DE10155692A1 - Procedure for the detection of endogenous and exogenous substances in the organism - Google Patents
Procedure for the detection of endogenous and exogenous substances in the organismInfo
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Differenzierung von endogenen und exogenen Stoffen, insbesondere von Stoffen mit mindestens einer Peptidbindung, in einem Organismus. The invention relates to a method for detection and / or Differentiation of endogenous and exogenous substances, especially of Substances with at least one peptide bond in an organism.
Exogene Stoffe, d. h. außerhalb eines Organismus entstandene Stoffe, wie z. B. rekombinante Proteine und Peptide, werden zur Behandlung verschiedener Erkrankungen eingesetzt, bei denen beispielsweise die endogenen Varianten, d. h. die im Körper selbst entstandenen, nicht von außen zugeführten bzw. aus der besonderen Anlage des Organismus hervorgegangenen Stoffe, vom Körper nur unzureichend gebildet werden können. Bereits in der klinischen Anwendung befindet sich das Wachstumshormon zur Behandlung von Wachstumshormondefizienzen unterschiedlicher Genese (Murray, R. D. and Shalet, S. M. (2000). Growth hormone: current and future therapeutic applications. Expert Opin Pharmacother 1, 975-990). Erythropoetin wird bei Anämien infolge beispielsweise von Tumoren eingesetzt (Kasper, C. (2001). Recombinant human erythropoietin in the treatment of anemic patients with hematological malignancies. Ann Hematol 80, 319-329). Rekombinante Gonadotropine werden bei Infertilität verwendet (Garcia-Campayo, V. and Boime, I. (2001). Novel recombinant gonadotropins. Trends Endocrinol Metab 12, 72-77). Blutgerinnungsfaktoren werden bei Erkrankungen mit erhöhter Blutungsneigung eingesetzt (Monroe, D. M., Hoffman, M., Allen, G. A. and Roberts, H. R. (2000). The factor VII-platelet interplay: effectiveness of recombinant factor VIIa in the treatment of bleeding in severe thrombocytopathia. Semin Thromb Hemost, 26, 373-377). Rekombinantes Thyrotropin findet bei Patienten mit einem Schilddrüsenkarzinom Anwendung (Baskin, H. J., Atwood, T. M. and Holcomb, L. P. (2000). Recombinant human thyrotropin stimulation of thyroglobulin in the follow-up of patients with stage I or II differentiated thyroid carcinoma. Endocr Pract 6, 430-434). Exogenous substances, i.e. H. substances created outside of an organism, such as B. recombinant proteins and peptides are used for treatment various diseases, for example the endogenous variants, d. H. those created in the body itself, not by externally supplied or from the special system of the organism resulting substances, insufficiently formed by the body can be. This is already in clinical use Growth hormone for the treatment of growth hormone deficiencies of different origins (Murray, R.D. and Shalet, S.M. (2000). Growth hormone: current and future therapeutic applications. Expert Opin Pharmacother 1, 975-990). Erythropoietin is followed by anemia used for example by tumors (Kasper, C. (2001). Recombinant human erythropoietin in the treatment of anemic patients with hematological malignancies. Ann Hematol 80, 319-329). recombinant Gonadotropins are used for infertility (Garcia-Campayo, V. and Boime, I. (2001). Novel recombinant gonadotropins. trends Endocrinol Metab 12, 72-77). Blood coagulation factors are considered Diseases with increased bleeding tendency used (Monroe, D.M., Hoffman, M., Allen, G.A. and Roberts, H.R. (2000). The factor VII platelet interplay: effectiveness of recombinant factor VIIa in the treatment of bleeding in severe thrombocytopathia. Semin Thromb Hemost, 26, 373-377). Recombinant thyrotropin takes place in patients with a Thyroid cancer application (Baskin, H.J., Atwood, T.M. and Holcomb, L. P. (2000). Recombinant human thyrotropin stimulation of thyroglobulin in the follow-up of patients with stage I or II differentiated thyroid carcinoma. Endocr Pract 6, 430-434).
Die meisten therapeutisch wichtigen Proteine sind Glykoproteine. Die Glykosylierung bestimmt Stabilität, Faltung und biologische Aktivität (Lerouge, P., Bardor, M., Pagny, S., Gomord, V. and Faye, L. (2000). N- glycosylation of recombinant pharmaceutical glycoproteins produced in transgenic plants: towards an humanisation of plant N-glycans. Curr Pharm Biotechnol 1, 347-354). In den meisten Fällen werden bei der Herstellung von z. B. rekombinanten Peptiden und Proteinen Modifikationen eingefügt, die deren Funktionalität hinsichtlich Stabilität und Effektivität (Rezeptorbindung) beeinflussen. Dies betrifft vor allem die Glykoproteine (Garcia-Campayo, V. and Boime, I. (2001). Novel recombinant gonadotropins. Trends Endocrinol Metab 12, 72-77; Lerouge, P., Bardor, M., Pagny, S., Gomord, V. and Faye, L. (2000); Lynch, T. J. (2000). Biotechnology: alternatives to human plasma-derived therapeutic proteins. Most therapeutically important proteins are glycoproteins. The Glycosylation determines stability, folding and biological activity (Lerouge, P., Bardor, M., Pagny, S., Gomord, V. and Faye, L. (2000). N- glycosylation of recombinant pharmaceutical glycoproteins produced in transgenic plants: towards an humanization of plant N-glycans. curr Pharm Biotechnol 1, 347-354). In most cases, the Production of e.g. B. recombinant peptides and proteins Modifications inserted, their functionality in terms of stability and Affect effectiveness (receptor binding). This affects above all Glycoproteins (Garcia-Campayo, V. and Boime, I. (2001). Novel recombinant gonadotropins. Trends Endocrinol Metab 12, 72-77; Lerouge, P., Bardor, M., Pagny, S., Gomord, V. and Faye, L. (2000); Lynch, T.J. (2000). Biotechnology: alternatives to human plasma-derived therapeutic proteins.
Baillieres Best Pract Res Clin Haematol 13, 669-688; Macdougall, I. C. (2001). An overview of the efficacy and safety of novel erythropoiesis stimulating protein (NESP). Nephrol Dial Transplant 16, 14-21). Modifikationen des Zuckerrestes werden beispielsweise bei Erythropoetin durchgeführt, um die Verweildauer des rekombinanten Proteins im Plasma zu verlängern (Egrie, J. C. and Browne, J. K. (2001). Development and characterization of novel erythropoiesis stimlulating protein (NESP). Nephrol Dial Transplant 16, 3-13). Baillieres Best Pract Res Clin Haematol 13, 669-688; Macdougall, I.C. (2001). An overview of the efficacy and safety of novel erythropoiesis stimulating protein (NESP). Nephrol Dial Transplant 16, 14-21). Modifications of the sugar residue are, for example, in the case of erythropoietin carried out to determine the residence time of the recombinant protein in the To extend plasma (Egrie, J.C. and Browne, J.K. (2001). Development and characterization of novel erythropoiesis stimulating protein (NESP). Nephrol Dial Transplant 16, 3-13).
International findet - bei unterschiedlichen legislativen Rahmenbedingungen - ein Einsatz von beispielsweise Wachstumshormon (auch als Growth Hormon (GH) oder somatotropes Hormon (STH) zu bezeichnen) in der Tierproduktion statt. Bei Milchkühen steht die Optimierung der Milchleistung im Vordergrund, während beispielsweise beim Schwein ein höherer Magerfleischanteil erzielt werden kann (Karg, H., Meyer, H. and Schams, D. (1992). Manipulation von Wachstum und Laktation beim Rind. Mh. Vet.-Med. 47, 113-118). International takes place - with different legislative Framework conditions - use of, for example, growth hormone (also as Growth hormone (GH) or somatotropic hormone (STH)) in animal production. In the case of dairy cows, the optimization of Milk yield in the foreground, for example in the pig higher proportion of lean meat can be achieved (Karg, H., Meyer, H. and Schams, D. (1992). Manipulation of growth and lactation in Cattle. Mh. Vet.-Med. 47, 113-118).
Sowohl im Hochleistungssport als auch im Breitensport werden zunehmend leistungssteigernde Präparate aus dem Bereich der Protein- und Peptidhormone eingesetzt (Clarkson, P. M. and Thompson, H. S. (1997). Drugs and sport. Research findings and limitations. Sports Med 24, 366-384; Davey, G. and Nerurkar, R. (1998). Doping in sport. Lancet 352, 1781-1782; Davies, J. S., Morgan, C. L., Currie, C. J. and Green, J. T. (1997). Growth hormone use by body builders. Br J Sports Med 31, 352-353; Haug, E. (1994). [Abuse of doping preparations outside organized sports. A new challenge for health care]. Tidsskr Nor Laegeforen 114, 424-425). Dies betrifft gegenwärtig vor allem das Wachstumshormon und das Erythropoetin (Ehrnborg, C., Bengtsson, B. A. and Rosen, T. (2000). Growth hormone abuse. Baillieres Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 14, 71-77; Jelkmann, W. (2000). Use of recombinant human erythropoietin as an antianemic and performance enhancing drug. Become both in high-performance sports and popular sports increasingly performance-enhancing preparations in the field of protein and Peptide hormones used (Clarkson, P. M. and Thompson, H. S. (1997). Drugs and sport. Research findings and limitations. Sports Med 24, 366-384; Davey, G. and Nerurkar, R. (1998). Doping in sport. Lancet 352, 1781-1782; Davies, J.S., Morgan, C.L., Currie, C.J. and Green, J. T. (1997). Growth hormone use by body builders. Br J Sports Med 31, 352-353; Haug, E. (1994). [Abuse of doping preparations outside organized sports. A new challenge for health care]. Tidsskr Nor Laegeforen 114, 424-425). This currently affects above all Growth hormone and erythropoietin (Ehrnborg, C., Bengtsson, B.A. and Rosen, T. (2000). Growth hormone abuse. Bailliere's Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 14, 71-77; Jelkmann, W. (2000). Use of recombinant human erythropoietin as an antianemic and performance enhancing drug.
Curr Pharm Biotechnol 1, 11-31). Erythropoetin wird zur Verbesserung des Sauerstofftransportes über eine Erhöhung des Anteils der roten Blutkörperchen, den Erythrozyten, vor allem im Radsport eingesetzt (Audran, M., Gareau, R., Matecki, S., Durand, F., Chenard, C., Sicart, M. T., Marion, B. and Bressolle, F. (1999). Effects of erythropoietin administration in training athletes and possible indirect detection in doping control. Med Sci Sports Exerc 31, 639-645; Breymann, C., Rohling, R., Krafft, A., Huch, A. and Huch, R. (2000). "Blood doping" with recombinant erythropoietin (rhEPO) and assessment of functional iron deficiency in healthy volunteers. Br J Haematol 108, 883-884; Gareau, R., Audran, M., Baynes, R. D., Flowers, C. H., Duvallet, A., Senecal, L. and Brisson, G. R. (1996). Erythropoietin abuse in athletes. Nature 380, 113; Jelkmann, W. (2000). Use of recombinant human erythropoietin as an antianemic and performance enhancing drug. Curr Pharm Biotechnol 1, 11-31). Berichte liegen auch über den Einsatz von Erythropoetin im Pferdesport vor (Kearns, C. F., Lenhart, J. A. and McKeever, K. H. (2000). Cross reactivity between human erythropoietin antibody and horse erythropoietin. Electrophoresis 21, 1454-1457). Curr Pharm Biotechnol 1, 11-31). Erythropoietin is improving of oxygen transport by increasing the proportion of red Blood cells, the erythrocytes, mainly used in cycling (Audran, M., Gareau, R., Matecki, S., Durand, F., Chenard, C., Sicart, M. T., Marion, B. and Bressolle, F. (1999). Effects of erythropoietin administration in training athletes and possible indirect detection in doping control. Med Sci Sports Exerc 31, 639-645; Breymann, C., Rohling, R., Krafft, A., Huch, A. and Huch, R. (2000). "Blood doping" with recombinant erythropoietin (rhEPO) and assessment of functional iron deficiency in healthy volunteers. Br J Haematol 108, 883-884; Gareau, R., Audran, M., Baynes, R.D., Flowers, C.H., Duvallet, A., Senecal, L. and Brisson, G. R. (1996). Erythropoietin abuse in athletes. Nature 380, 113; Jelkmann, W. (2000). Use of recombinant human erythropoietin as an antianemic and performance enhancing drug. Curr Pharm Biotechnol 1, 11-31). There are also reports of the use of erythropoietin in the Equestrian sport before (Kearns, C.F., Lenhart, J.A. and McKeever, K.H. (2000). Cross reactivity between human erythropoietin antibody and horse erythropoietin. Electrophoresis 21, 1454-1457).
Der Einsatz von HCG (menschliches Choriongonadotropin), ACTH (adrenocorticotropes Hormon), Wachstumshormon und Erythropoetin sowie von den Substanzen, die ihre Freisetzung regulieren oder ihre Wirkung vermitteln, wurde 1989 von der Medizinischen Kommission des Internationalen Olympischen Komitees (IOC) gebannt (Kicman, A. T. and Cowan, D. A. (1992). Peptide hormones and sport: misuse and detection. Br Med Bull 48, 496-517). The use of HCG (human chorionic gonadotropin), ACTH (adrenocorticotropic hormone), growth hormone and erythropoietin as well as the substances that regulate their release or their Communicating effect was in 1989 by the Medical Commission of the International Olympic Committee (IOC) banned (Kicman, A. T. and Cowan, D.A. (1992). Peptide hormones and sport: misuse and detection. Br Med Bull 48, 496-517).
Trotz dieser Beschränkungen des Einsatzes oder gar des Verbotes bestehen bei Mensch und Tier Probleme hinsichtlich des mißbräuchlichen Einsatzes dieser Substanzen (Bidlingmaier, M., Wu, Z. and Strasburger, C. J. (2000). Test method: GH. Baillieres Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 14, 99-109; Breymann, C. (2000). Erythropoietin test methods. Baillieres Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 14, 135-145). Despite these restrictions on use or even prohibition there are problems with humans and animals regarding the abusive Use of these substances (Bidlingmaier, M., Wu, Z. and Strasburger, C. J. (2000). Test method: GH. Bailliere's Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 14, 99-109; Breymann, C. (2000). Erythropoietin test methods. Baillieres Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 14, 135-145).
Das Problem des Nachweises der Verabreichung von beispielsweise rekombinantem Wachstumshormon oder Erythropoetin in Körperflüssigkeiten liegt darin, daß sich die endogene und exogene, z. B. rekombinante Form von Wachstumshormon und Erythropoetin, wenn überhaupt, dann nur in sehr geringem Maße unterscheiden (Healy, M. L. and Russell-Jones, D. (1997). Growth hormone and sport: abuse, potential benefits, and difficulties in detection. Br J Sports Med 31, 267-268). Der geringe Unterschied reicht bei gegenwärtig angewandten analytischen Methoden nicht aus, um innerhalb einer Probe sicher zwischen endogenen und exogenen Formen zu unterscheiden. Ein weiteres Problem ist die Tatsache, daß der Blutspiegel des natürlichen Wachstumshormons nicht konstant ist, sondern rhythmischen Schwankungen unterliegt. Plötzliche Erhöhungen können deshalb nur eine spontane Erhöhung endogener Wachstumshormon-Konzentrationen darstellen. Ferner ist die Freisetzung von Wachstumshormon und damit auch der Blutspiegel von quantitativen und qualitativen Veränderungen in der Nahrungszusammensetzung abhängig. Auch bei starker körperlicher Leistung ist eine Erhöhung des Wachstumshormon-Blutspiegels zu beobachten (Jenkins, P. J. (1999). Growth hormone and exercise. Clin Endocrinol (Oxf) 50, 683-689.) Ein akzeptiertes Nachweisverfahren existiert gegenwärtig weder für die Dopingkontrolle im Hochleistungssport noch für die Kontrolle des illegalen Einsatzes in der Tierproduktion. Deshalb werden für beide Proteohormone indirekte Nachweismethoden diskutiert (Bidlingmaier, M., Wu, Z. and Strasburger, C. J. (2000). Test method: GH. Baillieres Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 14, 99-109); Birkeland, K. I., Stray- Gundersen, J., Hemmersbach, P., Hallen, J., Haug, E. and Bahr, R. (2000). Effect of rhEPO administration on serum levels of sTfR and cycling performance. Med Sci Sports Exerc 32, 1238-1243; Breymann, C. (2000). Erythropoietin test methods. Baillieres Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 14, 135-145; Choi, D., Kim, M. and Park, J. (1996). Erythropoietin: physico- and biochemical analysis. J Chromatogr B Biomed Appl 687, 189-199). Indirekte Nachweismethoden sind jedoch mit dem hohen Risiko einer falschen positiven Aussage belastet. Ein erhöhter Hämatokrit, der bei Radrennfahrern zum Ausschluß führt, kann z. B. auch physiologischer oder pathophysiologischer Natur sein (Brun, J. F., Bouchahda, C., Chaze, D., Benhaddad, A. A., Micallef, J. P. and Mercier, J. (2000). The paradox of hematocrit in exercise physiology: which is the "normal" range from an hemorheologist's viewpoint? Clin Hemorheol Microcirc 22, 287-303; Schmidt, W., Biermann, B., Winchenbach, P., Lison, S. and Boning, D. (2000). How valid is the determination of hematocrit values to detect blood manipulations? Int J Sports Med 21, 133-138; Shaskey, D. J. and Green, G. A. (2000). Sports haematology. Sports Med 29, 27-38). Im Vordergrund steht die Differenzierung anhand der natürlicherweise vorkommenden verschiedenen Isoformen von Wachstumshormon, die bei einer Supplementierung nicht auftreten sollen (Wu, Z., Bidlingmaier, M., Dall, R. and Strasburger, C. J. (1999). Detection of doping with human growth hormone. Lancet 353, 895). Die Verwendung der Unterschiede im Isotopenverhältnis zwischen endogenem Wachstumshormon und verschiedenen rekombinanten Präparaten ist sehr aufwendig und erbringt keine einheitlichen Ergebnisse für die einzelnen Präparate (Abramson; F. P., Osborn, B. L. and Teffera, Y. (1996). Isotopic differences in human growth hormone preparations. Anal Chem 68, 1971-1972). Für Erythropoetin wird entweder der Hämatokrit herangezogen (Ekblom, B. (1996). Blood doping and erythropoietin. The effects of variation in hemoglobin concentration and other related factors on physical performance. Am J Sports Med 24, S40-42) oder andere Parameter des Eisenstoffwechsels (Clyne, N., Berglund, B. and Egberg, N. (1995). Treatment with recombinant human erythropoietin induces a moderate rise in hematocrit and thrombin antithrombin in healthy subjects. Thromb Res 79, 125-129; Gareau, R., Brisson, G. R., Chenard, C., Gagnon, M. G. and Audran, M. (1995). Total fibrin and fibrinogen degradation products in urine: a possible probe to detect illicit users of the physical-performance enhancer erythropoietin? Norm Res 44, 189-192). Neuere Methoden erlauben eine gewisse Differenzierung auf der Basis von Ladungsunterschieden in der isoelektrischen Fokussierung (Lasne, F. and de Ceaurriz, J. (2000). Recombinant erythropoietin in urine. Nature 405, 635). The problem of detecting the administration of, for example recombinant growth hormone or erythropoietin in Body fluids are that the endogenous and exogenous, z. B. recombinant form of growth hormone and erythropoietin, if any then differ only to a very small extent (Healy, M. L. and Russell-Jones, D. (1997). Growth hormone and sport: abuse, potential benefits, and difficulties in detection. Br J Sports Med 31, 267-268). The little difference is enough with currently applied analytical Methods are not sufficient to safely endogenously within a sample to distinguish between exogenous forms. Another problem is that Fact that the blood level of natural growth hormone is not is constant, but is subject to rhythmic fluctuations. sudden Increases can therefore only be a spontaneous increase in endogenous Represent growth hormone concentrations. Furthermore, the Release of growth hormone and thus the blood level of quantitative and qualitative changes in the Food composition dependent. Even with strong physical performance there is an increase of growth hormone blood levels (Jenkins, P. J. (1999). Growth hormone and exercise. Clin Endocrinol (Oxf) 50, 683-689.) There is currently no accepted method of detection for doping control in high performance sports and for the control of illegal use in animal production. Therefore, for both Proteohormones indirect detection methods discussed (Bidlingmaier, M., Wu, Z. and Strasburger, C.J. (2000). Test method: GH. Baillieres Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 14, 99-109); Birkeland, K.I., Stray- Gundersen, J., Hemmersbach, P., Hallen, J., Haug, E. and Bahr, R. (2000). Effect of rhEPO administration on serum levels of sTfR and cycling performance. Med Sci Sports Exerc 32, 1238-1243; Breymann, C. (2000). Erythropoietin test methods. Bailliere's Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 14, 135-145; Choi, D., Kim, M. and Park, J. (1996). Erythropoietin: physico- and biochemical analysis. J Chromatogr B Biomed Appl 687, 189-199). However, indirect detection methods are also included the high risk of a false positive statement. On Increased hematocrit, which leads to exclusion in racing cyclists, z. B. also be physiological or pathophysiological in nature (Brun, J. F., Bouchahda, C., Chaze, D., Benhaddad, A.A., Micallef, J.P. and Mercier, J. (2000). The paradox of hematocrit in exercise physiology: which is the "normal" range from an hemorheologist's viewpoint? Clin Hemorheol Microcirc 22, 287-303; Schmidt, W., Biermann, B., Winchenbach, P., Lison, S. and Boning, D. (2000). How valid is the determination of hematocrit values to detect blood manipulations? Int J Sports Med 21, 133-138; Shaskey, D.J. and Green, G.A. (2000). Sports haematology. Sports Med 29, 27-38). In the foreground is the differentiation based on of the naturally occurring various isoforms of Growth hormone that does not occur with supplementation (Wu, Z., Bidlingmaier, M., Dall, R. and Strasburger, C.J. (1999). Detection of doping with human growth hormones. Lancet 353, 895). The Using the differences in the isotope ratio between endogenous growth hormone and various recombinant preparations is very complex and does not produce uniform results for the individual preparations (Abramson; F.P., Osborn, B.L. and Teffera, Y. (1996). Isotopic differences in human growth hormone preparations. Anal Chem 68, 1971-1972). For erythropoietin either Hematocrit used (Ekblom, B. (1996). Blood doping and erythropoietin. The effects of variation in hemoglobin concentration and other related factors on physical performance. Am J Sports Med 24, S40-42) or other parameters of iron metabolism (Clyne, N., Berglund, B. and Egberg, N. (1995). Treatment with recombinant human erythropoietin induces a moderate rise in hematocrit and thrombin antithrombin in healthy subjects. Thromb Res 79, 125-129; Gareau, R., Brisson, G.R., Chenard, C., Gagnon, M.G. and Audran, M. (1995). Total fibrin and fibrinogen degradation products in urine: a possible probe to detect illicit users of the physical-performance enhancer erythropoietin? Norm Res 44, 189-192). Newer methods allow a certain differentiation based on charge differences in the isoelectric Focusing (Lasne, F. and de Ceaurriz, J. (2000). Recombinant erythropoietin in urine. Nature 405, 635).
Erwünscht ist ein Testverfahren, in dem bei einem Organismus endogene und exogene Stoffe, insbesondere Peptidverbindungen, nachgewiesen werden könnten. Es soll ein direkter und schneller Nachweis dieser Stoffe möglich sein, mit einer hohen Sensibilität, Sensitivität und Spezifität. Ferner ist es erwünscht, zwischen den verschiedenen exogenen Stoffen zu differenzieren, insbesondere bei den rekombinant und gentechnisch hergestellten Stoffen, diese einem bestimmten Produzenten zuzuordnen. What is desired is a test procedure in which an organism endogenous and exogenous substances, in particular peptide compounds, could be demonstrated. It should be a direct and quick proof of this Be possible with a high sensitivity, sensitivity and fabrics Specificity. It is also desirable to distinguish between the various exogenous ones Differentiate substances, especially in the recombinant and genetically engineered substances, these to a certain producer assigned.
Ziel der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Differenzierung von exogenen und endogenen Stoffen bereitzustellen, was spezifisch, selektiv und sensitiv genug ist, mit vergleichsweise geringem Aufwand diese Stoffe nachzuweisen und damit beispielsweise einen illegalen Einsatz von rekombinanten, gentechnisch produzierten Wachstumshormonen zur Leistungssteigerung bei Mensch (Doping) und Tier (Milchleistung, Mast) nachzuweisen. The aim of the invention is therefore to provide a method for detection and / or to differentiate between exogenous and endogenous substances to provide what is specific, selective and sensitive enough, by comparison little effort to detect these substances and thus, for example an illegal use of recombinant, genetically engineered Growth hormones to increase performance in humans (doping) and Animal (milk production, fattening).
Dieses Ziel wird gelöst durch das Verfahren, wie es in Anspruch 1 definiert ist. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen bis 2 bis 14 dargelegt. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht. This object is achieved by the method as set out in claim 1 is defined. Preferred embodiments are in the dependent ones Claims to 2 to 14 set out. The wording of all claims will hereby incorporated by reference into the content of this description.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß endogene und exogene Stoffe nach selektiver Anreicherung mit Hilfe eines hochsensitiven Nachweisverfahrens über ihre unterschiedlichen Massen nachgewiesen werden können. Surprisingly, it has been found that endogenous and exogenous Fabrics after selective enrichment with the help of a highly sensitive Proof of their different masses can be.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Differenzierung von endogenen und exogenen Stoffen, insbesondere von Stoffen mit mindestens einer Peptidbindung, wobei die in entnommenen körpereigenen Material, insbesondere von einem menschlichen oder tierischen Organismus entnommene körpereigene Material, vorhandenen endogenen und exogenen Stoffe auf einem Trägermaterial angereichert werden, und anschließend diese Stoffe über ihre unterschiedlichen Massen nachgewiesen und/oder differenziert werden. The invention thus relates to a method for detection and / or to differentiate between endogenous and exogenous substances, in particular of substances with at least one peptide bond, where the body material taken in, especially from a the body's own human or animal organism Material, existing endogenous and exogenous substances on one Carrier material are enriched, and then these substances over their different masses demonstrated and / or differentiated become.
Erfindungsgemäß handelt es sich bei den endogenen und exogenen Stoffen um Peptide, Polypeptide, Proteine, Peptidhormone und/oder Proteohormone. Bei den Peptid- und/oder Proteohormonen werden insbesondere STH (somatotropes Hormon), Erythropoetin, ACTH (adrenocorticotropes Hormon), und/oder HCG (menschliches Choriongonadotropin) umfaßt, aber auch alle anderen endogenen und exogenen Stoffe, insbesondere Peptidverbindungen, die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens nachgewiesen werden können, kommen in Frage. According to the invention, they are endogenous and exogenous Substances around peptides, polypeptides, proteins, peptide hormones and / or Proteohormones. With the peptide and / or proteohormones especially STH (somatotropic hormone), erythropoietin, ACTH (adrenocorticotropic hormone), and / or HCG (human Chorionic gonadotropin), but also all other endogenous and exogenous substances, in particular peptide compounds which are prepared with the aid of the invention Proof of procedure can be considered.
Vor der Anreicherung und/oder dem Nachweis der endogenen und exogenen Stoffe können diese modifiziert, insbesondere fraktioniert und/oder markiert werden. So kann z. B. zur Differenzierung zwischen endogenen und exogenen Stoffen die selektive Verdauung oder die chemische Modifikation der Stoffe genutzt werden. Dazu können die auf einem Trägermaterial gebundenen Stoffe vor der Massenbestimmung enzymatisch oder chemisch behandelt werden. So ist es z. B. möglich, daß durch Behandlung mit Proteasen (z. B. Tripsin) Peptide und Proteine in, von der Variante (Aminosäuresequenz) abhängig, unterschiedliche Peptidfragmente gespalten werden. Die einzelnen Teilstücke weisen eine jeweils charakteristische Molekulargewichtsverteilung auf, da die jeweiligen Enzyme an bestimmten Aminosäurepositionen bevorzugt schneiden. Die Wahl der Proteasen ist varianten- und speziesspezifisch, da speziesspezifische Unterschiede hinsichtlich der Aminosäurezusammensetzung von beispielsweise Wachstumshormonen bestehen. Als Ergebnis entsteht ein für die jeweilige Peptid- und Protein-Variante charakteristischer "Fingerabdruck". Diese Vorbehandlung der Peptide und Proteine verbessert nicht nur die Unterscheidung geringer Massenunterschiede, sondern erlaubt auch die Differenzierung von möglichen Varianten mit Unterschieden in der Aminosäuresequenz. Before enrichment and / or detection of endogenous and Exogenous substances can be modified, especially fractionated and / or be marked. So z. B. to differentiate between endogenous and exogenous substances selective digestion or chemical modification of the substances can be used. You can do this on substances bound to a carrier material before mass determination be treated enzymatically or chemically. So it is z. B. possible that by treatment with proteases (e.g. tripsin) peptides and Proteins in, depending on the variant (amino acid sequence), different peptide fragments are cleaved. The individual sections point each have a characteristic molecular weight distribution because the respective enzymes at certain amino acid positions are preferred to cut. The choice of proteases is variant and species specific, because species-specific differences in Amino acid composition of, for example, growth hormones. As The result is one for the respective peptide and protein variant characteristic "fingerprint". This pretreatment of the peptides and Proteins not only improve the distinction less Mass differences, but also allows the differentiation of possible ones Variants with differences in the amino acid sequence.
Es lassen sich auch andere kovalente Proteinmodifikationen wie beispielsweise Glykosylierungen oder Phosphorylierungen durch die enzymatische Vorbehandlung der auf dem Trägermaterial (angereicherten und gereinigten) Proteine oder Peptide wie beispielsweise Wachstumshormon- und Erythropoetin-Varianten mit beispielsweise Glykosidasen oder Phosphorylasen nachweisen. Hierbei wird die spezifisch auf dem Trägermaterial angereicherte Probe entsprechend üblicher Methoden mit spezifischen Enzymen versetzt, die eine vollständige oder selektive Abspaltung von Zucker- oder Phosphatresten erlauben. Als Enzyme eignen sich beispielsweise die Glykosidasen PNGase-F oder Phosphorylasen wie die Alkalische Phosphatase und andere. Durch den Einsatz von verschiedenen Glykosidasen kann zwischen N- bzw. O- Verknüpfungen der Zuckerreste unterschieden werden. Eine weitere Möglichkeit stellt die chemische Abspaltung von Zuckerresten dar. Dabei findet Hydrazin Anwendung. Die analytischen Schritte erfolgen in Volumen, Zeit und Temperatur an die Trägermaterialoberfläche angepaßt, entsprechend bekannter Verfahren (Savage, A. (1997). Glycosylation: A post-translational modification. In Mammalian Cell Biotechnology in Protein Production, (ed. H. Hauser and R. Wagner), pp. 231-276. Berlin, New York: Walter de Gruyter). Other covalent protein modifications such as for example glycosylation or phosphorylation by enzymatic pretreatment of the (enriched and purified) proteins or peptides such as Growth hormone and erythropoietin variants with, for example, glycosidases or detect phosphorylases. Here, the specific on the Carrier-enriched sample according to customary methods spiked with specific enzymes that are complete or selective Allow sugar or phosphate residues to be split off. As enzymes the glycosidases PNGase-F or are suitable, for example Phosphorylases such as alkaline phosphatase and others. Because of the engagement of different glycosidases can be between N- or O- Links between the sugar residues can be distinguished. Another Possibility is the chemical elimination of sugar residues hydrazine is used. The analytical steps take place in Volume, time and temperature adapted to the surface of the substrate, according to known methods (Savage, A. (1997). Glycosylation: A post-translational modification. In Mammalian Cell Biotechnology in Protein Production, (ed. H. Hauser and R. Wagner), pp. 231-276. Berlin, New York: Walter de Gruyter).
Weitere Möglichkeiten der z. B. Proteinmodifikation, die eine Verbesserung der Unterscheidung zwischen natürlichen und künstlichen Peptiden und Proteinen unter den beschriebenen Anreicherungs- und Meßbedingungen ermöglichen können, stellen verschiedene bekannte und künftige Möglichkeiten zur selektiven Markierung von Aminosäuren oder kovalenten Modifikationen dar, die zu Masseveränderungen führen und so massenspektroskopisch nachgewiesen werden können. Other possibilities of z. B. protein modification, the one Improve the distinction between natural and artificial peptides and proteins among the described enrichment and Measuring conditions can enable, represent various known and future possibilities for the selective labeling of amino acids or covalent modifications that lead to mass changes and so on can be detected by mass spectroscopy.
Bei dem körpereigenem Material handelt es sich bevorzugt um Material, daß von einem lebenden Organismus entnommen wurde, aber auch die ex mortem Entnahme ist erfindungsgemäß vorgesehen. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den körpereigenen Materialien um Körperflüssigkeiten, Gewebe und/oder Organe. Dabei könnten die Körperflüssigkeiten Blut, Serum, Plasma, Harn, Milch, Schweiß, Speichel und/oder Liquor sowie alle anderen Körperflüssigkeiten sein. Das Blut kann dabei durch Punktion von Blutgefäßen (Venenpunktion) gewonnen werden. Auf Grund des sehr geringen Volumens, das für die Analyse benötigt wird, kann Blut auch durch die Punktion von Blutkapillaren (beispielsweise der Fingerbeere) gewonnen werden. Die Blutentnahme bzw. die Plasma-/Serumgewinnung sowie die Gewinnung anderer Körperflüssigkeiten erfolgt nach etablierten Verfahren. Sie beinhalten die Punktion der Gefäße, Trennung der Blutbestandteile, vorzugsweise durch Zentrifugation, und die Lagerung, vorzugsweise bei -80°C. Im Fall einer unmittelbaren Analyse ist die Probe vorzugsweise bis zur Analyse bei 4°C zu lagern. Gewebe und Organe werden durch etablierte Biopsieverfahren oder post mortem entnommen und entsprechend etablierten Verfahren gelagert. Vor der Analyse müssen die Organe und Gewebe zunächst beispielsweise nach etablierten Verfahren in entsprechenden Puffer homogenisiert werden. Als Puffer bietet sich beispielsweise Tris-HCl (pH 7,8) an. Die Körperflüssigkeiten wie z. B. Serum, Plasma, Liquor oder Harn können in der Originalkonzentration, verdünnt oder aufkonzentriert auf das Trägermaterial als definiertes Volumen mittels einer Pipette aufgetragen werden. Zur Vergrößerung des Auftragvolumens kann ein Adapter verwendet werden. Ein vergleichbares Vorgehen bietet sich für die Homogenate von Geweben und Organen an. Verdünnungsschritte und Probenvolumen (> 2 µl) sind von der Konzentration des zu untersuchenden Peptides und Proteins in der jeweiligen Matrix, z. B. Lösung, abhängig. Eine selektive Anreicherung auf dem Trägermaterial kann beispielsweise durch selektive Fraktionierung erfolgen. Methoden für Gewebehomogenate und den Harn sind dem Fachmann bekannt. The body's own material is preferably material that was taken from a living organism, but also that ex mortem removal is provided according to the invention. In a preferred embodiment is the body's own Materials around body fluids, tissues and / or organs. Doing so the body fluids blood, serum, plasma, urine, milk, sweat, Saliva and / or cerebrospinal fluid and all other body fluids. The blood can be punctured by blood vessels (venipuncture) be won. Due to the very small volume that is necessary for the Analysis is needed, blood can also be punctured by Blood capillaries (for example the fingertip) are obtained. The Blood sampling or plasma / serum extraction and extraction other body fluids follow established procedures. they include the puncture of the vessels, separation of the blood components, preferably by centrifugation, and storage, preferably at -80 ° C. In the case In an immediate analysis, the sample is preferably pending analysis Store at 4 ° C. Tissues and organs are established by Biopsy procedure or post mortem and taken accordingly established procedures stored. Before the analysis, the organs and Tissue initially, for example, according to established procedures appropriate buffer can be homogenized. As a buffer, for example Tris-HCl (pH 7.8). The body fluids such as B. serum, plasma, Liquor or urine can be in the original concentration, diluted or concentrated on the carrier material as a defined volume by means of applied with a pipette. To enlarge the Order volume, an adapter can be used. A comparable procedure lends itself to the homogenization of tissues and organs. Dilution steps and sample volume (> 2 µl) depend on the concentration the peptide and protein to be examined in the respective matrix, z. B. solution, depending. A selective enrichment on the Carrier material can be made, for example, by selective fractionation. Methods for tissue homogenates and urine are known to those skilled in the art known.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Trägermaterial um ein chromatographisches Trägermaterial. Dieses chromatographische Trägermaterial kann ein hydrophobes, hydrophiles, kationenaustauschendes, anionenaustauschendes und/oder metallionenbindendes Trägermaterial sein, aber auch alle anderen chromatographischen Trägermaterialien werden von dem erfindungsgemäßen Verfahren beansprucht. Die Bindung erfolgt während einer Inkubationsperiode, deren Parameter (Dauer, Temperatur etc.) von der Matrix und der Konzentration des jeweils zu untersuchenden Peptids oder Proteins abhängig sind. In einem weiteren Schritt (Waschschritt) erfolgt die selektive Entfernung möglichst vieler Stoffe, insbesondere Proteine und Peptide, von der Matrix bzw. dem Trägermaterial, die nicht von Interesse sind. Als Differenzierungskriterien zwischen endogenen und exogenen Stoffen, insbesondere Peptid- oder Proteinvarianten, dienen beispielsweise spezielle Bindungen an bestimmte chromatographische Oberflächen, Unterschiede in der Bindungsintensität an diese Oberflächen in Abhängigkeit von der Stringens des Waschpuffers etc. Als Trägermaterial kann aber auch ein immobilisiertes Trägermaterial genutzt werden, welches in einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens beansprucht wird. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist dieses immobilisierte Trägermaterial mit Antikörpern, Bindungsproteinen und/oder Rezeptoren immobilisiert worden. Dabei kann das Trägermaterial bzw. die Oberfläche des Trägermaterials vor Immobilisierung aktiviert werden. Auf diesen aktivierten/inaktivierten Trägermaterialien wird entsprechend publizierten Standardverfahren entweder ein Antikörper (monoklonal/polyklonal), Bindungsproteine und/oder Rezeptoren immobilisiert, die in der Lage sind, endogene und exogene Stoffe, z. B. STH oder Erythropoetin zu binden und so zusammen mit evtl. vorhandenen Fragmenten oder Varianten aus komplexen Matrizes, z. B. Lösungen, zu fischen. Die Kopplung von Antikörpern, Bindungsproteine und/oder Rezeptoren kann entweder direkt oder über einen Spacer erfolgen. Durch die Verwendung eines Spacers kann die Orientierung des Antikörpers, Bindungsproteins und/oder Rezeptors kontrolliert werden. Die Kopplung von Antikörpern oder Rezeptoren erfolgt in üblicher Weise während einer Inkubationsperiode, deren Parameter (Dauer, Temperatur etc.) von der Matrix und der Konzentration des jeweils zu untersuchenden Stoffes, insbesondere der Peptid- und/oder Proteinverbindung, abhängig ist. In einem weiteren Schritt (Waschschritt) erfolgt die Entfernung aller in der Matrix vorhandenen Substanzen, die nicht auf dem Trägermaterial gebunden wurden bzw. nicht von Interesse sind. In a further preferred embodiment, the Support material around a chromatographic support material. This chromatographic support material can be a hydrophobic, hydrophilic, cation-exchanging, anion-exchanging and / or metal ion-binding carrier material, but also all others chromatographic support materials are of the invention Process claimed. The binding takes place during a Incubation period, its parameters (duration, temperature etc.) from the matrix and the concentration of the peptide or protein to be examined are dependent. In a further step (washing step) the selective removal of as many substances as possible, in particular proteins and Peptides, of the matrix or the carrier material, of no interest are. As differentiation criteria between endogenous and exogenous Substances, especially peptide or protein variants, are used for example, special ties to certain chromatographic Surfaces, differences in the binding intensity to these surfaces in Dependence on the stringing of the washing buffer etc. As Carrier material can also be used an immobilized carrier material, which claims in a further embodiment of the method becomes. In a further preferred embodiment, this is immobilized carrier material with antibodies, binding proteins and / or Receptors have been immobilized. The carrier material or the Surface of the carrier material are activated before immobilization. On these activated / inactivated carrier materials is accordingly published standard methods either an antibody (monoclonal / polyclonal), binding proteins and / or receptors immobilized are able to endogenous and exogenous substances, e.g. B. STH or Bind erythropoietin and so together with any existing Fragments or variants from complex matrices, e.g. B. solutions to fish. The coupling of antibodies, binding proteins and / or receptors can be done either directly or via a spacer. Through the Using a spacer can change the orientation of the antibody, Binding protein and / or receptor are controlled. The coupling of antibodies or receptors takes place in the usual way during an incubation period, the parameters (duration, temperature, etc.) of the matrix and the concentration of the substance to be examined, in particular the peptide and / or protein compound. In a further step (washing step) removes all in the Matrix existing substances that are not on the carrier material were bound or are of no interest.
Bei dem Trägermaterial kann es sich z. B. um einen Chip, vorzugsweise einen Proteinchip, handeln. Auf oder an diesem Chip kann die Anreicherung, der Nachweis und ggf. eine notwendige Modifizierung erfolgen. The carrier material can be e.g. B. a chip, preferably a protein chip. On or on this chip the Enrichment, detection and, if necessary, any necessary modification.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die endogenen und exogenen Stoffe vor deren Nachweis voneinander abgetrennt. Diese Abtrennung der endogenen und exogenen Stoffe kann vor oder nach der Anreicherung auf einem geeigneten Trägermaterial erfolgen. Desweiteren kann die Abtrennung nach erfolgter Modifizierung, insbesondere Fraktionierung und/oder Markierung, erfolgen. So lassen sich z. B. die schon weiter oben dargestellten Modifikationen der Stoffe, wie beispielsweise Glykosylierung oder Phosphorylierung, durch die enzymatische Vorbehandlung der auf dem Trägermaterial (eventuell zuvor angereicherten) gereinigten endogenen und exogenen Stoffe mit beispielsweise Glykosidasen oder Phosphorylasen zur Auftrennung nutzen. In a further preferred embodiment, the endogenous and exogenous substances separated from each other before detection. This separation of the endogenous and exogenous substances can take place before or after enrichment on a suitable carrier material. Furthermore, the separation after modification, in particular fractionation and / or labeling. So z. B. the Modifications of the substances already described above, such as for example glycosylation or phosphorylation, through which enzymatic pretreatment of the on the carrier material (possibly before enriched) purified endogenous and exogenous substances For example, use glycosidases or phosphorylases for the separation.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die endogenen und exogenen Stoffe über ihre unterschiedlichen Molekulargewichte nachgewiesen. So stellt z. B. das sogenannte SELDI (für surface enhanced laser desorption/ionization)-Verfahren ein geeignetes Verfahren zum Nachweis von endogenen und exogenen Stoffen anhand des unterschiedlichen Molekulargewichts dar. Auch kann eine Analyse über z. B. Flugzeitmassenspektrometer (TOF [time-of-flight]-Analysator) oder vergleichbaren Apparaturen erfolgen, die eine Differenzierung auf der Basis der Molekülmasse oder beispielsweise anderen Selektionsmethoden erlauben. Die Stoffe werden dabei nach Zugabe einer energieabsorbierenden Matrix mit Hilfe eines Laserstrahls ionisiert und anschließend in einem elektrischen Feld beschleunigt. Die Schußfrequenz des Laserstrahls beträgt dabei im Durchschnitt 50 bis 100 Schüsse. Aus der Flugzeit der Stoffe vom Probenträger bis zum Detektor am Ende des Flugtunnels wird die Molekülmasse der gebundenen Partikel und ihrer eventuell vorhandenen Fragmente bestimmt. Die Differenzierung zwischen endogenen und exogenen Stoffen erfolgt in der Regel auf der Basis des Unterschieds des Molekulargewichts der Stoffe und/oder ihrer eventuell vorhandenen Fragmente. Die Genauigkeit des Systems in Bezug auf die Aussage über das Molekulargewicht (in Abhängigkeit von der Molekülgröße) beträgt ca. 0,1 bis 0,01 Prozent. In a further preferred embodiment, the endogenous and exogenous substances via their different molecular weights demonstrated. So z. B. the so-called SELDI (for surface enhanced laser desorption / ionization) process is a suitable process for the detection of endogenous and exogenous substances using the different molecular weight. An analysis of z. B. time of flight mass spectrometer (TOF [time-of-flight] analyzer) or comparable devices are made, which differentiate on the Basis of molecular weight or for example others Allow selection methods. The substances are added after a energy absorbing matrix ionized with the help of a laser beam and then accelerated in an electric field. The firing frequency of the Laser beam averages 50 to 100 shots. From the Flight time of the substances from the sample carrier to the detector at the end of the Flight tunnels are the molecular mass of the bound particles and their any fragments present are determined. The differentiation between endogenous and exogenous substances usually takes place on the Basis of the difference in the molecular weight of the substances and / or their any fragments present. The accuracy of the system in Relation to the statement about the molecular weight (depending on the molecular size) is approximately 0.1 to 0.01 percent.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die endogenen und exogenen Stoffe quantifiziert. Dies Quantifizierung kann dabei über Standards von endogenen und exogenen Stoffen erfolgen. In a further preferred embodiment, the endogenous and exogenous substances quantified. This quantification can be done via Standards of endogenous and exogenous substances are made.
Abschließend werden in einer besonders bevorzugten Ausführungsform die exogenen Stoffe anhand ihrer charakteristischen Modifizierung, insbesondere anhand ihrer bereits vorhandenen Modifizierung, voneinander unterschieden. So erfolgt z. B. die Differenzierung zwischen endogenen und exogenen Stoffen in der Regel auf der Basis des Unterschiedes des Molekulargewichts der Stoffe, insbesondere Peptid- und Proteinverbindung, oder ihrer Fragmente. Diese Unterschiede ergeben sich beispielsweise aus einer oder mehreren zusätzliche Aminosäuren. Die N-terminale Verlängerung des z. B. rekombinanten Wachstumshormons führt beispielsweise zu einer Erhöhung des Molekulargewichtes. Die Genauigkeit des z. B. TOF-Analysators in Bezug auf die Aussage über das Molekulargewicht (in Abhängigkeit von der Molekülgröße beträgt die Meßgenauigkeit 0,1 bis 0,01%) erlaubt daher nicht nur die Differenzierung zwischen endogenen und exogenen Stoffen, z. B. Wachstumshormonvarianten, sondern im Fall von Unterschieden in der Länge der N- terminalen Verlängerung auch Hinweise auf die Quelle des rekombinanten Wachstumshormons. Auch Modifikationen im Bereich der Zuckerreste wie beispielsweise beim Erythropoetin können so direkt oder nach beispielsweise enzymatische Modifikation nachgewiesen und z. B. zur Zuordnung zu einem bestimmten Produzenten genutzt werden. Finally, in a particularly preferred embodiment the exogenous substances based on their characteristic modification, especially based on their existing modification, distinguished from each other. So z. B. the differentiation between endogenous and exogenous substances usually based on the Difference in the molecular weight of the substances, in particular peptide and Protein compound, or its fragments. These differences arise for example from one or more additional amino acids. The N-terminal extension of the z. B. recombinant growth hormone leads, for example, to an increase in the molecular weight. The Accuracy of the z. B. TOF analyzer in relation to the statement about the molecular weight (depending on the molecular size is Measuring accuracy 0.1 to 0.01%) therefore not only allows Differentiation between endogenous and exogenous substances, e.g. B. Growth hormone variants, but in the case of differences in the length of the N- terminal extension also indicates the source of the recombinant growth hormone. Also modifications in the area of Sugar residues such as erythropoietin can be so directly or afterwards for example enzymatic modification detected and z. B. for Assignment to a specific producer can be used.
Weitere Einzelheiten und Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung der Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens und von bevorzugten Ausführungsformen in Verbindung mit den Unteransprüchen. Hierbei können die jeweiligen Merkmale für sich allein oder zu mehreren in Kombination miteinander verwirklicht sein. Further details and features of the invention result from the following description of the representation of the invention Method and preferred embodiments in connection with the subclaims. Here, the respective characteristics for themselves be realized alone or in combination with each other.
Spezifische monoklonale bzw. polyklonale Antikörper gegen die zu untersuchenden Partikel sowie eine IgG-Kontrolle in einer Konzentration zwischen 0,01 und 0,09 mg/ml werden in einem Volumen von 20 µl auf die voraktivierten Oberflächen eines Trägermaterials aufgetragen. Anschließend erfolgt die Inkubation in einer wasserdampfgesättigten Kammer (Inkubationskammer) für 1 bis 2 Stunden bei Raumtemperatur oder bei 4°C über Nacht (14-16 Stunden). Während dieser Inkubationsperiode werden die Antikörper kovalent an die aktivierten Trägermaterialoberflächen gebunden. Die verbleibenden freien Stellen des Trägermaterials werden durch die nun anschließende Zugabe von 20 µl Glyzerinlösung (0,1 M, pH 7,8) blockiert. Es erfolgt eine weitere Inkubation für 20 Minuten bei Raumtemperatur in der Inkubationskammer. Anschließend wird die Antikörperlösung durch mehrmaliges Waschen entfernt. Im ersten Schritt wird das Trägermaterial mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,8)- Lösung (50-100 µl) gewaschen. Anschließend erfolgt eine zweimalige Waschung mit jeweils 300 µl PBS-Lösung, die 0,5% (v/v) Triton X-100 enthält. Die Inkubationsdauer bei Raumtemperatur beträgt dabei jeweils 20 Minuten in der Inkubationskammer. Anschließend erfolgen zwei weitere Waschschritte mit jeweils 300 µl PBS (ohne Triton X-100) für 10 Minuten bei Raumtemperatur in der Inkubationskammer. Specific monoclonal or polyclonal antibodies against the investigating particles and an IgG control in a concentration between 0.01 and 0.09 mg / ml in a volume of 20 ul the preactivated surfaces of a carrier material are applied. The incubation is then carried out in a steam-saturated one Chamber (incubation chamber) for 1 to 2 hours at room temperature or at 4 ° C overnight (14-16 hours). During this Incubation period, the antibodies are covalently attached to the activated Carrier surfaces bound. The remaining vacancies of the Carrier material are now added by 20 µl Glycerine solution (0.1 M, pH 7.8) blocked. Another incubation for 20 minutes at room temperature in the incubation chamber. The antibody solution is then removed by washing several times. In the first step, the carrier material with 50 mM Tris-HCl (pH 7.8) - Solution (50-100 µl) washed. This is followed by two Wash with 300 µl PBS solution containing 0.5% (v / v) Triton X-100 contains. The incubation period at room temperature is in each case 20 minutes in the incubation chamber. Then two further washing steps with 300 µl PBS (without Triton X-100) for 10 Minutes at room temperature in the incubation chamber.
Die Aufgabe des Probenmaterials erfolgt entweder direkt auf das voraktivierte und immobilisierte Trägermaterial bei geringem Probenmaterial (Volumen < 5 µl) oder über einen Adapter (Volumen > 5 µl). Die Inkubation erfolgt für 1-2 Stunden bei Raumtemperatur in der Inkubationskammer. Anschließend wird das Probenmaterial mittels einer Pipette entfernt, und das beladene Trägermaterial wird zweimal mit jeweils 300 µl PBS-Lösung, die 0,5% (v/v) Triton X-100 enthält gewaschen. Die Inkubationsdauer bei Raumtemperatur beträgt dabei jeweils 10 Minuten in der Inkubationskammer. Anschließend erfolgen zwei weitere Waschschritte mit jeweils 300 µl PBS (ohne Triton X-100) für 10 Minuten bei Raumtemperatur in der Inkubationskammer. Die letzten beiden Waschschritte erfolgen mit Wasser (300 µl) für jeweils 10 Minuten. Anschließend wird das Trägermaterial getrocknet. Als energieabsorbierende Substanz wird beispielsweise alpha-Cyano-4-hydroxy Zimtsäure (2 mg/ml) in 50% (v/v) Acetonitril und 0,2% (v/v) Tri-flouressigsäure zugegeben. Die Analyse der endogenen und exogenen Stoffe erfolgt anschließend mit Hilfe eines Flugzeitmassenspektrometers. The sample material is either fed directly onto the Pre-activated and immobilized carrier material with low sample material (Volume <5 µl) or via an adapter (volume> 5 µl). The Incubation takes place for 1-2 hours at room temperature in the Incubation chamber. Then the sample material is pipetted removed, and the loaded carrier material is twice with 300 ul PBS solution containing 0.5% (v / v) Triton X-100 washed. The Incubation time at room temperature is 10 minutes each the incubation chamber. This is followed by two more Wash steps with 300 µl PBS (without Triton X-100) for 10 minutes Room temperature in the incubation chamber. The last two Washing steps are carried out with water (300 µl) for 10 minutes each. The carrier material is then dried. As an energy absorbing Substance becomes, for example, alpha-cyano-4-hydroxy cinnamic acid (2 mg / ml) in 50% (v / v) acetonitrile and 0.2% (v / v) tri-fluoroacetic acid added. Endogenous and exogenous substances are analyzed then using a time-of-flight mass spectrometer.
Durch diese Erfindung ist es möglich, aus z. B. einem komplexen Proteingemisch sehr ähnliche Varianten eines speziellen Peptids oder Proteins - beispielsweise des Wachstumshormons und des Erythropoetins - anzureichern und nachzuweisen, aber auch der Nachweis von anderen endogenen und exogenen Stoffen ist möglich. Der Gegenstand der Erfindung vereinigt daher unter anderem die hohe Selektivität von Antikörpern oder anderen Affinitätsschritten mit einer hohen Genauigkeit der Bestimmung des Molekulargewichtes der angereicherten Stoffe bzw. Moleküle. Nach der Aufgabe der Matrix auf die Trägermaterialoberfläche kann unter anderem die Anreicherung, Modifikation (enzymatische Spaltung) und der Nachweis auf dieser erfolgen. Damit werden ferner auch Fehlerquellen und das Kontaminationsrisiko reduziert. Ein Analysendurchgang ist im allgemeinen innerhalb von 4 Stunden abgeschlossen. Der Probendurchsatz ist vom Automatisierungsgrad abhängig. By this invention, it is possible from z. B. a complex Protein mixture very similar variants of a special peptide or Protein - for example growth hormone and erythropoietin - to enrich and to prove, but also the proof of others endogenous and exogenous substances are possible. The subject of The invention therefore combines, among other things, the high selectivity of Antibodies or other affinity steps with a high accuracy of Determination of the molecular weight of the enriched substances or Molecules. After placing the matrix on the substrate surface can include enrichment, modification (enzymatic Cleavage) and the proof on this. This will also Sources of error and the risk of contamination are reduced. On Analysis run is generally completed within 4 hours. The sample throughput depends on the degree of automation.
Claims (14)
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