DE102004002885B4

DE102004002885B4 - Neue medizinisch einsetzbare Pyrrolalkaloide: Verfahren zu ihrer Isolierung, Synthese, sie enthaltende Arzneimittel und deren Verwendung

Info

Publication number: DE102004002885B4
Application number: DE102004002885A
Authority: DE
Inventors: Gerhard Prof. Dr. Bringmann; Gerhard Dr. Lang; Hideyuki Dr. Tsuruta; Ernesto Prof. Fattorusso; Anna Prof. Aiello; Michele D'esposito; Marialuisa Prof. Menna; Werner E.G. Prof. Dr. Müller; Heinz Christoph Dr. Schröder; Sanja Dr. Petrovic-Ottstadt
Original assignee: Johannes Gutenberg Universitaet Mainz; Julius Maximilians Universitaet Wuerzburg
Current assignee: Johannes Gutenberg Universitaet Mainz; Julius Maximilians Universitaet Wuerzburg
Priority date: 2004-01-20
Filing date: 2004-01-20
Publication date: 2007-03-15
Anticipated expiration: 2024-01-21
Also published as: DE102004002885A1

Abstract

Verbindung der allgemeinen Formel 23:

worin R¹ bis R¹¹ unabhängig voneinander entweder Wasserstoff, ein C₁-C₁₈-Alkyl oder C₁-C₁₈ Alkenyl, wobei das Alkyl beziehungsweise Alkenyl gerade, verzweigt oder cyclisch sein kann, ein Aryl- oder Heteroarylrest, ein über ein C₁-C₁₈-Alkyl oder C-C₁₈-Alkenyl gebundener Aryl- oder Heteroarylrest, eine Acylgruppe, ausgewählt aus Formyl, Acetyl, Trichloracetyl, Fumaryl, Maleyl, Succinyl, Benzoyl, eine Sulfonylgruppe, ausgewählt aus -SO₃H, -SO₂Me, -SO₂CF₃, -SO₂C₆H₄CH₃ oder -SO₂C₆H₄CH₂Br, oder Fluor, Chlor, Brom, Jod, -CN, NO₂,
eine Alkoxygruppe -OR oder eine Thioethergruppe -SR oder eine Aminogruppe -NRR', deren Reste R und R' jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, ein C₁-C₁₈-Alkyl oder C₁-C₁₈-Alkenyl, wobei das Alkyl beziehungsweise Alkenyl gerade, verzweigt oder cyclisch sein kann, ein Aryl- oder Heteroarylrest, ein über ein C₁-C₁₈-Alkyl oder C₁-C₁₈-Alkenyl gebundener Aryl- oder Heteroarylrest, eine Acylgruppe, ausgewählt aus Formyl, Acetyl, Trichloracetyl, Fumaryl, Maleyl, Succinyl, Benzoyl, oder eine Sulfonylgruppe, ausgewählt aus -SO₃H, -SO₂Me, -SO₂CF₃, -SO₂C₆H₄CH₃ oder -SO₂C₆H₄CH₂Br sein können, sind, wobei
im Falle...

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue bioaktive Verbindungen aus der Klasse der Pyrrolalkaloide und Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen durch Isolierung aus natürlichen Quellen und durch chemische Synthese. Diese Erfindung betrifft weiterhin diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel und deren Verwendung bei der Behandlung von Krankheiten.
Hintergrund der Erfindung
Meeresschwämme sind eine reichhaltige Quelle an Pyrrolalkaloiden, einer Gruppe von Naturstoffen, die sich durch ihre strukturelle Vielfalt und interessante biologische Aktivitäten auszeichnet. Strukturelle Gemeinsamkeit der meisten Mitglieder dieser Verbindungsklasse ist die Pyrrol-2-Carbonsäuregruppe, welche durch ein kurzes aliphatisches Verbindungsstück mit einem Heterozyklus, oft einer Aminoimidazoleinheit, verbunden ist.
Als erste Verbindung dieser Klasse wurde das dibromierte Oroidin (1) isoliert, zuerst aus dem Schwamm Agelas oroides und später auch aus verschiedenen anderen Schwämmen (S. Forenza, L. Minale, R. Riccio, E. Fattorusso, J. Chem. Soc., Chem. Comm. 1971, 13, 1129–1130). Im Laufe der letzten dreißig Jahre wurden zahlreiche weitere Pyrrolalkaloide mit vielfältigen biologischen Aktivitäten isoliert, zumeist (aber nicht ausschließlich) aus Schwämmen der Familien Agelisidae, Hymeniacidonidae und Axinellidae. So wurde zum Beispiel Keramadin (2), ein neuartiger Antagonist serotonerger Rezeptoren, aus einer von Okinawa stammenden Agelas-Spezies isoliert (H. Nakamura, Y. Ohizumi, J. Kobayashi, M. Kasei, Tetrahedron Lett. 1984, 25, 2475–2478). Hymenidin (3), aus einem Hymeniacidon sp. (J. Kobayashi, Y. Ohizumi, H. Nakamura, Y. Hirata, Experientia 1986, 42, 1176–1177), und Clathrodin (4), aus dem karibischem Schwamm Agelas clathrodes (J. J. Morales, A. D. Rodriguez, J. Nat. Prod. 1991, 54, 629–631), sind die mono- bzw. unbromierten Analoga von Oroidin (1). Clathrodin wirkt, wie auch Oroidin, auf muscarinische Acetylcholinrezeptoren (mAChR) in Membranen aus Rattengehirn, während Hymenidin eine ausgeprägte antiserotonerge Wirkung besitzt. Eine antimikrobielle Wirkung von Oroidin ist ebenfalls bekannt. Die Tauroacidine A (5) und B (6), aus einer Hymeniacidon sp., sind Brompyrrolalkaloide mit einem Taurinrest am Aminoimidazolring (J. Kobayashi, K. Inaba, M. Tsuda, Tetrahedron 1997, 53, 16679–16682); sie wirken als Inhibitoren der EGF-Rezeptor-Kinase und der c-erb8-2-Kinase mit einem IC₅₀ von jeweils 20 μg/ml. Die verwandte Verbindung Taurodispacamid A (7) wurde aus dem mediterranen Schwamm Agelas oroides isoliert und zeigte eine gute antihistaminische Aktivität am isolierten Meerschweinchenileum (E. Fattorusso, O. Taglialatela-Scafati, Tetrahedron Lett. 2000, 41, 9917–9922). Eine ungewöhnliche N-Methylimidazoliniumgruppe enthalten Clathramide A (8) und B (9) (F. Cafieri, E. Fattorusso, A. Mangoni, O. Taglialatela-Scafati, Tetrahedron 1996, 52, 13713–13720), aus dem karibischen Schwamm Agelas clafhrodes, die eine antifungische Wirkung gegen Aspergillus niger zeigen. Trotz ihrer Ähnlichkeit zu anderen, bioaktiven, Strukturen konnte bei diesen Verbindungen jedoch keine antihistaminische, antiserotonerge oder anticholinerge Wirksamkeit beobachtet werden. Bei den Dispacamiden A bis D (10–13) handelt es sich um Brompyrrolalkaloide mit einer Aminoimidazoloneinheit (F. Cafieri, E. Fattorusso, A. Mangoni, O. Taglialatela-Scafati, Tetrahedron Lett. 1996, 37, 3587–3590; F. Cafieri, R. Carnuccio, E. Fattorusso, O. Taglialatela-Scafati, T. Vallefuoco, Bioorg. Med. Chem. Lett. 1997, 7, 2283–2288), sie wurden aus verschiedenen karibischen Agelas-Arten isoliert und weisen eine erstaunlich selektive antihistaminische Wirkung auf. Aus dem Schwamm Agelas nakamurai wurden Mukanadin B (14) (H. Uemoto, M. Tsuda, J. Kobayashi, J. Nat. Prod. 1999, 62, 1581–1583), mit einer Hydantion- an Stelle der Aminoimidazolongruppe, und die Slagenine A bis C (15–17) (M. Tsuda, H. Remoto, J. Kobayashi, Tetrahedron Lett. 1999, 40, 5709–5712), mit einem einzigartigem Tetrahydrofuro[2,3-d]imidazolidin-2-onring, isoliert. Die Manzacidine A bis D (18–21) (J. Kobayashi, F. Kanda, M. Ishibashi, H. Shigemori, J. Org. Chem. 1991, 56, 4574–4576; T. Jahn, G. M. König, A. D. Wright, Tetrahedron Lett. 1997, 38, 3883–3884), aus einer Hymeniacidon sp., und Agelongin (22), aus Agelas longissima (F. Cafieri, E. Fattorusso, A. Mangoni, O. Taglialatela-Scafati, R. Carnuccio, Bioorg. Med. Chem. Lett. 1995, 5, 799–804), stellen insofern eine strukturelle Neuerung unter den Pyrrolalkaloiden dar, als dass sie an Stelle des üblichen Imidazolrings einen 3,4,5,6-Tetrahydropyrimidin- beziehungsweise einen Pyridinring und an Stelle der zentralen Amidbindung eine Esterbindung besitzen. Agelongin besitzt eine antiserotonerge Wirkung an Funduspreparationen von Rattenmagen.
Das Anwendungsspektrum für eine kommerzielle Nutzung der neuen bioaktiven Substanzen, die interessante biologische Aktivitäten besitzen, ist sehr breit. Intensiv wird dabei auch nach solchen Substanzen gesucht, die eine Behandlung von bisher kaum therapierbaren neurodegenerativen Erkrankungen, wie z. B. von Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson oder Multipler Sklerose, ermöglichen.
Intrazelluläres freies Calcium [Ca²⁺]_i ist ein sehr wichtiger Second-Messenger in der Stimulation vieler Zellen. Die Mobilisierung von Calcium spielt auch eine sehr große Rolle bei verschiedenen Krankheiten, wie z. B. neurodegenerativen Erkrankungen des ZNS, Ischämie, Alzheimer-Krankheit, psychopathologischen Krankheiten und bei Alterungsprozessen. Dabei ist sowohl bei diesen Erkrankungen als auch bei direkten Verletzungen des Gehirns eine Erhöhung der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration festzustellen. Dieser erhöhte Einstrom von Ca²⁺ führt über eine Reihe von weiteren Mechanismen zur fortschreitenden Zellzerstörung.
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine neue bioaktive Substanz aus einem marinen Organismus und strukturell verwandte Verbindungen, Verfahren zu deren Herstellung und zu deren Verwendung zur Verfügung zu stellen.
Die vorliegende Erfindung betrifft das neue, aus dem Schwamm Axinella damicornis isolierte, Alkaloid Daminin (24) sowie Alkaloide der allgemeinen Struktur 23.
Agelongin (22) ist der bisher einzige Vertreter der allgemeinen Struktur 23, dabei ist R² = Br und R¹ sowie R³ bis R¹¹ sind H.
Neue Substanzen wie das hier beschriebene Alkaloid Daminin (24), die die intrazellu läre Ca²⁺-Konzentration ([Ca²⁺]_i) senken (z. B. nach der Inkubation mit Neurotoxinen oder Neurotransmittern) und ausgeprägte neuroprotektive Eigenschaften besitzen, könnten in Zukunft bei der Behandlung von derartigen Erkrankungen eine große Rolle spielen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sollen die neuen Pyrrolalkaloide auch von der allgemeinen Formel 23 abgeleitete Verbindung sein, worin R¹ bis R¹¹ sowie X unabhängig voneinander entweder H, ein unsubstituiertes, monosubstituiertes oder polysubstituiertes C₁-C₁₈-Alkyl, wobei das Alkyl gerade, verzweigt oder cyclisch sein kann, Alkenyl, ein unsubstituierter, monosubstituierter oder polysubstituierter Aryl- oder Heteroarylrest, eine unsubstituierte, monosubstituierte oder polysubstituierte Benzylgruppe, eine Acylgruppe, wie z. B. Formyl, Acetyl, Trichloracetyl, Fumaryl, Maleyl, Succinyl, Benzoyl, oder eine verzweigte oder Heteroatom- oder arylsubstituierte Acylgruppe, -OH oder -SH, (im Falle von R¹, R³, R⁸, R¹⁰, und R¹¹ mit Auftreten zusätzlicher Tautomeren verbunden) ein Alkoxysubstituent, wie z. B. -OMe, -OEt, -OnPr, -iPr, -OnBu, -OiBu, -OsecBu, -OtBu, dessen Alkylgruppe verzweigt, unverzweigt oder cyclisch ist, eine über ein Schwefelatom gebundene Alkylgruppe, wie -SMe, -SEt, oder eine Sulfonylgruppe, wie z. B. -SO₃H, -SO₂Me, -SO₂CF₃, -SO₂C₆H₄CH₃ oder SO₂C₆H₄CH₂Br, oder ein Stickstoffsubstituent, wie z. B. -NH₂, -NHR, -NRR' (mit R, R' = Alkyl, Aryl usw.), -NC oder -NO₂, oder Fluor, Chlor, Brom, Iod, -CN oder ein Heterosubstituent sind, wobei im Falle von R⁶ unterschiedlich von R⁷ oder R⁴ unterschiedlich von R⁵ oder bei sterisch anspruchsvollen (d.h. großen, raumfüllenden oder auch sperrigen) Arylresten, z.B. mit voluminösen ortho-Substituenten, R¹-R³ sowie R⁸-R¹¹ die Verbindung zentro- oder axialchiral sein kann, sowie alle auftretenden Stereoisomere und racemischen Gemische davon, zwei oder mehr Reste (z.B. ein Rest R¹ und ein Rest R² oder ein Rest R⁴ und ein Rest R⁶) können so untereinander in der Art verknüpft sein, dass dadurch ein iso- oder heteroaromatischer oder gesättigter Ring gebildet ist. So kann z.B. R¹ plus R² auch ein an zwei benachbarten Kohlenstoffeatomen des Pyrrolgerüsts kondensierter aromatischer oder gesättigter Ring sein. Außerdem besteht die Maßgabe, dass Formel 23 nicht die folgende Formel 22 bedeutet:
Agelongin (22)
Umfaßt sind außerdem Gemische verschiedener dieser Verbindungen, die zum Beispiel zu einem auf die jeweils zu therapierende Erkrankung und/oder den Patienten auf Basis von diagnostischen oder Daten über den Behandlungserfolg oder -verlauf abgestimmten "personalisierten" Medikament verarbeitet werden können. Unter einem Derivat wird auch eine Verbindung entsprechend der allgemeinen Formel 23 verstanden, die aus anderen (z. B. marinen) Organismen isoliert werden kann, als dem hier (beispielhaft) erwähnten.
Unter einem "Vorläufer" einer Substanz soll im Rahmen der vorliegenden Erfindung zum einen eine Substanz verstanden werden, die im Laufe ihrer Verabreichung zur Behandlung durch die Bedingungen im Körper (z. B. pH im Magen, oder ähnliches) so verändert wird, oder aber durch den Körper nach Aufnahme so metabolisiert wird, dass sich als wirksame Substanz die erfindungsgemäße Verbindung oder deren Derivate bilden.
Daminin ist ein bisher unbekannter Naturstoff und die Pyrrolalkaloid-Derivate nach der allgemeinen Formel 23 sind davon abgeleitete Syntheseprodukte, die bisher unbekannt waren und deren Wirkung nicht beschrieben ist.
Diese erfindungsgemäßen Verbindungen können mit den üblichen Lösungsmitteln, Hilfs- und Trägerstoffen zu Tabletten, Dragees, Kapseln, Tropflösungen, Suppositorien, Injektions- und Infusionszubereitungen verarbeitet werden, um therapeutisch zur peroralen, rektalen oder parenteralen Applikation Verwendung zu finden.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der Substanz Daminin (24), das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Substanz aus einem marinen Organismus, bevorzugt dem Schwamm Axinella damicomis, gewonnen wird. Des Weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des Naturstoffs Daminin (24) und von Pyrrolalkaloiden der allgemeinen Formel 23 durch chemische Synthese gemäß der Schemata 1 oder 2, wie in den Beispielen angegeben.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung mindestens einer der oben genannten Verbindungen zur Behandlung von Erkrankungen, wie z. B. neurodegenerativen Erkrankungen des ZNS, Ischämie, Alzheimer-Krankheit, psychopathologischen Krankheiten. Diese Verwendung kann zum Beispiel in Form einer Depotsubstanz oder als Vorläufer zusammen mit einer geeigneten, pharmazeutisch verträglichen Verdünnungslösung oder Trägersubstanz erfolgen. Im Falle der Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen wird eine Behandlung in einem Konzentrationsbereich zwischen 0,5 und 3,0 μg/ml bevorzugt.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine erfindungsgemäße Verbindung, zusammen mit geeigneten Zusatz- oder Hilfsstoffen. Diese pharmazeutische Zusammensetzung kann dadurch gekennzeichnet sein, daß die Verbindung in Form einer Depotsubstanz oder als Vorläufer zusammen mit einer geeigneten, pharmazeutisch verträglichen Verdünnungslösung oder Trägersubstanz vorliegt.
Besonders bevorzugt werden pharmazeutische Zusammensetzung, in denen die erfindungsgemäße Verbindung in solch einer Menge vorliegt, daß ein Konzentrationsbereich zwischen 1,0 und 3,0 μg/ml bei der Behandlung in vivo vorliegt.
Erfindungsgemäß kann die oben genannte pharmazeutische Zusammensetzung in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln, Tropflösungen, Suppositorien, Injektions- oder Infusionszubereitungen zur peroralen, rektalen oder parenteralen Verwendung vorliegen. Solche Darreichungsformen und deren Herstellung sind dem Fachmann bekannt.
Die Erfindung soll nun im Folgenden anhand von Beispielen unter Bezug auf die bei gefügten Figuren weiter verdeutlicht werden, ohne jedoch auf diese Beispiele beschränkt zu werden. Es zeigt
1: Reduktion des durch den Glutamatrezeptor-Agonisten L-Glutamat in Neuronen hervorgerufenen Anstiegs des intrazellulären Calcium-Spiegels durch das neue Pyrrolalkaloid Daminin (24). In der Kontrollserie wurden die Neuronen nur mit L-Glutamat behandelt [offene Kreise]. In den Testserien wurden die Neuronen mit steigenden Konzentrationen an Daminin (24) (0,5 μg/ml [gefüllte Dreiecke]; 1,0 μg/ml [offene Quadrate]; beziehungsweise 3,0 μg/ml [offene Rauten]) für 5 Minuten vorinkubiert. Anschließend wurde in die Ansätze L-Glutamat (10 Min.) hinzu gesetzt. Die Änderungskinetik wurde kontinuierlich gemessen. Der Mittelwert (n = 35) als auch die Standardabweichung (± SE) wurden ermittelt.
2: In dieser Versuchsreihe wurde NMDA als Agonist für den Glutamatrezeptor auf Neuronen eingesetzt. Auch dieser bewirkt eine starke Zunahme der Konzentration an intrazellulären Calcium-Ionen ([gefüllte Rauten]). Werden die Neuronen jedoch mit dem neuen Pyrrolalkaloid Daminin (24) (1 μg/ml) vorinkubiert (5 Min.), kommt es zu einer signifikanten Reduktion dieser Zunahme ([offene Quadrate]). Der Mittelwert (n = 30) als auch die Standardabweichung (± SE) wurden ermittelt.
Beispiel 1: Gewinnung des neuen Pyrrolalkaloids Daminin (24) und von Agelongin (22) aus biologischen Material
Im November 2001 wurden in der Bucht von Calvi (Korsika) Exemplare des Schwammes Axinella damicomis gesammelt und bis zur weiteren Bearbeitung tiefgefroren. Zur Extraktion wurde der frisch aufgetaute Schwamm homogenisiert und bei Raumtemperatur zuerst mit Methanol und anschließend mit Chloroform behandelt. Die Extrakte wurden in vacuo aufkonzentriert und die wasserunlösliche Lipidfraktion mit n-Butanol behandelt. Der in n-Butanol lösliche Anteil wurde einer MPLC-Trennung auf einer "reversed-phase"-Säule unterzogen, wobei ein Eluentengradient von Wasser über Methanol nach Chloroform verwendet wurde. Zwei Alkaloidhaltige Fraktionen wurden mit Methanol/Wasser (3:7) (Fraktion A) bzw. Methanol/Wasser (2:8) (Fraktion B) eluiert. Die polarere Fraktion A wurde durch HPLC auf einer RP-18-Säule (Luna, 5 μm, 4,6 × 250 mm) aufgetrennt und über eine weitere HPLC auf einer C-18-Säule (AQUA, 5 μm, 4,6 × 250 mm) aufgereinigt, wodurch Verbindung 24 (4 mg) als Reinsubstanz erhalten wurde. Fraktion B wurde durch zwei aufeinanderfolgende HPLC-Trennungen auf RP-18-Säulen, mit Methanol/Wasser (1:1) als Eluent, aufgereinigt (Luna, 5 μm, 4,6 × 250 mm; Luna 3 μm, 4,6 × 250 mm), dadurch wurden 3 mg der reinen Verbindung 22 erhalten.
Der Vergleich der Spektraldaten von 22 mit Literaturwerten, zeigte, dass es sich um die aus Agelas longissima bekannte Verbindung Agelongin (F. Cafieri, E. Fattorusso, A. Mangoni, O. Taglialatela-Scafati, R. Carnuccio, Bioorg. Med. Chem. Lett. 1995, 5, 799–804) handelte.
Die Summenformel C₁₃H₁₂N₂O₄ für Verbindung 24 wurde aus dem HRFAB-Massenspektrum (gemessen: m/z 261,0890; berechnet: m/z 261,0875) abgeleitet. Das Vorhandensein einer aromatischen Esterfunktion und einer Carboxylatgruppe wurde aus den IR-Absorptionen bei ν_max 1710 cm^–1 bzw. 1646 cm^–1 abgeleitet, erhärtet wurde dieser Befund durch die Signale im ¹³C-NMR-Spektrum bei δ161,6 und δ159,0. Darüberhinaus zeigte das ¹³C-NMR-Spektrum sieben sp²-Methinsignale und zwei nicht protonierte sp²-Kohlenstoffe, ein Hinweis auf aromatische Ringsysteme, sowie zwei sp³-Methylensignale. Im ¹H-NMR-Spektrum (in DMSO-d₆) waren zehn gut aufgelöste Signale zu sehen: sieben aromatische Protonensignale, ein mit D₂O austauschbares Proton sowie zwei miteinander koppelnde Methylensignale im mittleren ppm-Bereich (siehe Tabelle 1). Die Auswertung der NMR-Spektren, inklusive COSY, ROESY, HSQC und HMBC, zeigte eindeutig, dass die Struktur von 24 große Ähnlichkeiten zu Agelongin (22) aufweist. Aus den Spektraldaten ergeben sich zwei heterozyklische Teilstrukturen, ein Pyridinium-β-Carboxylat und ein Pyrrol-2-Carbonsäureester, die durch eine Ethylenbrücke verbunden sind. Somit ist Verbindung 24 das nicht-bromierte Analogon von Agelongin. Die NMR-Spektren erlaubten die vollständige und eindeutige Zuordnung aller ¹³C- und ¹H-Resonanzen; insbesondere die chemischen Verschiebungen der Pyrrolgruppe zeigten eine gute Übereinstimmung mit bekannten 2-substituierten Pyrrolen (J. Kobayashi, F. Kanda, M. Ishibashi, H. Shigemori, J. Org. Chem. 1991, 56, 4574–4576; Y. Cheng, N. Tan, R. Teng, Y. Lu, C. Wang, Q. Zheng, J. Nat. Prod. 2002, 65, 750–752).
Tabelle 1 NMR-Daten von Verbindung 24
24 (Daminin)
Beispiel 2: Synthese neuer Pyrrolalkaloide
2.1 Allgemeiner Syntheseweg
Zur Synthese von 23, können zwei verschiedene Vorgehensweisen gewählt werden, die in Schema 1 und 2 dargestellt sind. Der erste Weg (siehe Schema 1) beginnt mit dem Pyrrolteil des Moleküls, der Pyrrol-2-Carbonsäure 25 (R¹-R³ = H), welche in das bekannte Säurechlorid 26 überführt (T. J. Donohoe, P. M. Guyo, J. Org. Chem. 1996, 61, 7664–7665) wird und anschließend mit einem Überschuss an Ethylenglykol (27, R⁴-R⁷ = H) zum Monoester 28 (R¹-R⁷ = H) umsetzt. Alternativ kann 28 (R¹-R⁷ = H) aus 25 (R¹-R³ = H) auch direkt erhalten werden, indem ein Überschuss an Ethylenglykol (27, R⁴-R⁷ = H) und DCC (Dicyclohexylcarbodiimid), oder ein anderes wasserentziehendes Mittel, eingesetzt wird.
Die weitere Umsetzung von 28 zum Bromid 29 (R¹-R⁷ = H) wird zum Beispiel durch den Einsatz von 1,2-Dibromtetrachlorethan in Kombination mit Triphenylphosphan erreicht (G. Bringmann, S. Schneider, Synthesis 1983, 139–141). Dieses Bromid 29 (R¹-R⁷ = H) kann nun, in Analogie zu anderen N-Alkylierungsreaktionen einfacher Pyridine (z. B. R. C. Elderfield, B. Fischer, J. M. Lagowski, J. Org. Chem. 1957, 22, 1376–1380), mit Nikotinsäure (30, R⁸-R¹¹ = H, X = OH) zum Zielmolekül 23 reagieren.
Mit Hilfe dieses Syntheseweges ist, durch Variation von X sowie der Reste am Pyrrolteil (R¹-R³), an der "Ethylenbrücke" (R⁴-R⁷) und am Nikotinsäureteil (R⁸-R¹¹), auch eine Vielzahl strukturell ähnlicher Verbindungen zugänglich.
Der zweite Syntheseweg (siehe Schema 2) kann, unter bestimmten Umständen, sogar als Eintopfsynthese durchgeführt werden. Dazu wird Verbindung 30 (R⁸-R¹¹ = H, X = OH) durch N-Alkylierung mit dem Bromethanol 31 (R⁴-R⁷ = H) in das Pyridiniumsalz 33 (R⁴-R¹¹ = H, X = OH) überführt. Alternativ kann zur N-Alkylierung auch das entsprechende Epoxid 32 (R⁴-R⁷ = H) verwendet werden. Die Nukleophilie des Pyridins 30 kann durch den Einsatz als Carboxylatsalz (z. B. X = ONa oder OK) noch gesteigert werden. Die Veresterung des so erhaltenen Pyridiniumsalzes 33 mit dem Pyrrol-2-Carbonsäurechlorid 26 (R¹-R³ = H) ergibt das Zielmolekül 24 (R¹-R¹¹ = H, X = OH).
Auch dieser Syntheseweg kann durch Variation der Reste R¹-R¹¹ (siehe Patentansprüche) und von X (welches, z. B., auch O-Alkyl, O-Aryl, NH₂, NH-Alkyl, NH-Aryl, N-Alkyl₂, N-Aryl₂, N-Aryl-Alkyl, etc. sein kann) modifiziert werden.
In ähnlicher Weise können die heterozyklischen Systeme, der Pyridin- und der Pyrrolring, durch andere Regioisomere (z. B. 3- an Stelle von 2-Pyrrolcarbonsäuren) oder auch durch andere mono-, bi- oder oligozyklische, hetero- oder isozyklische, gesättigte oder ungesättigte Ringsysteme ersetzt werden.
2.2 Synthese von Daminin (24)
Darstellung des 1-(2-Hydroxyethyl)-3-Methoxycarbonylpyridinium-Bromids (33a): Eine Lösung von Nikotinsäuremethylester (30a; 1 g) und 2-Bromethanol (31a; 5 ml) in Toluol (7 ml) wurde unter Rühren für 2,5 Stunden auf 120°C erhitzt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand dreimal mit je 15 ml Diethylether gewaschen. Umkristallisation aus 60 ml Acetonitril-Diethylether (1:2) ergab das 1-(2-Hydroxyethyl)-3-methoxycarbonyl-Pyridiniumbromid (33a) in Form weißer Kristalle (siehe Schema 3).
Darstellung von Daminin (24): Eine Suspension von Kaliumpyrrol-2-carboxylat (25a; 230 mg) in Oxalylchlorid (0,25 ml) und Dichlormethan (5 ml) wurde bei Raumtemperatur (RT) unter Stickstoff gerührt. Nach 4 Stunden wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, und der Rückstand wieder in 5 ml Dichlormethan gelöst. Zu dieser Lösung wurden 1-(2-Hydroxyethyl)-3-methoxycarbonyl-Pyridiniumbromid (33a, 262 mg, Schema 3), Pyridin (0,24 ml) und eine katalytische Menge Dimethylaminopyridin gegeben. Die Mischung wurde bei RT über Nacht gerührt. Anschließend wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand mit Diethylether gewaschen. Anschließend wurde der Rückstand in Pyridin (4 ml) gelöst und nach Zugabe von Lithiumjodid (900 mg) bei 100°C gerührt. Nach 3 Stunden wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand durch Säulenchromatographie aufgereinigt (SiO₂, Ethylacetat/Methanol (2:8)). Der so erhaltene Feststoff wurde aus 12 ml Ethanol/Diethylether (2:1) umkristallisiert.
Beispiel 3: Biologische Eigenschaften der Verbindungen Neuroprotektive Aktivität
Materialien: Es wurden die gleichen Materialien wie früher beschrieben verwendet (S. Perovic, A. Wichels, C. Schütt, G. Gerdts, S. Pahler, R. Steffen, W.E.G. Müller, Environm. Toxicol. Phamtacol. 1998, 6, 125–133). Fura-2-acetoxymethylester (Fura-2-AM) wurde von Molecular Probes (Leiden, Niederlande), "Dulbecco's modified Eagle's Medium" mit 4,5 g/L Glucose (DMEM/HG) von Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Deutschland) und die Antikörper "Mäuse-anti-Neurofilament" (68 kDa) und "Mäuse-Anti-Glial-Fibrillary-Acidic-Protein" (Anti-GFAP) von Roche Diagnostics (Mannheim, Deutschland) bezogen.
Zellen: Die kortikale Zellkultur wurde aus den Gehirnen von 17–18 Tage alten Rattenembryonen nach R. I. Freshney (In: Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique (Hrsg.: R. I. Freshney), A. R. Liss Inc., New York, 1987, S. 257–288) erhalten; die Methode wurde leicht modifiziert (S. Perovic, C. Schleger, G. Pergande, S. Iskric, H. Ushijima, P. Rytik, W. E. G. Müller, Eur. J. Pharmacol. (Mol. Pharmacol. Sec.) 1994, 288, 27–33). Zusammenfassend wurden die Neuronen aus den Cerebral-Hemisphären isoliert und diese in "Hank's balanced salt solution" ohne Ca²⁺ und Mg²⁺ (HBSS) überführt. Die Zellen wurden in HBSS mit Hilfe von 0,025% (w/v) Trypsin (10 Min.; 37°C) dissoziiert. Die proteolytische Reaktion wurde mit 10% (v/v) fötalem Kälberserum (FKS) beendet. Die Einzelzell-Suspension wurde zentrifugiert und das resultierende Pellet mit DMEM/HG/10% FKS-Medium aufgenommen. Die Zellen wurden in eine mit Poly-L-Lysin (5 μg/ml, 300 μl/cm²) beschichtete Kammer mit einer Zelldichte von 2,0 × 10⁵ Zellen/cm² ausplattiert. Das DMEM/HG/10% FKS-Medium wurde zwei Tage nach der Isolierung entfernt und durch DMEM/HG/serumfreies Medium ersetzt. Sieben Tage nach der Isolierung erfolgte eine Immunfärbung mit "Anti-Neurofilament"-Antikörper (gegen ein 68-kDa-Protein) als Marker für Neuronen und "Anti-GFAP" als Marker für Gliazellen. Die Kulturen enthielten >80% Neuronen; die restlichen Zellen waren GFAP-positiv und stellten hauptsächlich Astrozyten dar.
Beladen von Neuronen mit Fura-2-AM: Die intrazelluläre Ca²⁺-Konzentration ([Ca²⁺]_i) wurde durch Fluoreszenzmessungen bestimmt. Als Parameter wurde das Verhältnis der Fluoreszenz des Ca²⁺-Indikatorfarbstoffes Fura-2-AM bei den Wellenlängen von 340 und 380 nm herangezogen (G. Grynkiewicz, M. Poenie, R.Y. Tsien, J. Biol. Chem. 1985, 260, 3440–3450). Die Neuronen wurden mit 6 μM Fura-2-AM in DMEM/HG/serumfreiem Medium (plus 1% Rinderserumalbumin) 60 Minuten lang bei 37°C beladen. Nach der Inkubation wurden die Zellen zweimal mit Medium gewaschen und weitere 45 Minuten bei 37°C inkubiert. Diese Inkubationszeit ist ausreichend, um die Neuronen zu beladen (inaktives Fura-2-AM) und den Acetoxymethylester (aktives Fura-2) zu hydrolysieren.
Eine Calcium-Kalibrierungskurve wurde nach der Methode von Grynkiewicz et al. (G. Grynkiewicz, M. Poenie, R.Y. Tsien, J. Biol. Chem. 1985, 260, 3440–3450) erstellt. Fluoreszenzbilder wurden bei 340 und 380 nm erhalten. Der Quotient aus den bei den Fluoreszenzdaten (340/380 nm) wurde berechnet und für die Erstellung der Kalibrierungskurve eingesetzt. Ein Quotient (Ratio) von 1,0 entsprach 228 nM [Ca²⁺]_i.
Versuchsansatz-Änderungen des Calciumspiegels in Neuronen: In dieser Versuchsreihe wurden die Zellen zuerst mit Fura-2-AM beladen und anschließend mit den Testsubstanzen (in Locke's Lösung; 154 mM NaCl; 5,6 mM KCl; 3,6 mM NaH-CO₃; 5,6 mM Glucose und 10 mM HEPES; pH 7,4; ohne CaCl₂) behandelt. Daminin (24) wurde in Wasser (Konzentration: 10 mg/ml) gelöst und bei 4°C gelagert. Neuronen wurden im ersten Ansatz (Kontrollen) nach 10 Minuten mit 200 μl L-Glutaminsäure (L-Glu) oder 200 μM N-Methyl-D-Asparaginsäure (NMDA) und 2,4 mM CaCl₂ stimuliert. Im Testansatz wurden die Zellen mit dem Daminin (24) zunächst vorinkubiert (5 Minuten mit 0,5; 1,0; 3,0 μg/ml Daminin); anschließend wurden 200 μM L-Glu oder 200 μM NMDA und 2,4 mM CaCl₂ zu den Ansätzen zugegeben (für 10 Minuten), und es wurde die Änderung des Calciumspiegels der vorinkubierten Neuronen bestimmt. Die Versuchsdauer zur Messung des [Ca²⁺]_i-Spiegels betrug 20–27 Minuten.
Zur Durchführung wurden die Zellen auf mit Poly-L-Lysin beschichteten Deckgläsern im 4-Kammer-System (Lab-Tek^® Chamber Slide^TM-System; Nunc, Wiesbaden, Deutschland) kultiviert. Mit einem "inverted-stage"-Mikroskop Olympus IX70 mit apochromatisch reflektierendem Licht und dem Fluoreszenzobjektiv UApo40X/340 wurden die Fluoreszenzmessungen durchgeführt. Die Zellen wurden alternierend mit Licht der Wellenlängen 340 und 380 nm mit Hilfe eines computergesteuerten Schmalband-Interferenzfilters vor einer 100-W-Xenon-Lampe beleuchtet. Zusätzlich wurde ein 0,25-ND-Filter für 380 nm benutzt. Die Fluoreszenzemissionen bei 510 nm wurden mit einer CCD-Kamera (Modell C2400-87; Hamamatsu, Herrsching, Deutschland) aufgezeichnet. Die Bilder wurden computergestützt, mit dem Imaging-System Argus 50, Hamamatsu, digitalisiert als 256 × 256 pixels mit 8-bit-Arrays. Der Quotient (Ratio) 340/380 nm wurde durch Division der Bilderpaare ermittelt.
Statistik: Die Ergebnisse wurden mittels eines gepaarten Student's t-test (L. Sachs, Angewandte Statistik (Springer, Berlin) (1984) Seite 1-552 ausgewertet.
Ergebnisse: Die Neuronen wurden mit dem neuen Pyrrolalkaloid Daminin (24) vorinkubiert (5 Minuten) und anschließend mit L-Glutamat (200 μM) oder N-Methyl-D-Asparaginsäure (NMDA; 200 μM) in Anwesenheit von 2,4 mM CaCl₂ behandelt. Wurde L-Glutamat als Agonist eingesetzt und die Neuronen ohne Pyrrolalkaloid inkubiert, wurde ein Anstieg von intrazellulärem Calcium ([Ca²⁺]_i) von einem Ratio-Quotient von 0,75 ± 0,07 auf ein Ratio-Quotient von 2,29 ± 0,13 (305%) ermittelt (1). Wurde hingegen NMDA eingesetzt, wurde ein Anstieg des Ratio-Quotientes von 0,83 ± 0,04 auf 1,95 ± 0,08 (235%) gemessen (2). Die Kontrollen wurden dabei als 100% angenommen.
Eine Präinkubation der Neuronen mit 0,5, 1,0 und 3,0 μg/ml Daminin (24) zeigte einen Abfall des (Ca²⁺]_i-Spiegels nach der Zugabe von 200 μM L-Glu und 2,4 mM CaCl₂ (1). Der Abfall des [Ca²⁺]_i-Spiegels war signifikant und betrug etwa 65,7% bei 0,5 μg/ml (p<0,05); 58,0% bei 1,0 μg/ml (p<0,001) und 25,1% bei 3,0 μg/ml (p<0,001; 1).
Die Abnahme der freien Calciumkonzentration in Neuronen nach Präinkubation mit 1,0 μg/ml Daminin (24) und anschließender Inkubation mit 200 μM NMDA war ebenfalls signifikant; im Vergleich zur Kontrolle waren die Werte um 36,5% (p<0,05; 2;) gesunken.
Aus den in der 1 (Agonist: L-Glutamat) zusammengefassten Daten geht hervor, dass das neuen Pyrrolalkaloid Daminin (24) bereits in den niedrigen Konzentrationen von 0,5 μg/ml signifikant den Anstieg an intrazellulären Calcium-Ionen reduziert. Bei höheren Konzentrationen ist dieser protektive Effekt noch stärker.
Auch aus dieser Serie muß der Schluß gezogen werden, daß das neue Pyrrolalkaloid Daminin (24) auch in dem Versuchssystem mit dem NMDA-Agonisten eine sehr ausgeprägte Protektionswirkung gegenüber NMDA besitzt (2; Agonist: NMDA).
Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, daß die Vorinkubation von Neuronen mit niedrigen Konzentrationen des neuen Pyrrolalkaloids Daminin (24) eine signifikante Neuroprotektion bewirkt.

Claims

Verbindung der allgemeinen Formel 23:
worin R¹ bis R¹¹ unabhängig voneinander entweder Wasserstoff, ein C₁-C₁₈-Alkyl oder C₁-C₁₈ Alkenyl, wobei das Alkyl beziehungsweise Alkenyl gerade, verzweigt oder cyclisch sein kann, ein Aryl- oder Heteroarylrest, ein über ein C₁-C₁₈-Alkyl oder C-C₁₈-Alkenyl gebundener Aryl- oder Heteroarylrest, eine Acylgruppe, ausgewählt aus Formyl, Acetyl, Trichloracetyl, Fumaryl, Maleyl, Succinyl, Benzoyl, eine Sulfonylgruppe, ausgewählt aus -SO₃H, -SO₂Me, -SO₂CF₃, -SO₂C₆H₄CH₃ oder -SO₂C₆H₄CH₂Br, oder Fluor, Chlor, Brom, Jod, -CN, NO₂, eine Alkoxygruppe -OR oder eine Thioethergruppe -SR oder eine Aminogruppe -NRR', deren Reste R und R' jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, ein C₁-C₁₈-Alkyl oder C₁-C₁₈-Alkenyl, wobei das Alkyl beziehungsweise Alkenyl gerade, verzweigt oder cyclisch sein kann, ein Aryl- oder Heteroarylrest, ein über ein C₁-C₁₈-Alkyl oder C₁-C₁₈-Alkenyl gebundener Aryl- oder Heteroarylrest, eine Acylgruppe, ausgewählt aus Formyl, Acetyl, Trichloracetyl, Fumaryl, Maleyl, Succinyl, Benzoyl, oder eine Sulfonylgruppe, ausgewählt aus -SO₃H, -SO₂Me, -SO₂CF₃, -SO₂C₆H₄CH₃ oder -SO₂C₆H₄CH₂Br sein können, sind, wobei im Falle von R⁶ unterschiedlich von R⁷ oder R⁴ unterschiedlich von R⁵ oder bei ste risch sperrigen Arylresten R¹-R³ sowie R⁸-R¹¹ die Verbindung zentro- oder axialchiral sein kann, sowie alle auftretenden Stereoisomere und racemischen Gemische davon, jeweils R¹-R³ sowie R⁴-R⁷ und R⁸-R¹¹ so untereinander in der Art verknüpft sein können, dass dadurch ein iso- oder heteroaromatischer oder gesättigter Ring gebildet ist, mit der Maßgabe, dass Formel 23 nicht die folgende Formel 22 bedeutet:
Agelongin (22)
Verbindung nach Anspruch 1 mit der Formel 24:
Daminin (24)
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel 23 nach Anspruch 1, umfassend die Isolierung der Verbindung aus einem Schwamm der Gattung Axanella, insbesondere Axinella damicornis., unter Verwendung an sich bekannter Verfahrensschritte.
Verfahren nach Anspruch 3 zur Isolierung von Agelongin (22) und Daminin (24).
Verfahren zur Synthese einer Verbindung der allgemeinen Formel 23 nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass man gemäß dem folgenden allgemeinen Schema a) eine Pyrrolcarbonsäure der allgemeinen Formel 25 mit einem Diol der allgemeinen Formel 27 zu einer Verbindung der allgemeinen Formel 28 verestert, b) eine Verbindung der allgemeinen Formel 28 durch Hydroxy/Halogenaustausch zu einem Halogenid der allgemeinen Formel 29 umsetzt, und c) eine Halogenverbindung der allgemeinen Formel 29 mit einem Pyridinderivat der allgemeinen Formel 30 unter nucleophiler Substitution zu einem Pyridiniumsalz der allgemeinen Formel 23 umsetzt,
wobei in den allgemeinen Formeln 25, 27, 28, 29 und 30 die Reste R¹ bis R¹¹ die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen haben.
Verfahren zur Synthese einer Verbindung der allgemeinen Formel 23 nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man gemäß dem folgenden allgemeinen Schema a) eine Pyridin-Verbindung der allgemeinen Formel 30 mit einem Halogenid der allgemeinen Formel 31 oder mit einer Epoxid-Verbindung der allgemeinen Formel 32 unter Epoxid-Öffnung zu einer Pyridinium-Verbindung der allgemeinen Formel 33 umsetzt, und b) eine Verbindung der allgemeinen Formel 33 mit einer Pyrrolcarbonsäure der allgemeinen Formel 25 zu einer Verbindung der allgemeinen Formel 23 unter Veresterung umsetzt,
wobei in den allgemeinen Formeln 25, 30, 31, 32 und 33 die Reste R¹ bis R¹¹ die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen haben.
Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, weiterhin umfassend eine anschließende synthetische Derivatisierung der dargestellten Verbindungen.
Verbindung nach Anspruch 1 oder 2 als Medikament zur Prävention oder Behandlung von Erkrankungen.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- oder Hilfsstoffen.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung in Form einer Depotsubstanz oder als Vorläufer zusammen mit einer geeigneten, pharmazeutisch verträglichen Verdünnungslösung oder Trägersubstanz vorliegt.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Oberflächenbeschichtung von medizinischen Vorrichtungen, als Zusatz von Werkstoffen oder Spüllösung vorliegt.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 11 in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln, Tropflösungen, Suppositorien, Injektions- oder Infusionszubereitungen zur peroralen, rektalen oder parenteralen Verwendung.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 oder 2 zur Behandlung und Prävention von neurodegenerativen Erkrankungen.