DE10132212A1

DE10132212A1 - Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierung durch vergleichende Analyse der Einzelstränge von Amplifikaten

Info

Publication number: DE10132212A1
Application number: DE10132212A
Authority: DE
Inventors: Juergen Distler; Erik Leu
Original assignee: Epigenomics AG
Current assignee: Epigenomics AG
Priority date: 2001-06-27
Filing date: 2001-06-27
Publication date: 2003-03-06
Anticipated expiration: 2021-06-28
Also published as: DE10132212B4; US20040265814A1; WO2003002760A2; EP1404879A2; WO2003002760A3

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierung in DNA-Proben. Eine genomische DNA-Probe wird chemisch, bevorzugt mit einem Bisulfit (= Disulfit, Hydrogensulfit), derart behandelt, dass Cytosin in Uracil umgewandelt wird, während 5-Methylcytosin unverändert bleibt. Abschnitte der Proben-DNA werden mit mindestens 2 Primern in einer Polymerasereaktion, bevorzugt einer Polymerasekettenreaktion, amplifiziert. Zuletzt werden die Fragmente hinsichtlich der Basenzusammensetzung jeweils der beiden komplementären Stränge des Amplifikates untersucht, wobei aus dem Unterschied im Molekulargewicht der beiden Stränge auf den Methylisierungsstatus in dem amplifizierten Abschnitt der genomischen DNA-Probe geschlossen wird.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierung in DNA-Proben.
Die nach den methodischen Entwicklungen der letzten Jahre in der Molekularbiologie gut studierten Beobachtungsebenen sind die Gene selbst, die Übersetzung dieser Gene in RNA und die daraus entstehenden Proteine. Wann im Laufe der Entwicklung eines Individuums welches Gen angeschaltet wird und wie Aktivieren und Inhibieren bestimmter Gene in bestimmten Zellen und Geweben gesteuert wird, ist mit Ausmaß und Charakter der Methylierung der Gene bzw. des Genoms korrelierbar. Insofern äußern sich pathogene Zustände in einem veränderten Methylierungsmuster einzelner Gene oder des Genoms.

5-Methylcytosin ist die häufigste kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryotischer Zellen. Sie spielt beispielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkription, beim genetischen Imprinting und in der Tumorgenese. Die Identifizierung von 5-Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist daher von erheblichem Interesse. 5-Methylcytosin-Positionen können jedoch nicht durch Sequenzierung identifiziert werden, da 5-Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweist wie Cytosin. Darüber hinaus geht bei einer PCR-Amplifikation die epigenetische Information, welche die 5-Methylcytosine tragen, vollständig verloren.

Eine relativ neue und die mittlerweile am häufigsten angewandte Methode zur Untersuchung von DNA auf 5-Methylcytosin beruht auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, das nach anschließender alkalischer Hydrolyse in Uracil umgewandelt wird, welches in seinem Basenpaarungsverhalten dem Thymidin entspricht. 5-Methylcytosin wird dagegen unter diesen Bedingungen nicht modifiziert. Damit wird die ursprüngliche DNA so umgewandelt, dass Methylcytosin, welches ursprünglich durch sein Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unterschieden werden kann, jetzt durch "normale" molekularbiologische Techniken als einzig verbliebenes Cytosin beispielsweise durch Amplifikation und Hybridisierung oder Sequenzierung nachgewiesen werden kann. Alle diese Techniken beruhen auf Basenpaarung, welche jetzt voll ausgenutzt wird. Der Stand der Technik, was die Empfindlichkeit betrifft, wird durch ein Verfahren definiert, welches die zu untersuchende DNA in einer Agarose-Matrix einschließt, dadurch die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulfit reagiert nur an einzelsträngiger DNA) verhindert und alle Fällung- und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 DEC 15; 24(24): 5064-6). Mit dieser Methode können einzelne Zellen untersucht werden, was das Potential der Methode veranschaulicht. Allerdings werden bisher nur einzelne Regionen bis etwa 3000 Basenpaare Länge untersucht, eine globale Untersuchung von Zellen auf Tausenden von möglichen Methylierungsanalysen ist nicht möglich. Allerdings kann auch dieses Verfahren keine sehr kleinen Fragmente aus geringen Probenmengen zuverlässig analysieren. Diese gehen trotz Diffusionsschutz durch die Matrix verloren.

Eine Übersicht über die weiteren bekannten Möglichkeiten, 5-Methylcytosine nachzuweisen, kann aus dem folgenden Übersichtsartikel entnommen werden: Rein T, DePamphilis ML, Zorbas H. Identifying 5-methylcytosine and related modifications in DNA genomes. Nucleic Acids Res. 1998 May 15; 26(10): 2255-64.

Die Bisulfit-Technik wird bisher bis auf wenige Ausnahmen (z. B. Zeschnigk M, Lich C, Buiting K, Dörfler W, Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome based an allelic methylation differences at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. 1997 Mar-Apr; 5(2): 94-8) nur in der Forschung angewendet. Immer aber werden kurze, spezifische Stücke eines bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung amplifiziert und entweder komplett sequenziert (Olek A, Walter J. The pre-implantation ontogeny of the H19 methylation imprint. Nat Genet. 1997 Nov.; 17(3): 275-6) oder einzelne Cytosin-Positionen durch eine "Primer-Extension-Reaktion" (Gonzalgo ML, Jones PA. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE). Nucleic Acids Res. 1997 Jun. 15; 25(12): 2529-31, WO-Patent 9500669) oder einen Enzymschnitt (Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 1997 Jun. 15; 25(12): 2532-4) nachgewiesen. Zudem ist auch der Nachweis durch Hybridisierung beschrieben worden (Olek et al., WO 99 28498).

Harnstoff verbessert die Effizienz der Bisulfit- Behandlung vor der Sequenzierung von 5-Methylcytosin in genomischer DNA (Paulin R, Grigg GW, Davey MW, Piper AA. Urea improves efficiency of bisulphate-mediated sequencing of 5'-methylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 1998 Nov. 1; 26(21): 5009-10).

Weitere Publikationen, die sich mit der Anwendung der Bisulfit-Technik zum Methylierungsnachweis bei einzelnen Genen befassen, sind:
Grigg G, Clark S. sequencing 5-methylcytosine residues in genomic DNA. Bioassays. 1994 Jun.; 16(6): 431-6, 431; Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Dörfler W. Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader- Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method. Hum Mol Genet. 1997 Mar; 6(3): 387-95; Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol fort bisulphate genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 1994 Feb. 25; 22(4): 695-6; Martin V, Ribieras S, Song-Wang X, Rio MC, Dante R. Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5' region of the pS2 gene andin its expression in human breast cancer cell lines. Gene. 1995 May 19; 157(1-2): 261-4; WO 97 46705, WO 95 15373 und WO 45560.

Ein weiteres bekanntes Verfahren ist die sogenannte methylierungssensitive PCR (Herman JG, Graff JR, Myohanen S, Nelkin BD, Baylin SB. (1996), Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci USA. Sep 3; 93(18): 9821-6). Für dieses Verfahren werden Primer verwendet, die entweder nur an eine Sequenz hybridisieren, die durch die Bisulfit-Behandlung einer an der betreffenden Position unmethylierten DNA entsteht, oder aber umgekehrt Primer, welche nur an eine Nukleinsäure bindet, die durch die Bisulfit-Behandlung einer an der betreffenden Position unmethylierten DNA entsteht. Mit diesen Primer können demnach Amplifikate erzeugt werden, deren Detektion wiederum Hinweise auf das Vorliegen einer methylierten oder unmethylierten Position in der Probe liefern, an welche die Primer binden.

Ein neueres Verfahren ist auch der Nachweis von Cytosin- Methylierung mittels einer Taqman PCR, das als Methyl- Light bekannt geworden ist (WO 00/70090). Mit diesem Verfahren ist es möglich, den Methylierungsstatus einzelner oder weniger Positionen direkt im Verlauf der PCR nachzuweisen, so dass sich eine nachfolgende Analyse der Produkte erübrigt.

Stand der Technik ist wiederum ein von Epigenomics entwickeltes Verfahren, welches zu untersuchende DNA und Hintergrund-DNA nach Bisulfit-Behandlung gleichermaßen amplifiziert und dann die im Fragment enthaltenen ehemaligen CpG Positionen durch Hybridisierungstechniken untersucht, alternativ mittels mini Sequenzierung oder anderen gängigen Verfahren. Dies hat den Vorteil, dass man ein quantitatives Bild bezüglich der untersuchten Methylierungspositionen erhält, d. h. es erfolgt die Bestimmung des Methylierungsgrades einer Vielzahl von Positionen, was z. B. bei soliden Tumoren eine sehr genau Klassifizierung ermöglicht.

Für die Markierung von Amplifikaten sind vielfach fluoresziert markierte Primeroligonukleotid e verwendet worden. Besonders geeignet für Fluoreszenzmarkierungen ist das einfache Anbringen von Cy3 und Cy5 Farbstoffen am 5'- Ende des jeweiligen Primers. Die Farbstoffe Cy3 und Cy5 sind, neben vielen anderen, kommerziell erhältlich.

Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations- Massenspektrometrie (MALDI-TOF) ist eine sehr leistungsfähige Entwicklung für die Analyse von Biomolekülen (Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 1988 Oct. 15; 60(20): 2299-301). Ein Analyt wird in eine lichtabsorbierende Matrix eingebettet. Durch einen kurzen Laserpuls wird die Matrix verdampft und das Analytmolekül so unfragmentiert in die Gasphase befördert. Durch Stöße mit Matrixmolekülen wird die Ionisation des Analyten erreicht. Eine angelegte Spannung beschleunigt die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen Massen werden Ionen unterschiedlich stark beschleunigt. Kleinere Ionen erreichen den Detektor früher als größere.

MALDI-TOF Spektroskopie eignet sich ausgezeichnet zur Analyse von Peptiden und Proteinen. Die Analyse von Nukleinsäuren ist etwas schwieriger (Gut, I. G. und Beck, S. (1995), DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Molecular Biology: Current Innovations and Future Trends 1: 147-157.) Für Nukleinsäuren ist die Empfindlichkeit etwa 100 mal schlechter als für Peptide und nimmt mit zunehmender Fragmentgröße überproportional ab. Für Nukleinsäuren, die ein vielfach negativ geladenes Rückgrat haben, ist der Ionisationsprozeß durch die Matrix wesentlich ineffizienter. In der MALDI-TOF Spektroskopie spielt die Wahl der Matrix eine eminent wichtige Rolle. Für die Desorption von Peptiden sind einige sehr leistungsfähige Matrices gefunden worden, die eine sehr feine Kristallisation ergeben. Für DNA gibt es zwar mittlerweile einige ansprechende Matrices, jedoch wurde dadurch der Empfindlichkeitsunterschied nicht verringert. Der Empfindlichkeitsunterschied kann verringert werden, indem die DNA chemisch so modifiziert wird, dass sie einem Peptid ähnlicher wird. Phosphorothioatnukleinsäuren, bei denen die gewöhnlichen Phosphate des Rückgrats durch Thiophosphate substituiert sind, lassen sich durch einfache Alkylierungschemie in eine ladungsneutrale DNA umwandeln (Gut, I. G. und Beck, S. (1995), A procedure for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 23: 1367-1373). Die Kopplung eines "charge tags" an diese modifizierte DNA resultiert in der Steigerung der Empfindlichkeit um den gleichen Betrag, wie er für Peptide gefunden wird. Ein weiterer Vorteil von "charge tagging" ist die erhöhte Stabilität der Analyse gegen Verunreinigungen, die den Nachweis unmodifizierter Substrate stark erschweren.

Genomische DNA wird durch Standardmethoden aus DNA von Zell-, Gewebe- oder sonstigen Versuchsproben gewonnen. Diese Standardmethodik findet sich in Referenzen wie Fritsch und Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.

Nach der Erfindung der PCR sind in den folgenden Jahren zahlreiche Varianten bekannt geworden, die diese Technik zur Amplifikation der DNA verfeinern. Insbesondere ist hier die Multiplexierung der PCR (Multiplex-PCR) zu erwähnen, wobei man mehr als 2 spezifische Primer einsetzt und dabei in einem Reaktionsgefäß eine Vielzahl von verschiedenen, spezifische n Amplifikation erzeugen kann. Besonders interessant ist auch die sogenannte Nested PCR, welche unter anderem zum Nachweis besonders geringer DNA Mengen verwendet wird. Diese Art der PCR besteht aus zwei aufeinanderfolgenden Amplifikationen, wobei die Primer der zweiten Amplifikation innerhalb des ersten Amplifikates liegen und nicht mit den Primern der ersten Amplifikation identisch sind. Dadurch wird eine besondere Spezifität erreicht, da die Primer der zweiten Amplifikation nur dann funktionieren, wenn in der ersten Amplifikation das beabsichtigte Fragment erzeugt wurde. Dagegen ist die die Vermehrung etwaiger Nebenprodukte der ersten Amplifikation in der zweiten so gut wie ausgeschlossen.

Es sind demnach bislang vielerlei Verfahren zur Methylierungsanalyse Stand der Technik. Die meisten dieser Verfahren erlauben die Analyse von einzelnen Positionen im Genom, einige, wie zum Beipiel Hybridisierungstechniken an Oligomer Arrays, erlauben die Analyse einer Vielzahl von Positionen gleichzeitig. Der experimentelle Aufwand dieser Verfahren ist jedoch vergleichsweise hoch. Die vorliegende Erfindung soll ein Verfahren bereitstellen, das es nach den Bisulfit Behandlung und Amplifikation mit in molekularbiologischen Laboratorien verbreiteter Intrumentierung wie Kapillargelelektrophorese oder HPLC erlaubt, eine direkte Methylierungsanalyse in dem gesamten Fragment ohne weitere Schritte durchzuführen. Die Methode verzichtet dabei auf die Analyse bestimmter Einzelpositionen, sondern analysiert das Ausmaß der Methylierung in dem untersuchten Fragment.

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass sich die Basenzusammensetzung der DNA in der Bisulfit- Behandlung und in der nachfolgenden Amplifikation auf charakteristische Weise ändert und dass sich allein daraus ein Analyseverfahren zum Nachweis von Cytosin- Methylierung ableiten lässt. Wird eine genomische DNA Probe mit Bisulfit behandelt, so werden alle nicht methylierten Cytosinbasen in Uracil umgewandelt und in der nachfolgenden Amplifikation in Thymin. Demzufolge nimmt die Anzahl der Cytosinbasen grundsätzlich ab, und zwar umso mehr, je geringer der Methylierungsgrad des betreffenden amplifizierten Abschnittes der DNA-Probe ist. Entsprechend nimmt die Anzahl der Thyminbasen zu, je geringer der Methylierungsgrad ist. In dem in der Amplifikation gebildeten komplementären Gegenstrang ist es umgekehrt so, dass je geringer der Methylierungsgrad in der DNA Probe war, umso mehr Adenin eingebaut wurde. Umgekehrt enthält der Gegenstrang umso mehr Guanin, je höher der Methylierungsgrad der DNA-Probe war.

Dies führt nun zu dem Effekt, dass sich die Molmasse der beiden in der Amplifikation gebildeten komplementären Stränge umso mehr unterscheidet, je geringer der Methylierungsgrad in dem amplifizierten Abschnitt der genomischen DNA-Probe ist. Eine Umwandlung des Cytosins in dem einen Strang in letztlich Thymidin führt zu einer Erhöhung der Masse um jeweils 15 Da, während auf dem komplementären Strang sich dadurch, dass entsprechend Guanin durch Adenin ersetzt wird, eine Verringerung der Molekülmasse um 16 Da ergibt. Daraus folgt, dass sich aus der Umwandlung jedes zusätzlichen Cytosins in letzlich Thymin eine zusätzliche Massendifferenz von 31 Da zwischen den beiden komplementären Strängen des Amplifikates ergibt.

Die vorliegende Erfindung nutzt nun mehrere Verfahren, um diese Massendifferenz aufzuzeigen und daraus unmittelbar Information über den Methylierungszustand des untersuchten Abschnittes der genomischen DNA Probe abzuleiten.

Zusätzlich zu der sich mit abnehmender Methylierung verändernden Molekülmasse der Einzelstränge gibt es noch weitere Effekte, der hier ausgenutzt werden können. Jede Umwandlung von Cytosinbasen in Thymidin führt beispielsweise zu dem Verlust einer Aminofunktion in dem jeweiligen Einzelstrang, während in dem anderen Strang Guanin gegen Adenin auszutauschen ist und dabei jedoch die Aminofunktion erhalten bleibt. Auch dadurch verändern sich je nach gewähltem Analyseverfahren die Eigenschaften der jeweiligen Einzelstränge zueinander erheblich. In jedem Fall lässt sich aber eine unmittelbare Abhängigkeit dieser Eigenschaften vom Methylierungsgrad herstellen.

Zur Analyse der Einzelstränge lassen sich mehrere Verfahren nutzen, die hier beschrieben werden sollen. Insbesondere ist denaturierende Gelelektrophorese, bevorzugt die Kapillargelelektrophorese, zur Auftrennung der Einzelstränge geeignet (siehe Beispiel 1). Normalerweise wird in der Gelelektrophorese, wenn sie nicht denaturierend durchgeführt wird, die DNA im wesentlichen in Abhängigkeit von ihrer Länge aufgetrennt. Dabei dienen DNA Fragmente bekannte Länge als Standard. Bei denaturierender Gelelektrophorese hingegen erfolgt oft auch eine Auftrennung in Abhängigkeit von der Sequenz, wenn diese unterschiedliche Konformationen und Sekundärstrukturen des DNA-Einzelstranges bedingen. Eine der bekanntesten Techniken in diesem Zusammenhang ist die SSCP.

Da jedoch hier ein Methylierungsgrad innerhalb eines Fragmentes festzustellen ist, dem eine Vielzahl möglicher unterschiedlicher Sequenzen nach der Bisulfit-Behandlung gegenüberstehen, eignen sich derartige Methoden nicht so gut, da man sehr viele verschiedene Fälle unterscheiden muss. Jedoch ist eine Anwendung der SSCP auch für Methylierungsanalyse in diesem Sinne denkbar.

Der besondere Vorteil dieser Erfindung im Hinblick auf die Gelelektrophorese ist jedoch, dass sich die Basenzusammensetzung in der Bisulfit-behandelten und amplifizierten DNA wesentlich von der genomischen unterscheidet, und zwar umso mehr, je geringer ihr Methylierungsgrad ist. Diese Unterschiede sind extrem genug, dass man sie, wie in Beispiel 1 gezeigt, auch unmittelbar zur Methylierungsanalyse verwenden kann, da sich das Verhalten in der Kapillargelelektrophorese messbar in Abhängigkeit von der Sequenz ändert. Besonders sinnvoll und bevorzugt ist es auch, den Abstand der Banden für die beiden jeweiligen Einzelstränge des PCR-Produktes als Mass für den Methylierungsgrad in der genomischen Probe zu verwenden.

Ähnliches gilt auch für die zwei Peaks einer denaturierenden HPLC, die analog ausgewertet werden kann. Auf geeigneten Reversed-Phase Säulen, bevorzugt in Verbindung mit Triethylammoniumacetat/Acetonitril Gradienten eluiert, lassen sich die beiden Einzelstränge ebenfalls auftrennen. Auch hier ist die Retentionszeit wiederum unmittelbar abhängig von der Basenzusammensetzung und damit letztlich von dem Methylierungsgrad der genomischen DNA- Probe in dem betreffenden Fragment.

Es ist auch möglich und bevorzugt, die HPLC bei einer Temperatur durchzuführen, in der die DNA zumindest partiell noch doppelsträngig vorliegt. Die dabei gebildeten Duplexes und Heteroduplexes können ebenfalls in Abhängigkeit von der Anzahl der Fehlpaarungen von der HPLC aufgetrennt werden. Dies erlaubt es, ein Bild von der Homogenität der Methylierung zwischen zwei Proben zu erzeugen. Es ist auch möglich und bevorzugt, Methylierung auf diese Art unmittelbar zu messen, wenn ein bekanntes Referenzamplifikat zugesetzt wird, das aus einer im Methylierungsmuster gut charakterisierten und mit Bisulfit behandelten Probe gewonnen wurde. Die Peaks erlauben in diesem Falle einen Rückschluss auf die Ähnlichkeit des Methylierungsmusters mit dem der Referenz-DNA.

Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird dadurch gelöst, dass ein Verfahren zum Nachweis von Cytosin- Methylierung in DNA-Proben geschaffen wird bei dem man die folgenden Schritte ausführt:

a) eine genomische DNA Probe wird chemisch, bevorzugt mit einem Bisulfit (= Disulfit, Hydrogensulfit), derart behandelt, dass Cytosin in Uracil umgewandelt wird, während 5- Methylcytosin unverändert bleibt,
b) Abschnitte der Proben-DNA werden mit mindestens 2 Primern in einer Polymerasereaktion, bevorzugt einer Polymerasekettenreaktion, amplifiziert und
c) die Fragmente werden hinsichtlich der Basenzusammensetzung jeweils der beiden komplementären Stränge des Amplifikates untersucht, wobei aus dem Unterschied im Molekulargewicht der beiden Stränge auf den Methylierungsstatus in dem amplifizierten Abschnitt der genomischen DNA-Probe geschlossen wird.

In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens werden der oder die Unterschiede im Molekulargewicht der beiden Stränge durch denaturierende Gelelektrophorese gemessen. Analog dem Molekulargewicht kann die Bruttozusammensetzung der DNA in Bezug auf die Nukleobasen A, C, T und G betrachtet werden. Im folgenden wird jedoch der Einfachheit halber immer nur auf das Molekulargewicht Bezug genommen. In einer wiederum besonders bevorzugten Variante des Verfahrens wird der Unterschied im Molekulargewicht der beiden Stränge durch Kapillargelelektrophorese bestimmt.

In einer weiteren besonders bevorzugten Variante des Verfahrens wird der Unterschied im Molekulargewicht der beiden Stränge durch chomatographische Verfahren gemessen. Besonders bevorzugt handelt es sich bei diesem chromatographischen Verfahren um denaturierende Hochdruckflüssigkeits-chromatographie (HPLC).

Besonders bevorzugt tragen zusätzlich zum Molekulargewicht auch noch weitere Faktoren wie z. B. der unterschiedliche Gesamtgehalt an Guanin, an Aminofunktionen oder Ketofunktionen der beiden komplementären Stränge zu ihrem unterschiedlichen Verhalten in einer der oben erwähnten analytischen Methoden bei.

Ebenfalls ist es besonders bevorzugt, den Unterschied im Molekulargewicht der beiden Stränge durch Massenspektrometrie zu bestimmen. Da ausschliesslich die Massendifferenz der beiden Stränge bestimmt wird, erübrigt sich hier eine Kalibrierung. Es ist jedoch offensichtlich, dass es ebenfalls möglich ist, die Massen der beiden Stränge getrennt zu bestimmen und nur eine Masse für die Methylierungsanalyse heranzuziehen.

Besonders bevorzugt ist auch eine Verfahrensvariante, bei der Referenz-DNA bekannter Zusammensetzung und gleicher oder ähnlicher Länge bei der Analyse als externer oder interner Standard verwendet wird. Wiederum besonders bevorzugt handelt es sich bei dieser Referenz-DNA um Bisulfit-behandelte DNA aus einer Referenzprobe mit bekanntem Methylierungsstatus handelt oder aber um die ohne vorherige chemische Behandlung amplifizierte genomische DNA mit gleicher oder ähnlicher Fragmentlänge wie das jeweils analysierte Fragment.

In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens gewinnt man die Proben DNA aus Serum oder anderen Körperflüssigkeiten eines Individuums, aus Zellinien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Serum, Gehirn-Rückenmarks- Flüssigkeit, in Paraffin einbettetem Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologischen Objektträgern und allen möglichen Kombinationen hiervon.

In einer weiteren besonders bevorzugten Variante des Verfahrens führt man die chemische Behandlung mit einem Bisulfit (= Disulfit, Hydrogensulfit) durch. Besonders bevorzugt erfolgt die chemische Behandlung nach Einbetten der DNA in Agarose. Ebenfalls bevorzugt ist es, dass bei der chemischen Behandlung ein die DNA-Duplex denaturierendes Reagenz und/oder ein Radikalfänger zugegen ist.

In einer besonders bevorzugten Verfahrensvariante wird die Amplifikation mehrerer Fragmente in einem Reaktionsgefäß in Form einer Multiplex-PCR durchgeführt.

Die in den Amplifikationen verwendeten Primer amplifizieren besonders bevorzugt keine Fragmente aus nicht mit Bisulfit behandelter genomischer DNA (oder nur in vernachlässigbarem Ausmaß), so dass sie für die mit Bisulfit umgewandelte DNA spezifisch sind. Dies schützt vor fehlerhaften Ergebnissen im Falle einer unvollständigen Umwandlungsreaktion mit beispielsweise Natriumbisulfit.

In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens sind die Amplifikate für die Detektion mit mindestens einer nachweisbaren Markierung versehen, die bevorzugt durch Markierung der Primer während der Amplifikation eingebracht wird. Besonders bevorzugt sind die Markierungen Fluoreszenzmarkierungen oder Radionuklide. Besonders bevorzugt werden die beiden Stränge der Amplifikate getrennt und insgesamt im Massenspektrometer nachgewiesen und somit durch ihre jeweilige Masse eindeutig charakterisiert.

Besonders bevorzugt ist auch eine Verfahrensvariante bei der man aus dem Methylierungsgrad an den verschiedenen untersuchten CpG Positionen auf das Vorliegen einer Erkankung oder eines anderen medizinischen Zustandes des Patienten schließt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung eines der beschriebenen Verfahrensvarianten zur Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen, wobei diese nachteiligen Ereignisse mindestens einer der folgenden Kategorien angehören: unerwünschte Arzneimittelwirkungen; Krebserkrankungen; CNS-Fehlfunktionen, Schäden oder Krankheit; Aggressionssymptome oder Verhaltensstörungen; klinische, psychologische und soziale Konsequenzen von Gehirnschädigungen; psychotische Störungen und Persönlichkeitsstörungen; Demenz und/oder assoziierte Syndrome; kardiovaskuläre Krankheit, Fehlfunktion und Schädigung; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des gastrointestinalen Traktes; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Atmungssystems; Verletzung, Entzündung, Infektion, Immunität und/oder Rekonvaleszenz; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Körpers als Abweichung im Entwicklungsprozess; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit der Haut, der Muskeln, des Bindegewebes oder der Knochen; endokrine und metabolische Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit; Kopfschmerzen oder sexuelle Fehlfunktion.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung eines der beschriebenen Verfahrensvarianten zur Unterscheidung von Zelltypen oder Geweben oder zur Untersuchung der Zelldifferenzierung.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Kit, bestehend aus einem Bisulfit enthaltenen Reagenz, Primern zur Herstellung der Amplifikate, sowie optional einer Anleitung zur Durchführung eines Assays entsprechend einer der beschriebenen Verfahrensvarianten.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beipiel 1 Amplifikation von Fragmenten des MdrI Gens durch PCR (genomische DNA)

Für die Experimente wurde humane DNA (Promega) verwendet. Das MdrI-Fragment wurde mit den PCR-Primern
CAAGCATGCTGAAGAAAGACCACTGCAG (SEQ-ID: 1) und
TGGGAACTGTCCCATAGTAGCTCCCAGC (SEQ-ID: 2) unter folgenden Reaktionsbedingungen amplifiziert:
1 µl Promega_DNA (2 ng/µl)
0,2 µl Taq Polymerase (5 U/µl)
0,2 µl dNTP's (Endkonzentration je 200 µM)
1 µl dATP Fluorescein-markiert (0,5 µM Endkonzentration)
2,5 µl 10 × PCR Puffer (Qiagen)
2 µl Primer (SEQ-ID 1 und 2) je 25 pmol/µl
18,1 µl Wasser

Die Amplifikation erfolgte in einem PCR-Thermocycler (Eppendorf) unter Verwendung des folgenden Programms:

Das so hergestellte MdrI-PCR-Produkt hat eine Länge von 633 bp und die Sequenz:

Beipiel 2 Amplifikation von bisulfit-behandelten Fragmenten des MdrI Gens durch PCR zur Analyse des Methylierungszustandes

Für die Herstellung von aufmethylierter humaner DNA, welche als Standard für die weiteren Untersuchungen dienen soll, wurden 700 ng DNA mit der CpG-spezifischen Methylase SssI (BioLabs Inc) nach Herstellerangaben umgesetzt. Diese methylierte DNA und nicht modifizierte humane DNA wurde, wie beschrieben mit Bisulfit behandelt (Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 DEC 15; 24(24): 5064-6). Ebenso wurde eine DNA-Probe mit Bisulfit behandelt, welche entsprechend nicht aufmethyliert wurde. Von diesen beiden Bisulfit- behandelten DNA-Proben wurde mit den Primern
TAAGTATGTTGAAGAAAGATTATTGTAG (SEQ-ID: 4) und
TAAAAACTATCCCATAATAACTCCCAAC (SEQ-ID: 5) ein, dem genomischen Fragment entsprechendes Bisulfit-Fragment, durch PCR amplifiziert. Die PCR-Reaktionsbedingungen waren wie folgt:
1 µl Bisulfit-behandelte DNA (10 ng/µl)
0,2 µl Taq Polymerase (5 U/µl)
0,2 µl dNTP's (Endkonzentration je 200 µM)
1 µl dATP Fluorescein-markiert (0,5 µM Endkonzentration)
2,5 µl 10 × PCR Puffer (Qiagen)
2 µl Primer je 5 pmol/µl
18,1 µl Wasser

Das so hergestellte MdrI-PCR-Produkt hat eine Länge von 633 bp und die methylierte Variante hat die folgende Sequenz:

Beispiel 3

Analyse der PCR-Fragmente durch Kapillar- Elektrophorese

Die Auftrennung der DNA erfolgte mit dem Kapillar- Elektrophoresesystem ABI Prism 310, augestattet mit Modul GS STR POP4 (Applied Biosystems, Weiterstadt) unter denaturierenden Bedingungen in einer Kapillare (Länge 47 cm, Durchmesser 50 µm). Probenvorbereitung und Laufbedingungen waren wie vom Gerätehersteller empfohlen. Die Fragmentgrößenbestimmung erfolgte über den internen Längenstandard ROX-1000 (Applied Biosystems).

Die gewählten Laufbedingungen waren:
Injektionszeit: 2 sec
Injectionsspannung: 3,5 kV
Laufspannung: 15 kV
Temperatur: 60°C
Laufzeit: 45 min.

Es wurden unter diesen Bedingungen zum einen die amplifizierte genomische DNA sowie die aufmethylierte und die nicht aufmethylierte und anschliessend Bisulfit behandelten DNA-Proben gemessen. Es war zu erwarten, dass für die statistisch zusammmengesetzten jeweiligen Einzelstränge des Amplifikats der genomischen DNA ein Wert gemessen werden würde, der im wesentlichen der tatsächlichen Länge des Fragmentes entspricht. Dies bestätigte sich, für das Amplifikat wurde für die beiden Einzelstränge ein Wert von 630.45 Basen bzw. 632.56 Basen gemessen, der theoretische Wert liegt bei 633 Basen (Fig. 1c).

Bei den Amplifikaten der Bisulfit-DNA war nun zu erwarten, dass die Werte stärker abweichen würden, da die Basenzusammensetzung der Stränge, insbesondere die der Guanine und Cytosine, nicht mehr gleich verteilt ist. Entsprechend obigen Überlegungen war auch damit zu rechnen, dass sich bei der aufmethylierten DNA-Proben ein geringerer Unterschied zwischen beiden Strängen ergibt als bei der nicht aufmethylierten Probe. Die bestätigt sich durch das Experiment. Für die nicht aufmethylierte Probe werden Werte von 620.87 Basen und 640.46 Basen für die jeweiligen Einzelstränge gefunden (Fig. 1a, bei statistischer Verteilung der Basen wären 633 zu erwarten), bei der aufmethylierten DNA-Probe ergeben sich Werte von 622.56 Basen und 640.69 Basen (Fig. 1b). Der gemessene Unterschied entspricht also für aufmethylierte DNA 18.13 Basen, hingegen für nicht aufmethylierte DNA 19.59 Basen. Dieser messbare Unterschied von 1.46 kann unmittelbar für die Diagnose des Methylierungszustandes in einer unbekannten Probe herangezogen werden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierung in DNA-Proben, dadurch gekennzeichnet, dass die folgenden Verfahrensschritte ausgeführt werden:
eine genomische DNA Probe wird chemisch, bevorzugt mit einem Bisulfit (= Disulfit, Hydrogensulfit), derart behandelt, dass Cytosin in Uracil umgewandelt wird, während 5-Methylcytosin unverändert bleibt,
Abschnitte der Proben-DNA werden mit mindestens 2 Primern in einer Polymerasereaktion, bevorzugt einer Polymerasekettenreaktion, amplifiziert,
die Fragmente werden hinsichtlich der Basenzusammensetzung jeweils der beiden komplementären Stränge des Amplifikates untersucht, wobei aus dem Unterschied im Molekulargewicht der beiden Stränge auf den Methylierungsstatus in dem amplifizierten Abschnitt der genomischen DNA-Probe geschlossen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Unterschied im Molekulargewicht der beiden Stränge durch denaturierende Gelelektrophorese gemessen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Unterschied im Molekulargewicht der beiden Stränge durch Kapillargelelektrophorese bestimmt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Unterschied im Molekulargewicht der beiden Stränge durch chomatographische Verfahren gemessen wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass denaturierende Hochdruckflüssigkeits-chromatographie (HPLC) verwendet wird.

6. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich zum Molekulargewicht auch noch weitere Faktoren wie z. B. der unterschiedliche Gesamtgehalt an Guanin, an Aminofunktionen oder Ketofunktionen der beiden komplementären Stränge zu ihrem unterschiedlichen Verhalten in einer der analytischen Methoden der Ansprüche 2 bis 5 beitragen.

7. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Unterschied im Molekulargewicht der beiden Stränge durch Massenspektrometrie gemessen wird.

8. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Referenz-DNA bekannter Zusammensetzung und gleicher oder ähnlicher Länge bei der Analyse als externer oder interner Standard verwendet wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Referenz-DNA um Bisulfit- behandelte DNA aus einer Referenzprobe mit bekanntem Methylierungsstatus handelt oder aber um die ohne vorherige chemische Behandlung amplifizierte genomische DNA mit gleicher oder ähnlicher Fragmentlänge wie das jeweils analysierte Fragment.

10. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man die Proben DNA aus Serum oder anderen Körperflüssigkeiten eines Individuums, aus Zellinien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Serum, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin einbettetem Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologischen Objektträgern und allen möglichen Kombinationen hiervon gewinnt.

11. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man die chemische Behandlung mit einem Bisulfit (= Disulfit, Hydrogensulfit) durchführt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die chemische Behandlung nach Einbetten der DNA in Agarose erfolgt.

13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass bei der chemischen Behandlung ein die DNA-Duplex denaturierendes Reagenz und/oder ein Radikalfänger zugegen ist.

14. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation mehrerer Fragmente in einem Reaktionsgefäß in Form einer Multiplex-PCR durchgeführt wird.

15. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die in der Amplifikation eingesetzten Primer die chemisch mit Bisulfit umgewandelte DNA amplifizieren, nicht aber die entsprechende nicht umgewandelte genomische Sequenz.

16. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikate für die Detektion mit mindestens einer nachweisbaren Markierung versehen sind, die bevorzugt durch Markierung der Primer während der Amplifikation eingebracht wird.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen Fluoreszenzmarkierungen sind.

18. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen Radionuklide sind.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die beiden Stränge der Amplifikate getrennt werden und insgesamt im Massenspektrometer nachgewiesen werden und somit durch ihre jeweilige Masse eindeutig charakterisiert sind.

20. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man aus dem Methylierungsgrad an den verschiedenen untersuchten CpG Positionen auf das Vorliegen einer Erkankung oder eines anderen medizinischen Zustandes des Patienten schließt.

21. Verwendung eines Verfahrens nach einem der voranstehenden Ansprüche zur Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen, wobei diese nachteiligen Ereignisse mindestens einer der folgenden Kategorien angehören: unerwünschte Arzneimittelwirkungen; Krebserkrankungen; CNS- Fehlfunktionen, Schäden oder Krankheit; Aggressionssymptome oder Verhaltensstörungen; klinische, psychologische und soziale Konsequenzen von Gehirnschädigungen; psychotische Störungen und Persönlichkeitsstörungen; Demenz und/oder assoziierte Syndrome; kardiovaskuläre Krankheit, Fehlfunktion und Schädigung; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des gastrointestinalen Traktes; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Atmungssystems; Verletzung, Entzündung, Infektion, Immunität und/oder Rekonvaleszenz; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Körpers als Abweichung im Entwicklungsprozess; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit der Haut, der Muskeln, des Bindegewebes oder der Knochen; endokrine und metabolische Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit; Kopfschmerzen oder sexuelle Fehlfunktion.

22. Verwendung eines Verfahrens nach einem der voranstehenden Ansprüche zur Unterscheidung von Zelltypen oder Geweben oder zur Untersuchung der Zelldifferenzierung.

23. Kit, bestehend aus einem Bisulfit enthaltenen Reagenz, Primern zur Herstellung der Amplifikate, sowie optional einer Anleitung zur Durchführung eines Assays nach einem der Ansprüche 1-22.