DE10155518A1

DE10155518A1 - Verfahren zum durchflußzytometrischen Nachweis der Freisetzung von Stoffen aus Zellorganellen

Info

Publication number: DE10155518A1
Application number: DE2001155518
Authority: DE
Inventors: Klaus-Michael Debatin; Karsten Stahnke; Hubert Hug
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-11-13
Filing date: 2001-11-13
Publication date: 2003-05-28

Abstract

Die Erfindung ist gerichtet auf ein Verfahren zum durchflußzytometrischen Nachweis der Freisetzung von Stoffen aus Zellorganellen, aufweisend die folgenden Schritte: DOLLAR A Fixieren von zu untersuchenden Zellen; Permeabilisieren der äußeren Zellmembran; Färben der Zellen mit einer Fluorchrom-Verbindung, welche spezifisch an zumindest einen nachzuweisenden Stoff bindet; durchflußzytometrische Messung der einzelnen Zellen unter Anregung der Fluorchrom-Verbindung; und Feststellen der Fluoreszenzstärke der Zellen.

Description

Die vorliegende Erfindung ist auf einen gezielten Nachweis der Freisetzung von Substanzen aus Organellen von Zellen mittels Fluoreszenzdurchflußzytometrie gerichtet.
Durchflußzytometrie ist ein Verfahren, mit dessen Hilfe die Fluoreszenz einzelner, mit einem Fluorochrom markierter Zellen gemessen werden kann. Ein Durchflußzytometer umfasst einen Vorratsbehälter mit einer Zellsuspension markierter Zellen, eine Fallstrecke, die ein dünner Tröpfchenfaden, der aus einer Öffnung des Vorratsbehälters ausfließt, durchqueren muß, einen Laser, welcher den Tröpfchenfaden bestrahlt, sowie einen oder mehrere Meßkanäle, welche die Emissions-Fluoreszenz des Tröpfchenfadens messen können. Die Herstellung des Tröpfchenfadens ist hierbei kritisch, da erreicht werden soll, daß sich einzelne Tröpfchen bilden, die jeweils nur eine Zelle enthalten. Auf diese Weise kann erreicht werden, daß der Laser auch nur jeweils eine Zelle bestrahlt, so daß von den Meßkanälen die Fluoreszenz einer einzelnen Zelle gemessen wird. Eine angeschlossene Datenverarbeitungsanlage speichert die einzelnen Messungen und kann eine statistische Auswertung durchführen.
Ein Prinzip der Durchflußzytometrie ist die Messung relativer Fluoreszenzen mittels spannungsgesteuerter Photomultiplier- Röhren (PMTs) als Meßkanäle. Dabei wird das Fluoreszenzsignal auf einer logarithmischen Skala von 100 (Beginn der 1. Dekade) bis 10⁴ (Ende der 4. Dekade) dargestellt. Eine Kalibrierung auf diesen Wertebereich erfolgt anhand von negativen und positiven Kontrollstandards, welche im einen Fall nur Hintergrundfluoreszenz und im anderen Fall die maximal erwartbare, zu bestimmende Fluoreszenz aufweisen sollen. Die dabei verwendeten PMT-Spannungen sind vom eingesetzten Durchflußzytometer abhängig und werden anhand der jeweils verwendeten Kontrollstandards eingestellt.
Zusätzlich kann eine elektronische Kompensation der Messwerte vorgenommen werden. Die elektronische Kompensation ist ein Standardverfahren in der Mehrfarbendurchflußzytometrie. Werden Zellen mit zwei oder mehr Fluorochromen markiert, entsteht manchmal das Problem, daß aufgrund der Überlappung der Emissions-Fluoreszenzspektren bei starken Fluoreszenzsignalen eine Einstrahlung in den benachbarten Fluoreszenzkanal auftritt und dort zu einem falsch positiven Signal führt. Dieses wird im Rahmen der elektronischen Kompensation durch elektronische Subtraktion für jedes einzelne Meßereignis korrigiert, indem von der falsch positiven Fluoreszenz ein Prozentsatz der Ausgangsfluoreszenz abgezogen wird.
Apoptose ist ein biologischer Prozeß, bei dem eine Kette von genetisch kontrollierten Ereignissen in Zellen ausgelöst wird, die den gesteuerten Tod und die effiziente Beseitigung der betroffenen Zellen bewirken. Ein Nachweis von Apoptose und Apoptose-regulierender Moleküle ist entscheidend für Diagnose und Therapie verschiedener Erkrankungen, wie Autoimmunerkrankungen, Virusinfektionen, neurodegenerative Erkrankungen, Knochenmarkinsuffizienzsyndromen, Leukämien und soliden Tumoren.
Im Rahmen des Apoptose-Nachweises geht es häufig um die Testung potentiell wirksamer Zytostatika. Zytostatika induzieren Apoptose, indem sie wesentliche Elemente des Apoptoseprogramms aktivieren. Die Effektivität von Zytostatika hängt davon ab, in welchem Ausmaß die molekularen Apoptoseregulatoren aktiviert werden, insbesondere, in welchem Ausmaß Mitochondrien zur Freisetzung von pro-apoptotischen Signalmolekülen aktiviert werden. Insbesondere die Freisetzung von Cytochrom c aus den Mitochondrien von Zellen, die apoptotisch werden, ist ein wichtiger Schritt in der Signalabfolge des Zelltodprogramms, die bei den meisten Formen von Zelltod beteiligt ist.
Im Stand der Technik sind hauptsächlich zwei Verfahren bekannt die mitochondriale Cytochrom c Freisetzung nachzuweisen. Zum einen kann eine Trennung von Cytosol und Mitochondrien in einem Trennverfahren und eine anschließende Detektion mittels Immunoblot vorgenommen werden. Die Zunahme eines Meßsignals in der cytosolischen Fraktion und die Abnahme des Meßsignals in der Mitochondrienfraktion wird dabei als eine Freisetzung des Cytochrom c aus den Mitochondrien interpretiert. Dieses Verfahren ist aufwendig, störanfällig und benötigt zudem eine große Menge (ca. 50 Mio.) Zellen. Eine solche Lösung ist damit praktisch nur in der Grundlagenforschung anwendbar, um das Prinzip mitochondrialer Freisetzung zu belegen. Ein weiterer Nachteil dieses vorbekannten Verfahrens liegt darin, daß die verwendeten Zellen nur gemeinsam untersucht werden können, so daß es nicht möglich ist, eine Cytochrom c Freisetzung in nur einem Teil bzw. einer Subpopulation der verwendeten Zellen nachzuweisen. Damit ist es auch nicht möglich, die bei Zytostatikaresistenz fehlende Cytochrom c Freisetzung nur einer Teilpopulation der untersuchten Zellen nachzuweisen.
Das andere bekannte Verfahren besteht in einem immunhistochemischen Nachweis der Freisetzung durch Anfärbung von Cytochrom c in der Zelle mittels geeignet markierter Antikörper und fluoreszenzmikroskopischer Auswertung. Auch dieses Verfahren ist zeitaufwendig, zudem erfordert die mikroskopische Auswertung viel Erfahrung und ist vom Untersucher abhängig. Im Gegensatz zum oben vorgestellten Verfahren ist die Analyse einzelner Zellen möglich, wobei die Menge analysierter Zellen durch die mikroskopische Beobachtung und die begrenzte Zellzahl auf einem Objektträger stark limitiert ist.
Eine Testung der Resistenz gegen Zytostatika wird konventionell durch den Nachweis von Wachstumshemmung, Zelltod oder Abnahme metabolischer Funktionen (beispielsweise der Reduktion von MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazoliumbromid) in Zytostatika-behandelten Zellkulturen durchgeführt. Die Zytostatika-Resistenztestung mittels eines MTT Assays zeigt zwar grobe Korrelationen mit dem Ansprechen einer Chemotherapie, ist aber nicht geeignet, für den einzelnen Patienten individuelle Vorhersagen über die Wirksamkeit einzelner Medikamente zu machen.
Ein Nachweis der Cytochrom c Freisetzung in primären humanen Zellen zum Zwecke des Nachweises einer Zytostatika-Wirkung ist aus dem Stand der Technik nicht bekannt, was auf methodische Schwierigkeiten mit den oben skizzierten Verfahren zurückzuführen ist. Die einzige Möglichkeit, mitochondriale Veränderungen nach Apoptose-Induktion in Patientenzellen ex vivo nachzuweisen, ist die Messung des Mitochondrienmembranpotentials, welches allerdings nur bei einem Teil der Apoptoseformen und nicht in allen Zelltypen verändert ist.
Der vorliegenden Erfindung lag daher die Aufgabe zu Grunde, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem ein zuverlässigerer und differenzierter Nachweis von Apoptosesignalmolekülen in Zellen mit aktiviertem Zelltodprogramm in einfacher Weise möglich wird.
Diese Aufgabe wird gelöst durch die Bereitstellung des Verfahrens gemäß dem unabhängigen Patentanspruch 1. Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen, Aspekte und Details der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Patentansprüchen und der Beschreibung.
Der Erfindung liegt das Prinzip zugrunde, durch geeignete Vorbehandlung von Zellen Stoffe spezifisch in Zellorganellen durchflußzytometrisch nachweisen zu können. Das Verfahren ist damit nicht nur zum Nachweis von Apoptose geeignet, sondern kann ganz allgemein dort eingesetzt werden, wo Substanzen in Organellen nachgewiesen werden sollen, die auch im Cytoplasma vorkommen oder vorkommen können und daher ansonsten mitgemessen würden.
Die Erfindung ist daher gerichtet auf ein Verfahren zum durchflußzytometrischen Nachweis von Stoffen, die aus Zellorganellen freigesetzt werden, aufweisend die folgenden Schritte:

- Fixieren von zu untersuchenden Zellen
- Permeabilisieren der äußeren Membran unter Erhalt der Organellenstruktur;
- Färben der Zellen mit einer Fluorochrom-Verbindung, welche spezifisch an zumindest einen nachzuweisenden Stoff bindet; und
- durchflußzytometrische Messung der einzelnen Zellen unter Anregung der Fluorochrom-Verbindung; und
- Feststellen der Fluroreszenzstärke der Zellen.

Durch dieses Verfahren ist es möglich, die aufzufindenden Stoffe zwar aus dem Cytosol zu entfernen, sofern sie dort vorhanden waren, da die äußere Zellmembran permeabel gemacht ist, jedoch in den Zellorganellen zu belassen, da sie dort an Organellenstrukturen gebunden sind und die Zelle daher nicht verlassen können. Noch in den Organellen vorhandener Stoff kann dann durch Anlagerung einer Fluorochrom-Verbindung durchflußzytometrisch bestimmt werden.
Unter Zellen sind erfindungsgemäß alle tierischen oder menschlichen Zellen zu verstehen, bei denen das Zelltodprogramm aktiviert ist. Dies sind bevorzugt primäre Tumor- oder Leukämiezellen.
Unter einem nachzuweisenden Stoff ist im Sinne der vorliegenden Erfindung jede in der Zelle vorhandene chemische Substanz zu verstehen, die mittels einer Fluoreszenzverbindung nachgewiesen werden kann, sei dies durch direkte oder indirekte Bindung etc. Es kann sich hierbei um Nukleinsäuren wie DNA, RNA, t-RNA, als genomische oder Plasmid-DNA, mRNA, mitochondriale DNA etc. handeln, oder um Proteine, Peptide und Proteinkomplexe, oder um andere Moleküle wie Stoffwechselprodukte, Strukturkomponenten der Zelle aus Kohlenhydratpolymeren, Membrankomponenten oder sonstige Bestandteile der Zellen.
Keinesfalls soll die Erfindung auf Cytochrom c beschränkt sein, auch wenn der Wunsch nach dessen einfachem Nachweis als Ausgangsbasis der Erfindung beschrieben ist. Vielmehr kann der Fachmann dem Studium der Erfindungsbeschreibung entnehmen, daß die Erfindung auf zahlreiche Verbindungsklassen anwendbar ist, und eine Vielzahl von Anwendungsfeldern erschließt. Eine derartige Anwendung ist beispielsweise der Freisetzungsnachweis anderer Apoptosesignalmoleküle aus Mitochondrien, wie z. B. Smac oder AIF (apoptosis inducing factor), oder aus dem endoplasmatischen Retikulum, wie z. B. Caspase 12.
Nach der Durchflußzytometrie, die stets rechnergestützt erfolgt, steht ein Datensatz über die einzelnen, gemessenen Zellen zur Verfügung, der in üblicher Weise und mit Hilfe entsprechender Auswerteprogramme verarbeitet und ausgewertet werden kann. Das erfindungsgemäße Verfahren kann beispielsweise den weiteren Schritt aufweisen:

- Berechnen eines Anteils an Zellen, der über und/oder unter einem vorgegebenen Fluoreszenzgrenzwert liegt.

Durch diese Ausführungsform lässt sich mittels Grenzwertfestsetzung das erhaltene, primäre Datenmaterial auf eine einfachere Ja/Nein Entscheidung reduzieren, d. h. auf die Beantwortung der Frage, ob sich der gesuchte Stoff in einer Organelle aufhält oder im Cytoplasma. Entsprechende Grenzwertfestsetzungen sind dem Fachmann geläufig und können in Vorversuchen festgelegt werden.
Um das Diffundieren von Stoffen, namentlich des zu untersuchenden Stoffs, aus dem Cytoplasma der fixierten Zellen zu beschleunigen, kann es weiterhin vorteilhaft sein, wenn die Zellen nach dem Permeabilisieren mit einer Waschlösung gewaschen werden, um den nachzuweisenden Stoff aus dem Cytoplasma der Zellen zu entfernen. Beispiele für geeignete Waschpuffer sind Saponin (0,1%), Digitonin (0,1%), Triton X100 (0,01%). Weiterhin kann es vorteilhaft sein, die Bindung des Stoffes an die Waschlösung durch Zugabe von Proteinen und Auswahl eines geeigneten pH-Wertes zu erhöhen.
Unter einer Zellorganelle sind im Sinne der vorliegenden Erfindung alle Kompartimentierungen innerhalb von Zellen zu verstehen, welche durch ihre Doppelschichtmembran von anderen Kompartimenten der Zelle so getrennt sind, daß der zu untersuchende Stoff ohne eine Permeabilisierung der Kompartiment-Membran nicht in das Cytosol gelangen kann. Beispielsweise können die Zellorganellen Mitochondrien, Chloroplasten, Golgisysteme, endoplasmatisches Retikulum oder Zellkerne sein. Je nach Durchlässigkeit der betrachteten Organellenmembran können ggfs. unterschiedliche Stoffe untersucht werden, beispielsweise nur Stoffe, die mehr als eine Grenzmolekularmasse für den Durchtritt durch die Organellenmembran aufweisen.
Der erste Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Fixieren der zu untersuchenden Zellen. Hierdurch werden diese in ihrer Form stabilisiert und sind den nachfolgenden Verfahrensschritten leichter zugänglich. Das Fixieren kann beispielsweise in üblicher Weise mit bekannten Fixationsmitteln in üblichen Verfahren durchgeführt werden. Bevorzugterweise wird die Fixierung mit Paraformaldehyd, Glutaraldehyd oder Methanol erfolgen.
Ein zentraler Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Permeabilisieren der äußeren Zellmembran, um einen Austritt des zu untersuchenden Stoffs aus dem Cytosol zu ermöglichen. Erst durch das Permeabilisieren kann eine Unterscheidung bezüglich der Lokalisierung des nachzuweisenden Stoffs getroffen werden. Sofern sich der zu untersuchende Stoff in einer der Organellen aufhält, ist ein Auswaschen nach Permeabilisierung der äußeren Zellwand nicht möglich, so daß der Stoff nach Fluorochrom-Bindung durchflußzytometrisch nachweisbar bleibt. Ist andererseits der Stoff im Cytoplasma auffindbar, wird er durch das Permeabilisieren zum Hinausdiffundieren aus der Zelle gebracht werden, so daß kein durchflußzytometrischer Nachweis mehr möglich ist bzw. das gemessene Signal erheblich kleiner ist. Vorzugsweise wird das Permeabilisieren der äußeren Zellmembran mit einem Detergens erfolgen. Es ist jedoch auch möglich, andere Techniken der Permeabilisierung zu verwenden, beispielsweise eine Behandlung mit hypotonen Lösungen. Das verwendete Detergens kann ausgewählt sein aus Saponin (0,1%), Digitonin (0,1%) oder Triton X100 (0,01%).
Die verwendete Fluorochrom-Verbindung sollte über zwei Funktionalitäten verfügen, um für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet zu sein. Zum einen sollte sie ein eigentliches Fluorochrom enthalten, das nach Anregung im Durchflußzytometer eine Fluoreszenz-Emission erzeugt. Zum anderen sollte die Fluorochrom-Verbindung eine mit dem eigentlichen Fluorochrom gekoppelte Substanz enthalten, welche spezifisch an den zu untersuchenden Stoff bindet. Das verwendete Fluorochrom richtet sich nach der jeweils konkreten Fragestellung und den verfügbaren Fluorochromen. Bevorzugte Fluorochrome sind Fluoresceinisothiocyanat (FITC), R- Phycoerythrin, Allophycocyanin oder Peridinchlorophyll. Dem Fachmann ist die Durchführung geeigneter intracellulärer Fluoreszenzfärbungen geläufig. Auch bei der spezifischen bindenden Komponente steht ein großes Spektrum an Verbindungen zur Verfügung, die aus dem Stand der Technik für eine Vielzahl von Stoffen bekannt sind. Als besonders flexibel im Einsatz haben sich hierbei Nukleinsäuren und Proteine herausgestellt, da sie einer Vielzahl von zu untersuchenden Stoffen angepasst werden können. Nukleinsäuren sind insbesondere geeignet zur Bindung an andere Nukleinsäuren durch eine komplementäre Abfolge der Nukleotide. Insbesondere wird bevorzugt, daß die Fluorochrom-Verbindung einen Farbstoff-Anteil und einen Proteinanteil aufweist, wobei der Proteinanteil vorzugsweise ein Antikörper, Antikörperderivat oder Antikörperfragment ist. Durch die Verwendung von Antikörpern lässt sich eine große Zahl von zu untersuchenden Stoffen mit hoher Spezifität nachweisen, seien dies andere Proteine, Nukleinsäuren oder Strukturelemente innerhalb der Zelle.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders vorteilhaft anwendbar, wenn der nachzuweisende Stoff ein Protein ist.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der nachzuweisende Stoff Cytochrom c, so daß dieses Verfahren sich unerwarteterweise sogar zum Nachweis der Apoptose und der Zytostatika-Wirksamkeit bzw. -Resistenz einsetzen lässt.
Es ist ganz besonders bevorzugt das Vorhandensein von Cytochrom c durch Bindung an einen anti-Cytochrom c-Antikörper (Fa. BD Pharmingen), der wiederum durch einen FITC-markierten anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper nachgewiesen wird, nachzuweisen.
Wie bereits erläutert, ist ein besonders interessantes Einsatzgebiet der vorliegenden Erfindung die Beobachtung dynamischer Vorgänge in der Zelle, beispielsweise die Wirkung von Zytostatika auf eine Zellpopulation. Es wird daher insbesondere bevorzugt, daß die Zellen vor der Fixierung mit einem Wirkstoff inkubiert werden, um auf diese Weise eine zu untersuchende Reaktion zu provozieren.
Ein solcher Wirkstoff ist vorzugsweise ein potentielles Zytostatikum, dessen apoptose-auslösende Eigenschaften bestimmt werden sollen.
Es ist aber auch möglich, ein bekanntes Zytostatikum mit Tumor- oder Leukämiezellen eines Patienten zu inkubieren, um über das erfindungsgemäße Verfahren die Sensitivität der malignen Zellen für verschiedene Zytostatika zu bestimmen. Es besteht ferner die Möglichkeit Zellen eines Patienten, der unter Zytostatikatherapie steht, zu untersuchen, um herauszufinden, ob dieser auf die Therapie anspricht (ex vivo Monitoring von Zytostatikatherapie).
Bislang ist das erfindungsgemäße Verfahren im Hinblick auf seine isolierte Ausführung beschrieben worden. Es ist jedoch auch möglich, mehr als eine Messung mit einem Durchflußzytometer gleichzeitig durchzuführen. Das einfachste Vorgehen dabei ist die Verwendung eines Durchflußzytometers mit zwei oder mehr Lasern, die jeweils in unterschiedlichen Wellenlängenbereichen Licht emittieren und damit in der Lage sind, verschiedene Fluorochrome zur Fluoreszenz anzuregen.
Es wird daher erfindungsgemäß bevorzugt, daß gleichzeitig eine zweite Eigenschaft der zu untersuchenden Zellen mit Hilfe einer zweiten Fluorochrom-Verbindung festgestellt wird.
Es ist allerdings auch möglich, ein Ein-Laser Durchflußzytometer zu verwenden, um zwei verschiedene Fluorochrom-Verbindungen gleichzeitig zu messen. In dieser bevorzugten Ausführungsform ist die Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren mit einem Ein-Laser- Durchflußzytometer mit zwei Fluoreszenzkanälen durchgeführt wird, wobei das zweite Fluorochrom einen mit dem ersten Fluorochrom überlappenden Emissionswellenlängenbereich aufweist und die Photomultiplier-Röhrenspannung des zum Messen des zweiten Fluorochroms vorgesehenen Fluoreszenzkanals so eingestellt wird, daß kein vom ersten Fluorochrom in diesem Fluoreszenzkanal erzeugtes Fluoreszenz-Emissionssignal detektiert wird.
Diese bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird in der deutschen Patentanmeldung DE 100 53 747.2 detailliert beschrieben, so daß hier auf eine ausführliche Darstellung verzichtet werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erlaubt die erfindungsgemäße Methode beispielsweise auf einfache und kostensparende Weise die Messung des wichtigsten Apoptose-induzierenden mitochondrialen Signalvorgangs in Kombination mit dem gleichzeitigen Nachweis von Caspasenaktivierung mittels konventioneller Durchflußzytometrie. Damit ist es erstmals möglich, zwei Apoptosesignalwege in einer Zelle durchflußzytometrisch zu untersuchen.
Durch die etablierte Methode der Durchflußzytometrie kann damit der mitochondriale Apoptosesignalweg im Zusammenhang weiterer biologischer Parameter wie der Zelldifferenzierung, dem Zellzyklus, der Zellaktivierung usw. untersucht werden. Die kombinierte durchflußzytometrische Untersuchung mit anderen apoptoseregulierenden Molekülen ermöglicht eine weitere Charakterisierung von Signalwegen und deren Abhängigkeiten. Weiterhin ermöglicht die erfindungsgemäße Methode durch die Verbindung mit der Detektion von Phosphatidylserinexternalisierung mittels Annexin-V. ein umfassendes Monitoring von den frühen Apoptose-Schritten der Mitochondrienaktivierung bis zu einem späten Schritt der Membranveränderung. Dieser Detektion liegt das Prinzip zugrunde, daß sich Phosphatidylserin in lebenden Zellen ausschließlich auf der Innenseite der Zellmembran befindet. Nach Membranveränderungen durch den Apoptoseprozeß erscheint Phosphatidylserin auf der Membranaußenseite. Annexin V bindet spezifisch an Phosphatidylserin, so daß sich mittels (FITC)- markiertem Annexin V die apoptotischen Membranveränderungen nachweisen lassen.
Für die Fortentwicklung von Zytostatika ist es entscheidend, Substanzen zu identifizieren, die effektiv mitochondriale Signalwege aktivieren, da nur dann von einer sicheren Apoptoseinduktion ausgegangen werden kann. Durch die Anwendung der Durchflußzytometrie ist die erfindungsgemäße Methode besonders geeignet für die präklinische Testung der Wirksamkeit von neu entwickelten Zytostatika an etablierten Zellkultursystemen im Hochdurchsatzverfahren.
Weiterhin erlaubt es das erfindungsgemäße Verfahren es, die mitochondriale Cytochrom c Freisetzung gemeinsam mit der Expression von Oberflächenepitopen zu messen. Damit ist es beispielsweise möglich, Leukämiezellen in heterogenen Zellpopulationen, wie peripherem Blut, zu identifizieren und deren Chemosensitivität zu untersuchen. Zusätzlich können resistente Subpopulationen nach ihrem Differenzierungsgrad weiter charakterisiert werden.
Der entscheidende Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der geringe Kostenaufwand, eine einfache und schnelle Durchführbarkeit sowie die Möglichkeit, derzeit verfügbare Routine-Durchflußzytometer für die Messung zu verwenden. Damit ist gewährleistet, daß die Methode als diagnostische Anwendung beispielsweise zur Chemosensitivitätsmessung bei Leukämien und Tumoren rasche Verbreitung finden wird.
Die Erfindung wird weiter anhand der Figuren beschrieben, welche zeigen:
Fig. 1 Analyse der mitochondrialen Cytochrom c-Freisetzung in CD95 und Etoposid-induzierter Apoptose durch Durchflußzytometrie
Jurkatzellen wurden mit Medium allein (A, D), mit Zelltodtriggerndem anti-APO-1 Antikörper für 3 Stunden (B) und 6 Stunden (C) oder mit Etoposid für 4 Stunden (E) und 8 Stunden (F) kultiviert. Das intrazelluläre Cytochrom c wurde durch Durchflußzytometrie in fixierten (4% PFA) und permeabilisierten (Saponin 0,2%) Zellen nachgwiesen. Das Fluoreszenzprofil des Cytochrom c-Signals ist im Histogramm gezeigt. Die Prozentsätze geben den Anteil von Zellen mit verringertem Cytochrom c-Gehalt wieder.
Fig. 2 Identifizierung von mangelnder Cytochrom c-Freisetzung und Caspase-3 Aktivierung in Zellen, die mit Bcl-2 transfiziert sind
Jurkat-Zellen (A-C) und Jurkat-Zellen, die mit Bcl-2 (D-F) transfiziert worden waren, wurden mit Medium allein (A, F), mit anti-APO-1 (B, E) und mit anti-APO-1 sowie dem Caspase- Inhibitor z-VAD-fmk (C, F) für 6 Stunden (A-C) oder 24 Stunden (D-F) inkubiert. Lebende Zellen wurden im "Forward/Side Scatter Plot" identifiziert und auf Cytochrom c und aktives Caspase-3-Fragment analysiert. In der Figur ist Cytochrom c gegenüber Caspase-3 gezeigt.
Fig. 3 Analyse der Cytochrom c-Freisetzung und Caspase-3 Aktivierung in primären Leukämiezellen eines Patienten mit resistentem Krankheitsverlauf
Leukämiezellen eines Patienten mit gegenüber Chemotherapie resistenter myeloischer Leukämie (FAB MO) wurden in RPMI 1640- Medium allein (A), Etoposid 10 µg/ml (B) und OH- Cyclophosphamid 3 µg/ml (C) für 24 Stunden inkubiert. Lebende Zellen wurden im "Forward/side scatter plot" identifiziert und auf Cytochrom c und aktives Caspase-3 Fragment analysiert. In der Figur ist Cytochrom c gegenüber Caspase-3 gezeigt. Man beachte die Caspase-Aktivierung in Abwesenheit der Cytochrom c-Freisetzung in dieser Leukämieprobe.
Im folgenden soll die Erfindung an Hand von konkreten Ausführungsbeispielen weiter erläutert werden.

Beispiel 1

Allgemeines

Zellkulturen

Die menschliche Jurkat T-Lymphozyten-Zellinie wurde in RPMI 1640 (Life Technologie, Inc., Eggenstein, Deutschland) mit 10% fötalem Kälberserum (FCS, Sigma Chemicals, Deisenhofen, Deutschland) zusammen mit Penicillin, Streptomycin und Glutamin (Biochrom KG, Berlin, Deutschland) bei 37% in befeuchteter Luft/5% CO₂ kultiviert. Die Vektorkontrolle oder SKW-Zellinien, die Bcl-2 überexprimieren, wurden in RPMI 1640 (Life Technologies) enthaltend 0,5 mg/ml Geneticin (Life Technologies) gehalten. 0,5 × 10⁵ Zellen/ml wurden in 24- Lochplatten zur Bestimmung der Apoptose oder in 75-cm² Gefäßen (Falcon, Heidelberg, Deutschland) für die Proteinisolierung, Mikroskopie oder Durchflußzytometrie kultiviert.

Proben

Aus Knochenmarkaspiraten von Leukämiepatienten wurden Leukämische Blasten durch Ficoll-Hypaque Dichtegradientenzentrifugation (Ficoll, Dichte 1,077 g/l, Biochrom KG) bei 300 × g für 25 Min. bei 20°C isoliert, zweimal mit Hanks- Salzlösung ergänzt mit 2% fötalem Kalbsserum (HBSS/FCS) bei 4°C gewaschen und auf 10⁷ Zellen/ml eingestellt. 1 × 10⁶ Zellen/ml wurden in 24-Lochplatten zur Bestimmung der Apoptose für die Durchflußzytometrie kultiviert.

Beispiel 2

Analyse der Leukämiezellpopulation

Zellanalysen wurden mittels Durchflußzytometrie an einem FACSCalibur Cytometer (Fa. Becton Dickinson) ausgestattet mit einem 488 nm Argon- und einem 650 nm Rotdiodenlaser durchgeführt. 0,5-1 × 10⁶ Zellen pro Test wurden für 25 Minuten bei 4°C mit einer Kombination von Fluorochrom CD34PerCP, CD33APC, CD19APC konjugiert an monoklonale Antikörper für CD34, CD33 im Fall von AML, und CD34, CD19 im Fall von ALL angefärbt. Die Antikörper CD34 PerCp, CD33 APC wurden von der Firma Pharmingen erworben, CD19 wurde von der Firma Coulter/Immunotech (Krefeld, Deutschland) erhalten. Für jeden Antikörper wurde ein Isotyp-angepaßtes Immunglobulin in allen Experimenten als Kontrolle verwendet.
Die Proben wurden mit HANKS-Salzlösung ergänzt mit 2% Rinderserumalbumin (Fa. Serva) und 0,2% Azid (Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland) gewaschen. Nach Fixierung mit 2% Paraformaldehyd wurden die Proben sofort auf einem FACSCalibur-Cytometer analysiert. Ein Minimum von 50000 Ereignissen pro Probe wurde erfaßt, in Listenmodus-Dateien gespeichert und nachfolgend mit "Cellquest"-Software (Fa. Becton Dickinson) analysiert. Leukämiezellen, identifiziert durch CD34 CD33 Koexpression wurden auf Cytochrom c- Freisetzung und Caspasenaktivierung untersucht.
Die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt.

Beispiel 3

Analyse der Cytochrom c-Freisetzung

Die Zellanalyse wurde mittels Durchflußzytometrie an einem FACSCalibur Cytometer (Becton Dickinson) ausgestattet mit einem 488 nm Argon- und einem 650 nm Rotdiodenlaser durchgeführt. 1 × 10⁶ Zellen pro Test wurden mit HANKS- Salzlösung ergänzt mit 2% Rinderserumalbumin (Fa. Serva) und 0,2% Azid (Fa. Merck) gewaschen, gefolgt von einem 20 minütigen PFA-Lösung (4%) Fixierungsschritt. Die Zellen wurden mit 0,2% Saponin für 5 Minuten bei Raumtemperatur permeabilisiert. Unspezifische Bindung des anti-Cytochrom c- Antikörpers wurde mit 5 µg Maus-IgG1 (Fa. Sigma) geblockt. Anti-Cytochrom c-Antikörper (7H8.2C12, Fa. Pharmingen) und anti-Caspase-3-Antikörper (Fa. Becton Dickinson) wurden für weitere 20 Minuten bei 4°C zugefügt. Für die Cytochrom c- Anfärbung wurden die Zellen mit Ziege-anti-Maus IgG2b FITC (1 : 20, Fa. Southern Biotechnology Assoc., Birmingham, AL, USA) inkubiert. Für jeden Antikörper wurde ein Isotyp-angepaßtes Immunoglobulin als Kontrolle in allen Experimenten verwendet. Nach Fixierung mit 2% Paraformaldehyd wurden die Proben sofort auf einem FACSCalibur Cytometer analysiert. Ein Minimum von 50000 Ereignissen pro Probe wurde erfaßt, in Listenmodus- Dateien gespeichert und nachfolgend mit "Cellquest"-Software (Fa. Becton Dickinson) analysiert.
Die Ergebnisse sind in den Fig. 1, 2 und 3 gezeigt.

Claims

1. Verfahren zum durchflußzytometrischen Nachweis der Freisetzung von Stoffen aus Zellorganellen, aufweisend die folgenden Schritte:

- Fixieren von zu untersuchenden Zellen;

- Permeabilisieren der äußeren Membran unter Erhalt der Organellenstruktur;

- Färben der Zellen mit einer Fluorochrom-Verbindung, welche spezifisch an zumindest einen nachzuweisenden Stoff bindet;

- durchflußzytometrische Messung der einzelnen Zellen unter Anregung der Fluorochrom-Verbindung; und

- Feststellen der Fluroreszenzstärke der Zellen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es den weiteren Schritt aufweist:

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß nach dem Permeabilisieren die Zellen mit einer Waschlösung gewaschen werden, um den nachzuweisenden Stoff aus dem Cytoplasma der Zellen zu entfernen.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellorganellen Mitochondrien, Chloroplasten, Golgisysteme, endoplasmatisches Retikulum oder Zellkerne sind.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Fixieren durch Paraformaldehyd, Glutaraldehyd oder Methanol erfolgt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Permeabilisieren der äußeren Zellmembran mit einem Detergens erfolgt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Detergens ausgewählt ist aus Triton X-100, Digitonin oder Saponin.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Fluorochrom-Verbindung einen Farbstoff-Anteil und einen Proteinanteil aufweist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Proteinanteil ein Antikörper, Antikörperderivat oder Antikörperfragment ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der nachzuweisende Stoff ein Protein ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der nachzuweisende Stoff Cytochrom c ist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen vor der Fixierung mit einem Wirkstoff inkubiert werden.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein potentielles Zytostatikum ist, dessen apoptose-auslösende Eigenschaften bestimmt werden sollen.

14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein bekanntes Zytostatikum ist, dessen Resistenzpotential in Zellen bestimmt werden soll.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß gleichzeitig eine zweite Eigenschaft der zu untersuchenden Zellen mit Hilfe einer zweiten Fluorochrom- Verbindung festgestellt wird.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren mit einem Ein-Laser-Durchflußzytometer mit zwei Fluoreszenzkanälen durchgeführt wird, wobei das zweite Fluorochrom einen mit dem ersten Fluorochrom überlappenden Emissionswellenlängenbereich aufweist und die Photomultiplier- Röhrenspannung des zum Messen des zweiten Fluorochroms vorgesehenen Fluoreszenzkanals so eingestellt wird, daß kein vom ersten Fluorochrom in diesem Fluoreszenzkanal erzeugtes Fluoreszenz-Emissionssignal detektiert wird.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die Zellen primäre Tumor- oder Leukämiezellen sind.