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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion von
Proteinen aus Gastrointestinalproben und neue und/oder verbesserte
Verfahren zur Bestimmung dieser Proteine.
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Der
Beginn und das Fortschreiten vieler Krankheiten hat veränderte Muster
des Zellstoffwechsels, der Antigenizität und Veränderungen der quantitativen
und qualitativen Bildung zellulärer
Produkte oder deren Sekretion oder Freisetzung zur Folge.
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Ein
derartiger Krankheitstyp ist Krebs, und für die Zwecke der vorliegenden
Erfindung ist Krebs des Gastrointestinal-(GI-)traktes von speziellem
Interesse. Abseits vom GI-Trakt auftretende Krebsarten und andere
Krankheiten wie entzündliche
und ansteckende Krankheiten liegen ebenfalls im Bereich der Erfindung.
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Forscher
haben festgestellt, dass sich bestimmte, endogen erzeugte Substanzen
in erhöhten
oder erniedrigten Mengen oder in variierenden Formen in Proben nachweisen
lassen, die aus dem GI-Trakt von Patienten mit Erkrankungen des
GI-Gewebes oder des Gewebes in unmittelbarer Nähe entnommen wurden. Zum Beispiel
wird das Protein Calprotectin, früher als L1-Protein bezeichnet,
als Reaktion auf einige Erkrankungen in großen Mengen von Leukozyten in
den GI-Trakt abgegeben,
siehe beispielsweise
US 4,833,074 und
US 5,455,160 . Calprotectin,
ein Kalzium bindendes heterokomplexes Protein, das zwei schwere
Ketten und eine leichte Kette umfasst (Fagerhol et al., 1990), und
als weiteres Beispiel das Protein Hämoglobin wurden in erhöhten Mengen
in den Faeces von an GI-Krebs leidenden Patienten gefunden (Roseth
et al., 1993; Young & St.
John, 1992).
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Der
Nachweis abnormer Mengen oder Formen solcher Indikator-Proteine
kann für
die Vorhersage und die Diagnose von großem Wert sein und kann bei
der Überwachung
des Krankheitsverlaufes und auch der Wirksamkeit der Behandlung
und/oder therapeutischer Vorgehensweisen hilfreich sein. Obgleich
Veränderungen
im Proteinprofil in Proben feststellbar sein sollten, die von irgendeinem
Bereich des GI-Traktes entnommen wurden, könnte dies, falls die Probe
eine Fäkalprobe
ist, eine völlig
nicht-invasive Methode darstellen, mit der diagnostische und prognostische
Einschätzungen
vorgenommen werden könnten.
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Momentan
gibt es keine bedienerfreundliche Untersuchung, die hinreichend
verlässlich
und genau ist, um den Titer solcher Proteine gastrointestinalen
Ursprungs zu messen. Das liegt grundsätzlich an der Schwierigkeit,
die Proteine aus GI-Proben, in der Regel Faeces, in einer Form zu
extrahieren, die für
eine direkte Untersuchung mit Hilfe einer konventionellen Methode
wie beispielsweise ELISA geeignet ist.
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In
US 4,833,074 offenbaren
Fagerhol et al. ein Antikörper-basiertes
Erkennungssystem für
das Protein Calprotectin und ein Verfahren zur Isolation und Reinigung
von Calprotectin aus Granulozyten. Solche Antikörper-basierten Verfahren zum
quantitativen Nachweis funktionieren gut (wie später noch detaillierter erörtert werden
wird), wenn das Protein aus besser zugänglichen Quellen als dem GI-Trakt gewonnen wird.
Jedoch ist es offensichtlich in vieler Hinsicht wünschenswert,
dass die Proben, aus denen die betreffenden Proteine isoliert werden
sollen, fäkaler
Herkunft sind.
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Ein
weiteres, Immunoassay-basiertes Verfahren zum Bestimmen von Analyten
in Fäkalproben
wird in EP-A-0281251 offenbart, bei dem man eine Stuhlprobe in einer
wässrigen
Lösung,
die verschiedene Konservierungsmittel, Analyten stabilisierende
Mittel und endogene Interferenz reduzierende Mittel umfasst, dispergiert,
die Feststoffe absitzen lässt
und dann die flüssige
Phase zur Untersuchung der Analyten benutzt.
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In
US 5,455,160 offenbaren
Fagerhol et al. ein Kit und ein Verfahren zur Bestimmung von Calprotectin in
GI-Proben. Der Kit und das Verfahren werden als diagnostisches Instrument
für die
Erkennung von Krebs und entzündlichen
Darmerkrankungen vorgestellt. Diese Lehren sind ein richtungweisender
Schritt in der Bestimmung und klinischen Evaluation veränderter
Proteinspiegel in Proben, die aus dem GI-Trakt stammen. Dieses Verfahren
weist aber einige schwerwiegende Nachteile in Bezug auf die quantitative
Genauigkeit und Reproduzierbarkeit sowie die Einfachheit, mit der
das Verfahren von den Bedienern in einem Labor ausgeführt werden
kann, auf.
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Erstens
beschreibt das Verfahren des oben genannten US-Patentes 5,455,160
die Verwendung einer Probengröße von 5
g Faeces, was von älteren
oder gebrechlichen Patienten schwierig zu erhalten sein könnte. Dass
solche großen
Mengen Faeces erforderlich sind, bereitet Lagerhaltungsprobleme,
besonders wenn die Proben tiefgekühlt werden müssen.
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Wichtiger
noch, das Verfahren erfordert, die Faeces-Proben in einem verhältnismäßig kleinen
Puffervolumen (2-fache Menge) in einem offenen Reagenzglas mittels
eines Rührstabes,
der kein Einweggegenstand ist, zu homogenisieren. Es ist offensichtlich,
dass dies ein gewisses Gesundheitsrisiko für das Laborpersonal aufgrund
der Faeces-Aerosole, die sich im Verlauf des Verfahrens bilden,
birgt. Das kann zu einer Kontaminierung der Umgebung und des Bedieners,
möglicherweise
zu einer Cross-Kontamination von Proben, nicht zu vergessen Rückstands-
und Reinigungsproblemen und einer generell unangenehmen Arbeitsumgebung
führen.
Diese Probleme schließen
den routinemäßigen Einsatz
eines solchen Verfahrens als klinisches Instrumentarium aus.
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Die
Erfinder haben festgestellt, dass die Extraktionsschritte des Verfahrens
gemäß Stand
der Technik üblicherweise
zur Bestimmung von nur etwa 15 bis 30% der Gesamtmenge des in der
Fäkalprobe
enthaltenen Calprotectin führen
(Tabelle 1, Beispiel 4 nachstehend). Das wurde durch Vergleich der
Menge Calprotectin, die durch eine einzelne Extraktion entsprechend
dem Verfahren gemäß dem Stand
der Technik erhalten wurde, mit der Gesamtmenge des in der Probe
vorhandenen Calprotectins herausgefunden. Die Gesamtmenge Calprotectin
in einer Probe wurde durch fünfmaliges
Extrahieren derselben Probe bestimmt, so dass das Calprotectin im
Wesentlichen erschöpft
war, wobei ein erfindungsgemäßes Verfahren
angewandt wurde und die fünf
aus der Probe extrahierten Mengen aufsummiert wurden.
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Außerdem scheint
dem Verfahren gemäß Stand
der Technik eine beträchtliche
Schwankungsbreite innezuwohnen.
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Darüber hinaus
ist das Endprodukt des Extraktionsverfahren gemäß Stand der Technik eine Suspension,
die eine große
Menge an unlöslichem
partikularem Detritus umfasst. Solch ein viskoser, partikelbeladener Überstand
ist für
die Anwendung vieler Verfahren zur quantitativen Bestimmung ungeeignet,
beispielsweise für
solche, in denen mit spezifischen Antikörpern beladene Membranfilter
eingesetzt werden.
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Es
wird daher ein verlässliches,
praktikables Verfahren benötigt,
mit dem man die betreffenden Proteine aus aus dem GI-Trakt stammenden
Proben extrahieren kann, im speziellen, aber nicht ausschließlich aus Faeces,
vorzugsweise in einer Form, die ihre Analyse und/oder Quantifizierung
nach irgendeinem dem Fachmann bekannten Verfahren erleichtert.
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Überraschenderweise
hat man nun herausgefunden, dass man durch den Einsatz kleinerer
Mengen als gemäß Stand
der Technik, beispielsweise 50 bis 100 mg Faeces (im Vergleich zu
5 g gemäß Stand
der Technik), eine wesentlich genauere und reproduzierbarere quantitative
Bestimmung der Menge Calprotectin oder anderer endogener Proteine
durchführen
kann. Gleichzeitig kann man in demselben Fäkalextrakt, das für die Messung
von Calprotectin verwendet wird, die Konzentration anderer endogener
Proteine, wie beispielsweise Hämoglobin,
bestimmen. Die Erfinder haben ein neuartiges Extraktionsverfahren
entwickelt, das die Probleme des Verfahrens des Standes der Technik
verbessert und ein praktikables, verlässliches und bedienerfreundliches
Verfahren zur Bestimmung von Proteinen aus GI-Trakt-Proben bereitstellt.
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Ein
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur
Extraktion von Proteinen aus Gastrointestinal-(GI-)traktproben,
einschließlich
Faeces von Menschen oder anderen Säugetieren, umfassend:
- a) Vermischen einer kleinen Probenmenge (10
bis 500 mg, vorzugsweise 20 bis 150 mg, gegebenenfalls vorher gewogen)
mit einer überschüssigen Menge
eines gepufferten wässrigen
Extraktionsmediums (vorzugsweise im Bereich eines 50-fachen Überschusses
V/W), das Harnstoff in etwa einmolarer Konzentration umfasst,
- b) Homogenisieren der Probe (vorzugsweise durch Verwirbeln)
in einem geschlossenen Behälter,
- c) Trennen des festen und des flüssigen Materials der Dispersion
(vorzugsweise durch Zentrifugieren und zusätzlich oder optional durch
Filtrieren), und
- d) Gewinnen des klaren flüssigen
Extraktes, der die aus der Probe extrahierten Proteine enthält, im Folgenden
auch als das Filtrat oder „Überstand" bezeichnet;
wobei
dieser Extrakt und die Proteine darin eine qualitative und/oder
quantitative Bestimmung unter Verwendung eines geeigneten Mittels
zulassen.
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Eine
kleinere Probe ist einfacher zu nehmen, zu lagern und zu verdünnen. Die
Probennahme ist insbesondere bei älteren oder gebrechlichen Patienten
relevant oder wenn es sich bei der betreffenden Probe nicht um Faeces,
sondern um eine Probe handelt, die durch Gastroskopie, Endoskopie
oder irgendeine andere invasive Methode erhalten wird.
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Das
Verkleinern der Probenmasse von 5 g auf etwa 10 bis 500 mg oder
vorzugsweise 20 bis 150 mg, erlaubt eine wesentlich größere Verdünnung der
Probe mit dem Extraktionsmedium, wobei man immer noch mit für die Laborpraxis
ausgezeichnet handhabbaren Volumina arbeitet. Die vorliegende Erfindung
ermöglicht eine
Verdünnung
mit etwa 50 Volumina (V/W) im Vergleich zu dem Extraktionsverfahren
aus
US 5,455,160 , bei
dem man mit 2 Volumina (V/W) verdünnt.
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Ohne
sich auf eine Theorie beschränken
zu wollen, vermutet man, dass durch ein größeres Volumen des Extraktionsmediums
die Zugänglichkeit
der molekularen Bestandteile der Probe zum Medium erhöht und folglich
die Solubilisierung dieser Bestandteile, einschließlich der
betreffenden Proteine, erhöht
wird. Je weniger konzentriert das Homogenat ist, desto größer ist
die Einheitlichkeit der flüssigen
Phase und umso weniger variabel ist die Endzusammensetzung in Bezug
auf pH-Wert, Metallionen-Konzentration etc., die allesamt durch
die Faeces beeinflusst werden können.
Für solch
hoch verdünnte
Proben sind die Puffer-, Chelat- oder Dissoziations-Kapazitäten des
Extraktionsmediums nicht erschöpft,
und daher sind die Extraktionsausbeute ebenso wie die Stabilität des extrahierten
Materials, wie beispielsweise Proteine, einfacher zu steuern.
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Unter
der Voraussetzung einer ausreichenden Verdünnung ist das Verhältnis aus
Probe zu Extraktionsmedium für
die Extraktionsausbeute von Calprotectin unkritisch. Dies erlaubt
eine leichte Vereinfachung der Verfahrensweise, indem man eine eingewogene
Fäkalprobe
mit einem vorgegebenen Volumen, beispielsweise 5 ml, des Extraktionsmediums
vermischt. So können
Gefäße, die
mit gleichbleibenden Volumina des Extraktionsmediums gefüllt sind,
eingesetzt werden, so dass das Einwiegen von Proben der einzige
variable Schritt ist.
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Eine
weitere Vereinfachung des Verfahrens besteht im Weglassen des Einwiege-Schrittes.
Bei der Bearbeitung durch einen erfahrenen Labortechnikers ist es
möglich,
eine ziemlich gleich bleibende Menge an Fäkalprobe, beispielsweise im
Bereich von 30 bis 50 mg, zu entnehmen. Die Entnahme nahezu gleich
bleibender Mengen Faeces kann einfach mit Hilfe einer visuellen
Prüfung
umgesetzt werden, oder mit besserer Reproduzierbarkeit, unter Zuhilfenahme
eines Probenahme-Gerätes
für einen
solchen Zweck, beispielsweise des kommerziellen Gerätes von
Boehringer (Kat. Nr. 718211) oder anderer Geräte. Obwohl weniger genau als
die vollständige,
den Einwiege-Schritt umfassende Verfahrensweise, kann eine klinisch
ausreichende Genauigkeit erreicht werden. Das liegt im Wesentlichen
an den großen
Unterschieden der Calprotectin-Niveaus bei kranken und bei gesunden
Leuten, und daher sind präzise
Daten nicht immer erforderlich, um von klinischer Relevanz zu sein.
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Obwohl
herausgefunden wurde, dass extensive Extraktion einer sorgfältig gewogenen
Fäkalprobe
mit einem Citrat-Harnstoff-Extraktionsmedium die verlässlichsten
quantitativen Ergebnisse liefert, wurde ebenfalls gezeigt, dass
auch eine vereinfachte Ausführungsform
dieses Verfahrens überraschend
brauchbare Ergebnisse liefern kann.
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Durch
Extraktionen, die mit einem Citrat-freien Medium an jeweils einer
mit (ungefähr
50 mg) Fäkalprobe
gefüllten
Schlaufe durchgeführt
wurden, wurden hoch signifikante Unterschiede des Calprotectin-Niveaus
bei gesunden und erkrankten Personen festgestellt. Ohne auf allzu
viel Genauigkeit zu verzichten, sollten ziemlich verlässliche
und reproduzierbare Ergebnisse mit dieser vereinfachten Ausführungsform
des Tests zu erzielen sein, wobei der Einwiege-Schritt und gegebenenfalls
die Zentrifugier-Schritte entfallen. Letztlich ist es eine Sache
der Entscheidung, teilweise abhängig
vom klinischen Problem, ob ein sehr genauer Test, beispielsweise
im Anschluss an Krebs-Behandlungen, oder ein geringfügig ungenauerer,
aber immer noch klinisch sehr brauchbarer Test ausgewählt wird,
der sogar besser für
groß angelegte
Screeninguntersuchungen geeignet ist, da er weniger Aufwand verursacht
und daher noch bedienerfreundlicher ist.
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Die
Art des Puffers als solcher, das heißt seine pH-Wert stabilisierende
Fähigkeit,
seine Stärke
und Zusammensetzung, kann für
einige Proteine wichtig sein und kann zu der Extraktion und Stabilisierung
dieser Proteine aus der GI-Probe
beitragen.
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Eine
bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung umfasst ein gepuffertes Extraktionsmedium, das in der
Lage ist, Proteine zu stabilisieren und aus einer GI-Probe heraus zu eluieren.
Im Falle der Calprotectin-Extraktion, ergab ein 0,1-M Tris-Puffer
mit einem pH-Wert von 8 exzellente Ergebnisse. In Anwesenheit von
Citrat war die Ausbeute noch höher,
und der pH-Wert des Mediums stellte sich als weniger wichtig heraus;
tatsächlich
könnte
es möglich
sein, Proteine zu extrahieren, indem man ein erfindungsgemäßes Extraktionsmedium in
einem so großen
pH-Bereich wie von 5 bis 10 verwendet. Das zeigt, dass Citrat eine
besondere Rolle im Extraktionsmedium spielt, die nicht in Zusammenhang
mit seiner Puffer-Kapazität
steht, was nachstehend noch detaillierter besprochen wird.
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Darüber hinaus
darf man erwarten, dass die Fähigkeit
des Extraktionsmediums zu dispergieren, zu disaggregieren oder die
Moleküle
zu dekomplexieren einen sehr großen Einfluss auf die zu erwartende
Proteinausbeute hat. Erfindungsgemäß umfasst das Extraktionsmedium
Harnstoff in etwa einmolarer Konzentration, wobei es in der Lage
ist, Proteinmoleküle
aus den umliegenden Zellen, Fluiden und/oder fäkalen Abfallprodukten zu lösen.
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Weil
Dissoziationsmittel schädlich
für die
zu extrahierenden Proteine sein können, beispielsweise indem
sie die Dissoziation aktiver Molekülkomplexe in inaktive Monomere
bewirken, ist zu beachten, dass das Dissoziationsmittel und seine
Konzentration im Hinblick auf die betreffenden speziellen Proteine
gewählt
werden müssen.
Es wurde gezeigt, dass 8 M Harnstoff Monomerisation und Deaktivierung
von Calprotectin verursacht (Fagerhol et al., 1990). Deshalb ist
die Erkenntnis der Erfinder, dass die Aufnahme von 1 M Harnstoff in
das Extraktionsmedium vorteilhaft war, überraschend und unerwartet.
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Die
Wahl des Dissoziationsmittels und seiner Konzentration sollte nicht
nur von seinem unmittelbaren Einfluss auf die Extraktionsausbeute
abhängen,
sondern auch von weiteren Effekten, die es auf die Stabilität der Proteine
oder anderer interessierender Moleküle, besonders unter Lagerbedingungen,
haben kann. Die Erfinder haben gezeigt, dass Dissoziationsmittel
wie beispielsweise SDS die Ausbeute von Calprotectin im Extrakt
erhöhen.
Dennoch war das Protein bei der Lagerung unter Verwendung von SDS
im Extraktionsmedium anfällig
für Denaturierung.
Der Einsatz von 1 M Harnstoff erhöhte auf der anderen Seite die
Ausbeute nachhaltig, und die Zugabe von BSA, 0,5 bis 2%, wahlweise
in Kochsalzlösung,
zum Extraktionsmedium erhöhte sie
weiter. Daher enthält
das Extraktionsmedium in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung darüber hinaus
Rinderserum-Albumin (BSA).
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Ca2+ bindet bekanntermaßen spezifisch an Calprotectin-Monomere
und scheint die Stabilisierung des Calprotectin-Komplexes zu unterstützen. Auch
sind Kalzium-Ionen dafür
bekannt, Zellmembranen in vivo zu stabilisieren, indem sie darauf
bivalente Brücken
bilden. Es ist möglich,
dass Calprotectin von Bestandteilen der Faeces oder auf Intestinalzellen
eingeschlossen oder daran oder durch solche Kalzium-Brücken in
einer Art und Weise gebunden ist, die seine Extraktion behindert
und dadurch die Calprotectin-Ausbeute vermindert. Wenn das der Fall
ist, sollte man erwarten, dass das Einbringen von Kalzium-Chelatbildnern
in das Extraktionsmedium den Calprotectin-Komplex aus der unlöslichen
Zellmasse freisetzt und so die Protein-Ausbeute erhöht. Wie
oben gezeigt, legt die relative Unabhängigkeit des Effektes von Citrat,
einem bekannten Kalzium-Chelatbildner, vom pH-Wert einen Effekt
nahe, der eher der Kalziumbindung als seiner pH-Pufferkapazität zuzuschreiben ist.
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Um
diese Hypothese weiter zu untersuchen wurden eine Reihe von Kalzium-Chelatbildnern
wie EDTA, EGTA, Citrat und Phosphat in das Extraktionsmedium aufgenommen,
und der Effekt auf die Calprotectin-Ausbeute bewertet. EDTA erhöhte die
Calprotectin-Ausbeute, aber das Protein erwies sich bei der Lagerung
als instabil. Ein etwas schwächerer
Kalzium-Komplexbildner, speziell Citrat, erhöhte die Protein-Ausbeute ohne irgendeinen
signifikanten destabilisierenden Effekt. Es ist möglich, dass
das Citrat die Kalzium bindenden Komponenten in der Fäkalprobe
entfernt oder mit ihnen konkurriert ohne Kalzium aus dem Komplex
selber zu entfernen, und dass es so die Extraktion vereinfacht,
ohne den Calprotectin-Komplex zu destabilisieren. Ein empfindliches
Gleichgewicht zwischen Calprotectin, Ca2+,
Ca2+-Chelatbildnern und den Fäkal- oder
GI-Proben hat möglicherweise
einen signifikanten Einfluss auf die Extraktionsausbeute und die
Calprotectin-Stabilität.
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Folglich
umfasst das Extraktionsmedium in einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung einen oder mehrere Kalzium-Chelatoren in Konzentrationen
von beispielsweise 10 bis 250 mM (abhängig von ihren Affinitäten für Ca2+), wobei dieser Kalzium-Chelatbildner bevorzugt
Citrat ist, aber gegebenenfalls auch jeder andere dem Fachmann bekannte
Kalzium-Chelatbildner sein kann.
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Es
können
sich auch andere Vorteile aus der Aufnahme eines Chelatbildners
in das Extraktionsmedium ergeben. Es ist beispielsweise bekannt,
dass Zn2+ die Fähigkeit besitzt, Calprotectin
zu binden (Raftery et al., 1996) und dass auch zweiwertige Metallionen
(Ca2+, Zn2+, Mn2+ und Fe2+) sich
signifikant auf die biologische Funktion von Calprotectin auswirken
(Yui et al., 1997). Daher kann die Anwesenheit von Zn2+ die
Extraktion und/oder die Untersuchung von Calprotectin beeinflussen.
Als die Effekte von Zn2+ und verschiedenen
anderen Metallionen auf die Untersuchung von gereinigtem Calprotectin überprüft wurden,
störten
Zn2+, Al3+, Fe2+ und Fe3+ die Untersuchung,
Fe2+ und Fe3+ bei
besonders geringen Konzentrationen.
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Dieser
Interferenz konnte durch die Anwesenheit von Chelatbildnern, beispielsweise
Citrat und/oder Phosphat, entgegengewirkt werden. Wenn GI-Proben
mit diesen Ionen angereichert waren, war die Störung weniger signifikant, vermutlich
auf Grund der Anwesenheit großer
Mengen an Bakterien, die bekanntermaßen Chelat bildende Substanzen
produzieren (Finkelstein et al., 1983), in den Fäkalproben. Dennoch zeigten
die Beobachtungen, dass es vorteilhaft sein kann, wenn das Extraktionsmedium
Chelatbildnern mit der Fähigkeit auch
andere Ionen als Kalzium-Ionen zu chelatisieren umfasst. Deshalb
umfasst das Extraktionsmedium in einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung einen oder mehrere Chelat bildende Substanzen, die
in der Lage sind, ein oder mehrere andere Metallionen zu chelatisieren.
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Bei
der Freisetzung von Calprotectin aus Fäkalproben können die verstärkenden
Wirkungen von (Kalzium-)Chelatoren und Dissoziationsmitteln (beispielsweise
Harnstoff) antagonistisch, additiv oder synergistisch sein. Vorläufige Experimente
zeigen, dass Harnstoff und Citrat auf eine additive Art, ohne gegenseitige Abhängigkeit
wirken. Während
bei zwei verschiedenen Experimenten mit unterschiedlichen Fäkalproben Harnstoff
eine Ausbeute von etwa 150% und Citrat eine von etwa 225% ergab,
lag die kombinierte Wirkung bei etwa 270%. Der Verstärkungseffekt
schien bei Citrat also deutlich größer zu sein als bei Harnstoff,
aber die Kombination beider Mittel könnte vorteilhaft sein. Da relative
Effekte bei den Proben untereinander schwanken können, könnte die Kombination dieser
beiden Mittel, die vermutlich auf unterschiedliche Weise wirken,
eine bessere Gewähr
für die
effiziente Extraktion durch eine höhere Probenanzahl bieten.
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Abhängig von
der Herkunft der Fäkal-
oder GI-Probe oder dem Krankheitsstadium oder der intestinalen Bedingung
kann die Erhöhung
der Calprotectin-Ausbeute,
die durch die vorliegende Erfindung im Vergleich zu dem Verfahren
aus
US 5,455,160 erreicht
wird, erheblich variieren. Für
individuelle Fäkalproben
wurde in der Regel eine 3- bis 20-fache Erhöhung der Ausbeute nach dem
erfindungsgemäßen Verfahren
gegenüber dem
Verfahren gemäß Stand
der Technik festgestellt, aber in Ausnahmefällen (etwa 5%) wurde keine
Erhöhung
festgestellt (siehe Tabelle 2, Beispiel 4 nachstehend). Die natürliche Unterschiedlichkeit
von Fäkalproben,
einschließlich
Extremen wie beispielsweise flüssigen
Durchfall und sehr festem Material, beeinflusst die Zugänglichkeit
der Proteine oder der betreffenden Epitope. Daher kann eine direkte
Korrelation zwischen den Extraktionsverfahren nicht erwartet werden.
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Protein-Extraktion,
die ein hier beschriebenes Verfahren benutzt, ergibt einen klaren Überstand
oder ein klares Filtrat, der oder das für eine nachfolgende Protein-Analyse
geeignet ist, wobei jede geeignete, dem Fachmann bekannte Untersuchung
verwendet werden kann, vorzugsweise immunometrische Verfahren wie ELISA
oder RIA oder Untersuchungen, die auf dem Einsatz mit Antikörpern bestückter Membranfilter
basieren, auf die der Überstand
oder das Filtrat direkt ohne Verstopfung aufgebracht werden kann.
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Natürlich kann
der Extrakt direkt zur Messung jeglicher aus der Probe extrahierter
Proteine, für
die eine geeignete Untersuchung zur Verfügung steht, eingesetzt werden,
beispielsweise Hämoglobin.
Es wurde beispielsweise unter Verwendung von Assays für sowohl
Hämoglobin
als auch Calprotectin gezeigt (Gilbert et al., 1996), dass beide
Proteine unabhängig
voneinander Indikatoren von GI-Erkrankungen sind. Daher kann in
einem Extrakt-Überstand
für zahlreiche
Tests zur Erkennung von GI-Erkrankungen geeignetes Material enthalten
sein, was zu dem diagnostischen Wert dieses Verfahrens beiträgt.
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Es
ist beabsichtigt, ein groß angelegtes
Screening fäkaler
Proben von gesunden Personen, beispielsweise über 50 Jahre alt, in Zukunft
zu empfehlen. Gegenwärtige
Screeningtests auf Fäkalblut
liefern eine größere Anzahl
sowohl falscher positiver als auch falscher negativer Ergebnisse;
Screening auf Calprotectin mag sich daher als Ergänzung für solche
Tests hilfreich erweisen.
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Die
klare und nicht-viskose Beschaffenheit des zentrifugierten, nach
dem erfindungsgemäßen Verfahren
erhaltenen Extrakts hat den Vorteil, dass der Extrakt direkt auf
die Filter der folgenden Nachweis- oder Quantifizierungs-Untersuchungen appliziert
werden kann. Daher musste nur etwa ein Drittel einer Reihe von Fäkalproben,
die mittels eines Filters mit spezifischen Antikörpern auf Calprotectin hin
untersucht wurden, nach dem Zentrifugieren filtriert werden, um
teilchenförmiges
Material zu entfernen, bevor sie auf einen mit Antikörpern beladenen
Filter appliziert werden konnten. Das ist ein Unterschied zu dem
Verfahren gemäß Stand der
Technik, wonach praktisch keine der Proben zur direkten Anwendung
auf einem Testfilter nach dem Zentrifugieren geeignet war und sich
nur etwa ein Zehntel der Proben sogar nach der Filtration für eine derartige Anwendung
eignete, um derartiges teilchenförmiges
Material zu entfernen.
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Das
hier offenbarte Extraktionsverfahren hat sich als schnell und ökonomisch
erwiesen, es birgt ein geringes Kontaminationsrisiko und ist sicher
und bedienerfreundlich. Es ist nicht teuer in der Durchführung und weniger
zeitaufwändig
als das Verfahren des Standes der Technik. Der gewonnene Überstand
ist für
den Einsatz in Membranfilter-Technologien, in denen es unmittelbar
appliziert werden kann, geeignet, und somit kann ein einfacher und
handhabbarer umfassender Assay zur Verfügung gestellt werden.
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Alle
Probleme, die dem Verfahren des Standes der Technik eigen sind,
sind durch die vorliegende Erfindung vermindert worden. Durch den
Einsatz geringerer Volumina kann man in kleinerem Maßstab arbeiten, der
mit dem Einsatz eines geschlossenen Systems vereinbar ist. Der Rührstab zum
Homogenisieren, der kein Einweggegenstand ist und der in dem Verfahren
gemäß dem Stand
der Technik verwendet wurde, erforderte gründliches Reinigen nach jedem
Gebrauch und barg selbst dann noch das Risiko der Cross-Kontamination. In
der vorliegenden Erfindung wird der Stab, der kein Einweggegenstand
ist, durch die Einmal-Inokulationsschlaufe ersetzt, die zur Entnahme
der Probe, die während
des Extraktionsverfahrens im Reagenzglas bleibt, benutzt wird und
die die Funktion des Homogenisierstabes erfüllt. Eine derartige Anordnung
erlaubt das Versiegeln des Reagenzglases vor dem Verwirbeln und
ergibt ein geschlossenes System. Der Gebrauch eines geschlossenen
Systems während
des Homogenisierens einer Fäkalprobe
im Extraktionsmedium hat einen erheblichen Rückgang der Umgebungskontamination
mit Fäkalbakterien
im Vergleich zum Verfahren gemäß dem Stand
der Technik zur Folge.
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Weitere
Vorteile, die der Einsatz eines geschlossenen Systems mit sich bringt,
sind offensichtlich die Verminderung unangenehmer Gerüche, das
geringere Risiko einer Cross-Kontamination anderer Proben und die
relative Schnelligkeit und Einfachheit, mit der der Arbeitsbereich
nach der Protein-Extraktion
aus den Proben gereinigt werden kann.
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Zusätzlich lässt ein
Vergleich der Zeit, die zum Durchführen sowohl des vorliegenden
als auch das Verfahren des Standes der Technik benötigt wird,
erkennen, dass das Verfahren gemäß Stand
der Technik 60 Minuten erforderte, um proteinhaltige Überstände von
32 Proben zu extrahieren, während
das erfindungsgemäße Verfahren
nur 25 bis 30 Minuten erforderte. Darüber hinaus können behandelte
Proben als klare Überstande
tiefgekühlt
gelagert werden. So werden Probleme mit dem Homogenisieren etc.
nach dem Auftauen minimiert.
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Um
die Lagerung des Extraktionsmediums zu ermöglichen und um mikrobiellen
Verderb zu vermeiden, können
dem Mittel nach Bedarf Konservierungsstoffe, beispielsweise Natriumazid,
zugesetzt werden.
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In
einer anderen Ausführungsform
der Erfindung nutzt das Verfahren eine Variation des Assays auf Calprotectin,
die Fagerhol et al. in
US 5,455,160 bereitstellt,
worin ein Antikörper
basiertes Nachweisverfahren mit einem Membranfilter/-karten-System kombiniert
und dazu benutzt wird, Calprotectin in dem Extrakt aus der GI-Traktprobe
qualitativ und/oder quantitativ zu bestimmen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird eine NycoCardTM verwendet.
So wird eine Nitrozellulose-Membrane oder eine Nylon-Membrane, beispielsweise
Hybond N® (von
Amersham International vertrieben) oder Magna Nylon® (von
MSI vertrieben), als Filter verwendet. Geeignet ist eine Porengröße von 0,22
oder 0,45 μm.
Die Membrane trägt
Antikörper,
die in der Lage sind, das Zielmolekül, beispielsweise Calprotectin,
zu binden. Eine absorbierende Lage, wie beispielsweise Löschpapier,
wird auf einer Seite der Membrane angebracht, um den Durchgang der
flüssigen
Probe durch die Membrane zu unterstützen. Eine flüssigkeitsundurchlässige Schicht
oder Rahmen wird über
die andere Seite der Membrane gelegt. Die undurchlässige Schicht
oder der Rahmen weist runde Löcher
mit einem Durchmesser von beispielsweise 5 mm auf, um eine genaue
Applikation der flüssigen
Probe und der Untersuchungsflüssigkeiten
auf die Membrane zu ermöglichen.
Ein bekanntes Volumen der Probe, beispielsweise 10 bis 500 μl, wird auf
die Membrane appliziert und man lässt es in die absorbierende
Lage darunter eindringen. Man appliziert eine flüssige Lösung, beispielsweise 10 bis
500 μl,
eines Antikörper-Konjugats
an Gold-Sol-Kolloid als Marker und lässt es durch die Membrane dringen.
Die Membrane wird dann mit 2 × 200 μl Aliquots
einer geeigneten Waschflüssigkeit
gewaschen, beispielsweise Tris-HCl-Puffer (pH 7,0), bevor die Menge
an auf der Membrane immobilisiertem Gold-Sol abgeschätzt wird, üblicherweise
mit dem bloßen
Auge durch den Vergleich mit einer Farbskala oder durch ein Reflektometer.
Die erfindungsgemäße Extraktionsflüssigkeit
kann auch für
die weitere Vereinfachung der Untersuchungen von fäkalem Calprotectin
benutzt werden, indem man einen einfachen Messstab oder Membran-basierte
Einrichtungen verwendet. Klinische Studien zeigen, dass das erfindungsgemäße Verfahren
genauso klinisch relevant und verlässlich ist wie das Verfahren
von Røseth
et al. (1992) ist, und einen starken Beweis für eine enge Korrelation zwischen
dem Niveau von fäkalem
Calprotectin und dem Maß kolorektaler neoplastischer
Erkrankung liefert.
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Die
vorliegende Erfindung wird nun durch die folgenden, nicht einschränkenden
Beispiele erläutert.
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Beispiel 1a
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Ein
Beispiel für
das Extraktionsmedium (wässrige
Vorratslösung)
wurde wie folgt zubereitet:
| 0,25
M | Tris |
| 0,25
M | Zitronensäure |
| 2,5
M | Harnstoff |
| 0,025
M | CaCl2 |
| 1,25% | Rinderserum-Albumin
(BSA) |
| 0,05% | Natriumazid |
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Der
pH-Wert wird auf pH 8,0 unter Verwendung von NaOH und dem mit Filtern
von 0,22 μm
Porendurchmesser gefilterten Medium eingestellt. Das Medium kann
im Anschluss bei Raumtemperatur etwa 3 Monate lang oder bei 4°C etwa 12
Monate lang gelagert werden.
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Beispiel 1b
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Eine
vereinfachte Version des in Beispiel 1a bereiteten Extraktionsmediums
kann wie folgt zubereitet werden:
| Tris | unverändert |
| Zitronensäure | entfällt |
| Harnstoff | unverändert |
| CaCl2 | unverändert |
| BSA | 1%
anstelle von 0,5% (final) |
| Azid | ersetzt
durch Merthiolat; Salzlösung
zugefügt |
-
Beispiel 2a
-
Verfahren
zur Extraktion des Proteins Calprotectin aus einer Probe von Humanfaeces.
Es wurde nach der folgenden Verfahrensweise vorgegangen:
- 1. 50 bis 10 mg Fäkalprobe wurden mit einer Einmal-Inokulationsschlaufe
genommen und gewogen.
- 2. Die Schlaufe und die Probe wurden in ein 14 ml-Extraktions-Reagenzglas
transferiert.
- 3. Eine Vorratslösung
des Extraktionsmediums wurde wie in obigem Beispiel 1a hergestellt.
Die Grund-/Basislösung
wurde 2,5-fach mit Wasser verdünnt
und dem Reagenzglas zugefügt,
um einen Gesamtverdünnungsfaktor
von 1 : 50 zu erhalten.
- 4. Das Reagenzglas wurde versiegelt und die Fäkalprobe
wurde im Extraktionsmedium homogenisiert.
- 5. Das Homogenisieren wurde durch etwa 30 Sekunden langes Verwirbeln
und anschließendes
20-minütiges
Schütteln
bei 1400 bis 1800 Upm auf einem Schüttelapparat erreicht, wobei
die Einmal-Inokulationsschlaufe noch im Reagenzglas verblieb.
- 6. 1 ml des Rohextraktes wurde in einem EppendorfTM Mini-Zentrifugier-Röhrchen bei 10.000*g 20 Minuten zentrifugiert,
um einen klaren Überstand
zu erhalten. Der so gewonnene Überstand
ist für
die Verwendung in jeglicher Untersuchung zum Bestimmen spezifischer
Proteinkonzentrationen geeignet.
- 7. Der so gewonnene Überstand
kann bei –20°C gelagert
werden.
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Beispiel 2b
-
Eine
vereinfachte Version des in Beispiel 2a beschriebenen Verfahrens
kann ohne die Wiege- und Zentrifugierschritte und unter Verwendung
des in Beispiel 1b beschriebenen Extraktionsmediums wie folgt durchgeführt werden:
- 1. Ein Teil der Fäkalprobe wird mit einem Stab
homogenisiert, bevor Material für
die Tests entnommen wird.
- 2. Zwei gefüllte
Schlaufen (Einmal-Inokulationsschlaufen, jede gefüllte Schlaufe
entspricht etwa 100 mg) homogenisierten Fäkalmaterials wird in 10 ml
Extraktionsmedium (wie in Beispiel 1b beschrieben) in ein Reagenzglas
mit Schraubverschluss gegeben. Die Schlaufe wird mit Extraktionsmedium
gespült.
- 3. Das verschlossene Reagenzglas wird 20 bis 30 Sekunden verwirbelt.
- 4. Das Reagenzglas wird mindestens 20 Minuten auf einem Probenschüttler (bei
1–2 Upm)
belassen.
- 5. Die Masse lässt
man 5 bis 10 Minuten absitzen.
- 6. Von oben werden 50 μl
zum Untersuchen abgenommen. Alternativ kann eine Portion von 100 μl bei –18°C eingefroren
werden, bis sie untersucht wird.
-
Beispiel 3
-
Überwachung
des Risikos von Umgebungskontamination
-
Die
Ausbreitung von Bakterien während
der Zubereitung des Extraktes wurde bewertet, indem man nährstoffhaltige
Agarplatten, die für
die Kultur von Coliform und anderen gram-negativen Bakterien geeignet sind,
in der unmittelbaren Nachbarschaft des Arbeitsplatzes (etwa 10 oder
20 cm entfernt) während
sowohl des Verfahrens des Standes der Technik als auch des erfindungsgemäßen Extraktionsprozesses
platzierte. Die Platten wurden nach der Zubereitung des Extraktes
eingesammelt, bei 37°C über Nacht
inkubiert und die Anzahl der Kolonien am nächsten Tag ausgezählt. Die
Verfahren und die erhaltenen Bakterien-Auszählungen werden im Folgenden
und ebenso in
1 veranschaulicht.
| Verfahren
gemäß Stand
der Technik | auf
den Testplatten beobachtete Kolonien |
| Homogenisieren | 50–100 Kolonien |
| Spülen | über 200
Kolonien |
| erfindungsgemäßes Verfahren | |
| alle
Schritte | 5
Kolonien |
-
Der
Vergleich der Anzahl der durch die beiden verschiedenen Verfahren
entstandenen Kolonien zeigt, dass eine sehr geringe fäkale Kontamination
des Umgebungsbereiches nach der vorliegenden Erfindung verglichen
mit der nach dem Stand der Technik auftritt.
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Beispiel 4
-
Extraktionsausbeute
von Calprotectin nach dem neuen und nach dem Verfahren des Standes
der Technik
-
(a) Feststellen der Gesamtmenge
an Calprotectin
-
Um
eine Abschätzung
der Gesamtmenge des Calprotectin in Fäkalproben zu erhalten, wurden
vier solcher Proben, die niedrigen und hohen Calprotectin-Werte
entsprachen, fünfmal
unter Verwendung der Verfahrensweise aus Beispiel 2 extrahiert und
aus jedem Extrakt wurde die Calprotectin-Menge mittels ELISA bestimmt.
Bei allen Proben enthielt der fünfte
Extrakt nur geringe Mengen Calprotectin, so dass die Summe des in
den fünf
Extrakten nachgewiesenem Calprotectins als der in jeder Probe enthaltenen
Gesamtmenge entsprechend angesehen wurde.
-
(b) Ausbeute einer einzelnen
Extraktion nach dem neuen und dem Verfahren des Standes der Technik
-
Das
Verfahren aus Beispiel 2a wurde genutzt, um Calprotectin je einmal
aus vier Fäkalproben
zu extrahieren, wobei das neue und das dem Stand der Technik entsprechende
Verfahren eingesetzt wurden. Tabelle 1 zeigt die erzielte Ausbeute.
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Tabelle
1: Extraktionsausbeute mittels des 5 g-Verfahrens nach Stand der
Technik im Vergleich zu dem erfindungsgemäßen 50 mg-Verfahren aus vier
repräsentativen
Proben
-
Bei
den vier Proben schwankte die Ausbeute zwischen 52 und 80% nach
dem neuen Verfahren im Vergleich zu 5 bis 18% gemäß dem Verfahren
des Standes der Technik.
-
(c) Verhältnis der
nach dem neuen und nach dem Verfahren des Standes der Technik ermittelten
Calprotectin-Werte
-
Calprotectin
wurde einmal aus Fäkalproben
mittels des Verfahrens aus Beispiel 2a und des Verfahrens nach dem
Stand der Technik extrahiert. Die Calprotectin-Niveaus wurden durch ELISA bestimmt
und die Verhältnisse
der beiden Verfahren werden in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle
2: Verhältnis
der Calprotectin-Ausbeute mittels des Extraktionsverfahrens gemäß dem Stand
der Technik (5 g) und dem neuen Extraktionsverfahren (50 mg)
| Median
der Verhältnisse: | 3,9 |
| Wertebereich
der Verhältnisse: | 0,9–19,6 |
-
Die
für die
beiden Methoden ermittelten Verhältnisse
schwankten zwischen 0,9 und 19,6 mit einem Median von 3,9. Das Fehlen
einer Korrelation zwischen den beiden Verfahren liegt höchstwahrscheinlich
an der kleinen und sehr veränderlichen
Extraktionsausbeute des Verfahrens gemäß dem Stand der Technik (siehe
Tabelle 1). Trotzdem waren mit Ausnahme zweier Proben (Nr. 12 und
Nr. 18) die Ausbeuten nach dem neuen Verfahren um 40 bis 2000% höher.
-
Beispiel 4
-
Bestimmung von Calprotectin
durch ELISA und von Calprotectin und Hämoglobin mit Hilfe einer Filtermethode (NycoCardTM)
-
Aus
16 Proben von kolorektalen Krebs-Patienten wurden Calprotectin und
Hämoglobin
nach der Vorgehensweise aus Beispiel 2 extrahiert. Die klaren Überstände wurden
für die
Bestimmung von Calprotectin nach einem gängigen ELISA-Verfahren und
für die
Bestimmung von Calprotectin und Hämoglobin mit Hilfe einer Filterkarte
(NycoCardTM), wobei ein Gold-markiertes
monoklonales Antikörper-Konjugat
benutzt wurde, verwendet. Die gemessenen Werte werden in Tabelle
3 wiedergegeben.
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Tabelle
3: Messungen* von Calprotectin und Hämoglobin in 16 Fäkalproben
von Patienten mit kolorektalem Krebs
-
Es
scheint keine Korrelation zwischen der Menge des in den untersuchten
Fäkalproben
gemessenem Calprotectin und Hämoglobin
zu geben. Das kann mit ihrem offensichtlich unabhängigen Charakter
als Signale für
Krebs (Gilbert et al., 1996) erklärt werden.
-
Bibliographie
-
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