucht. Dafür wurden die Dosis-Wirkungskurven der Immunantwort von zwei verschiedenen HLA-DR1-restringierten T-Zellen erstellt und dafür HLA-DR-exprimierende 721.221 Zellen wie im Vergleichsversuch 3.2 beschrieben, für 4 h mit titrierten Mengen an pCP, AdEtOH oder AdCaPY inkubiert. Als Peptidantigen wurde dabei entweder HA306-318 (siehe auch 3, linkes Feld) oder CO260-273 (siehe auch 3, rechtes Feld) verwendet. Nach der Beladung wurden die Zellen gewaschen und dazu verwendet, EvHA/X5 bzw hCII 19.3 Zellen zu stimulieren. In beiden Fällen wird die Immunantwort der T-Zellen durch die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Verbindungen AdEtOH oder AdCaPY deutlich verstärkt. Der Vergleich der Dosiswirkungen ergibt damit, dass ebenfalls bezüglich der T-Zellantwort die Adamantylverbindungen etwa 10-1000-fach effektiver sind als pCP.
3.4 Allelspezifische Wirkung der Katalyse durch Adamantylverbindungen
Zur Untersuchung der allelspezifischen Wirkung der Katalyse durch Adamantylverbindungen wurden HLA-DR4 (DRB1*0401) und HLADR2 (DRB1*1501)-exprimierende Zellen unter Anwesenheit der Katalysatoren mit HA306-318 bzw. MPB86-100 beladen und anschließend im T-Zellassay eingesetzt. Zur Auswertung wurden Dosis-Wirkungskurven einer HLA-DR4- (4, linkes Feld) und einer HLA-DR2-restringierten T-Zellantwort (4, rechtes Feld) erstellt. Während die Dosis-Wirkungskurven der HLA-DR4-restringierten 8475/94 T-Zellen denen der zuvor in Vergleichsexperiment 3.3 beschriebenen HL-DR1-restringierten T-Zellen entspricht, ist bei den Kurven der HLA-DR2 restringierten 08073 T-Zellen ein deutlicher Unterschied zu erkennen. Im Gegensatz zu pCP, das auf allen untersuchten HLA-DR Molekülen verstärkend wirken kann, wirken die Adamantylverbindungen offensichtlich allelspezifisch.
3.5 Untersuchung der Ursachen der Allelspezifischen Wirkung
Die allelspezifische Wirkung der Adamantylverbindungen beruht offensichtlich auf der Interaktion mit der ,tiefen' P1 Tasche. Da die allelspezifische Wirkung der Adamantylverbindungen offensichtlich mit einem Dimorphismus an der Position 86 der HLA-DR β-Kette korreliert, wurde zur Untersuchung dieser Annahme und eine entsprechende Mutation im HLA-DR2 (DRB1*1501) Molekül durchgeführt und anschließend in Fibroblastenzellen exprimiert. Die Ergebnisse sind in 5 dargestellt. 5 zeigt einen Vergleich der Dosis-Wirkungskurven der Katalyse der Bindung von MBP86-100 an das HLA-DR2 Wildtyp Molekül (siehe Figur, linke Abb.) und an das mutierte HLA-DR2 Molekül, bei dem der Valinrest an der Position 86 durch Glycin ersetzt wurde (siehe Figur, rechte Abb.). Während Adamantanethanol am nicht-mutierten HLA-DR2 Molekül der Fibroblastenzellen keine Katalyse bewirken kann wie an den in 4 beschriebenen MGAR Zellen, bewirkt die V-7G Substitution, dass das mutierte HLA-DR2 Molekül wieder für die Adamantylvermittelte Katalyse empfänglich wird. Da bekannt ist, dass der Glycin Valin-Dimorphismus die Tiefe der Bindungstasche P1 bestimmt, wobei 86G mit einer tiefen Tasche korreliert, vermitteln Adamantylverbindungen demnach ihre katalytische Aktivität offensichtlich durch ihre Bindung an eine tiefe P1 Tasche.
3.6 Katalyse einer HLA-DR1 (DRB1*O101)-restringierten T Zellantwort
Zur Untersuchung der Katalyse einer HLA-DR1 (DRB1*O101)-restringierten T Zellantwort durch verschiedene katalytisch aktive Adamantylverbindungen wurden Dosis-Wirkungskurven der Katalyse einer HLA-DR1 (DRB1*O101)-restringierten T Zellantwort erstellt. Das Experiment wurde analog zu Vergleichsexperiment 3.3 durchgeführt, wobei das Peptidantigen HA306-318 auf 721.221 Zellen geladen wurde, um damit EvHNX5 T Zellen zu stimulieren. Die Ergebnisse werden in 6 dargestellt. Die dargestellten Dosis- Wirkungskurven zeigen, dass alle aufgeführten Adamantylverbindungen eine katalytische Aktivität besitzen. Der z.T. sehr unterschiedliche chemische Charakter der Seitenketten legen den Schluss nahe, dass die Wirkung im wesentlichen durch die Adamantylgruppierung vermittelt wird. Da die Lage der Dosis-Wirkungskurven offensichtlich auch von der Seitenkette bestimmt wird, kann der Seitenkette eine modulierende Wirkung zugesprochen werden.
3.7 Beladung von MHC Klasse II Tetrameren mittels Adamantylverbindungen.
Im vorliegende Vergleichsversuch wurde die Beladung von MHC Klasse II Tetrameren mittels Adamantylverbindungen näher untersucht.. Dazu wurden folgende Tetramere eingesetzt: HA- Tetramere, HLA-DR1- Tetramere, die vom Hersteller (Proimmune Ltd.) bereits mit dem T Zellantigen HA306-318 beladen bezogen wurden und IC-Tetramere, welche das nichtrelevante Peptid IC106-120 tragen.

A) Um nachzuweisen, dass Adamantylverbindungen die Beladung von Tetrameren katalysieren können, wurden IC-Tetramere über Nacht mit AdEtOH und HA306-318 inkubiert. Als Kontrolle wurde zudem eine Beladung mit einen nicht-relevanten Peptid (ABL) durchgeführt. Nach Färbung der Zellen mit den Komplexen ergab die durchflußzytometrische Analyse, dass die PD2 T Zellen, welche mittels Adamantylethanol beladenen Tetrameren gefärbt wurden, ein ähnlich hohes Signal lieferten, wie die vorgefertigten HA.- Tetramere.
B) Um sicherzustellen, dass der Austausch des IC-Peptides durch das HA-Peptid tatsächlich auf die Katalyse durch das Adamantylethanol zurückzuführen ist, wurde in einem zweiten Experiment der Ligandenaustausch in Anwesenheit sowie in Abwesenheit des Adamantylethanols durchgeführt. Die dabei entstandenen Komplexe wurden ebenso wie das unbehandelte IC- Tetramer anschließend wieder zur Färbung der PD2 Zellen, sowie als Negativkontrolle zur Färbung von HLA-DR3-restringierten TT1272-1284 spezifischen A10 T Zellen verwendet. Wie aus dem Balkendiagramm in 7 ersichtlich ist, werden auch in diesem Experiment die HA306-318-spezifischen PD2 Zellen mit denen durch Adamantylethanol katalysierten Tetrameren gefärbt. Dagegen wird keine nennenswerte Färbung mit den Komplexen beobachtet, bei denen eine Beladung ohne Katalysator versucht wurde. Die mit Hilfe des Adamantylethanols entstandenen Komplexe weisen zudem die geforderte Antigenspezifität auf, da A 10 T Zellen im Gegensatz zu den PD2 nicht gefärbt werden.

Die Ergebnisse aus Vergleichsversuch 3.7 werden in 7 dargestellt. 7 zeigt die Ergebnisse durchflußzytometrischer Messungen von HLA-DR1-restringierten humanen T Zellen (PD2), welche mit fluoreszenzmarkierten peptidbeladenen HLA-DR1 Tetrameren gefärbt wurden.
3.8 Untersuchung von Verbindungen, die ebenfalls über die tiefe P1 Tasche wirken.
Neben den Adamantylverbindungen wurden nach den vorher beschriebenen Verfahren weitere Verbindungen identifiziert, welche die gleiche Allelspezifität aufweisen wie die Adamantylverbindungen, 2-(7,7-Dichlor-6-methylbicyclo[4.1.0]heptan-3-yl-propan-2-ol (#4230) und 6-Methoxybenzofuran-3(2H)-on-oxim (#3651). Trotz sehr unterschiedlicher chemischer Struktur weist dabei zumindest #4230 eine Raumstruktur auf, welche der der Adamantylgruppe sehr ähnlich ist. Bei diesen zusätzlich bestimmten Verbindungen wurde die Aktivität und Allelspezifität mit den HLA-DR1-restringierten HA306-318-spezifischen EvHA/X5 T Zellen und den HLA-DR2-restringierten MBP86-100 spezifischen 08073 T Zellen getestet. Auf HLA-DR1 weist #4230 eine katalytische Aktivität auf, welche ungefähr der des Adamantylethanols entspricht. #3651 ist dagegen schwächer, weist jedoch immer noch höhere Aktivität auf als das pCP. Auf HLA-DR2 weisen beide Verbindungen keine Aktivität auf, weshalb sie vermutlich, ähnlich wie die Adamantylverbindungen, ihre katalytische Wirkung durch die Bindung an die tiefe P1 Tasche vermitteln. Die Ergebnisse aus Vergleichsversuch 3.8 werden in 8 dargestellt.
3.9 Untersuchung der Aktivität verschiedener katalytisch aktiver Phenol-/Anilinverbindungen.
Im vorliegende Vergleichsversuch wurde die katalytische Aktivität der Beispielsubstanzen ist hier an der beschleunigten Beladung von löslichen HLA-DR1 Molekülen mit dem HA306-318 demonstriert. Ein Vergleich der Dosis-/Wirkungskurven zeigt, dass alle Verbindungen in einem sehr ähnlichen Wirkungsbereich liegen, wobei insbesondere DCC und pHDP leicht erhöhte Aktivität zeigen. Die Ergebnisse werden in 9 dargestellt.
3.10 Katalyse der HLA-DR Beladung
Im Folgenden wurde die Katalyse der HLA-Beladung durch pCP zum Vergleich bestimmt. Dazu wurden Dosis-Wirkungskurven des Adamantylethanol und des pCP mittels T Zellassays, wie in Vergleichsversuch 3.3 beschrieben, bestimmt. Diese Dosis-Wirkungskurven illustrieren die Wirkung der beiden Katalysatoren auf HLA-DR Molekülen mit tiefer oder flacher P1 Tasche {β86G bzw. β86V} sowie auf die Maus MHC Klasse II Moleküle H2-Ek und H2-Ak. Mit dem vorliegenden Versuch konnte gezeigt werden, dass die Katalyse der HLA-DR Bindung unabhängig von der Tiefe der P1 Tasche ist. Weiterhin zeigt pCP lediglich bei Maus MHC-Klasse II eine leicht bessere Wirkung, nicht jedoch bei humanem HLA-DR. Die Ergebnisse werden in 10 dargestellt.
3.11 Katalytische Aktivität von Thiophenverbindungen
Zur Untersuchung der katalytischen Aktivität von verschiedenen katalytisch aktiven Thiophenverbindungen wurde beispielhaft die Aktivität von drei Beispielverbindungen anhand der Dosis/Wirkungskurven der Stimulation HLA-DR1- restringierten EvHA/XS T Zellen bestimmt. Der Versuch wurde wie unter Vergleichsversuch 3.3 beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse sind in 11 dargestellt. Ähnlich wie bei den aktiven Phenol/Anilinverbindungen ist auch hier die Aktivität offensichtlich unabhängig vom b86-Dimorphismus der HAL-DR Moleküle. Wie in diesem Beispiel gezeigt, wird mit der Verbindung ATC deshalb die Peptidbeladung sowohl von von Fibroblasten katalysiert, welche entweder HLA-DR1 (DRB1*0101; b86G) oder auch HLA-DR2 (DRB1*1S01; b86V) exprimieren. Die Tiefe der P1 Tasche spielt demnach auch bei den Thiophenverbindungen offensichtlich keine Rolle. Die katalytische Aktivität der bislang identifizierten aktiven Verbindungen dieser Verbindungsklasse ist stärker als die des pCP.
4. Vorteile der Erfindung
Im Rahmen dieser Erfindung wurden Verfahren zur Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen mit Liganden unter Verwendung von Verbindungen der Formeln I, II, III und IV1 bis IV3 entwickelt, die im Vergleich zur Verwendung des bereits bekannten Katalysators pCP bspw. für Adamantanethanol (AdaEtOH), Dichlorophenylhydroxyiminoacetamid (DPHIA) und 4-Hydroxybiphenyl (4-HBP) bei Konzentrationen oberhalb von 0,025mM eine Erhöhung der Beladung katalysieren. Es im Rahmen dieser erfindungsgemäßen Verfahren ebenfalls möglich eine Verringerung der Beladung von MHC-Molekülen mit Liganden, gegebenenfalls bis zur vollständigen Entfernung, zu erreichen sowie alternativ einen Austausch von Liganden von MHC-Molekülen unter Verwendung der Verbindungen der Formeln I, II, III und IV1 bis IV3 zu erzielen. Die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Verbindungen der Formeln I, II, III und IV1 bis IV3 (Katalysatoren) führen zu einer Konformationsänderung der MHC-Moleküle von einer geschlossenen nicht-rezeptiven Konformation in eine offene rezeptive Konformation, die eine Beladung bzw. einen Austausch der Liganden der MHC-Moleküle erst ermöglicht. Im Vergleich zu pCP wurde mit Hilfe der erfindungsgemäß verwendeten Katalysatoren eine Verbesserung der zur Konformationsänderung benötigten Konzentration an katalytisch aktiven Verbindungen mindestens um den Faktor 10 erreicht. Damit erlauben die erfindungsgemäß verwendeten Katalysatoren höhere Wirksamkeiten, die den Einsatz solcher Verbindungen im Tierversuch ermöglichen.
Weiterhin wurden erstmals durch die im Rahmen dieser Erfindung verwendeten Verbindungen der Formeln I, II, III und IV1 bis IV3 effiziente Möglichkeiten zur Auslösung tumorspezifischer, pathogenspezifischer oder autoreaktiver Immunantworten bereitgestellt, sowie Möglichkeiten zur Behandlung von Erkrankungen oder Zuständen, die mit diversen pathologisch überschießenden oder unterbleibenden Immunantworten verknüpft sind. Weiterhin wird durch die Bereitstellung eines Vakzins oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung eine Behandlung von Krebs, Infektionskrankheiten, Autoimmunerkrankungen oder die Abschwächung von aggressiven Immunreaktionen ermöglicht.

Claims

Verfahren zur Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen mit Liganden, umfassend die folgende Schritte: a) Bereitstellung einer Zusammensetzung enthaltend MHC-Moleküle; und b) Zugabe eines Katalysators ausgewählt aus einer Verbindung der Formel I mit der folgenden Struktur:
wobei: R¹, R², R³, R⁴, R⁵ und R⁶ eine Bindung sein können oder gemeinsam oder unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus: H, O, S, N, OH, OR¹, SH, SO, SO₂, SO₃, HSO₃, SR¹, SR¹R², X, CX₃, CHX₂, CH₂X, CR¹X₂, CR₂ ¹X, CR₃ ¹, wobei X = Halogen, oder CN, CO, COOH, COOR¹, NH, NH₂, NHR¹, NR¹R², NO, NO₂, NOH, NOR¹, oder CH₃, (CH₂)_n, (CH₂)_nCH₃; (CH₂)_nR¹, OCH₃, O(CH₂)_n, O(CH₂)_nCH₃; O(CH₂)_nR¹, (CH₂)_nOH, wobei R¹ und R² wie hier definiert sind und n = 1-6, oder einem verzweigten oder unverzweigten. C₁-C₂₀-Alkyl, C₁-C₂₀-Alkenyl, C₁-C₂₀-Heteroalkyl, C₁-C₂₀-Heteroalkenyl, C₁-C₂₀-Alkoxy, C₁-C₂₀-Alkenoxy, C₁-C₂₀-Acyl, C₃-C₈-Cycloalkyl, C₃-C₈ Cycloalkenyl, C₅-C₂₀-Aryl, C₅-C₂₀-Heteroaryl, Arylalkyl, Arylalkenyl, C_5-20-Aryloxy, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkenyl, Heterocycloalkyl, Heterocycloalkenyl, Carboxamido-, Acylamino-, Amidino-, oder Heteroaryloxyrest; und wobei alle Alkyl, Alkenyl, Heteroalkyl, Heteroalkenyl, Alkoxy, Alkenoxy, Acyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Arylalkenyl, Aryloxy, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkenyl, Heterocycloalkyl, Heterocycloalkenyl, Carboxamido-, Acylamino-, Amidino- oder Heteroaryloxyreste substituiert sein können und 1 bis 10 H Atome mit einem OH, OR¹, SH, SO, SO₂, SO₃, HSO₃, SR¹, SR¹R², X, CX₃, CHX₂, CH₂X, CR¹X₂, CR₂ ¹X, CR₃ ¹, CN, CO, COOH, COOR¹, NH, NH₂, NHR¹, NR¹R², NO, NO₂, NOH, NOR¹, CH₃, (CH₂)_n, (CH₂)_nCH₃; (CH₂)_nR¹, OCH₃, O(CH₂)_n, O(CH₂)_nCH₃; O(CH₂)_nR¹, (CH₂)_nOH, oder einem niederen Alkyl-, Carboxy-, Carboalkoxy-, Carboxamido-, Cyano-, Carbonyl-, Alkylthio, Sulfoxid, Sulfon, Acylamino-, Amidino-, Phenyl-, Benzyl-, Heteroaryl-, Phenoxy-, Benzyloxy-, Heteroaryloxy-, oder einem substituierten Phenyl-, Benzyl-, Heteroaryl-, Phenoxy-, Benzyloxy-, oder einem Heteroaryloxyrest substituiert sein können; und c) Änderung des Beladungszustandes der MHC-Moleküle; und d) Isolierung der MHC-Moleküle, deren Beladungszustand verändert wurde.
Verfahren zur Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen mit Liganden, umfassend die folgende Schritte: a) Bereitstellung einer Zusammensetzung enthaltend MHC-Moleküle; und b) Zugabe eines Katalysators ausgewählt aus einer Verbindung der Formel II mit der folgenden Struktur:
wobei: R^1', R^2', R^3' und R^4' eine Bindung sein können oder gemeinsam oder unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus: H, O, S, N, OH, OR^1', SH, SO, SO₂, SO₃, HSO₃, SR^1', SR^1'R^2', X, CX₃, CHX₂, CH₂X, CR¹X₂, CR₂ ¹X, CR₃ ^1' wobei X = Halogen, oder CN, CO, COOH, COOR¹, NH, NH₂, NHR^1', NR^1'R^2', NO, NO₂, NOH, NOR^1', oder CH₃, (CH₂)_n, (CH₂)_nCH₃, (CH₂)_nR^1', OCH₃, O(CH₂)_n, O(CH₂)_nCH₃, O(CH₂)_nR^1', (CH₂)_nOH, wobei n = 1-6 und R^1' und R^2' wie hier definiert sind, oder einem verzweigten oder unverzweigten C₁-C₂₀-Alkyl, C₁-C₂₀-Alkenyl, C₁-C₂₀-Heteroalkyl, C₁-C₂₀-Heteroalkenyl, C₁-C₂₀-Alkoxy, C₁-C₂₀-Alkenoxy, C₁-C₂₀-Acyl, C₃-C₈-Cycloalkyl, C₃-C₈-Cycloalkenyl, C₅-C₂₀-Aryl, C₅-C₂₀-Heteroaryl, Arylalkyl, Arylalkenyl, C_5-20-Aryloxy, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkenyl, Heterocycloalkyl, Heterocycloalkenyl, Carboxamido-, Acylamino-, Amidino-, Adamantyl- oder Heteroaryloxyrest, oder R^1' und R^2' gemeinsam eine verbrückte Struktur ausbilden können, ausgewählt aus OR^1', SR^1', SR^1'R^2', CR^1'X₂, CR₂ ¹ ^'X, wobei X = Halogen, oder COOR^1', NHR^1', NR¹'R^2', NOR^1', oder (CH₂)_n, (CH₂)_nR^1', O(CH₂)_n, O(CH₂)_nR^1', wobei n = 1-6 und R^1' und R^2' wie hier definiert sind, oder einem verzweigten oder unverzweigten C₁-C₂₀-Alkyl, C₁-C₂₀-Alkenyl, C₁-C₂₀-Heteroalkyl, C₁-C₂₀-Heteroalkenyl, C₁-C₂₀-Alkoxy, C₁-C₂₀-Alkenoxy, C₁-C₂₀-Acyl, C₃-C₈-Cycloalkyl, C₃-C₈-Cycloalkenyl, C₅-C₂₀-Aryl, C₅-C₂₀-Heteroaryl, Arylalkyl, Arylalkenyl, C_5-20-Aryloxy, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkenyl, Heterocycloalkyl, Heterocycloalkenyl, Carboxamido-, Acylamino-, Amidino-, Adamantyl- oder Heteroaryloxyrest; und wobei alle Alkyl, Alkenyl, Heteroalkyl, Heteroalkenyl, Alkoxy, Alkenoxy, Acyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Arylalkenyl, Aryloxy, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkenyl, Heterocycloalkyl, Heterocycloalkenyl, Carboxamido-, Acylamino-, Amidino-, Adamantyl- oder Heteroaryloxyreste substituiert sein können und 1 bis 10 H Atome mit einem OH, OR^1', SH, SO, SO₂, SO₃, HSO₃, SR^1', SR^1'R^2', X, CX₃, CHX₂, CH₂X, CR^1'X₂, CR₂ ^1'X, CR₃ ^1', CN, CO, COOH, COOR^1', NH, NH₂, NHR^1', NR^1'R^2', NO, NO₂, NOH, NOR^1', CH₃, (CH₂)_n, (CH₂)_nCH₃; (CH₂)_n R^1', OCH₃, O(CH₂)_n, O(CH₂)_nCH₃; O(CH₂)_nR^1', (CH₂)_nOH, oder einem niederen Alkyl-, Carboxy-, Carboalkoxy-, Carboxamido- , Cyano-, Carbonyl-, Alkylthio, Sulfoxid, Sulfon, Acylamino-, Amidino-, Phenyl- , Benzyl-, Heteroaryl-, Phenoxy-, Benzyloxy-, Heteroaryloxy-, oder einem substituierten Phenyl-, Benzyl-, Heteroaryl-, Phenoxy-, Benzyloxy-, oder einem Heteroaryloxyrest substituiert sein können; und c) Änderung des Beladungszustandes der MHC-Moleküle; und d) Isolierung der MHC-Moleküle, deren Beladungszustand verändert wurde.
Verfahren zur Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen mit Liganden, umfassend die folgende Schritte: a) Bereitstellung einer Zusammensetzung enthaltend MHC-Moleküle; und b) Zugabe eines Katalysators ausgewählt aus einer Verbindung der Formel III mit der folgenden Struktur:
wobei: R^1''und R^2'' eine Bindung sein können oder gemeinsam oder unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus: H, O, S, N, OH, OR^1'', SH, SO, SO₂, SO₃, HSO₃, SR^1'', SR^1''R^2'', X, CX₃, CHX₂, CH₂X, CR^1''X₂, CR₂ ^1''X wobei X = Halogen, oder CN, CO, COOH, COUR^1'', NH, NH₂, NHR^1'', NR^1''R^2'', NO, NO₂, NOH, NOR^1'', CH₃, (CH₂)_n, (CH₂)_nCH₃, (CH₂)_nR^1'', OCH₃, O(CH₂)_n, O(CH₂)_nCH₃; O(CH₂)_nR^1'', (CH₂)_nOH, wobei n = 1-6 und R^1'' und R^2'' wie hier definiert sind, oder einem verzweigten oder unverzweigten C₁-C₂₀-Alkyl, C₁-C₂₀-Alkenyl, C₁-C₂₀-Heteroalkyl, C₁-C₂₀-Heteroalkenyl, C₁-C₂₀-Alkoxy, C₁-C₂₀-Alkenoxy, C₁-C₂₀-Acyl, C₃-C₈-Cycloalkyl, C₃-C₈- Cycloalkenyl, C₅-C₂₀-Aryl, C₅-C₂₀-Heteroaryl, Arylalkyl, Arylalkenyl, C_5-20-Aryloxy, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkenyl, Heterocycloalkyl, Heterocycloalkenyl, Carboxamido-, Acylamino-, Amidino-, Adamantyl- oder Heteroaryloxyrest, und R^3'' und R^4'' eine Bindung sein können oder gemeinsam oder unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus: H, O, S, N, SH, SO, SO₂, SO₃, HSO₃, SR^1'', SR^1''R^2'', Br, CX₃, CHX₂, CH₂X, CR^1''X₂, CR₂ ^1''X, CR₃ ^1'' wobei X = Halogen, oder CN, CO, COOH, COOR^1'', NH, NH₂, NHR^1'', NR^1''R^2'', NO, NO₂, NOH, NOR^1'', CH₃, (CH₂)_n, (CH₂)_nCH₃, (CH₂)_nR^1'', OCH₃, O(CH₂)_n, O(CH₂)_nCH₃; O(CH₂)_nR^1'', (CH₂)_nOH, wobei n = 1-6 und R^1'' und R^2'' wie oben definiert sind, oder einem verzweigten oder unverzweigten C₁-C₂₀-Alkyl, C₁-C₂₀-Alkenyl, C₁-C₂₀-Heteroalkyl, C₁-C₂₀-Heteroalkenyl, C₁-C₂₀-Alkoxy, C₁-C₂₀-Alkenoxy, C₁-C₂₀-Acyl, C₃-C₈-Cycloalkyl, C₃-C₈-Cycloalkenyl, C₅-C₂₀-Aryl, C₅-C₂₀-Heteroaryl, Arylalkyl, Arylalkenyl, C_5-20-Aryloxy, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkenyl, Heterocycloalkyl, Heterocycloalkenyl, Carboxamido-, Acylamino-, Amidino-, Adamantyl- oder Heteroaryloxyrest, oder R^3'' und R^4'' gemeinsam eine verbrückte Struktur ausbilden können, ausgewählt aus OR^1'', SR^1'', SR^1''R^2'', CR^1''X₂, CR₂ ^1''X, wobei X = Halogen, oder COOR^1'', O(CH₂)_nR^1'', NHR^1'', NR^1''R^2'', NOR^1'', (CH₂)_n, (CH₂)_nR^1'', O(CH₂)_n, O(CH₂)_nR^1'', wobei n = 1-6 und R^1'' und R^2'' wie oben definiert sind, oder einem verzweigten oder unverzweigten C₁-C₂₀-Alkyl, C₁-C₂₀-Alkenyl, C₁-C₂₀-Heteroalkyl, C₁-C₂₀-Heteroalkenyl, C₁-C₂₀-Alkoxy, C₁-C₂₀-Alkenoxy, C₁-C₂₀-Acyl, C₃-C₈-Cycloalkyl, C₃-C₈-Cycloalkenyl, C₅-C₂₀-Aryl, C₅-C₂₀-Heteroaryl, Arylalkyl, Arylalkenyl, C_5-20-Aryloxy, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkenyl, Heterocycloalkyl, Heterocycloalkenyl, Carboxamido-, Acylamino-, Amidino-, Adamantyl- oder Heteroaryloxyrest; und wobei alle Alkyl, Alkenyl, Heteroalkyl, Heteroalkenyl, Alkoxy, Alkenoxy, Acyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Arylalkenyl, Aryloxy, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkenyl, Heterocycloalkyl, Heterocycloalkenyl, Carboxamido-, Acylamino-, Amidino-, Adamantyl- oder Heteroaryloxyreste substituiert sein können und 1 bis 10 H Atome mit einem SH, SO, SO₂, SO₃, HSO₃, SR^1'', SR^1''R^2'', Br, CX₃, CHX₂, CH₂X, CR^1''X₂, CR₂ ^2''X, CR₃ ^1''CN, CO, COOH, COOR^1'', NH, NH₂, NHR^1'', NR^1''R^2'', NO, NO₂, NOH, NOR^1'', CH₃, (CH₂)_n, (CH₂)_nCH₃; (CH₂)_nR^1'', OCH₃, O(CH₂)_n, O(CH₂)_nCH₃; O(CH₂)_nR^1'', (CH₂)_nOH, einem niederen Alkyl-, Carboxy-, Carboalkoxy-, Carboxamido-, Cyano-, Carbonyl-, Alkylthio, Sulfoxid, Sulfon, Acylamino-, Amidino-, Phenyl-, Benzyl-, Heteroaryl-, Phenoxy-, Benzyloxy-, Heteroaryloxy-, oder einem substituierten Phenyl-, Benzyl-, Heteroaryl-, Phenoxy-, Benzyloxy-, oder einem Heteroaryloxyrest substituiert sein können; und c) Änderung des Beladungszustandes der MHC-Moleküle; und d) Isolierung der MHC-Moleküle, deren Beladungszustand verändert wurde.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R¹, R², R³, R⁴, R⁵ und R⁶ können gemeinsam oder unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden bestehend aus: H, O, S, N, OH, OR¹, SH, SO, SO₂, SO₃, HSO₃, SR¹, SR¹R², X, CX₃, CHX₂, CH₂X, CR¹X₂, CR₂ ¹X, CR₃ ¹, X = Halogen, oder CN, CO, COOH, COOR¹, NH, NH₂, NHR¹, NR¹R², NO, NO₂, NOH, NOR¹, CH₃, (CH₂)_n, (CH₂)_nCH₃, (CH₂)_nR¹, OCH₃, O(CH₂)_n, O(CH₂)_nCH₃, O(CH₂)_nR¹, (CH₂)_nOH, Adamantyl, CH(OH)CH₃, C₆H₄SO₂NH, (CNNHC(CONHNH₂)CH₂); oder C₆H₄(NHCOCH₃), wobei n = 1-6 und alle X, R¹, R², R³, R⁴, R⁵ und R⁶ wie oben definiert sind.
Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung der Formel I aus einer der folgenden Strukturen ausgewählt wird:
Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass R^1', R^2', R^3' oder R^4' können eine Bindung sein oder gemeinsam oder unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus: H, O, S, N, OH, OR^1', SH, SO, SO₂, SO₃, HSO₃, SR^1', SR^1'R^2', X, CX₃, CHX₂, CH₂X, CR^1'X₂, CR₂ ^1'X, CR₃ ^1', wobei X = Halogen, oder CN, CO, COOH, COOR^1', NH, NH₂, NHR^1', NR^1'R^2', NO, NO₂, NOH, NOR^1', CH₃, (CH₂)_n, (CH₂)_nCH₃, (CH₂)_nR^1', OCH₃, O(CH₂)_n, O(CH₂)_nCH₃, O(CH₂)_n R^1', (CH₂)_nOH, Adamantyl, COOC₂H₅, oder (CNOC(COOCH₃)CH), und/oder R^1', R^2' können gemeinsam eine verbrückte Struktur ausbilden, ausgewählt aus OR^1', SR^1', SR^1'R^2', CR^1'X₂, CR₂ ^1'X, CR₃ ^1', wobei X = Halogen, oder COOR^1', oder NHR^1', NR^1'R^2', NOR^1', (CH₂)_n, (CH₂)_nR^1', O(CH₂)_n, O(CH₂)_nR^1', C₅H₁₀, C₅H₉(CH₃); C₅H₉(NOH), wobei n = 1-6 und alle X, R^1', R^2', R^3' und R^4' wie oben definiert sind.
Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung der Formel II aus einer der folgenden Strukturen ausgewählt wird:
Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass R^1'' und R^2'' können eine Bindung sein oder gemeinsam oder unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus: H, O, S, N, OH, OR^1'', SH, SO, SO₂, SO₃, HSO₃, SR^1'', SR^1''R^2'', X, CX₃, CHX₂, CH₂X, CR^1''X₂, CR₂ ^1''X, CR₃ ^1'', wobei X = Halogen, oder CN, CO, COOH, COOR^1'', NH, NH₂, NHR^1'', NR^1''R^2'', NO, NO₂, NOH, NOR^1'', CH₃, (CH₂)_n, (CH₂)_nCH₃, (CH₂)_nR^1'', OCH₃, O(CH₂)_n, O(CH₂)_nCH₃; O(CH₂)_nR^1'', (CH₂)_nOH, Adamantyl, und R^3'' und R^4'' können eine Bindung sein oder gemeinsam oder unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus: H, O, S, N, SH, SO, SO₂, SO₃, HSO₃, SR^1'', SR^1''R^2'', Br, CX₃, CHX₂, CH₂X, CR^1''X₂, CR₂ ^1''X, CR₃ ^1'', wobei X = Halogen, oder CN, CO, COOH, COOR^1'', NH, NH₂, NHR^1'', NR^1''R^2'', NO, NO₂, NOH, NOR^1'', CH₃, (CH₂)_n, (CH₂)_nCH₃, (CH₂)_nR^1'', OCH₃, O(CH₂)_n, O(CH₂)_nCH₃; O(CH₂)_nR^1'', (CH₂)_nOH, Adamantyl, C₆H₁₀OH, SO₂CF₃, S(CCH(CH₃)N(OH)NC(CH₃)), (CNONC)NHCH₂(N₄CH), NHC(O)(C₄H₂O(CH₃)), CH₂(C₂N₂H₅(CO)₂), SCFCF₃COOCH₃, SCH₂(C₂NSH(NH₂)) C₃N₂H₃, C(CH₃)C(O)NHC(O)CH₂, C(CH₃)CH₂NHC(O)S, C₆H₅, NHC(O)CHNOH, S(CH₂)₂(C₅H₄N), CHC(CN)(COOCH₃), C₃H₄N, S(C(CH₃)NHNC(CH₃)), NH(C₆H₃N₂O), C₆H₄S(O)₂NH, C₆H₄NHC(O)CH₃, oder NHC(O)CHNOH; oder R^3'' und R^4'' können gemeinsam eine verbrückte Struktur ausbilden, ausgewählt aus OR^1'', SR^1'', SR^1''R^2'', CR^1''X₂, CR₂ ^2''X, CR₃ ^1'', wobei X = Halogen, oder COOR^1'', NHR^1'', NR^1''R^2'', NOR^1'', (CH₂)_n, (CH₂)_nR^1'', O(CH₂)_n, O(CH₂)_nR^1'', (NHCHC)(C₃NOH)COOCH₃, (OCH₂CH(CF₃)S(O)₂) (OCH₂C(NOH)), (C(O)N(CH₂)₂(C₆H₉))C(O)), (OC(S)S), (O(CH₂)₂C(NOH)), (OC(O)CHC(CH₂COOH)), oder (NCHC(COOC₂H₅)C(OH)); wobei n = 1-6 und alle X, R^1'', R^2'', R^3'' und R^4'' wie zuvor definiert sind.
Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung der Formel III aus einer der folgenden Strukturen ausgewählt wird:
Verfahren zur Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen mit Liganden umfassend die folgende Schritte: a) Bereitstellung einer Zusammensetzung enthaltend MHC-Moleküle; und b) Zugabe eines Katalysators ausgewählt aus einer Verbindung der Formeln IV1 bis IV3:
c) Änderung des Beladungszustandes der MHC-Moleküle; und d) Isolierung der MHC-Moleküle, deren Beladungszustand verändert wurde.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte (a) und (b) austauschbar sind).
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-11, dadurch gekennzeichnet, dass die MHC Moleküle MHC Klasse I oder II-Moleküle sind.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-12, dadurch gekennzeichnet, dass die MHC Moleküle mit Liganden beladen oder unbeladen sind.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-13, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand ausgewählt wird aus Antigenen, insbesondere tumor- oder pathogenspezifischen Antigenen, gewebsspezifischen Selbstantigenen, Peptidantigenen und Fragmenten solcher Peptidantigene, vollständigen Proteinen, Proteingemischen und/oder komplexen Proteingemischen.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-14, dadurch gekennzeichnet, dass die Änderung des Beladungszustandes der MHC-Moleküle in Schritt (c) zu einer Beladung von nicht beladenen MHC-Molekülen mit Liganden führt.
Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Beladung der MHC-Moleküle in Schritt (c) durch Zugabe von potentiellen Liganden von MHC-Molekülen erfolgt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-14, dadurch gekennzeichnet, dass die Änderung des Beladungszustandes der MHC-Moleküle in einem alternativen Schritt (c') zu einem Austausch von Liganden von beladenen MHC-Molekülen gegen andere Liganden führt.
Verfahren gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Austausch von Liganden von mit Liganden beladenen MHC-Molekülen in dem alternativen Schritt (c') folgende Schritte umfasst: (i) Verringerung der Beladung von mit Liganden beladenen MHC-Molekülen; (ii) Zugabe von anderen Liganden von MHC-Molekülen.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15-18, dadurch gekennzeichnet, dass zur Auslösung tumorspezifischer, pathogenspezifischer oder autoreaktiver Immunantworten eine Erhöhung der Beladung der MHC-Moleküle mit antigenischen Liganden erfolgt.
Verfahren gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass zur Auslösung der Immunantworten eine Beladung von antigenpräsentierenden Zellen (APC) erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die antigenpräsentierenden Zellen ausgewählt werden aus körpereigenen oder nicht-körpereigenen maturierten und nichtmaturierten dendritischen Zellen, B-Zellen oder Makrophagen.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-14, dadurch gekennzeichnet, dass die Änderung des Beladungszustandes der MHC-Moleküle in einem alternativen Schritt (c'') zu einer Verringerung der Beladung von mit Liganden beladenen MHC-Molekülen führt.
Verfahren gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Verringerung der Beladung von mit Liganden beladenen MHC-Molekülen in Schritt (c'') durch einen Waschschritt erfolgt.
Verfahren gemäß Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Verringerung der Beladung von mit Liganden beladenen MHC-Molekülen in Schritt (c'') zu einer vollständigen Entfernung der Liganden führt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 22-24, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verringerung der Beladung von mit Antigenen beladenen MHC-Molekülen zur Abschwächung von aggressiven Immunreaktionen erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-25, dadurch gekennzeichnet, dass die Änderung des Beladungszustandes von MHC-Molekülen an einer Bindungstasche eines MHC-Moleküls vorgenommen wird.
Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindungstasche eine Bindungstasche eines MHC I-Moleküls ist.
Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Peptidbindungstasche eines MHC I-Moleküls ausgewählt wird aus den Peptidbindungstaschen A, B, C, D, E oder F.
Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Peptidbindungstasche eine Peptidbindungstasche eines MHC II-Moleküls ist.
Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Peptidbindungstasche eines MHC II-Moleküls ausgewählt wird aus den Peptidbindungstaschen P1, P3, P4, P6, P7 und P9.
Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindungstasche die Bindungstasche P1 ist.
Screeningverfahren zur Suche und Identifizierung von neuen Antigenen, zum Nachweis spezifischer zytotoxischer T-Zellen oder zum Monitoring einer spezifischen T-Zell-Antwort umfassend die folgende Schritte: a) Bereitstellung einer Zusammensetzung enthaltend MHC-Moleküle, deren Beladungszustand mit Liganden nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-31 verändert wurde; und b) Bestimmung der Wechselwirkung dieser MHC-Moleküle, deren Beladungszustand mit Liganden nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-31 verändert wurde, mit einem physiologischen Bindungspartner der MHC-Moleküle mit Hilfe eines biochemischen oder biophysikalischen Nachweisverfahrens; und
Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet dass das Screeningverfahren in vitro T-Zell Assays, Proliferationsassays, ELISPOTS, ELISA-Verfahren, Chromium-Release-Assays und High-Throughput Screeningverfahren (HTS) mit umfasst.
MHC-Molekül, erhältlich nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-31.
Verwendung eines ligandenbeladenen MHC-Moleküls gemäß Anspruch 34 zur Herstellung von Vakzinen, bevorzugt von Peptidvakzinen.
Verwendung eines ligandenbeladenen MHC-Moleküls gemäß Anspruch 34 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Auslösung tumorspezifischer, pathogenspezifischer oder autoreaktiver Immunantworten.
Verwendung eines ligandenbeladenen MHC-Moleküls gemäß Anspruch 34 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs, Infektionskrankheiten oder von Autoimmunkrankheiten.
Verwendung gemäß Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass der Krebs ausgewählt wird aus Kolonkarzinomen, Melanomen, Nierenkarzinomen, Lymphomen Akute myeloide Leukämie (AML), Akute Lymphoie Leukämie (ALL), chronische myeloide Leukämie (CML), chronische lymphozytische Leukämie (CLL), Gastrointestinale Tumoren, Lungenkarzinome, Gliome, Schilddrüsentumoren, Mammakarzinome, Prostatatumore, Hepatome, diverse virus-induzierte Tumoren wie z.B. Papillomvirus-induzierte Karzinome (z.B. Cervixkarzinom), Adenokarzinome, Herpesviren-induzierte Tumore (z.B. Burkitt's Lymphom, EBV-induziertes B Zelllymphom), Hepatitis B-induzuierte Tumore (Hepatozellkarzinome), HTLV-1 und HTLV-2 induzierte Lymphome, Akustikusneurinom, Gebärmuttehalskrebs, Lungenkrebs, Rachenkrebs, Analkarzinom, Glioblastom, Lymphome, Rektumkarzinom, Astrozytom, Hirntumore, Magenkrebs, Retinoblastom, Basaliom, Hirnmetastasen, Medulloblastome, Scheidenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Hodenkrebs, Melanom, Schilddrüsenkarzinom, Blasenkrebs, Hodgkin-Syndrom, Meningeome, Schneeberger Krankheit, BronchialkarzinomHypophysentumor, Mycosis fungoides, Speiseröhrenkrebs, Brustkrebs, Karzinoie, Neurinom, Spinaliom, Burkitt-Lymphom, Kehlkopfkrebs, Nierenkrebs, Thymom, Corpuskarzinom, Knochenkrebs, Non-Hodgkin-Lymphome, Urethrakrebs, CUP-Sysndrom, Kopf-Hals-Tumore, Oligodendrogliom, Vulvakrebs, Darmkrebs, Kolonkarzinom, Ösphaguskarzinom, Warzenbeteiligung, Dünndarmtumore, Kraniopharyngeome, Ovarial-Karzinom, Weichteiltumore, Eierstockkrebs, Leberkrebs, Pankreaskarzinom, Zervixkarzinom, Endometriumkarzinom, Lebermetastasen, Peniskrebs, Zungenkrebs, Gallenblasenkrebs, Leukämie, Plasmozytom, Gebärmutterkrebs, Lidtumor oder Prostatakrebs.
Verwendung gemäß Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass die Infektionskrankheiten ausgewählt werden aus Influenza, Malaria, SARS, Gelbfieber, AIDS, Lyme-Borreliose, Leischmaniasis, Anthrax, Meningitis, viralen Infektionskrankheiten wie AIDS, Condyloma acuminata, Dellwarze, Erkältung, Dengue-Fieber, Dreitagefieber, Ebolavirus, Frühsommermeningoenzephalitis (FSME), Grippe, Gürtelrose, Hepatitis, Herpes-Simplex Typ I, Herpes-Simplex Typ II, Herpes zoster, Influenza, Japanische Enzephalitis, Lassafieber, Marburg-Virus, Masern, Maul- und Klausenseuche, Mononukleose, Mumps, Norwalk-Virus-infektion, Pfeifersches-Drüsenfieber, Pocken, Polio (Kinderlähmung), Pseudokrupp, Ringelröteln, Tollwut, Warzen, West-Nil-Fieber, Windpocken, Zytomegalie-Virus (CMV), bakteriellen Infektionskrankheiten wie Abort (Prostataentzündung), Anthrax, Appendizitis(Blinddarmentzündung), Borreliose, Botulismus, Camphylobacter, Chlamydia trachomatis (Harnröhren-, Bindehautentzündung), Cholera, Diphterie, Diphterie, Donavanosis, Epiglottitis, Fleckfieber, Flecktyphys, Gasbrand, Gonorhoe, Hasenpest, Heliobakter pylori, Keuchhusten, klimatischer Bubo, Knochenmarksentzündung, Legionärskrankheit, Lepra, Listeriose, lungenentzündung, Meningitis, Bakterielle Gehirnhautentzündung, Milzbrand, Mittelohrentzündung, Mycoplasma hominis, Neugeborenensepsis (Chorioamnionitis), Noma, Paratyphus, Pest, Reitersyndrom, Rocky Mountain spotted fever, Salmonellen-Paratyphus, Salmonellen-Typhus, Scharfach, Syphilis, Tetanus, Tripper, Tsutsugamushi, Tuberkulose, Typhus, Vaginitis (Kolpitis), Weicher Schanker, durch Parasiten, Protozoen oder Pilze hervorgerufene Inkektionskrankheiten wie Amöbenruhr, Bilharziose, Chagas- Krankheit, Echinococcus, Fischbandwurm, Fischvergiftung (Ciguatera), Fuchsbandwurm, Fußpilz, Hundebandwurm, Kandiose, Kleienpilzflechte, Krätze (Skabies), Kutane Leishmaniose, Lamblienruhr (Giadiasis), Läuse, Malaria, Mikroskopie, Onchozerkose (Flussblindheit), Pilzerkrankungen, Rinderbandwurm, Schistosomiasis, Schlafkrankheit, Schweinebandwurm, Toxoplasmose, Trichomoniasis, Trypanosomiasis (Schlafkrankheit), Viszerale Leishmaniose, Windeldermatitis oder Zwergbandwurm.
Verwendung gemäß Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass die Autoimmunerkrankungen ausgewählt werden aus Multipler Sklerose (MS), Rheumatoider Arthritis, Diabetes, Diabetes Typ I, Systemischer Lupus Erythematosus (SLE), Chronischer Polyarthritis, Basedowscher Krankheit, Autoimmunen Formen der chronischen Hepatitis, Colitis Ulcerosa, Allergie Typ I-Erkrankungen, Allergie Typ II-Erkrankungen, Allergie Typ III-Erkrankungen, Allergie Typ IV-Erkrankungen, Fibromyalgie, Haarausfall, Morbus Bechterew, Morbus Crohn, Myasthenia gravis, Neurodermitis, Polymyalgia rheumatica, Progressiver Systemischer Sklerose (PSS), Psiorasis, Reiter-Syndrom, Rheumatischer Arthritis, Schuppenflechte oder Vaskulitis.
Verwendung eines ligandenbeladenen MHC-Moleküls gemäß Anspruch 34 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Abschwächung von aggressiven Immunreaktionen.
Verwendung einer Verbindung der Formeln I, II, III oder IV1 bis IV3, wie in den Ansprüchen 1 bis 10 definiert, zusammen mit Liganden zur Herstellung von Vakzinen.
Verwendung gemäß Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand ausgewählt wird aus Antigenen, insbesondere tumor- oder pathogenspezifischen Antigenen, gewebsspezifischen Selbstantigenen, Peptidantigenen und Fragmenten solcher Peptidantigene, vollständigen Proteinen, Proteingemischen und/oder komplexen Proteingemischen.
Vakzin, enthaltend ein ligandenbeladenes MHC-Molekül gemäß Anspruch 34, und optional einen pharmazeutisch geeigneten Träger.
Vakzin, enthaltend eine Verbindung der Formeln I, II, III oder IV1 bis IV3, wie in den Ansprüchen 1 bis 10 definiert, zusammen mit Liganden, und optional einen pharmazeutisch geeigneten Träger.
Vakzin gemäß Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand ausgewählt wird aus Antigenen, insbesondere tumor- oder pathogenspezifischen Antigenen, gewebsspezifischen Selbstantigenen, Peptidantigenen und Fragmenten solcher Peptidantigene, vollständigen Proteinen, Proteingemischen und/oder komplexen Proteingemischen.
Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein ligandenbeladenes MHC-Molekül nach Anspruch 34, und optional einen pharmazeutisch geeigneten Träger.