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Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure hohen Reinheitsgrades
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure durch submerse
Gärung von Kohlehydrat-Kulturlösungen, bei der eine säurehaltige Flüssigkeit gebildet
wird, aus der die Zitronensäure direkt auskristallisieren kann.
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Die Herstellung von Zitronensäure durch vegetative Gärung ist bekannt.
Bei einer gebräuchlichen Gärungsmethode wird der Pilz unter der Oberfläche des wäßrigen
Gärungsmediums gehalten und dort mit Sauerstoff und anderen notwendigen Nährstoffen
versorgt. Bei richtiger Auswahl des Pilzes und genauer Überwachung der Gärungsbedingungen
wird der in einer solchen wäßrigen Fermentationslösung vorhandene Zucker zu wenigstens
70°/o in Zitronensäure umgewandelt. Im Anschluß an die Gärung ging man in der Praxis
so vor, daß die Zitronensäure zuerst als ein unlösliches Salz, z. B. als Calciumcitrat,
entfernt und isoliert wurde. Das ausgefällte Salz wurde mit einer starken Säure,
die ein unlösliches Salz mit dem Calciumkation bildet, z. B. mit Schwefelsäure,
umgesetzt. Dadurch wird die Zitronensäure in reiner Form wiedergewonnen. Dieses
sogenannte Kalk-Schwefelsäure-Verfahren ist ebenso wie die Extraktion der Säure
mittels eines Alkohol-Ather-Gemisches unwirtschaftlich und unbefriedigend, da hierbei
die reine Säure nur auf indirektem Wege gewonnen wird. Auch das völlige Eindampfen
der säurehaltigen Gärlösung hat sich nicht bewährt, da hierbei ein stark verunreinigtes
Produkt anfiel, das erst umständlich gereinigt werden mußte.
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Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein einfaches Verfahren
zur Gewinnung von Zitronensäure anzugeben, wobei aus der durch Gärung entstandenen
säurehaltigen Flüssigkeit die Zitronensäure direkt in kristalliner Form abgetrennt
werden kann.
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Erfindungsgemäß wird dies dadurch erreicht, daß man die in bekannter
Weise erhaltenen und vom Pilzmycel befreiten Gärlösungen gegebenenfalls im Vakuum
so weit einengt, daß beim Abkühlen der Gärlösung nicht mehr als 75°/o ; vorzugsweise
50 bis 60 O/o, der in der Flüssigkeit enthaltenen Zitronensäure auskristallisieren.
Dies wird am besten dadurch erreicht, daß man die Gärlösung auf ein Zehntel bis
ein Vierzehntel ihres Volumens einengt.
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Als zuckerhaltige Ausgangsstoffe kann man z. B.
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Invertmelassen, Maisstärkehydrolysate, Rübenmelassen u. dgl. verwenden.
Normalerweise verwendet man ein wäßriges Fermentationsmedium, das genügend kohlehydrathaltige
Stoffe, gewöhnlich etwa 10 bis 15 O/o Saccharose, Dextrose, Lävulose oder Glucose
enthält.
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Da bei der Reinigung eine gewisse Verdünnung auftritt, muß die Ausgangslösung
eine höhere Konzentration an Kohlehydraten aufweisen, damit das gereinigte Medium
schließlich die gewünschte Konzentration von 10 bis 15 ovo besitzt.
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Diese zuckerhaltigen Ausgangsstoffe besitzen jedoch neben gewissen
Nährstoffen, die nur in Spureninengen vorhanden sind, wegen ihres hohen Aschegehalts
noch andere Kationen, vor allem Eisenionen, welche die Säurebildung hemmen. Darüberhinaus
scheinen diese Verunreinigungen auch die Kristallisation zu verzögern, so daß sie
vorher entfernt werden müssen. Bei Verwendung der genannten unreinen Ausgangsstoffe
werden die Verunreinigungen durch Zusatz von Kalk oder anderen Reinigungsmitteln.
wie unlösliche Schwermetallhydroxyde, entfernt. Danach muß noch eine Behandlung
mit Kationenaustauschern, z. B. den im Wasserstoffzyklus wirksamen Austauschern,
erfolgen. Die Reinigung mit den Austauschern sollte so lange fortgesetzt werden,
bis die Eisenkonzentration unter etwa vier Millionstel liegt. Dabei werden gleichzeitig
auch die anderen störenden Kationen, wie Blei-, Quecksilber-, Kupfer- und Kobaltionen,
entfernt. Es sei erwähnt, daß man bei den Kationen der Erdalkali-und Alkalimetalle
etwas höhere Konzentrationen dulden kann. Gegebenenfalls muß sich auch noch eine
Behandlung mit einem Anionenaustauscherharz anschließen. Danach sollte die Gesamtkonzentration
der Ionen auf eine Menge vermindert sein, die 5 bis 10 Millionstel Teilen Natriumchlorid
äquivalent ist.
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In die gereinigte Kohlehydratlösung gibt man verschiedene Nährsalze,
und zwar 0,15 bis 0,2% Ammoniumcarbonat, 0,1 bis 0,02% sarures Kaliumphosphat, 0,08
bis 0,15% hydratisiertes Magnesiumsulfat und 0,0002 bis 0.00040h Zink in Form von
Zinkchlorid oder anderen löslichen Zinksalzen. Diese Kulturlösung wird dann mit
Salzsäure auf einen p-Wert von 2,2 bis 2,8 gebracht, in einen Gärbehälter übergeführt
und durch 2stündiges Erhitzen auf 82 C sterilisiert.
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Nach dem Abkühlen auf etwa Zimmertemperatur wird eine beliebige Pilzart,
die Zitronensäure bilden kann, in einer Konzentration von etwa 5 Millionen bis etwa
25 Millionen Sporen je Liter Fermentationslösung zugegeben. Es hat sich gezeigt,
daß optimale Gärungsergebnisse bei Verwendung ausgewählter Mutanten und wilder Stämme
des Aspergillus niger erhalten werden, dr ausgezeichnete säurebildende Eigenschaften
besitzt. Stammkulturen dieser Apsergillus-niger-Sporen werden als Strichkulturen
auf Sabourads Agar in gefrorenem Zustand aufbewahrt und kurz vor Gebrauch durch
Inkubierung bei Raumtemperatur vermehrt. In das so beimpfte Medium wird dann sterile
Luft in den Gärbehälter eingeführt, und zwar in Mengen, die vom Volumen der Fernientationslösung
abhängen, wobei diese für Gärbehälter mit kleinem Volumen größer und für Gärbehälter
mit relativ großem Volumen kleiner sind. Im allgemeinen liegt die Nienge zwischen
einem Zehntel bis einem Volumen Luft je Volumen Lösung und Minute. Zur Kontrolle
der Schaumentwicklung ist die Zugabe eines schaumhemmenden Zusatzes erforderlich.
Die Temperatur der Lösung wird während der Gärung auf 24 bis 34°C gehalten, druch
Erwärmen des Gärbehälters, so lange das Keimen der Sporen vor sich geht, und später
durch Abkühlen des Gärbehälters, wenn die Gärung weiter fortschreitet und innen
mehr Wärme entstcht, als zur aufrechterhaltung der Höchsttemperatur erforderlich
ist, Unter diesen Bedingungen sind 8 bis 12 Tage zur vollständigen Gärung erforderlich.
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Danach wird der Inhalt aus dem Gärbehälter entfernt und das Pilzmycel,
das sich aus den Psoren entwickelt hat, durch Filtrieren entfernt, wobei günstigstenfalls
gleichzeitig eine Klärung stattfindet.
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Zur Filtration haben sich die verschiedenen handelsüblichen Kohlen
in Mengen von 0.1 bis 1,5 g je 100 ccm Fermentationslösung bewährt.
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Die filtrierte Gärungsflüssigkeit wird dann erfindungsgemäß eingeengt,
bis die Fermentationsflüssigkeit, die normalerweise etwa 10 bis 200/o Zitronensäure
enthält. auf ungefähr ein Zehntel bis ein Vierzehntel ihres ursprünglichen Volumens
vermindert ist. Dabei sollen beim Abkühlen und Rühren nicht mehr als 75%, vorzugswiese
50 bis 60%, der in der Flüssigkeit enthaltenen Zitronensäure auskristallisieren,
die dann durch Zentrifugieren oder Filtration isoliert werden. Die Kristalle können
außerdem zur weiteren Reinigung und Entfernung von Spuren Mutterlauge auf dem Filter
oder in der Zentrifuge mit wenig Wasser gewaschen werden.
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Die Erfindung wird durch folgende Beispiele näher erläutert.
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Beispiel 1 1 1 alte dunkle Fermentationslösung wurde im Vakuum bei
etwa 20 mm Hg auf 75 ml = 106 g eingeengt. Das Konzentrat wurde während der Kristallbildung
gerührt. Nach Entfernung der Kristalle auf einem Büchner-Trichter hatte die Mutterlauge
eine
Zitronensäurekonzentration von 76,6 auf 100 ml, nachdem die Kristalle möglichst
trocken gesaugt worden waren, wurde die obere Hälfte weggenommen und bei Zimmertemperatur
getrocknet. Das Produkt war hellbaraun und wog 27 g. Die im Büchner-Trichter verblicbenen
Kristalle wurden durch Zugabe von 2 bis 3 ml Wasser gewaschen und trocken gesaugt.
Die gewaschenen Kristalle wogen 32,5 g. Das untgewaschene Produkt hatte eine Zitronensärekonzentration
von 86,1 g/100 ml und ein Dextroseäquivalent von 5.4/1900 ml. Bei dem gewaschenen
Produkt wurden 94.4%/100 ml Zitronensäure und ein Dextroseäquiralent vou 3,8 g/100
ml ermittelt, so dan sich insgesant eine Ausbeute von 54% Zitronensäure ergab.
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Unter Dextroseäquivalent versthet man die als Verunreinignung in
der auskristallisierten Zitronensäure vorhandenen Polysaccharide, ausgedrückt in
der dem Monosaccharid Dextrose äquivalenten Menge.
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Beispiel 2 Ein Teil derselben Fermentationslösung wurde mit 0,5 g
Kohlepulver (Darco G60) je 100 ml Flüssigkeit behandelt. Das klare Filtrat, das
ein Volumen von 7070 ml und einen Gehalt von 688 g Zitronensäure besaß, wurde im
Vakuum eingeengt. wobei die Temperatur der Flüssigkeit nie mehr als 300 betrug.
Das Konzentrat hatte nach 17 Stunden ein Gewicht von 908 g und ein Volumen von etwa
650 ml. Das Konzentrat wurde dann eine Stunde lang gerührt und die gebildeten Kristalle
mittels einer Zentrifuge entfernt.
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Die Kristalle wunden zunächst mit 25 inl Wasser und dann mit 10 bis
15 ml des aufgefangenen zweiten Waschwassers erneut gewaschen. Die erhaltenell weißen
Kristalle wogen 310 g. Die Analyse ergab 96 ng Zitronensäure sowie ein Dextroseäqueivalent
von 1,4 g/100 ml. Aus der Mutterlauge schieden sich beim Stehen über Nacht bei Zimmertemperatur
weitere Kristalle aus. Die Nilisdiung wurde etwa 1 Stunde im Eishad gerührt und
dann abzentrifugiert. Das erhaltene kristalline Produkt wurde mit etwa 3 ml Wasser
gewaschen. Nach dem Trocknen über Nacht wog es 92 g. Die Analyse ergab einen Zitronensäuregehalt
von 96 g und ein Dextroseäquivalent von 1,5 g je 100 ml. Die gesamte Ausbeute an
Zitronensäure entsprach etwa 560/0.
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Beispiel 3 Ein Fermentationsmedium aus Rübenmelasse enthielt nach
der oben beschriebenen Behanlung mit Kohle 7.7 g Zitronensäure und 1,2 g Dextroseäquivalent
je 100 ml. Ein Liter wurde im Vakuum bis zu einem Gewicht von 80 g eingeengt. Die
erhaltenen Kristalle wurden durch Filtrieren auf einem Büchner-Trichter isoliert.
Das getrocknete kristalline Produkt wog43g. Beispiel 4 Das Ausgangsmaterial für
diesen Versuch war eine Fermentationslösung, die aus von Katioen befreitem Maiszucker
hergestellt war, Nach Behaudlung mit Kohlepulver (Darco G60) hatt das klare Filtrat
ein Volumen von -14 # mit 6.1 g Zitronensäure und 1.8 g Dextroseäquivalent je 100
ml. Die Lösung wurde durch Kochen konzentriert, bis das Volumen auf 13 1 oder 300/0
des ursprünglichen Volumens vermindert war. Das weitere Einengen wurde im Vakuum
ausgeführt. Das Konzentrat wurde 2 Tage bei Zimmertemperatur stehengelassen, bevor
die Kristalle mit der Zentrifuge isoliert wurden. Die Kristalle wogen 465 g. Aus
der Mutterlauge wurgen
durch Tiefkühlung weitere Kristalle erhalten
und mit der Zentrifuge abgetrennt. Die gekühlte Mischung war so viskos, daß das
Zentrifugieren nur langsam vonstatten ging. Es wurden 344 g Kristalle erhalten.
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Die Ausbeute betrug insgesamt 809 g.
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Dieser Versuch zeigt, daß sogar ein schlechtes Ausgangsmaterial mit
einem so niedrigen Säure-Zucker-Verhältnis wie 3,4 : 1 durch Kochen teilweise konzentriert
werden kann und dann noch Zitronensäure durch direkte Kristallisation liefert. Wie
man außerdem sieht, ist die Ausbeute an Zitronensäure durch direktes Auskristallisieren
um so geringer, je mehr Zucker im Verhältnis zur Zitronensäure anwesend ist.
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Hieraus geht hervor, daß die Reinheit der kristallisierten Zitronensäure
weitgehend von dem mehr oder weniger starken Einengen der Lösung abhängt. Die auskristallisierte
Zitronensäure kann zwischen einigen Prozent und bis zu 75 Ü/o der Gesamtmenge betragen.
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Die Ausbeute hängt ferner vom Auswaschen ab, da ein stärkeres Waschen
ein Wiederauflösen der kristallisierten Zitronensäure zur Folge hat. Man wird vorzugsweise
so konzentrieren und kristallisieren, daß zwischen 50 und 600/o' der in der filtrierten
Gärungsflüssigkeit enthaltenen Zitronensäure auskristallisiert und nach dem Waschen
auf der Zentrifuge oder dem Filter zurückbleiben. In diesem Fall enthält die getrocknete
Zitronensäure zwischen 3 und 5 ovo Verunreinigungen, die aus in dem Fermentationsmedium
vorhandenen Zucker und aus im Gärungsmedium vorhandenen anorganischen Salzen bestehen.
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Sie enthält aber keine schädlichen Verunreinigungen, wie Oxalsäure
oder andere giftige Substanzen.
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Zitronensäure in dieser Form ist zur Verwendung in Nahrungsmitteln,
Getränken und Medikamenten geeignet, bei denen die Anwesenheit geringer Mengen Zucker
und unschädlicher anorganischer Salze nicht unerwünscht ist.
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PTTANSPROCHE: 1. Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure hohen
Reinheitsgrades durch Gärung einer wäßrigen Lösung eines kohlehydrathaltigen Materials
mit einem Zitronensäure bildenden Pilz, Al)-trennung des Pilzmycels aus der Gärlösung,
Einengen der Lösung durch Erhitzen und Verdampfen von Wasser und anschließendes
Abkühlen der konzentrierten Lösung, um feste Zitronensäure auszukristallisieren,
dadurch gekennzeichnet, daß man das Einengen und Abkühlen der Gärlösung so kontrolliert,
daß nicht mehr als etwa 75 O/o der in der Lösung enthaltenen Zitronensäure auskristallisieren.