DE10154221A1 - Mittel zur Behandlung von Läsionen des Nervensystems - Google Patents
Mittel zur Behandlung von Läsionen des NervensystemsInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft Mittel und Verfahren, welche den Steroid-Gehalt von Nervenzellen beeinflussen, zur Erhöhung der Überlebensrate von Nervenzellen und zur Regeneration von synaptischen Verbindungen nach Läsionen des Nervensystems und die Verwendung von am Steroid-Stoffwechsel beteiligten Komponenten im Nervensystem zur Diagnose von Läsionen.
Description
- Die Erfindung betrifft Mittel zur Behandlung von Läsionen des Nervensystems unter Verwendung von Verfahren, welche den Steroid-Gehalt von Nervenzellen beeinflussen. Ziel der Erfindung ist die Erhöhung der Überlebensrate von Nervenzellen und die Regeneration von synaptischen Verbindungen nach Läsionen des Nervensystems und die Verwendung von am Steroid-Stoffwechsel beteiligten Komponenten im Nervensystem zur Diagnose von Läsionen. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Medizin und die pharmazeutische Industrie.
- Läsionen des peripheren oder zentralen Nervensystems gehören zu den schwerwiegendsten Gesundheitsschädigungen, denn sie führen zu pflege- und kostenintensiven körperlichen und geistigen Behinderungen; in vielen Altersgruppen der Bevölkerung stellen sie die häufigste Todesursache dar. Läsionen können durch eine Vielzahl von Ursachen ausgelöst werden, darunter Tumore, Hirn- oder Rückenmarksverletzungen (z. B. Querschnittslähmung), Ausfall der Blut- und Sauerstoffversorgung des Gehirns infolge von Herzstillstand, Arteriosklerosen oder Thrombosen (Schlaganfall), sowie Störungen des Stoffwechsels (Alzheimer, Parkinson) oder des Immunsystems (multiple Sklerose). Diese Auslöser führen zu einer Zerstörung synaptischer Verbindungen, zum Absterben von Nervenzellen und schliesslich zum Ausfall bestimmter Hirn- oder Rückenmarksfunktionen. Diese Ausfälle sind weitgehend irreparabel, da synaptische Verbindungen und Nervenzellen nur in sehr beschränktem Ausmaß wiederhergestellt und ersetzt werden können (Bansil S., Cook S. D., Rohowsky-Kochan C. (1995) Multiple sclerosis: immune mechanism and update on current therapies. Annals of Neurology 37 Suppl. 1, 87-101; Schwab M. E., Bartholdi D. (1996) Degeneration and regeneration of axons in the lesioned spinal cord. Physiological Reviews 76, 319-370; Shoulson I. (1998) Experimental therapeutics of neurodegenerative disorders: unmet needs. Science 282, 1072-1074).
- Eine wirksame Behandlung von Läsionen muß darauf abzielen, zunächst den Verlust an Neuronen zu verhindern und dann korrekte synaptische Verbindungen wiederherzustellen. Bislang sind solche Methoden jedoch nicht verfügbar. Die Erfindung hatte deshalb die Aufgabe, solche Methoden zu entwickeln.
- Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert. Die wesentliche Basis der Erfindung bildet die Entdeckung, daß Nervenzellen selbst nur unzureichende Mengen an Cholesterin synthetisieren, und dass ihr Überleben und Wachstum ganz entscheidend von der externen Versorgung mit diesem Molekül abhängig ist. Das Gehirn kann das im Blut enthaltene Cholesterin nicht aufnehmen, da die Lipoproteine, welche das Cholesterin transportieren, die Blut-Hirn Schranke nicht passieren können. Daher muss das im Gehirn enthaltene Cholesterin auch dort selbst synthetisiert und verteilt werden. Grosse Mengen an Cholesterin werden von speziellen Zelltypen der sogenannten Neuroglia, nämlich Astrozyten und Oligodendrozyten, synthetisiert und dann in Form von Lipoprotein Komplexen abgegeben. Die Nervenzellen nehmen diese Komplexe über Rezeptoren auf und inkorporieren das darin enthaltene Cholesterin in ihren Stoffwechsel [Danik et al. (1999) Crit. Rev. Neurobiol 13: 357-407].
- Das Absterben von Nervenzellen und von deren Fortsätzen und der damit einhergehende Verlust von synaptischen Verbindungen in Folge von Hirnläsionen kann dadurch zustande kommen, dass die Versorgung der Nervenzellen mit Cholesterin oder Steroiden allgemein zusammenbricht oder dass den Nervenzellen sogar Cholesterin entzogen wird, beispielsweise durch Überproduktion von Cholesterin-bindenden Proteinen wie Apolipoprotein.
- Gegenstand der Erfindung sind daher Mittel und therapeutische Verfahren, welche den Cholesterin-Gehalt von Nervenzellen beeinflussen, und welche damit zur Regeneration von Nervenzellen und deren Verbindungen verwendet werden können.
- Moleküle, welche den Cholesterin-Gehalt von Nervenzellen kontrollieren, darunter Cholesterin-synthetisierende Enzyme, Apolipoproteine und Lipoprotein-Rezeptoren, stellen selbst diagnostische und/oder therapeutische Substanzen dar oder dienen erfindungsgemäß auch als Targets zur Suche nach neuen diagnostisch oder therapeutisch wirksamen Substanzen.
- Außerdem betrifft die Erfindung die Verwendung der am Cholesterin-Stoffwechsel beteiligten Proteine und deren Nukleinsäuren als Ausgangsbasis zur Entwicklung spezifischer und wirkungsvoller Diagnostika und Therapeutika. Diese Proteine und Nukleinsäuren werden zum Aufbau von Genen und Vektoren eingesetzt, die die Basis für die Entwicklung solcher pharmazeutisch relevanten Substanzen darstellen. Somit betrifft die Erfindung auch Vektoren und Plasmide, die eine DNA enthalten, welche den Cholesterin-Stoffwechsel beeinflussende Proteine kodieren, und pro- oder eukaryotische Wirtszellen, die diese Vektoren enthalten.
- Darüber hinaus betrifft die Erfindung weiterhin monoklonale und polyklonale Antikörper, die gegen die am Cholesterin-Stoffwechsel beteiligten Komponenten gerichtet sind, und die sich zum Nachweis und/oder zur Behandlung von Läsionen des Zentralnervensystems eignen.
- Die Diagnostika gemäß der Erfindung eignen sich zur Bestimmung von Krankheitsdispositionen, wie z. B. von Tumoren, Hirn- oder Rückenmarkserkrankungen, Arteriosklerose, Alzheimer Krankheit, Parkinsonismus und multipler Sklerose.
- Therapeutika im Sinne der Erfindung enthalten vorzugsweise Komponenten, welche die Versorgung der Nervenzellen mit Cholesterin beeinflussen, vorzugsweise erhöhen.
- Die Erfindung soll nachfolgend erläutert werden.
- 1. Nervenzellen aus dem Hippokampus der Maus und der Retina von Ratten wurden durch sogenannte Immunopanning-Verfahren von anderen Zellen abgetrennt [Barres et al. (1988) Neuron 1: 791-803], auf Kulturschalen ausplattiert und dann in einem Kulturmedium definierter Zusammensetzung [Nägler et al. (2001) J. Physiol. 533: 665-679], aber ohne Zugabe von Cholesterin, kultiviert. Nach circa zwei Wochen wurde ihre Überlebensrate mit Hilfe von MTT-Tests und die Präsenz von funktionellen Synapsen durch elektrophysiologische Ganz-Zell Ableitungen bestimmt. Dabei stellte es sich heraus, dass hippokampale Nervenzellen in diesem Medium zur zu 16% überleben, während retinale Ganglienzellen zwar überleben, aber nur sehr wenige von Synapsen erzeugte elektrische Signale zeigen.
- 2. Die Behandlung der Kulturen mit Glia-konditioniertem Medium (GKM), welches von Gliazellen sezernierte lösliche Faktoren enthält, erhöhte die Überlebensrate der hippokampalen Zellen um das fünf-fache auf 80% und steigerte die Frequenz spontaner postsynaptischer Ströme in retinalen Ganglionzellen um das 70-fache.
- 3. Die bei der Erarbeitung der Erfindung durchgeführten Tests zeigten, daß die Zugabe von Cholesterin (1 : 1000 einer ethanolischen Stammlösung, Endkonz. 10 µg/ml) allein das Überleben der Nervenzellen aus dem Hippocampus unterstützt und die spontane synaptische Aktivität in retinalen Ganglienzellen steigert.
- 4. Die Verminderung der Cholesterin-Konzentration im GKM durch Mevastatin (1 : 1000 einer ethanolischen Stammlösung, Endkonz. 10 µM) den Effekt von GKM auf die retinalen Ganglienzellen abschwächt.
- Diese Ergebnisse zeigen, daß das Überleben und das Wachstum von Nervenzellen auf die Zugabe von exogenem Cholesterin angewiesen sind, und daß somit durch Beeinflussung des Cholesterin- oder Steroid-Stoffwechsels das Absterben von Neuronen und die Zerstörung von synaptischen Verbindungen unter pathologischen Bedingungen behandelt werden können.
- Die Erfindung wird weiterhin durch eine Abbildung erläutert.
- Abbildung: a, Überlebensraten von gereinigten hippokampalen Neuronen under verschiedenen Kulturbedingungen. Schwarze Balken, NB-: serum-freies Medium (Neurobasal mit B27, beide von Gibco/Invitrogen). Graue Balken: NB+ wie NB-, zusätzlich angereichert mit Wachstumsfaktoren und Medienzusätzen. Weisse Balken: wie NB+, zusätzlich angereichert mit löslichen Faktoren aus Gliazellen enhalten in Glia-Konditioniertem Medium (GKM). Die Überlebensraten wurden mit dem sogenannten MTT-Test bestimmt zu den angegebenen Zeiten nach Ausplattieren der Zellen. Die anfängliche Überlebensrate war hoch (n = 3 Präparationen), aber nur sehr wenige Zellen überleben nach fünf Tagen (n = 3). Nach 12 Tagen konnten keine lebenden Neurone gefunden werden (n = 3). Zusätzliche Faktoren im NB+ erhöhten die Überlebensrate (n = 3), aber langfristige Kultivierung war nur in Gegenwart von GKM möglich (n = 3).
- b, oben: Überlebensrate nach 12 Tagen in NB+ angereichert mit verschiedenen Cholesterin Konzentrationen. Unten: Cholesterin verstärkt die Überlebensrate sogar in Abwesenheit von Wachstumsfaktoren (NB+/-GF + chol).
- c, Phasen-Kontrast Aufnahmen von Neuronen, welche in NB+ (links), NB+ mit GKM (Mitte) oder in NB+ mit Cholesterin (5 µg ml-1) (rechts) kultiviert wurden. Nach 5 Tagen in NB- zeigen Neuriten klare Anzeichen von Degeneration. In Gegenwart von GKM oder Cholesterin sehen die Neuriten sogar nach 10 Tage in Kultur noch gesund aus.
- d, Spontane synaptische Aktivität in einem Neuron, welches für 10 Tage in Gegenwart von Cholesterin kultiviert wurde. Die Ableitungen wurden mit der sogenannten patch-clamp Technik bei einem Haltepotential von -70 mV durchgeführt. Der Einschub zeigt spontane, aus- und einwärts gerichtete synaptische Ströme, die bei einem Haltepotential von -40 mV abgeleitet wurden. Diese Ströme zeigen die Präsenz von inhibitorischen und erregenden Synapsen an.
Claims (22)
1. Mittel zur Behandlung von Läsionen des Nervensystems, umfassend Substanzen, die
den Steroid-Gehalt im zentralen oder peripheren Nervensystem von Menschen beeinflussen,
bevorzugt erhöhen.
2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zugeführten Substanzen die
Synthese, die Aufnahme, die Speicherung, den Abbau oder die Freisetzung von Steroiden in
Nervenzellen beeinflussen. [eine Erhöhung der Synthese führt zu einem anderen Ergebnis als
die Erhöhung des Abbaus!, daher nur "beeinflussen]
3. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zugeführten Substanzen die
Synthese, die Aufnahme, die Speicherung, den Abbau oder die Freisetzung von Steroiden in
Zellen beeinflussen, welche nicht Nervenzellen sind.
4. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zugeführten Moleküle die
Synthese, die Zusammensetzung, die Freisetzung, die extrazelluläre Konzentration, den
interzellulären Transport, die zelluläre Aufnahme oder die intrazelluläre Weiterverarbeitung
von Lipoproteinen im Nervensystem beeinflussen.
5. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den
zugeführten Substanzen um Steroid-analoge Moleküle mit ähnlichen physiko-chemischen
Eigenschaften handelt.
6. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den
zugeführten Molekülen um Steroid-Derivate handelt.
7. Mittel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den zugeführten
Molekülen um Cholesterin oder seine Ester handelt.
8. Mittel nach Anspruch 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den zugeführten
Substanzen um chemische Verbindungen handelt, welche den Steroidstoffwechsel
beeinflussen, wie beispielsweise Enzyminhibitoren oder Steroid-Chelatoren.
9. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den
zugeführten Substanzen um monoklonale oder polyklonale Antikörper handelt, welche gegen
mindestens eine der am Steroid-Stoffwechsel beteiligten Komponenten, wie Lipoproteine
oder Lipoprotein-Rezeptoren, gerichtet sind.
10. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den
zugeführten Substanzen um Proteine handelt, wie Fragmente von Lipoproteinrezeptoren oder
von Apolipoproteinen.
11. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den
zugeführten Substanzen um Komplexe aus Lipiden und Proteinen handelt.
12. Nukleinsäure-Sequenzen, die Proteine nach einem der Ansprüche 10 oder 11 kodieren
sowie Fragmente, Varianten und Mutationen.
13. Nukleinsäure-Sequenzen nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß T durch U
ausgetauscht ist.
14. Nukleinsäure-Sequenzen nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß sie
vollständig komplementär sind.
15. Vektoren, die eine für die Proteine gemäß einem der Ansprüche 10 oder 11 kodierende
DNA enthalten.
16. Plasmide, die eine für die Proteine gemäß einem der Ansprüche 10 oder 11 kodierende
DNA enthalten.
17. Wirtszellen, die die Plasmide oder Vektoren gemäß Anspruch 15 oder 16 enthalten.
18. Therapeutisches Verfahren zur Behandlung von Läsionen des Nervensystems, dadurch
gekennzeichnet, dass die Zuführung der Moleküle durch Implantation von Zellen, welche
diese Moleküle produzieren, erfolgt.
19. Verwendung von Substanzen, welche am Steroidstoffwechsel im Nervensystem beteiligt
sind, zur Diagnose von Läsionen des Zentralnervensystems, beispielsweise in Folge von
Unfällen, Tumorbildung, Arteriosklerose, Alzheimer Krankheit, Parkinsonismus und
multipler Sklerose.
20. Verwendung von Substanzen nach den Ansprüchen 1 bis 19 zur Entwicklung von
entsprechenden Diagnostika oder Therapeutika.
21. Verwendung von Substanzen nach den Ansprüchen 1 bis 19 zur Bestimmung einer
Disposition zur Erkrankung des Zentralnervensystems.
22. Verwendung von Substanzen nach Anspruch 1 bis 19 zum Aufbau von Genen und/oder
Vektoren, vorzugsweise zur Entwicklung von pharmazeutisch relevanten Molekülen.
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