DE102004019098A1

DE102004019098A1 - Photolabile Schutzgruppen

Info

Publication number: DE102004019098A1
Application number: DE102004019098A
Authority: DE
Inventors: Klaus-Peter Stengele
Original assignee: Chemogenix GmbH
Current assignee: Nimblegen Systems GmbH
Priority date: 2004-04-20
Filing date: 2004-04-20
Publication date: 2005-11-10
Also published as: DE602005001414D1; EP1589024B1; US7432368B2; JP2005306873A; DE602005001414T2; EP1589024A1; US20050272076A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Nukleosidderivate der allgemeinen Formel I,

wobei R¹ gleich H, Halogen, NO₂, CN, OCH₃, ein Alkyl-, Alkoxy- oder Alkoxyalkylrest mit 1 bis 4 C-Atomen, vorzugsweise ein Methyl-, Ethyl-, Propyl- oder Butylrest oder ein gegebenenfalls substituierter Arylrest oder aliphatischer Acylrest mit 2 bis 5 Atomen, R² bis R⁵ gleich H, NO₂, CN, OCH₃, ein verzweigter oder nicht verzweigter Alkyl-, Alkoxy- oder Alkoxyalkylrest mit 1 bis 5 C-Atomen oder ein gegebenenfalls substituierter Arylrest oder ein aliphatischer Acylrest mit 2 bis 5 Atomen, X die Gruppe C=O oder C=S bedeutet, Y=S, O, NR', C(R')₂ ist, wobei R' gleich H oder ein verzweigter oder nicht verzweigter Alkylrest mit 1 der 5 C-Atome oder ein gegebenenfalls substituierter Arylrest ist, Z = SO₂, OCO, OCS, SCS bedeutet und N ein Nukleotid ist.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleosidderivate mit photolabilen Schutzgruppen, ein Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung zur Herstellung von DNA Chips durch räumlich adressierte, lichtgesteuerte Nukleotidsynthese auf festen Substraten.
Die leichte gezielte Abspaltung von funktionellen Gruppen aus Molekülen spielt in vielen Gebieten der Chemie und Biologie eine wichtige Rolle, insbesondere beispielsweise beim Aufbau größerer chemischer Einheiten, wie etwa bei der Synthese von Polymeren, Naturstoffen usw.
Dabei werden z. B. besonders reaktive Gruppen, die die jeweilige beabsichtige Verknüpfung zweier Moleküle beeinträchtigen oder durch unerwünschte Nebenreaktionen stören können durch chemisch oder physikalisch wieder abspaltbare funktionelle Schutzgruppen zeitweilig gezielt „maskiert" bzw. geschützt, damit sie nicht an der erwünschten Verknüpfungsreaktion teilnehmen.
Für ein vergleichendes Studium der molekularen Erkennung zwischen Biomolekülen der gleichen oder verschiedener Strukturklassen, ist der Einsatz großer kombinatorischer Bibliotheken von auf einem Substrat immobilisierten Bindungspartnern der in Lösung angebotenen Biomoleküle von großem Vorteil. Unter dem Begriff "Biomoleküle" versteht der Fachmann insbesondere Verbindungen aus den Klassen der Nukleinsäuren und deren Derivate, Proteine, Peptide und Kohlenhydrate.
Große kombinatorische Bibliotheken, die das Prinzip der wechselseitigen molekularen Erkennung nutzen, sind insbesondere für die Analytik von Nukleinsäuren on großer Bedeutung. Beispielsweise in der Medizin und in der pharmazeutischen Forschung werden DNA-Chips, d.h. so genannte Mikroarrays von Feldern auf einem Glas- oder Polymersubstrat immobilisierter DNA oder beliebig ausgewählter Oligonukleotide (S.P.A. Fodor, Science 277 (1997) 393, DNA Sequencing Massively Parallel Genomics) schon seit längerem eingesetzt.
Dort nehmen DNA-Chips wiederum eine wichtige Rolle bei der genetischen Analytik und Diagnostik ein. Die am weitesten verbreitete Technik zur Herstellung derartiger DNA-Chips ist die so genannte räumlich adressierte, parallele, lichtgesteuerte Oligonukleotidsynthese auf festen Substraten (siehe z.B. S.P.A. Fodor et al, Nature 364 (1993) 555, Multiplexed Biochemical Arrays with Biological Chips) unter Verwendung photolabiler Schutzgruppen, d.h. Schutzgruppen für reaktive Funktionalitäten der Nukleosid- bzw. Nukleotidbausteine, die unter der Einwirkung von zumeist UV-Licht bestimmter Wellenlänge gezielt wieder abgespalten werden können, so dass die geschützten Funktionalitäten für eine Weiterreaktion wieder zur Verfügung stehen.
Zur Herstellung der DNA Chips dient dabei die vorstehend angesprochene so genannte photolithographische Technik. Dabei wird der synthetische Aufbau der gewünschten Oligonukleotidketten auf dem Substrat durch geeignete labile bevorzugt photolabile Schutzgruppen kontrolliert, die beispielsweise bei Belichtung (zumeist wird dazu elektromagnetische Strahlung im UV/VIS Bereich verwendet) die Anknüpfungsstelle für das jeweils nächste Nukleotid freigeben. Mit Hilfe dieser photolabilen Schutzgruppen lässt sich durch eine räumliche selektive Belichtung eine kombinatorische Strategie entwickeln, mit der man extrem dichte, räumlich adressierbare Microarrays von Oligonukleotiden erzeugen kann, deren Anzahl mit der Zahl der Synthesezyklen exponentiell anwächst. Bei einer derzeit erreichbaren Fläche jedes Elements von weniger als 25 μm² lassen sich theoretisch mehr als 10⁶ Sondenfelder auf 1 cm² unterbringen. Bislang erfolgt die Belichtung mit Hilfe von Mikrospiegel-Arrays (S. Singh-Gasson, et al, Nature Biotechn. 17 (1999) 974, Maskless Fabrication of Light Directed Olignucleotide Microarrays using a Digital Micromirror Array), wie sie in der Digital-Projektionstechnik verwendet werden. Damit wird die zeit- und kostenaufwendige Herstellung von Belichtungsmasken erspart und erlaubt die Möglichkeit einer schnelleren Herstellung der DNA Chips mittels der photolithographischen Technik.
Daher ist ein zentraler Punkt der photolithographischen Synthese die Art dieser photolabilen Schutzgruppen, die in vielfältigen chemischen Varianten in der organischen und bioorganischen Chemie eingesetzt werden (V.N.R. Pillay, Photolithic Deprotection and Activation of Functional Groups; in: Organic Photochemistry, Vol. 9 ed. A. Padwa (Marcel Dekker, New York and Basel, 1987), Seite 225 ff.). Am Weitesten verbreitet sind photolabile Schutzgruppen auf der Basis der 2-Nitrobenzyl-Gruppe. (J.E.T. Correy and E.R. Trenton, Caged Nucleotides and Neurotransmitters; in: Biological Applications of Photochemical Switches, in: Bioorganic Photochemistry Series, Vol. 2 ed. Harry Morrison (Wiley Interscience, 1993), Seite 243 ff.).
Bei der Herstellung von DNA Chips, beispielsweise beim Schutz der terminalen OH-Gruppe beim Oligonukleotidaufbau vom 3' zum 5' bzw. vom 5' zum 3' Ende wird von den Schutzgruppen des 2-Nitrobenzyltyps bislang vor allem die MeNPOC (α-Methyl-Nitropiperonyloxycarbonyl-) Schutzgruppe bevorzugt, die seit längerem die Standardschutzgruppe bei der DNA-Chip Herstellung ist (S.P.A. Fodor, et al, Science 251 (1991), 767, Light Directed, Spatially Adressible Parallel Chemical Synthesis).
Nachteilig bei dieser Art der Schutzgruppen ist die Bildung des aromatischen Nitrosoketons nach der Bestrahlung, das eine sehr reaktive Abgangsgruppe darstellt. Dadurch treten unerwünschte Neben- und Folgereaktionen auf, die oftmals Fehler im Nukleotidaufbau des resultierenden Oligo- bzw. Polynukleotids hervorrufen. Derartige Folge- und Nebenreaktionen entstehen z. B. dadurch, dass ein Teil der vorhandenen photolabilen Schutzgruppen auch selbst durch die elektromagnetische Strahlung angeregt wird und im angeregten Zustand eine Vielzahl unerwünschter Nebenreaktionen, wie z.B. Zerfall, intra- und intermolekulare Umlagerungen usw. hervorrufen können.
Weiter sind 2-(2-Nitrophenyl)-ethoxycarbonyl Verbindungen bei der Herstellung von DNA-Chips bekannt, bei denen die Schutzgruppen als 2-Nitrostyrolderivate abgespalten werden (DE-PS 44 44 996, DE-PS 196 20 170 und US-5,763,599). Diese sind Verbindungen durch die Abspaltung von im allgemeinen etwas reaktionsträgeren 2-Nitrostyrolen im Hinblick auf störende Nebenreaktionen etwas weniger störanfällig als die vorerwähnten Verbindungen.
Seit kurzem wurde auch die DMBOC Gruppe (3',5'-Dimethoxybenzoinyloxycarbonyl-) als Schutzgruppe (M.C.Pirrung et al., J.Org. Chem. 63 (1998), 241, Proofing of Photolithographic DNA Syntheses with 3',5'-Dimethoxybenzoinyloxycarbonyl-protected Deoxynucleosidephosphoramidites) bei der gezielten Polynukleotidsynthese verwendet.
Weitere bislang verwendete Schutzgruppen sind beispielsweise NPPOC (2-(2-Nitrophenyl)propyloxycarbonyl), MeNPPOC (2-(3, 4-Methylendioxy-2-nitrophenyl) propyloxycarbonyl), MeNPOC (2-(3, 4-Methylendioxy-2-nitrophenyl) oxycarbonyl), DMBOC (Dimethoxybenzoinylyloxycarbonyl), NPES (2-(2-Nitrophenyl)-ethylsulfonyl) und NPPS (2-nitrophenyl)-propylsulfonyl) Derzeit eingesetzte photolabile Schutzgruppen weisen noch keine befriedigenden Ergebnisse in Bezug auf die Fehlerrate der derart synthetisierten DNA Chips auf (D.J. Lockheart and E.A. Winseler, Nature 405 (2000) 827, Genomics, Gene Expression and DNA Arrays). Die Abspaltung der Schutzgruppen verläuft nicht vollständig genug, da sie zumeist nur eine geringe Absorptionsfähigkeit für die eingesetzten UV/VIS Wellenlängen aufweisen. Außerdem treten dabei störende Nebenreaktionen mit unerwünschten Reaktionsprodukten auf, so dass ein Großteil der Oligonukleotide auf den DNA-Chips nicht verwendet werden kann.
Weiterhin ist die Reaktionsgeschwindigkeit der Abspaltungsreaktion bei den bislang bekannten Schutzgruppen unbefriedigend lang, da die derzeit bekannten photolabilen Schutzgruppen erfordern unter den üblichen Bestrahlungsstärken mit der 365 nm Linie einer Quecksilberdampflampe Bestrahlungszeiten von einigen Minuten, um quantitativ abreagieren zu können.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand daher darin, Nukleosidderivate mit neuen photolabilen Schutzgruppen zur Verfügung zu stellen, die die vorstehend genannten Nachteile des Standes der Technik nicht aufweisen, und deren Schutzgruppen sich insbesondere schnell und ohne Nebenreaktion hervorzurufen abspalten lassen.

Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung von photolabile Schutzgruppen enthaltenden Nukleosidderivaten gelöst, die das Strukturmotiv

aufweisen, wobei R¹ gleich H, Halogen, NO₂, CN, OCH₃, ein Alkyl-, Alkoxy- oder Alkoxyalkylrest mit 1 bis 4 C-Atomen, oder ein gegebenenfalls substituierter Arylrest oder aliphatischer Acylrest mit 2 bis 5 Atomen,
R² bis R⁷ gleich H, NO₂, CN, OCH₃, ein verzweigter oder nicht verzweigter Alkyl-, Alkoxy- oder Alkoxyalkylrest mit 1 bis 5 C-Atomen vorzugsweise ein Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl, oder Pentylrest oder ein gegebenenfalls substituierter Arylrest oder ein Acylrest RCO ist, wobei R ein aliphatischer Rest mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen ist
X die Gruppe C=O oder C=S bedeutet
Y=S, O, NR', C(R')₂ ist, wobei R' gleich H, oder ein verzweigter oder nicht verzweigter Alkylrest mit 1 bis 5 C-Atomen oder ein gegebenenfalls substituierter Arylrest ist,
Z = SO₂, OCO, OCS, SCS, CO oder CS bedeutet,
n = 0, 1, 2 oder 3 bedeutet, mit der Bedingung, dass wenn n = 0 ist, Z ausgewählt ist aus CO, CS, SO₂,
und N ausgewählt ist aus 3' bzw. 5' substituierbaren Nukleosiden wie

wobei P = H oder eine in der Nukleotidchemie übliche Schutzgruppe oder eine bei der Herstellung von Oligonukleotiden übliche reaktive Gruppe bedeutet,
B = Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, Uracil, 2,6-Diaminopurin-9-yl, 5-Methylcytosinyl-1-yl, 5-Amino-4-Imidazolcarbonsäure-1-yl oder 5-Amino-4-Imidazolcarbonsäureamid-3-yl bedeutet, wobei im Falle von B = Adenin, Cytosin oder Guanin die primäre Aminofunktion und gegebenenfalls eine temporäre oder permanente Schutzgruppe aufweist bzw. Tymin oder Uracil an der O⁴-Position gegebenenfalls eine permanente Schutzgruppe aufweist,
R⁸ = H, OH, Halogen, OR' oder SR' bedeutet, wobei R' wie vorstehend definiert ist oder ein aliphatischer Acylrest mit 2 bis 5 Atomen sowie eine in der Nukleotidchemie übliche Schutzgruppe ist.

Die Alkyl-, Alkoxy, oder Alkoxyalkylgruppe der Reste R¹ bis R⁸ kann linear oder verzweigt sein, substituiert (insgesamt nur mit einem oder mehreren Halogenatomen) oder unsubstituiert sowie gesättigt oder ungesättigt sein. Zwischen den Resten kann eine Brückenverbindung bestehen, z. B. über eine Methylengruppe, so dass sich eine weitere Ringfunktion ergibt. Analoges gilt für die Acyl- oder Arylgruppe der Reste R¹ bis R⁸. Hier kommen als Substituenten neben Halogenatomen auch Alkylgruppen in Frage. Bevorzugte Alkylreste sind Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, n-Butyl-, iso-Propyl, tert-Butyl-. Bevorzugte Alkoxyreste sind die Methoxy-Ethoxy- oder tert-Butoxyreste. Bevorzugte aliphatische Acylreste sind Formyl, Acetyl, Propionyl oder Butyryl. Bevorzugte (Hetero)Arylreste sind die Phenyl-, Thienyl-, Thiophenyl-, Furyl-, Furanyl-, Pyranyl-, Pyrrolyl_, Imidazolyl-, Pyrazolyl-, Pyridyl-, Pyrazinyl-, Pyrimidinyl-, Pyrazinyl-, Pyridazinyl-, Thiazolyl-, Oxazolyl, Indolyl-, Pyrrolinyl-, Imidazolinyl-, Pyrazolinyl-, Thiazolinyl-, Triazolyl-, Tetrazolylgruppe sowie sich daraus ergebende annellierte Ringe.

In der Position P bedeutet „eine bei der Herstellung von Oligonukleotiden übliche reaktive Gruppe" beispielsweise eine Phosphitamid-Gruppe. Natürlich können anstelle eines Phosphitamids auch Phosphodiester, Phosphotriester oder H-Phosphonate verwendet werden.

In der Position P und R⁸ bedeutet der Ausdruck „eine in der Nukleotidchemie übliche Schutzgruppe" insbesondere in R⁸ eine H (DNA) oder O (RNA) Schutzgruppe wie die üblichen O-Alkyl-, O-Alkenyl-, O-Acetal- oder O-Silylether-Schutzgruppen. Bevorzugte Schutzgruppen sind O-Methyl- oder O-Ethylreste, O-Allylreste, O-Tetrahydropyranyl- bzw. O- Methoxytetrahydropyranyl-Reste sowie O-t-Butyldimethylsilyl-Reste, Dimethoxytrityl (DMT) oder Dansyl-Reste.

Die an den Basen B ggf. permanent vorkommenden Schutzgruppen basieren vorzugsweise auf Acyl-Schutzgruppen. Bevorzugt sind vor allem Phenoxyacetyl-, tert-Butylphenoxyacetyl-, Isobutyryl-, Acetyl-, Benzoyl-, Allyloxycarbonyl-, Phthaloyl-Dansylethyloxycarbonyl-, 2-(4-Nitrophenyl)ethoxycarbonyl- oder Dimethylformamidino-Reste. Im Falle von Adenin, Cytosin und Guanin handelt es sich vorzugsweise um Phenoxyacetyl-, tert-Butylphenoxyacetyl, Acetyl- oder 2-(4-Nitrophenyl)ethoxycarbonyl-Gruppen zum Schutz der exocyclischen Aminofunktionen. Die O⁶-Position von Guanin kann ggf. durch eine Schutzgruppe 2-(4-Nitrophenylsulfonyl)ethyl- oder 2-(4-Nitrophenyl)ethyl- geschützt sein. Ebenso kann die O⁴-Position von Thymin oder Uracil eine Schutzgruppe wie 2-(4-Nitrophenylsulfonyl)ethyl- oder 2-(4-Nitrophenyl)ethyl- aufweisen.

Halogen bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung F, Cl, Br, I, wobei die drei letztgenannten bevorzugt sind. Die Herstellung der erfindungsgemäßen Nucleosid-Derivate ist beispielhaft in 2 gezeigt, worauf nachfolgend Bezug genommen wird. Die Erwähnung von bestimmten Halogen- und Alkylsubstitutionen schließt immer gleichwirkende Äquivalente ein, z. B. „Chlor-" schließt nicht aus, dass auch die entsprechenden Jod- oder Bromverbindungen einsetzbar sind. Ebensolches gilt für „Methyl", das auch die entsprechenden anderen niederen Alkylverbindungen, wie Ethyl-, Propyl- oder Butyl mit einschließt.

Die erfindungsgemäßen Nukleosidderivate weisen den gegenüber bekannten Derivaten den überraschenden Vorteil auf, dass die erfindungsgemäße Schutzgruppe auch bei Bestrahlung mit sichtbarem Licht bei Wellenlängen von größer 380 nm, bevorzugt größer 390 nm und noch mehr bevorzugt bei größer 400 nm schneller und effektiver abgespalten werden kann.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist insbesondere wichtig, dass bei der erfindungsgemäßen Schutzgruppe eine Nitrogruppe und die Gruppe, die das Nukleosid mit dem Ringsystem verbindet am Anthracengerüst in o-Stellung zueinander stehen, um bei Abspaltung eine β-Eliminierungsreaktion durchführen zu können.

Dabei sind erfindungsgemäß sämtliche o-Substitutionsmuster an den Positionen 1 bis 4 des Ringsystems gemeint. Dies betrifft insbesondere die folgenden Derivate:

wobei in den Formeln 1a bis 1f die Substituenten die vorgenannte Bedeutung haben.

Die erfindungsgemäßen 3'- oder 5'-photolabilen Nukleoside können bei der photolithographischen Nukleinsäurechipsynthese eingesetzt werden. Verfahren hierzu sind dem Fachmann ausreichend bekannt.

Die Verwendung der erfindungsgemäßen Schutzgruppe beziehungsweise des Nukleosidderivats erlaubt vorteilhafterweise den Einsatz von besonders langwelligem Licht bei der lichtgesteuerten Synthese von Oligonukleotiden beziehungsweise Nukleinsäurechips. Bevorzugt werden dabei Wellenlängen von größer als 380 nm, bevorzugter von größer 390 nm und besonders bevorzugt von größer 400 nm verwendet.

Unter "Substrat" werden chemische Verbindungen verstanden, bevorzugt Oligonukleotide, Proteine, Peptide, Kohlenhydrate (Zucker), die mit der erfindungsgemäßen Verbindung eine kovalente chemische Bindung eingehen können. Jedoch schließt der Begriff Substrat auch oberflächenfunktionalisierte Trägermaterialien wie Glas, Polymere, Metall, Keramik usw. ein.

Unter dem Begriff „Nukleotid" werden erfindungsgemäß bevorzugt Oligonukleotide mit zwei bis zu 10 Nukleoside verstanden, die untereinander sowohl über 3'-5' als auch über 5'-3' Phosphorsäureesterbindungen verbunden sein können. Jedoch umfassen die erfindungsgemäßen Nukleotide daneben ebenfalls Polynukleotide aus mehr als 10 Nukleosid-Bausteinen.

Die Synthese der erfindungsgemäßen Nukleosidderivate kann über mehrere Stufen, oder über eine Zweistufensynthese erfolgen. Typischerweise wird zuerst das gewünschte Ringsystem mit dem entsprechende Substitutionsmuster aufgebaut, bei dem zunächst ein Alkohol der allgemeinen Formel

über an sich bekannte Syntheseverfahren hergestellt wird, wobei R₁ bis R₇ X, Y und n die vorstehend genannten Bedeutungen haben. Dieser Alkohol wird in einem zweiten Schritt in ein Acylierungsreagenz mittels aus der Literatur bekannter Verfahren umgewandelt, beispielsweise in einen Chlorkohlensäureester, zB. mit Diphosgen, in einen Chlorthiokohlensäurester, zB mit Thiophosgen oder in ein Sulfonylchlorid. Anschließend wird ein entsprechend derivatisiertes Nukleosid, beispielsweise Thymidin mit diesem Acylierungsreagenz acyliert, um das erfindungsgemäße Nukleosidderivat zu ergeben. Ein Weg zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist beispielhaft anhand von 1 erläutert.

Das freie Nukleosid zur Verwendung in erfindungsgemäßen Verfahren weist zunächst bevorzugt zwei freie OH-Gruppen auf, eine an der 3'Stellung die andere an der 5'Stellung. Anschließend wird eine davon, entweder an der 3' oder 5'Stellung durch Einführung einer orthogonalen Schutzgruppe zum Beispiel DMT oder Dansyl, intermediär geschützt, so dass die verbleibende freie Hydroxylgruppe (5' oder 3') mit dem Acylierungsreagenz reagieren kann. Bedarfsweise kann dann die intermediäre Schutzgruppe abgespalten werden, so dass die freie 3' oder 5' OH-Gruppe für weitere Reaktionen zur Verfügung steht.

Weitere Vorteile und Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus der Beschreibung und den beiliegenden Figuren.

Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand der nachstehenden Figuren und eines nicht einschränkenden Ausführungsbeispiels erläutert.

1 zeigt ein Syntheseschema für die Herstellung eines erfindungsgemäßen Nukleosidderivates,

2 zeigt den Vergleich der Reaktionsgeschwindigkeit bei der Abspaltung der Schutzgruppe (Entschützungsreaktion) eines Nukleosidderivats des Standes der Technik zu einem erfindungsgemäßen Nukleosidderivat,

3 zeigt die Geschwindigkeit der Schutzgruppenabspaltung aus einem erfindungsgemäßen Nukleosidderivat in verschiedenen Lösungsmitteln.

4 zeigt die Geschwindigkeit der Entschützungsreaktion bei einer Wellenlänge von mehr als 390 nm.

5 zeigt die Geschwindigkeit der Entschützungsreaktion bei einer Wellenlänge von mehr als 410 nm.

2 zeigt die Reaktionsgeschwindigkeit bei der Abspaltung der Schutzgruppe eines Nukleosidderivats des Standes der Technik, NPPOC-Thymidin (NPPOC-dT), im Vergleich zu einem erfindungsgemäßen Nukleosidderivat 2-NTX-3-POC-Thymidin(2-NTX-3POC-dT)(5'-[2-nitro-9-oxo-3-(2-propyloxacarbonyl)thioxanthon]thymidin)

Die Abnahme der Menge an Edukt über die Reaktionsdauer der Abspaltungsreaktion wurde bei beiden Verbindungen bei einer Wellenlänge von 365 nm (Hg Lampe) in einem Methanol/Wasser Gemisch gemessen.

Wie aus 2 ersichtlich ist, verläuft die Abnahme an Konzentration des Edukts bei 2-NTX-3POC-dT in Kurve 1 deutlich schneller als beim Edukt NPPOC-dT (Kurve 2). Dies korreliert sehr gut mit der Zunahme an Edukt in den entsprechenden Kurven 3 und 4.

Im Falle von 2-NTX-3-POC als photolabile Schutzgruppe erhielt man schon nach ca. 3 Sekunden Reaktionsdauer 90 % Produkt, während bei NPPOC nach einer doppelt so langen Reaktionszeit von 6 Sekunden erst 40 % Thymidin erhalten wurden.

3 zeigt den Reaktionsverlauf der Abspaltung der photolabilen Schutzgruppe aus 2-NTX-3-POC-dT in verschiedenen Lösungsmitteln bei 365 nm (Hg-Lampe, UG 1 Filter) in Bezug auf die Abnahme des Edukts 2-NTX-3-POC-dT als auch in Bezug auf die Zunahme des Produkts Thymidin.

Mit Ausnahme der Reaktion in Dioxan/Wasser sind die Reaktionsgeschwindigkeiten in den Mischungen Acetonitril/Wasser bzw. Methanol/Wasser in etwa gleich schnell.

4 zeigt die Geschwindigkeit der Entschützungsreaktion bei der Abspaltung der erfindungsgemäßen Schutzgruppe eines Nukleosidderivats (jeweils mit Thymidin) gegenüber Schutzgruppen aus dem Stand der Technik bei Wellenlängen oberhalb 390 nm. Verglichen mit den Schutzgruppen NPPOC, 5-Benzyl(Bz)-NPPOC und 4-Ethyl-5-phenyl-NPPOC, ist die Geschwindigkeit der Entschützungsreaktion bei den Schutzgruppen 2-NTX-3-POC beziehungsweise TS7POC (5'O-[(2-nitrophenyl)-5-(9-oxo-9H-thioxanthon-2-yl)pentyloxycarbonyl]) am schnellsten. Die erfindungsgemäße Schutzgruppe 2-NTX-3-POC ist im Vergleich zu TS7POC bei einer Wellenlänge von 400 nm bis zu einer Reaktionsdauer von circa 4 Minuten etwas langsamer und erreicht in etwa dieselben Werte wie TS7POC.

TS7POC bedient sich im Gegensatz zur erfindungsgemäßen Schutzgruppe des Prinzips der sogenannten "intramolekularen Aktivierung" der Schutzgruppe, bei der eine Sensibilisatoreinheit an eine herkömmliche Schutzgruppe gebunden ist (wie es zum Beispiel in der PCT/EP 2004/002361 beschrieben wurde). Überraschenderweise hat sich vorliegend gezeigt, dass auf bislang als unerlässlich für schnelle Reaktionszeiten bei der Entschützungsreaktion angesehene UV Sensibilisatoren verzichtet werden kann. Nämlich sowohl auf einen intramolekular gebundenen Sensibilisator, wie z. B. bei TS7POC beziehungsweise auf einen gesondert zugegebenen Sensibilisator wie es z. B. in der WO 03/74542 beschrieben ist, zur Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit der Abspaltungsreaktion. Trotzdem werden mit den erfindungsgemäßen Derivaten bzw. Schutzgruppen vergleichbare Reaktionsgeschwindigkeiten wie in Anwesenheit von Sensibilisatoren für die Abspaltungsreaktion erhalten.

5 zeigt, dass bei Verwendung einer erfindungsgemäßen Schutzgruppe, nämlich 2-NTX-3-POC die Geschwindigkeit der Abspaltung bei 420 nm verglichen mit den üblichen aus dem Stand der Technik bekannten Schutzgruppen beträchtlich ist und nach circa 30 Minuten Reaktionsdauer eine Abspaltung zu 90 % erfolgt ist, während bei den Schutzgruppen aus dem Stand der Technik nahezu keine Reaktion zu erkennen ist.

Ausführungsbeispiel

Synthese von 5'-[2-nitro-9-oxo-3-(2-propyloxycarbonyl)thioxanthon]thymidin.

Die Synthese der Titelverbindung ist in 1 schematisch erläutert. Die Reaktion der Thioacetylsäure 1 mit (2-Nitro-5-bromo)ethylbenzol 2 in kochendem DMF in Gegenwart von 1,8-diazabicyclo[5,4,0]undec-7-ene (DBU) resultiert in der Bildung von 2-(3-Ethyl-4-nitrophenylsulfid)benzoesäure 3, die als Feststoff mit 70 bis 80 % Ausbeute isoliert wurde. Das Erhitzen der Benzoesäure 3 in konzentrierter Schwefelsäure über einen Zeitraum von 0,5 bis 1 Stunde gefolgt von der Zugabe der Reaktionsmischung in Wasser und Filtration ergab 3-Ethyl-2-nitro-9-oxothioxanthon 4 das für den nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet wurde. Die Reaktion des Nitroderivates des Oxothioxanthons 4 aus dem vorhergehenden Schritt mit Paraformaldehyd in DMSO in Gegenwart von DBU bei 60 bis 70 °C für 4 bis 5 Stunden ergab 4-Nitro-9-oxo-3-(2-propanol)thioxanthon 5 das mittels Säulenchromatographie in guten Ausbeuten isoliert wurde. Die Behandlung der Verbindung 5 mit Diphosgen in THF bei 0 bis 4 °C in Gegenwart von Triethylamin ergab 2-Nitro-9-oxo-3-(2-propyloxycarbonyl-chlorid)thioxanthon 6 in guter Ausbeute. Die Acylierung von Thymidin mit Verbindung 6 bei 0 bis 4 °C führt zu 5'-[2-nitro-9-oxo-3-(2-propyloxacarbonyl)thioxanthon]thymidin 7 welches über Säulenchromatographie isoliert wurde.

Spektroskopische Daten für Verbindung 5:
UV (MeOH), λ_max in nm (log ε): 359 (3.86), 252 (4.48), 212 (4.12).
¹H-NMR (DMSO-D₆): 8.72 (s, H-C(1)); 8.42 (dd, H-C(8)); 8.03 (s, H-C(4)); 7.86 (dd, H-C(5)); 7.99 (ddd, H-C(7)); 7.61 (m, H-c(6)).

Spektroskopische Daten für Verbindung 6:
UV (MeOH), λ_max in nm (log ε): 348 (3.87), 254 (4.54), 211 (4.27).
¹H-NMR (DMSO-D₆): 11.14 (s, NH); 8.40 (dd, H-C(8*)); 8.15 (s, H-C(4*)); 7.85 (dd, H-C(5*)); 7.78 (ddd, H-C(7*)); 7.60 (ddd, H-C(6*)); 7.34 (s, H-C(6)); 6.11 (m, H-C(1')); 5.33 (d, OH); 4.41 (m, 2H, CH₂ für die 5'-Schutzgruppe); 4.24 (m, 2H, H-C(5',5'')); 4.18 (m, H-C(3')); 3.87 (m, H-C(4')); 3.75 (q, CH₃CH); 2.10 (m, 2H, H-C(2',2'')); 1.70 and 1.69 (2s, CH₃-C(5)); 1.38 (d, CH₃CH).

Claims

Nukleosidderivate mit photolabilen Schutzgruppen der allgemeinen Formel (I)
wobei R¹ = H, Halogen, NO₂, CN, OCH₃, ein Alkyl-, Alkoxy- oder Alkoxyalkylrest mit 1 bis 4 C-Atomen, vorzugsweise ein Methyl-, Ethyl-, Propyl-, oder Butylrest oder ein gegebenenfalls substituierter Arylrest oder aliphatischer Acylrest mit 2 bis 5 Atomen ist, R² bis R⁷ = H, NO₂, CN, OCH₃, ein verzweigter oder nicht verzweigter Alkyl-, Alkoxy- oder Alkoxyalkylrest mit 1 bis 5 C-Atomen oder einen gegebenenfalls substituierter Arylrest oder ein aliphatischer Acylrest mit 2 bis 5 fünf Atomen ist, X die Gruppe C=O oder C=S bedeutet, Y=S, O, NR', C(R')₂ ist, wobei R' gleich H, oder ein verzweigter oder nicht verzweigter Alkylrest mit 1 bis 5 C-Atomen oder einen gegebenenfalls substituierter Arylrest ist, Z = SO₂, OCO, OCS, SCS, CO oder CS bedeutet, n = 0, 1, 2 oder 3 bedeutet, mit der Bedingung, dass wenn n = 0 ist, Z ausgewählt ist aus CO, CS, SO₂, N ausgewählt ist aus
wobei P = H oder eine in der Nukleotidchemie übliche Schutzgruppe oder eine übliche reaktive Gruppe zur Herstellung von Oligonukleotiden ist, B = Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, Uracil, 2,6-Diaminopurin-9-yl, 5-Methylcytosinyl-1-yl, 5-Amino-4-Imidazolkarbonsäure-1-yl oder 5-Amino-4-Imidazolcarbonsäureamid-3-yl bedeutet, wobei im Falle von B = Adenin, Cytosin oder Guanin die primäre Aminofunktion und gegebenenfalls eine temporäre oder permanente Schutzgruppe aufweist bzw. Thymin oder Uracil an der O⁴-Position gegebenenfalls eine permanente Schutzgruppe aufweist, R⁸ = H, OH, Halogen, OR' oder SR' bedeutet, wobei R' wie vorstehend definiert ist oder aliphatischer Acylrest mit 2 bis 5 Atomen sowie eine in der Nukleotidchemie übliche Schutzgruppe ist.
Nukleosidderivat nach Anspruch 1, wobei eine NO₂-Gruppe und die -C(R₁)-(CH₂)n-Z-N-Gruppe in ortho Stellung zueinander stehen
Nukleosidderivat nach Anspruch 1 oder 2, wobei die übliche reaktive Gruppe zur Herstellung von Oligonukleotiden in der Position P eine Phosphitamid-Gruppe ist.
Verfahren zur Herstellung von Nukleosidderivaten nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei a) eine Verbindung der allgemeinen Formel II
in der die Reste die vorstehend genannte Bedeutung haben, mit einem Nukleosid der allgemeinen Formel III
in der R₈ und B oben genannte Bedeutung haben und wobei P eine in der Nukleotidchemie übliche Schutzgruppe ist reagieren lässt. b) wahlweise P weiter reagieren lässt.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei man in der 5'-Stellung oder 3'-Stellung der entstandenen Nukleosidderivate eine Phosphitamid-Gruppe einführt.
Verwendung der Nukleosidderivate nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zum lichtgesteuerten Aufbau von Oligonukleotiden oder Nukleinsäurechips.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei Licht mit einer Wellenlänge von größer als 380 nm, bevorzugt größer als 390 nm eingesetzt wird.