DE10162730A1 - Allele des glk-Gens aus coryneformen Bakterien - Google Patents
Allele des glk-Gens aus coryneformen BakterienInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft Allele glk-Gens aus coryneformen Bakterien, kodierend für Glukokinasen und Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin unter Verwendung von Bakterien, die diese Allele enthalten.
Description
- Gegenstand der Erfindung sind Allele des glk-Gens aus coryneformen Bakterien kodierend für Varianten der Glukokinase und Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin unter Verwendung von Bakterien, die diese Allele enthalten.
- Stand der Technik
- Die Aminosäure L-Lysin findet in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung Anwendung.
- Es ist bekannt, daß Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen wie zum Beispiel Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien, wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.
- Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und die Aminosäuren produzieren. Ein bekannter Antimetabolit ist das Lysinanalogon S-(2-Aminoethyl)-L-Cystein (AEC).
- Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung von L- Aminosäure produzierenden Stämmen von Corynebacterium eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die Aminosäure- Produktion untersucht.
- Die Nukleotidsequenz des für die Glukokinase von Corynebacterium glutamicum kodierenden Gens kann der Patentanmeldung WO 01/00844 unter dem Identification Code RXA02149 als Sequenz Nr. 23 entnommen werden.
- Weiterhin kann die Nukleotidsequenz des für die Glukokinase von Corynebacterium glutamicum kodierenden Gens der Patentanmeldung EP-A-1108790 als Sequenz Nr. 3484 sowie als Sequenz Nr. 7066 entnommen werden.
- Die Nukleotidsequenz ist ebenfalls in der Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) der National Library of Medicin (Bethesda, MD, USA) unter der Accession Number AX064897 und unter der Accession Number AX123568 hinterlegt.
- Die förderliche Wirkung der Überexpression des glk-Gens auf die Lysin-Produktion ist in der EP-A-1106694 dargelegt.
- Die Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von L- Lysin bereitzustellen.
- Wenn im folgenden L-Lysin oder Lysin erwähnt werden, sind damit nicht nur die Basen, sondern auch die Salze wie z. B. Lysin-Monohydrochlorid oder Lysin-Sulfat gemeint.
- Gegenstand der Erfindung sind aus coryneformen Bakterien insbesondere Corynebacterium glutamicum stammende für das Enzym Glukokinase kodierende, replizierbare Nukleotidsequenzen (DNA), wobei die zugehörigen Aminosäuresequenzen in der SEQ ID No. 2 an Position 213 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Alanin enthalten.
- Gegenstand der Erfindung ist weiterhin eine aus coryneformen Bakterien insbesondere Corynebacterium glutamicum stammende für das Enzym Glukokinase kodierende, replizierbare Nukleotidsequenz (DNA), wobei die zugehörige Aminosäuresequenz an Position 213 L-Valin enthält, dargestellt in der SEQ ID No. 4.
- Gegenstand der Erfindung ist weiterhin eine aus coryneformen Bakterien insbesondere Corynebacterium glutamicum stammende für das Enzym Glukokinase kodierende, replizierbare Nukleotidsequenz (DNA), deren Basensequenz an der Position 638 Thymin enthält, dargestellt in SEQ ID No. 3.
- Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Plasmide (Vektoren), die die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen enthalten und gegebenenfalls in coryneformen Bakterien replizieren.
- Gegenstand der Erfindung sind weiterhin coryneforme Bakterien, die die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen enthalten und in denen die für die Glukokinase kodierenden Nukleotidsequenzen gegebenenfalls überexprimiert vorliegen, wobei in den zugehörigen Aminosäuresequenzen an Position 213 von SEQ ID No. 2 eine andere proteinogene Aminosäure enthalten ist.
- Unter Überexpression versteht man eine Erhöhung der intrazellulären Konzentration oder Aktivität der erfindungsgemäßen Glukokinasen.
- Durch die Maßnahmen der Überexpression, wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 50%, maximal bis 1000% oder 2000%, bezogen auf die Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus erhöht.
- Zur Erzielung einer Überexpression kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich die Expression im Verlaufe der fermentativen L-Lysin-Produktion zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.
- Zur Erhöhung der Kopienzahl der erfindungsgemäßen glk- Allele eignen sich Plasmide, die in coryneformen Bakterien repliziert werden. Zahlreiche bekannte Plasmidvektoren wie z. B. pZ1 (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554), pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 102: 93-98 (1991)) oder pHS2-1 (Sonnen et al., Gene 107: 69-74 (1991)) beruhen auf den kryptischen Plasmiden pHM1519, pBL1 oder pGA1. Andere Plasmidvektoren wie z. B. solche, die auf pCG4 (US-A 4,489,160), oder pNG2 (Serwold- Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)) oder pAG1 (US-A 5,158,891) beruhen, können in gleicher Weise verwendet werden.
- Weiterhin kann zur Erhöhung der Kopienzahl das Verfahren der chromosomalen Genamplifikation angewendet werden, so wie es beispielsweise von Remscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)) zur Duplikation bzw. Amplifikation des hom-thrB-Operons beschrieben wurde. Bei dieser Methode wird das vollständige Gen bzw. Allel in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman, Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84 (1994); US-A 5,487,993), pCR®Blunt (Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)), pEM1 (Schrumpf et al., Journal of Bacteriology 173: 4510-4516 (1991)) oder pBGS8 (Spratt et al., Gene 41: 337-342 (1986)) in Frage. Der Plasmidvektor, der das zu amplifizierende Gen bzw. Allel enthält, wird anschließend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines "cross over"-Ereignisses enthält der resultierende Stamm mindestens zwei Kopien des betreffenden Gens bzw. Allels.
- Gegenstand der Erfindung sind aus coryneformen Bakterien stammende, für das Enzym Glucokinase kodierende, replizierbare, bevorzugt endogene Nukleotidsequenzen (DNA), wobei in den zugehörigen Aminosäuresequenzen das L-Alanin an Position 213 von SEQ ID No. 2 durch eine andere proteinogene Aminosäure ersetzt wird, insbesondere L-Valin, dargestellt in SEQ ID No 4. Gegenstand der Erfindung sind ebenso aus coryneformen Bakterien stammende, für das Enzym Glukokinase kodierende, replizierbare, bevorzugt endogene Nukleotidseguenzen (DNA), deren zugehörige Basensequenz an der Position 638 Thymin enthält, dargestellt in SEQ ID No. 3.
- Unter "endogenen Genen" oder "endogenen Nukleotidsequenzen" versteht man die in der Population einer Art vorhandenen Gene beziehungsweise Nukleotidsequenzen.
- Die Erfindung betrifft ebenso Vektoren (Plasmide) die die genannten Nukleotidsequenzen enthalten und gegebenenfalls in coryneformen Bakterien replizieren.
- Beansprucht werden auch coryneforme Bakterien, in denen die genannten Nukleotidsequenz(en) gemäß Enzym Glukokinase kodierenden Nukleotidseguenzen, bevorzugt überexprimiert vorliegen.
- Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin oder L-Lysin enthaltenden Futtermitteladditive, bei dem man im allgemeinen folgende Schritte durchführt:
- a) Fermentation coryneformer Bakterien, die für das Enzym
Glucokinase kodierende endogene Nukleotidsequenzen
enthalten, wobei in den zugehörigen
Aminosäuresequenzen das L-Alanin an der Position 213
durch eine andere proteinogene Aminosäure ersetzt ist,
bevorzugt L-Valin.
Die Allele des endogenen Glucokinase-Gens werden unter Bedingungen überexprimiert, die für die Bildung des Enzyms Glucokinase geeignet sind. - b) Anreicherung des L-Lysins in der Fermentationsbrühe,
- c) Isolierung des L-Lysins oder L-Lysin enthaltenden Futtermitteladditivs aus der Fermentationsbrühe, gegebenenfalls
- d) mit Bestandteilen aus der Fermentationsbrühe und/oder der Biomasse (> 0 bis 100%).
- Unter proteinogenen Aminosäuren sind sämtliche Aminosäuren zu verstehen, die Bestandteile von Proteinen beziehungsweise Polypeptiden sind. Insbesondere sind dies: L-Asparaginsäure, L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L- Glutaminsäure, L-Glutamin, Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L- Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L- Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan, L-Prolin und L-Arginin.
- Die Wildform des glk-Gens ist in Wildtypstämmen coryneformer Bakterien insbesondere der Gattung Corynebacterium enthalten. Sie ist in der SEQ ID No. 1 dargestellt. Das Wildtyp-Protein ist in der SEQ ID No. 2 dargestellt.
- Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die in der Fachwelt bekannte Art Corynebacterium glutamicum zu nennen. Bekannte Wildtypstämme der Art Corynebacterium glutamicum sind beispielsweise
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020. - Zur Erzeugung der erfindungsgemäßen glk-Allele, die für Varianten der Glukokinase, gekennzeichnet durch einen Aminosäureaustausch an Position 213 der SEQ ID No. 2, kodieren, werden im Stand der Technik beschriebene Mutagenesemethoden verwendet.
- Für die Mutagenese können klassische in-vivo Mutageneseverfahren unter Verwendung mutagener Stoffe wie beispielsweise N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidin oder ultraviolettes Licht verwendet werden.
- Weiterhin können für die Mutagenese in-vitro Methoden wie beispielsweise eine Behandlung mit Hydroxylamin (Miller, J. H.: A Short Course in Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1992) oder mutagene Oligonukleotide (T. A. Brown: Gentechnologie für Einsteiger, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993) oder die Polymerasekettenreaktion (PCR), wie sie im Handbuch von Newton und Graham (PCR, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1994) beschrieben ist, verwendet werden.
- Weitere Anleitungen zur Erzeugung von Mutationen können dem Stand der Technik und bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
- Bei Verwendung von in-vitro Methoden wird das im Stand der Technik beschriebene glk-Gen ausgehend von isolierter Gesamt-DNA eines Wildtypstammes mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion amplifiziert, gegebenenfalls in geeignete Plasmidvektoren kloniert, und die DNA anschließend dem Mutageneseverfahren unterworfen. Anleitungen zur Amplifikation von DNA-Sequenzen mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) findet der Fachmann unter anderem im Handbuch von Gait: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994). Geeignete glk- Allele werden anschließend mit den oben beschriebenen Verfahren ausgelesen und untersucht.
- Gegenstand der Erfindung ist ein neues für eine Variante der Glukokinase kodierendes glk-Allel, das in SEQ ID No. 3 dargestellt ist.
- Die erfindungsgemäßen glk-Allele können durch das Verfahren des Genaustausches ("gene replacement"), wie es bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)) oder Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915-927 (1998)) beschrieben ist, in geeignete Stämme überführt werden. Das entsprechende glk Allel wird hierbei in einen für C. glutamicum nicht replikativen Vektor wie beispielsweise pK18mobsacB oder pK19mobsacB (Jäger et al., Journal of Bacteriology 174: 5462-65 (1992)) oder pCR®Blunt (Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) kloniert und dieser anschließend durch Transformation oder Konjugation in den gewünschten Wirt von C. glutamicum überführt. Nach homologer Rekombination mittels eines ersten, Integration bewirkenden "cross-over"-Ereignisses und eines geeigneten zweiten, eine Exzision bewirkenden "cross-over"-Ereignisses im Zielgen bzw. in der Zielsequenz erreicht man den Einbau der Mutation.
- Zusätzlich kann es für die Produktion von L-Aminosäuren vorteilhaft sein, zusätzlich zur Verwendung der erfindungsgemäßen glk-Allele gleichzeitig eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges, der Glykolyse, der Anaplerotik, des Zitronensäure-Zyklus, des Pentosephosphat-Zyklus, des Aminosäure-Exports und gegebenenfalls regulatorische Proteine zu verstärken, insbesondere überzuexprimieren. Die Verwendung endogener Gene wird im allgemeinen bevorzugt.
- Unter "endogenen Genen" oder "endogenen Nukleotidsequenzen" versteht man die in der Population einer Art vorhandenen Gene beziehungsweise Nukleotidsequenzen und Allele.
- Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor verwendet oder ein Gen oder Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym (Protein) mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
- Durch die Maßnahmen der Verstärkung, insbesondere Überexpression, wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500%, maximal bis 1000% oder 2000% bezogen auf die des Wildtyp- Proteins beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus erhöht.
- So kann für die Herstellung von L-Lysin zusätzlich zur Verwendung der Variante des glk-Gens gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe
- - das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende Gen dapA (EP-B 0 197 335),
- - das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase kodierende Gen gap (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
- - das für die Enolase kodierende Gen eno (DE: 199 47 791.4),
- - das für die Triosephosphat-Isomerase kodierende Gen tpi (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
- - das für die 3-Phosphoglycerat-Kinase kodierende Gen pgk (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
- - das für die Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen zwf (JP-A-09224661, EP-A-1108790),
- - das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende Gen pyc (DE-A-198 31 609, EP-A-1108790),
- - das für die Malat-Chinon-Oxidoreduktase kodierende Gen mqo (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)),
- - das für eine feed-back resistente Aspartatkinase kodierende Gen lysC (Accession No. P26512; EP-B-0387527; EP-A-0699759; WO 00/63388),
- - das für das Lysin-Export-Protein kodierende Gen lysE (DE-A-195 48 222),
- - das für das Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1 (DE: 199 59 328.0, DSM 13115)
- - das für die 6-Phosphogluconate Dehydrogenase kodierende Gen gnd (WO 01/71012),
- - das für eine Untereinheit der Glukose-6-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen opcA (Sequenz Nr. 79 aus WO 01/00844; WO 01/04322),
- Die Verstärkung der 6-Phosphogluconate Dehydrogenase kann unter anderem auch durch Aminosäureaustausche, wie beispielsweise durch den Austausch von L-Prolin gegen L- Serin, L-Leucin, L-Isoleucin oder L-Threonin an Position 158 des Enzymproteins und/oder durch den Austausch von L- Serin durch L-Phenylalanin oder L-Tyrosin an Position 361 des Enzymproteins erreicht werden.
- Die Verstärkung der Untereinheit der Glukose-6-Phosphat Dehydrogenase, für welche das Gen opcA kodiert, kann unter anderem auch durch Aminosäureaustausche, wie beispielsweise durch den Austausch von L-Serin gegen L-Phenylalanin oder L-Tyrosin an Position 312 des Enzymproteins erreicht werden.
- Weiterhin kann es für die Produktion von L-Lysin vorteilhaft sein, neben der Verwendung der erfindungsgemäßen Allele des glk-Gens gleichzeitig eines oder mehrere der endogenen Gene, ausgewählt aus der Gruppe
- - das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende Gen pck (DE 199 50 409.1, DSM 13047),
- - das für die Glucose-6-Phosphat-Isomerase kodierende Gen pgi (US 09/396,478, DSM 12969),
- - das für die Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB (DE: 199 51 975.7, DSM 13114),
- - das für das Zwa2-Protein kodierende Gen zwa2 (DE: 199 59 327.2, DSM 13113),
- - das für die Fructose-1,6-Bisphosphat Aldolase kodierende Gen fda (Accession No. X17313; von der Osten et al., Molecular Microbiology 3 (11), 1625-1637 (1989)),
- - das für die Homoserin-Dehydrogenase kodierende Gen hom (EP-A-0131171),
- - das für die Homoserin-Kinase kodierende Gen thrB (Peoples, O. W., et al., Molecular Microbiology 2 (1988): 63-72) und
- - das für die Phosphofruktokinase kodierende Gen pfkB (Sequenz Nr. 57 aus WO 01/00844),
- Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen oder Enzym (Protein) inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
- Durch die Maßnahmen der Abschwächung wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen auf 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration des Wildtyp- Proteins, beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus, herabgesenkt.
- Die Abschwächung der Phosphofruktokinase kann unter anderem auch durch Aminosäureaustausche, wie beispielsweise durch den Austausch von L-Leucin gegen L-Alanin, L-Glycin oder L- Prolin an Position 109 des Enzymproteins erreicht werden.
- Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung und können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von L-Aminosäuren kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
- Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.
- Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette, wie zum Beispiel Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren, wie zum Beispiel Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie zum Beispiel Glycerin und Ethanol und organische Säuren, wie zum Beispiel Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
- Als Stickstoffquelle können organische Stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
- Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten, wie zum Beispiel Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.
- Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak beziehungsweise Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie zum Beispiel Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, wie zum Beispiel Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoffhaltige Gasmischungen, wie zum Beispiel Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
- Methoden zur Bestimmung von L-Aminosäuren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann zum Beispiel so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben durch Anionenaustausch-Chromatographie mit anschließender Ninhydrin-Derivatisierung erfolgen, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174) beschrieben.
- Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur fermentativen Herstellung von L-Lysin.
- Die Konzentration von L-Lysin kann gegebenenfalls durch den Zusatz von L-Lysin auf den gewünschten Wert eingestellt werden.
- Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
- Der Corynebacterium glutamicum Stamm DM1454 wurde durch mehrfache, ungerichtete Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl aus C. glutamicum ATCC13032 hergestellt. Der Stamm ist resistent gegen das Lysin-Analogon S-(2- Aminoethyl)-L-Cystein.
- Aus dem Stamm DM1454 wird mit den üblichen Methoden (Eikmanns et al., Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) chromosomale DNA isoliert. Mit Hilfe der Polymerase- Kettenreaktion wird ein DNA-Abschnitt amplifiziert, welcher das glk-Gen bzw. Allel trägt. Aufgrund der für C. glutamicum bekannten Sequenz des glk-Gens (Sequenz Nr. 3484 sowie Sequenz Nr. 7066 aus EP-A-1108790) werden folgende Primer-Oligonukleotide für die PCR ausgewählt:
glk_XL-A1 (SEQ ID No. 6):
5' ga tct aga-gct tct cga cga tcc gat cc 3'
glk_XL-A2 (SEQ ID No. 7):
5' ga tct aga-cat tat ctg cgg tgc ggt cc 3' - Die dargestellten Primer werden von der Firma MWG Biotech (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert und nach der Standard-PCR-Methode von Innis et al. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press) die PCR Reaktion durchgeführt. Die Primer ermöglichen die Amplifizierung eines ca. 1,65 kb langen DNA-Abschnittes, welcher das glk-Gen bzw. Allel trägt. Außerdem enthalten die Primer die Sequenz für eine Schnittstelle der Restriktionsendonuklease XbaI, die in der oben dargestellten Nukleotidabfolge durch Unterstreichen markiert ist.
- Das amplifizierte DNA-Fragment von ca. 1,65 kb Länge, welches das glk-Allel des Stammes DM1454 trägt, wird durch Elektrophorese in einem 0,8%igen Agarosegel identifiziert, aus dem Gel isoliert und mit den üblichen Methoden aufgereinigt (QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden).
- Die Nukleotidsequenz des amplifizierten DNA-Fragmentes bzw. PCR-Produktes wird von der Firma MWG Biotech (Ebersberg, Deutschland) durch Sequenzierung ermittelt. Die Sequenz des PCR-Produktes ist in der SEQ ID No. 5 dargestellt. Die Sequenz der Kodierregion ist zusätzlich in der SEQ ID No. 3 dargestellt. Die sich mit Hilfe des Programmes Patentin ergebende Aminosäuresequenz des dazugehörigen Glukokinase- Proteins ist in der SEQ ID No. 4 dargestellt.
- An der Position 638 der Nukleotidsequenz der Kodierregion des glk-Allels von Stamm DM1454 befindet sich die Base Thymin (SEQ ID No. 3). An der entsprechenden Position des Wildtypgens befindet sich die Base Cytosin (SEQ ID No. 1).
- An der Position 213 der Aminosäuresequenz des Glukokinase- Proteins von Stamm DM1454 befindet sich die Aminosäure Valin (SEQ ID No. 4). An der entsprechenden Position des Wildtyp-Proteins befindet sich die Aminosäure Alanin (SEQ ID No. 2).
- Das glk-Allel, welches an der Position 638 der Kodierregion die Base Thymin enthält und dementsprechend für ein Glukokinase-Protein kodiert, welches an Position 213 der Aminosäuresequenz die Aminosäure Valin enthält, wird im Folgenden als glk_A213V-Allel bezeichnet. Bei der Bezeichnung "glk_A213V" steht A für L-Alanin, V für L-Valin und 213 gibt die Position des Aminosäureaustausches an (Siehe SEQ ID No. 2 und 4).
- Das in Beispiel 1 beschriebene, mittels PCR hergestellte DNA-Fragment von ca. 1,65 kb Länge, welches das glk_A213V- Allel trägt, wird mittels Austauschmutagenese unter Zuhilfenahme des bei Schäfer et al. (Gene, 14, 69-73 (1994)) beschriebenen sacB-Systems in das Chromosom des C. glutamicum Stammes DSM5715 eingebaut. Dieses System ermöglicht die Herstellung bzw. die Selektion von Allel- Austauschen, die sich durch homologe Rekombination vollziehen.
- Dazu wird das ca. 1,65 kb große glk_A213-V-Fragment mit der Restriktionsendonuklease XbaI gespalten, durch Elektrophorese in einem 0,8%igen Agarosegel identifiziert und anschließend aus dem Gel isoliert und mit den üblichen Methoden aufgereinigt (QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden).
- Der mobilisierbare Klonierungsvektor pK18mobsacB wird mit dem Restriktionsenzym XbaI verdaut und die Enden mit alkalischer Phosphatase (Alkaline Phosphatase, Boehringer Mannheim, Deutschland) dephosphoryliert. Der so vorbereitete Vektor wird mit dem ca. 1,6 kb glk_A213V- Fragment gemischt und der Ansatz mit T4-DNA-Ligase (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Deutschland) behandelt.
- Anschließend wird der E. coli Stamm S17-1 (Simon et al., Bio/Technology 1: 784-791, 1993) mit dem Ligationsansatz transformiert (Hanahan, In. DNA cloning. A practical approach. Vol. 1. ILR-Press, Cold Spring Habor, New York, 1989). Die Selektion der Plasmid-tragenden Zellen erfolgt durch Ausplattieren des Tansformationsansatztes auf LB-Agar (Sambrock et al., Molecular Cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Habor, New York, 1989), der mit 25 mg/l Kanamycin supplementiert wurde.
- Plasmid-DNA wird aus einer Transformante mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep Kit der Firma Qiagen isoliert und durch Restriktionsspaltung mit dem Enzym BamHI und anschließender Agarosegel-Elektrophorese überprüft. Das Plasmid wird pK18mobsacB_glk_A213V genannt und ist in Fig. 1 dargestellt.
- Der in Beispiel 2.1 genannte Vektor pK18mobsacB_glk_A213V wird nach einem Protokoll von Schäfer et al. (Journal of Microbiology 172: 1663-1666 (1990)) in den C. glutamicum Stamm DSM5715 durch Konjugation transferiert. Der Vektor kann in DSM5715 nicht selbständig replizieren und bleibt nur dann in der Zelle erhalten, wenn er als Folge eines Rekombinationsereignisses im Chromosom integriert vorliegt. Die Selektion von Transkonjuganten, d. h. von Klonen mit integriertem pK18mobsacB_glk_A213V erfolgt durch Ausplattieren des Konjugationsansatzes auf LB-Agar (Sambrock et al., Molecular Cloning: a laboratory manuel. 2nd Ed. Cold Spring Habor, New York, 1989), der mit 15 mg/l Kanamycin und 50 mg/l Nalidixinsäure supplementiert wird. Kanamycin-resistente Transkonjuganten werden auf LB- Agarplatten mit 25 mg/l Kanamycin ausgestrichen und für 24 Stunden bei 33°C inkubiert. Zur Selektion von Mutanten, bei denen als Folge eines zweiten Rekombinationsereignisses die Exzision des Plasmides stattgefunden hat, werden die Klone 30 Stunden unselektiv in LB-Flüssigmedium kultiviert, anschließend auf LB-Agar mit 10% Sucrose ausgestrichen und 16 Stunden bebrütet.
- Das Plasmid pK18mobsacB_glk_A213V enthält ebenso wie das Ausgangsplasmid pK18mobsacB neben dem Kanamycin- Resistenzgen eine Kopie des für die Levan-Sucrase aus Bacillus subtilis kodierenden sacB-Gens. Die durch Sucrose induzierbare Expression führt zur Bildung der Levan- Sucrase, die die Synthese des für C. glutamicum toxischen Produktes Levan katalysiert. Auf LB-Agar mit Sucrose wachsen daher nur solche Klone an, bei denen das integrierte pK18mobsacB_glk_A213V als Folge eines zweiten Rekombinationsereignisses exzisiert hat. In Abhängigkeit von der Lage des zweiten Rekombinationsereignisses in bezug auf den Mutationsort findet bei der Exzision der Allelaustausch bzw. der Einbau der Mutation statt oder es verbleibt die ursprüngliche Kopie im Chromosom des Wirtes.
- Ungefähr 40 bis 50 Kolonien werden auf den Phänotyp "Wachstum in Gegenwart von Sucrose" und "Nicht-Wachstum in Gegenwart von Kanamycin" geprüft. Bei 4 Kolonien, die den Phänotyp "Wachstum in Gegenwart von Sucrose" und "Nicht- Wachstum in Gegenwart von Kanamycin" aufweisen, wird ein die Mutation A213V überspannender Bereich des glk-Gens, ausgehend von dem Sequenzierprimer gl1 (SEQ ID No. 8), von der Firma GATC Biotech AG (Konstanz, Deutschland) sequenziert, um nachzuweisen, daß die Mutation des glk_A213V-Allels im Chromosom vorliegt. Der verwendete Primer g/l wird dazu von der Firma GATC Biotech AG synthetisiert:
gl1 (SEQ ID No. 8):
5' gga aca tga tgc caa ctc ag 3' - Auf diese Weise wird ein Klon identifiziert, der an der Position 638 der Kodierregion des glk-Gens die Base Thymin enthält und somit das glk_A213V-Allel besitzt. Dieser Klon wird als Stamm DSM5715glk_A213V bezeichnet.
- Herstellung von Lysin
- Der in Beispiel 2 erhaltene C. glutamicum Stamm DSM5715glk_A213V wird in einem zur Produktion von Lysin geeigneten Nährmedium kultiviert und der Lysingehalt im Kulturüberstand bestimmt.
- Dazu wird der Stamm zunächst auf Agarplatte für 24 Stunden bei 33°C inkubiert. Ausgehend von dieser Agarplattenkultur wird eine Vorkultur angeimpft (10 ml Medium im 100 ml Erlenmeyerkolben). Als Medium für die Vorkultur wird das Medium MM verwendet. Die Vorkultur wird 24 Stunden bei 33°C bei 240 rpm auf dem Schüttler inkubiert. Von dieser Vorkultur wird eine Hauptkultur angeimpft, so daß die Anfangs-OD (660 nm) der Hauptkultur 0,1 OD beträgt. Für die Hauptkultur wird ebenfalls das Medium mm verwendet.
Medium MM CSL 5 g/l MOPS 20 g/l Glucose (getrennt autoklaviert) 50 g/l Salze: (NH4)2SO4) 25 g/l KH2PO4 0,1 g/l MgSO4.7 H2O 1,0 g/l CaCl2.2 H2O 10 mg/l FeSO4.7 H2O 10 mg/l MnSO4.H2O 5,0 mg/l Biotin (sterilfiltriert) 0,3 mg/l Thiamin.HCl (sterilfiltriert) 0,2 mg/l L-Leucin (sterilfiltriert) 0,1 g/l CaCO3 25 g/l - CSL (Corn Steep Liquor), MOPS (Morpholinopropansulfonsäure) und die Salzlösung werden mit Ammoniakwasser auf pH 7 eingestellt und autoklaviert. Anschließend werden die sterilen Substrat- und Vitaminlösungen sowie das trocken autoklavierte CaCO3 zugesetzt.
- Die Kultivierung erfolgt in 10 ml Volumen in einem 100 ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen. Die Kultivierung erfolgt bei 33°C und 80% Luftfeuchte.
- Nach 72 Stunden wird die OD bei einer Meßwellenlänge von 660 nm mit dem Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, München) ermittelt. Die gebildete Lysinmenge wird mit einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrindetektion bestimmt.
- In Tabelle 1 ist das Ergebnis des Versuches dargestellt.
Tabelle 1
- Folgende Figuren sind beigefügt:
- Fig. 1 Karte des Plasmids pK18mobsacB_glk_A213V.
- Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben folgende Bedeutung. Bei der Angabe der Basenpaarzahlen handelt es sich um Näherungswerte, die im Rahmen der Reproduzierbarkeit von Messungen erhalten werden.
Kan: Kanamycin Resistenz-Gen
BamHI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms BamHI
XbaI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms XbaI
glk: glk_A213V-Allel
sacB: sacB-Gen
RP4-mob: mob-Region mit dem Replikationsursprung für den Transfer (oriT)
oriV: Replikationsursprung V
SEQUENCE LISTING
Claims (11)
1. Aus coryneformen Bakterien stammende für das Enzym
Glukokinase kodierende, replizierbare
Nukleotidsequenzen (DNA), wobei in den zugehörigen
Aminosäuresequenzen das L-Alanin an Position 213 von
SEQ ID No. 2 durch eine andere proteinogene
Aminosäure ersetzt wird.
2. Aus coryneformen Bakterien stammende für das Enzym
Glukokinase kodierende, replizierbare
Nukleotidsequenz (DNA) gemäß Anspruch 1,
wobei die zugehörige Aminosäuresequenz an Position
213 L-Valin enthält, dargestellt in der SEQ ID No. 4.
3. Aus coryneformen Bakterien stammende für das Enzym
Glukokinase kodierende, replizierbare
Nukleotidsequenz (DNA) gemäß Anspruch 1,
deren Basensequenz an der Position 638 Thymin
enthält, dargestellt in SEQ ID No. 3.
4. Plasmide (Vektoren), die die Nukleotidsequenzen gemäß
den Ansprüchen 1 bis 3 enthalten und gegebenenfalls
in coryneformen Bakterien replizieren.
5. Coryneforme Bakterien, die Nukleotidsequenzen gemäß
den Ansprüchen 1 bis 4 enthalten und in denen die für
die Glukokinase kodierenden Nukleotidsequenzen
bevorzugt überexprimiert vorliegen.
6. Coryneforme Bakterien, die für Glukokinase kodierende
Nukleotidsequenzen enthalten, wobei in den
zugehörigen Aminosäuresequenzen das L-Alanin an der
Position 213 von SEQ ID No. 2 durch eine andere
proteinogene Aminosäure ersetzt ist.
7. Verfahren zur Herstellung von L-Lysin oder L-Lysin
enthaltenden Futtermitteladditiven, bei dem man
folgende Schritte durchführt (comprising):
a) Fermentation coryneformer Bakterien, in denen
Allele des endogenen glk-Gens überexprimiert
werden unter Bedingungen, die für die Bildung des
glk-Genprodukts Glukokinase geeignet sind, und
b) Isolieren des L-Lysins oder des L-Lysin
enthaltenden Futtermitteladditivs aus der
Fermentationsbrühe, wobei die coryneformen
Bakterien das L-Lysin bilden.
8. Verfahren gemäß Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet,
daß man coryneforme Bakterien einsetzt, die ein Allel
des glk-Gens enthalten, wobei in den zugehörigen
Aminosäuresequenzen das L-Alanin an Position 213 von
SEQ ID No. 2 durch eine andere proteinogene Aminosäure
ersetzt wird.
9. Verfahren gemäß Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet, daß man
Mikroorganismen einsetzt, in denen man zusätzlich
weitere Gene des Biosyntheseweges des L-Lysins
überexprimiert.
10. Verfahren gemäß Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet, daß man
Mikroorganismen einsetzt, in denen die
Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet
sind, die die Bildung des L-Lysins verringern.
11. Verfahren zur Herstellung von L-Lysin oder L-Lysin
enthaltenden Futtermitteladditiven bei dem man
folgende Schritte durchführt:
a) Fermentation coryneformer Bakterien, die für das
Enzym Glukokinase kodierende endogene
Nukleotidsequenzen enthalten, wobei in den
zugehörigen Aminosäuresequenzen das L-Alanin an der
Position 213 durch eine andere proteinogene
Aminosäure ersetzt ist, bevorzugt L-Valin,
b) Anreicherung des L-Lysins in der
Fermentationsbrühe,
c) Isolieren des L-Lysins oder des L-Lysin
enthaltenden Futtermitteladditivs aus der
Fermentationsbrühe, gegebenenfalls
d) mit Bestandteilen aus der Fermentationsbrühe
und/oder der Biomasse (> 0 bis 100%).
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