DE10118698A1

DE10118698A1 - Verfahren zur Immobilisierung und damit hergestellte Anordnungen von Verbindungen auf einer planaren Oberfläche

Info

Publication number: DE10118698A1
Application number: DE2001118698
Authority: DE
Inventors: Mike Schutkowski; Dirk Scharn; Frank Osterkamp; Gerd Hummel; Laurence Jobron; Antje Burian
Original assignee: Jerini AG
Current assignee: Jerini AG
Priority date: 2001-04-17
Filing date: 2001-04-17
Publication date: 2002-11-07
Also published as: WO2002083884A3; WO2002083884A2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung von Verbindungen auf einer Oberfläche, umfassend die Schritte DOLLAR A - Bereitstellen einer zu immobilisierenden Verbindung als ersten Reaktionspartner und einer Oberfläche als zweiten Reaktionspartner, wobei der erste Reaktionspartner eine erste reaktive Gruppe und der zweite Reaktionspartner eine erste reaktive Gruppe umfasst, und DOLLAR A - Umsetzen der beiden Reaktionspartner DOLLAR A wobei vorgesehen ist, dass beim Umsetzen der beiden Reaktionspartner ein heterocyclisches Ringsystem ausgebildet wird.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung von Verbindungen ins besondere von Biomolekülen, dadurch herstellbare planare Oberflächen und Anordnungen sowie Verwendung der planaren Oberfläche und der Anordnung in einem Verfahren zur Be stimmung der Substratspezifität einer enzymatischen Aktivität.

Mit der zunehmenden Verfügbarkeit von Sequenzinformationen aus den verschiedenen Ge nomprojekten gewann die Anordnung von Nukleinsäurefragmenten mit hoher Dichte auf ei nem Trägermaterial, sogenannten Chips oder Biochips, eine große Bedeutung, deren volles Potential jedoch erst mit der Verfügbarkeit neuerer Synthesetechniken sowie der Miniaturisie rung ausgeschöpft werden konnte und zu einer Vielzahl von Anwendungen führte. Neben Nukleinsäuren wurden Naturstoffe bzw. Bibliotheken davon, aber auch Anordnungen von Oligopeptiden und Proteinen auf derartige Chips aufgebracht. Als Trägermaterialien für diese Anordnungen wurden dabei Zellulose (D. R. Englebretsen, D. R. K. Harding; 1994, High yield, directed immobilization of a peptide-ligand onto a beaded cellulose support, Pept. Res., 7, 322-326, R. Frank, 1992, Spot synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support, Tetrahedron, 48, 9217-9232; A. Kramer und J. Schneider-Mergener, Methods in Molecular Biology, vol 87: Combinatorial Peptide Library Protocols, S. 25-39, edited by: S. Cabilly; Humana Press Inc., Totowa, NJ), Glas (S. P. A. Fodor, J. L. Read, M. C. Pirrung, L. Stryer, A. T. Lu, D. Solas; 1991, Light-directed, spati ally addressable parallel chemical synthesis, Science, 251, 767-773 J. Robles, M. Beltran, V. Marchan, Y. Perez, I. Travesset, E. Pedroso, A. Grandas; 1999, Towards nucleopeptides con taining any trifunctional amino acid, Tetrahedron, 55, 13251-13264), Nitrozellulose (S. J. Hawthorne, M. Pagano, P. Harriott, D. W. Halton, B. Walker; 1998, The synthesis and utiliza tion of 2,4-dinitrophenyl-labeled irreversible peptidyl diazomethyl ketone inhibitors, Anal. Biochem., 261, 131-138), PTFE-Membranen, Gold (B. T. Houseman, M. Meksich; 1998, Effi cient solid-phase synthesis of peptide-substituted alkanethiols for the preparation of substrates that support the adhesion of cells, J. Org. Chem., 63, 7552-7555), Titanoxid (SJ. Xiao, M. Textor, ND. Spencer, M. Wieland, B. Keller, H. Sigrist; 1997, Immobilization of the cell adhesive peptide ARG-GLY-ASP-CYS (RGDC) on titanium surfaces by covalent chemical attachment, J. Materials Science-Materials in Medicine, 8, 867-872), Siliziumoxid und modi fizierte Polypropylenoberflächen verwendet.

Mit der zunehmenden Bedeutung von Proteomics und deren biotechnologische Anwendung rücken Peptide und Proteine in den Vordergrund des Interesses. Generell sind es Proteine und meistens deren enzymatische Aktivitäten, die nahezu alle biochemischen Reaktionen inner halb und außerhalb der Zelle ermöglichen. Die Verwendung von Anordnungen von Nuklein säuren, mit denen entweder die Messenger-RNA (mRNA), die durch in der Zelle gerade akti ve Gene generiert wurden, oder aber DNA-Kopien dieser mRNA nachgewiesen werden, sind zwar von großer Bedeutung, jedoch ist die damit erhältliche Information aus einer Reihe von Gründen nicht ausreichend, um die Vorgänge sowohl intrazellulärer wie auch extrazellulärer Prozesse zu verstehen und hiervon im Rahmen verschiedener biotechnologischer Anwendun gen Gebrauch zu machen. Ein Grund besteht darin, dass die Menge an mRNA in einer Zelle oft nicht mit der entsprechenden, in der Zelle produzierten Proteinmenge korreliert. Außer dem können einmal hergestellte Proteine durch geringfügige chemische Modifikationen in der Zelle (post-translationale Modifikationen) erheblich in ihrer enzymatischen Aktivität (und damit in ihrer biologischen Funktion) beeinflußt werden. Somit besteht die Notwendigkeit, eine parallele Analyse der enzymatischen Aktivität möglichst vieler Proteine, insbesondere Enzyme, durchzuführen. Ein derartiger Ansatz erlaubt u. a. die sehr schnelle Bestimmung der Substratspezifität eines definierten Enzyms, welche wiederum eine wichtige Voraussetzung für das Design von Wissens-basierten Inhibitoren ist, oder die selektive Prüfung von Pharma ka bzw. Pharmaka-Kandidaten, insbesondere im Rahmen der Voraussage von Nebenwirkun gen.

Grundsätzlich weist die Immobilisierung eine Reihe von Vorteilen auf. Dazu gehört unter anderem die erhöhte Stabilität der immobilisierten Verbindungen. Werden beispielsweise Nukleinsäuren oder Proteine immobilisiert, beobachtet man regelmäßig, dass sich deren Halbwertszeit bei Exposition gegenüber verschiedenen Medien deutlich erhöht, so auch bei solchen Medien, die eine Nuklease- oder Protease-Aktivität aufweisen. Ein Grund für die be obachtete erhöhte Halbwertszeit mag sicherlich in der verringerten Zugänglichkeit der Nuk leinsäuren bzw. Protein für die entsprechenden degradativen Enzymaktivitäten sein.

Ein weiterer Vorteil der Immobilsierung ist die Wiederverwendbarkeit der immobilisierten Verbindungen. Beispielsweise ist es möglich, durch Immobilisierung von Verbindungen an Trägermaterialien, die im Rahmen von chromatographischen Prozessen verwendet werden, nach Passage eines Mediums, das es aufzureinigen oder unter dem Einfluss der immobilisier ten Verbindungen zu modifizieren gilt, und gegebenenfalls Regeneration, wieder zu verwen den. Derartige Prozesse sind beispielsweise die Affinitätschromatographie oder die Biokon version und Biotransformation.

Eine weitere Anwendung von immobilisierten Verbindungen bzw. Anordnungen von Nuk leinsäuren oder Proteinen ist das eingangs erwähnte Anwendungsgebiet der sogenannten Bio chips. Bei diesen ist eine genau definierte Korrelation zwischen der Art des immobilisierten Moleküls und seiner Positionierung oder Anordnung auf einer Oberfläche erforderlich.

Grundsätzlich gibt es zwei Methoden, Biomoleküle, wie zum Beispiel Oligoeptide oder Nuk leinsäuren, mit einer Oberfläche (planarer Träger oder Harzkügelchen) bzw. einem Biopoly mer (Proteinoberfläche und damit Biokonjugatbildung) zu verbinden. Einerseits können vor gefertigte Biomoleküle (und gereinigte) Biomoleküle zur Immobilisierungsreaktion, die ge richtet oder ungerichtet sein kann, verwendet werden und andererseits können diese Biomole küle direkt auf einer entsprechenden Oberfläche schrittweise synthetisiert werden. Im Stand der Technik wurden zum Beispiel Peptide auf Zellulose (R. Frank, 1992, Spot synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support, Tetrahedron, 48, 9217-9232; A. Kramer und J. Schneider-Mergener, Methods in Mo lecular Biology, vol 87: Combinatorial Peptide Library Protocols, S. 25-39, edited by: S. Ca billy; Humana Press Inc., Totowa, NJ; Töpert, F., Oires, C., Landgraf, C., Oschkinat, H. and Schneider-Mergener, J., 2001, Synthesis of an array comprising 837 variants of the hYAP WW protein domain) oder auf Polypropylen (WO 92/04366) oder auf Glas (S. P. A. Fodor, J. L. Read, M. C. Pirrung, L. Stryer, A. T. Lu, D. Solas; 1991, Light-directed, spatially addressable parallel chemical synthesis, Science, 251, 767-773, J. P. Pellois, W. Wang, X. L. Gao; 2000, Peptide synthesis based on t-Boc chemistry and solution photogenerated acids, J Comb. Chem., 2, 355-360) oder auf Chitin (W. Neugebauer, R. E. Williams, J. R. Barbier, R. Brze zinski, G. Willick; 1996, Peptide synthesis on chitin, Int. J. Pept. Prot. Res., 47, 269-275) oder an Separose (R. Gast, J. Glokler, M. Hoxter, M. Kiess, R. Frank, W. Tegge; 1999, Method for determining protein kinase substrate specificities by the phosphorylation of pep tide libraries on beads, phosphate-specific staining, automated sorting, and sequencing, Anal. Biochem., 276, 227-241) synthetisiert.

Auch Nukleinsäuren konnten so durch direkte Synthese auf geeigneten Oberflächen, wie zum Beispiel Glas (S. P. A. Fodor, J. L. Read, M. C. Pirrung, L. Stryer, A. T. Lu, D. Solas; 1991, Light directed, spatially addressable parallel chemical synthesis, Science, 251, 767-773, J. Robles, M. Beltran, V. Marchan, Y. Perez, I. Travesset, E. Pedroso, A. Grandas; 1999, Towards nu cleopeptides containing any trifunctional amino acid, Tetrahedron, 55, 13251-13264), direkt synthetisiert werden. Dabei ist für den Fachmann verständlich, dass infolge der nicht immer vollständigen Ausbeuten der einzelnen Syntheseschritte bzw. Kopplungsschritte gewisse He terogenitäten in den verschiedenen Aminosäuresequenzen im vorstehend beschriebenen Sinne entstehen können. Insbesondere bei Synthesen, die viele Reaktionsschritte erfordern, wie dies bei der Synthese von Amiosäuresequenzen der Fall ist (pro Aminosäurebaustein eine Kupp lungsreaktion und eine Schutzgruppen-Abspaltung und am Ende der Synthese im allgemeinen eine Reaktion für die simultane Abspaltung aller Schutzgruppen der Seitenkettenfunktionen) kann das ein Problem darstellen. So ist zum Beispiel bei der Synthese einer Aminosäurese quenz, die aus 20 Aminosäurebausteinen oder 40 Aminosäurebausteinen besteht, und einer angenommenen durchschnittlichen Ausbeute von 95% für die nötigen 41 bzw. 81 Reaktions schritte die zu erwartente theoretische Ausbeute nur noch 0.95⁴¹ = 0.122 (12.2%) bzw. 0.95⁸¹ = 0.0157 (1.57%). Selbst bei einer angenommen durchschnittlichen Ausbeute von 99% er geben sich für die oben aufgeführten Beispiele nur 66.2% bzw. 44.3%.

Die Anwendung der Immobilisierungstechnologie beispielweise im Bereich der Biochips und insbesondere die Verwendung von Biochips zur Bestimmung der Substratspezifität von En zymen wie zum Beispiel Kinasen, Phosphatasen, Acetyltransferasen, Glycosyltransferasen, Farnesyltransferasen, Sulfatasen, Sulfotransferasen oder Proteasen, die auf definierte Anord nungen von sich in ihrer Aminosäuresequenz unterscheidenden Peptide zurückgreifen, wer den infolge dieser Limitierungen neben der gewünschten Aminosäuresequenz in großer Viel zahl weitere Aminosäuresequenzen vorhanden sein, die sich durch das Fehlen einer oder meh rerer Aminosäurebausteine auszeichnen. Genau diese, dem Fachmann als Fehl- bzw. Ab bruchsequenzen bekannten Nebenprodukte, können unter Umständen das Ergebnis der Inku bation mit einer, die auf der Oberfläche angeordneten Aminosäuresequenzen modifizierenden, enzymatischen Aktivität stark verfälschen bzw. die Interpretation der Ergebnisse erschweren. Um diese Nachteile zu vermeiden, kann die Immobilisierung von möglichst gereinigten, Biomolekülen hilfreich sein. Im Stand der Technik wurden Biomoleküle, wie zum Beispiel Peptide oder Nukleinsäuren, auf verschiedenen Oberflächen wie Glas (S. P. A. Fodor, J. L. Read, M. C. Pirrung, L. Stryer, A. T. Lu, D. Solas; 1991, Light-directed, spatially addressable parallel chemical synthesis, Science, 251, 767-773, J. P. Pellois, W. Wang, X. L. Gao; 2000, Peptide synthesis based on t-Boc chemistry and solution photogenerated acids, J. Comb. Chem., 2, 355-360, J. Robles, M. Beltran, V. Marchan, Y. Perez, I. Travesset, E. Pedroso, A. Grandas; 1999, Towards nucleopeptides containing any trifunctional amino acid, Tetrahe dron, 55, 13251-13264), Zellulose (D. R. Englebretsen, D. R. K. Harding; 1994, High yield, directed immobilization of a peptide-ligand onto a beaded cellulose support, Pept. Res., 7, 322-326, R. Frank, 1992, Spot synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support, Tetrahedron, 48, 9217-9232; A. Kramer und J. Schneider-Mergener, Methods in Molecular Biology, vol 87: Combinatorial Peptide Library Protocols, S. 25-39, edited by: S. Cabilly; Humana Press Inc., Totowa, NJ), Nitrozel lulose (S. J. Hawthorne, M. Pagano, P. Harriott, D. W. Halton, B. Walker; 1998, The synthesis and utilization of 2,4-dinitrophenyl-labeled irreversible peptidyl diazomethyl ketone inhibi tors, Anal. Biochem., 261, 131-138), Titanoxid (SJ. Xiao, M. Textor, ND. Spencer, M. Wie land, B. Keller, H. Sigrist; 1997, Immobilization of the celladhesive peptide ARG-GLY- ASP-CYS (RGDC) on titanium surfaces by covalent chemical attachment, J. Materials Sci ence-Materials in Medicine, 8, 867-872) oder Gold (B. T. Houseman, M. Meksich; 1998, Efficient solid-phase synthesis of peptide-substituted alkanethiols for the preparation of substrates that support the adhesion of cells, J. Org. Chem., 63, 7552-7555) immobilisiert.

Eine weitere Unterscheidung der Immobilisierung kann auf der Grundlage der Orientierung oder Bindung der einzelnen immobilisierten Verbindung relativ zur Oberfläche vorgenommen werden. Hier kann zwischen spezifischer und unspezifischer Immobilisierung unterschieden werden. Bei unspezifischer Immobilisierung erfolgt in einem Immobilisierungsereignis der Kontakt zwischen der zu immobilisierenden Verbindung und der Oberfläche, auf bzw. an der die Verbindung immobilisiert wird, in unterschiedlicher Weise. Mit anderen Worten, es rea gieren entweder verschiedene in der zu immobilisierenden Verbindung enthaltene reaktive Gruppen mit der Oberfläche oder aber es reagieren verschiedene, auf der Oberfläche vorhan dene reaktive Gruppierungen mit einer reaktiven Gruppe der zu immobilisierenden Verbin dung (Quervernetzung). Infolgedessen kommt es zur Ausbildung einer Population von immo bilisierten Verbindungen, die hinsichtlich ihrer Bindung an die Oberfläche heterogen sind. Diese unterschiedlich Art der Immobilisierung kann zu einem oftmals unerwünschten unter schiedlichen Verhalten der immobilisierten Verbindung führen. Zum Beispiel können bei der Immobilisierung eines Substrates für eine Kinase auf oder an einer Oberfläche unter Nutzung der innerhalb dieses Substrates enthaltenen Aminogruppen mehrere (abhängig von der Anzahl der in der zu immobilisierenden Verbindung vorhandenen Aminogruppen) Möglichkeiten der Reaktion und damit der endgültigen Orientierung der Verbindung auf der Oberfläche beste hen. Werden dabei bei der nachgeschalteten Inkubation dieser immobilisierten Verbindung (Kinasesubstrat) mit einer, mindestens eine Kinaseaktivität enthaltenden, biologischen Flüs sigkeit eben eine oder mehrere dieser Aminogruppen für die effektive Ausbildung eines Em zym/Substrat/Komplexes benötigt, kann eine solche unspezifische Immobilisierung dazu füh ren, das nur eine geringe Population der immobilisierten Substrate in der richtigen Art und Weise verankert sind und damit das Meßsignal unterhalb der Nachweisgrenze liegt. Damit ist eine spezifische oder auch gerichtete Immobilisierung von großem Vorteil. Hier erfolgt in einem Immobilsierungsereignis der Kontakt zwischen der zu immobilisierenden Verbindung und der Oberfläche, auf bzw. an der die Verbindnung immobilisiert wird, jeweils in der glei chen Art und Weise und alle Verbindungen sind in einer definierten und vorhersagbaren Ori entierung auf oder an der Oberfläche gebunden.

Bei dieser Form der Immobilisierung handelt es sich in der Regel um eine kovalente Immobi lisierung, wobei hier eine chemoselektive Reaktion zwischen der zu immobilisierenden Ver bindung und der Oberfläche (des Trägermaterials) erfolgt. Hierzu können eine Reihe von Re aktionen verwendet werden, die dem Fachmann auf diesem Gebiet als solche bekannt (G. A. Lemieux und C. R. Bertozzi, 1998, chemoselective ligation reactions with proteins, oligosac charides and cells, TIBTECH, 16, 506-513) und in Fig. 1 dargestellt sind. Die chemoselektive Reaktion kann grundsätzlich durch zwei Mechanismen bedingt werden. Bei einem Mecha nismus weist die zu immobilisierende Verbindung eine reaktive Gruppe auf, die mit der Ober fläche spezifisch reagiert. Dies kann dadurch bewerkstelligt werden, dass die besagte reaktive Gruppe nur einmal an der zu immobilisierenden Verbindung vorhanden ist. Bei dem zweiten Mechanismus ist die reaktive Gruppe möglicherweise mehrfach vorhanden, jedoch unter scheiden sich die Gruppen in ihrer Reaktivität, so dass lediglich das Vorliegen bestimmter Reaktionsbedingungen wie pH Wert oder dergleichen zu einer Umsetzung mit der Oberfläche führt.

Die Verwendung von immobilisierten Verbindungen wie Aminosäuresequenzen in Form von Biochips macht es erforderlich, dass sowohl die Verbindungen als auch die Verknüpfung zwi schen der Oberfläche und der immobilisierten Verbindung den jeweiligen Test- oder Untersu chungsbedingungen standhalten. Weiterhin besteht in der Technik zunehmend das Bedürfnis nach einer Quantifizierung der Wechselwirkung zwischen der immobilisierten Verbindung und einem Agens, das in einer Probe enthalten ist, die mittels der immobilisierten Verbindung untersucht und gegebenenfalls quantifiziert werden soll. Dies wiederum setzt voraus, dass die tatsächliche Beladungsdichte der Oberfläche mit der immobilisierten Verbindung bekannt ist bzw. zerstörungsfrei bestimmt werden kann.

Der vorliegenden Erfindung lag somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Immobilsie rung von Verbindungen bereitzustellen, das den vorstehend beschriebenen Bedürfnissen ge recht wird.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Immobilisierung von Ver bindungen auf einer Oberfläche umfassend die Schritte

- Bereitstellen einer zu immobilisierenden Verbindung als ersten Reaktionspart ner und einer Oberfläche als zweiten Reaktionspartner, wobei der erste Reaktionspartner eine erste reaktive Gruppe und der zweite Reaktionspartner eine erste reaktive Gruppe umfasst, und
- Umsetzen der beiden Reaktionspartner

dadurch gekennzeichnet, dass beim Umsetzen der beiden Reaktionspartner ein hetero cyclisches Ringsystem ausgebildet wird.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass das heterocyclische Ringsystem zwischen dem ersten und dem zweiten Reaktionspartner ausgebildet wird.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass das heterocyclische Ringsystem aus Teilen der ersten reaktiven Gruppe des ersten Reaktionspartners und der ersten reaktiven Gruppe des zweiten Reaktionspartners gebildet wird.

Grundsätzlich besteht bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Möglichkeit, dass das hete rocyclische Ringsystem ohne Verlust von Atomen (Addition) oder unter Austritt von mindes tens einem Molekül (Kondensation und/oder Substitution) entsteht.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass das heterocyclische Ringsystem aus 3-12 A tomen besteht, wobei 1-7 Atome entweder Stickstoff, Schwefel oder Sauerstoff sind. Weiter bevorzugt ist, dass das aus 3 bis 12 Atomen bestehende heterocyclische Ringsystem aus 1 bis 7 Heteroatomen besteht, wobei die Heteroatome ausgewählt sind aus der Gruppe, die Stick stoff, Schwefel und Sauerstoff umfasst.

In einer noch weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass das heterocyclische Ringsystem ausgewählt ist aus der Gruppe, die Thiazole, Aminothiazole, Imidazole, Benzimidazole, Indo le, Tetrahydroisoquinoline, Tetrahydro-β-carboline, Dihydroquinazolin, Oxidationsprodukte aus ortho-Amino-Benzoesäurederivate und Pyrazole umfasst.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass das heterocyclische Ringsystem eine der fol genden Strukturelemente 1, 2, 3, 4 oder 5, bevorzugterweise 2, 3, 4, oder 5, umfasst:

wobei die Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt sind und worin
X O, S oder NH, bevorzugterweise NH ist;
A ein Ringsystem aus 4 bis 8 Atomen ist, bevorzugterweise Aryl ist;
Y S oder O, bevorzugterweise O ist;
R¹-R³ Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Aryl, Heteroatome, Heterocyclen oder Biomolekül
R⁴-R⁹ Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Aryl, Heteroatome, Heterocyclen, Biomo lekül oder H, D, T ist

Hierin sollen, sofern nichts gegenteiliges angegeben ist, die folgenden Begrifflichkeiten be deuten:
Alkyl: verzweigte und unverzweigte C_1-20-Alkyl, C_3-20-Cycloalkyl,
bevorzugterweise: verzweigte und unverzweigte C_1-12-Alkyl, C_3-12-Cycloalkyl,
und bevorzugtererweise: verzweigte und unverzweigte C_1-6-Alkyl, C_3-6-Cycloalkyl;
Alkenyl: verzweigte und unverzweigte C_2-20-Alkenyl, verzweigte und unverzweigte C_1-20-Alkyl-O-C_2-20-alkenyl, C_1-20(-O/S-C_2-20)_2-20alkenyl, Aryl-C_2-20-alkenyl, verzweigte und unverzweigte Heterocyclyl-C_2-20-alkenyl, C_3-20-Cycloalkenyl,
bevorzugterweise: verzweigte und unverzweigte C_2-12-Alkenyl, verzweigte und unver zweigte C_1-12(-O/S-C_2-12)_2-12alkenyl, und
bevorzugtererweise: verzweigte und unverzweigte C_2-6-Alkenyl, verzweigte und unver zweigte C_1-6(-O/S-C_2-8)_2-8alkenyl;
Alkinyl: verzweigte und unverzweigte C_2-20-Alkinyl, verzweigte und unverzweigte C_1-20 (-O/S-C_2-20)_2-20alkinyl,
bevorzugterweise: verzweigte und unverzweigte C_2-12-Alkinyl, verzweigte und unver zweigte C_1-12(-O/S-C_2-12)_2-12alkinyl, und
bevorzugtererweise: verzweigte und unverzweigte C_2-6-Alkinyl, verzweigte und unver zweigte C_1-6(-O/S-C_2-8)_2-8alkinyl;
Cycloalkyl: überbrückte und nicht-überbrückte C_3-40-Cycloalkyl,
bevorzugterweise: überbrückte und nicht-überbrückte C_3-26-Cycloalkyl, und bevorzugtererweise: überbrückte und nicht-überbrückte C_3-15-Cycloalkyl;
Aryl: substituierte und unsubstituierte mono- oder multi-verknüpfte Phenyl-, Pentalen-, Azulen-, Anthracenyl-, Indacen-, Acenaphtylen, Fluoren, Phenalen, Phenanthren,
Bevorzugt: substituierte und unsubstituierte mono- oder multi-verknüpfte Phenyl-, Pen talen-, Azulen-, Anthracenyl-, Inden-, Indacen-, Acenaphtylen-, Fluorensysteme;
bevorzugterweise: substituierte und unsubstituierte mono- oder multi-verknüpfte Phe nyl-, Pentalen-, Anthracenylsysteme sowie deren teilhydrierte Derivate;
Heteroatome: N, S, O, Se, P, B,
bevorzugterweise: N, S, O, Se, und
bevorzugtererweise: N, S, O;
Heterocyclen: ungesättigte und gesättigte 3-15-gliedrige mono-, bi- und tricyclische Ringe mit 1-7 Heteroatomen,
bevorzugterweise: 3-10-gliedrige mono-, bi- und tricyclische Ringe mit 1-5 Heteroato men, und
bevorzugtererweise: 5-, 6- und 10-gliedrige mono-, bi- und tricyclische Ringe mit 1-3 Heteroatomen;
Biomolekül: Nukleinsäuren, Gene, chromosomale Nukleinsäuren, cDNA, Oligonukleo tide, Polynukleotide, Primer, Sonden, PNA, Peptide, Polypeptide, Proteindomänen, Pro teine, Zucker, Polyzucker, Lipide, Polylipide, Naturstoffe bzw. Kombinationen aus zwei oder mehreren dieser Verbindungen.
Zusätzlich können zu die vorstehend genannten Gruppen oder Moleküle, d. h. Alkyl, Al kenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Aryl, Heteroatome, Heterocyclen, Biomolekül oder Natur stoff Substituenten aufweisen, genauer 0 bis 30, bevorzugterweise 0 bis 10 und bevor zugtererweise 0 bis 5 der folgenden Substituent, wobei diese entweder einzeln oder in beliebiger Kombination auftreten können: Fluor, Chlor, Brom, Iod, Hydroxyl, Amid, Ester, Säure, Amin, Acetal, Ketal, Thiol, Ether, Phosphat, Sulfat, Sulfoxyd, Peroxyd, Sulfonsäure, Thioether, Nitril, Harnstoffe und Carbamat.
Bevorzugte Substituenten sind: Fluor, Chlor, Brom, Hydroxyl, Amid, Ester, Säure, A min. Ether, Phosphat, Sulfat, Sulfoxyd, Thioether, Nitril, Harnstoffe, Carbamat.
Besonders bevorzugte Substituenten sind: Chlor, Hydroxyl, Amid, Ester, Säure, Ether, Nitril.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass die reaktive Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe, die Thioamine, Thiocarbonyle, Thioharnstoffe, Hydroxylamino, alpha- Isothiocyanatoketone, Anthranilsäureamide, Aniline, Aldehyde, Ketone, 1,2-Diketone, Ami ne, Aminooxyderivate, Arylhydrazine, Arylamine, Heteroarylamine, ortho-Amino- Benzoesäure, Hydrazine, 2-Cyan-Aldehyde, Imine und Säurehalogenide umfasst.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass die erste reaktive Gruppe der zu immobilisie renden Verbindung eine reaktive Gruppe ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die Thioamid, Anilin, Thioharnstoff, Thiocarbonyl, Anthranilsäure, Anthranilsäureamid und Hydroxylamino enthält.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass die erste reaktive Gruppe der Ober fläche eine reaktive Gruppe ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die Carbonyl, Keto und Aldehyd umfasst.

In einer noch weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Umsetzen eine chemoselek tive Reaktion ist.

Schließlich ist in einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Immobilisierung eine ge richtete Immobilisierung ist.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass der entstehende heterocyclische Ring sich in seinem Absorptions-/Emmisionsverhalten von den Edukten unterscheidet.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass die zu immobilisierende Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, die Nukleinsäuren, Gene, chromosomale Nukleinsäuren, cDNA, Oligonukleotide, Polynukleotide, Primer, Sonden, PNA, Peptide, Polypeptide, Prote indomänen, Proteine, Zucker, Polyzucker, Lipide, Polylipide, Naturstoffe und niedermoleku lare Verbindungen umfasst.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Oberfläche eine planare Ober fläche ist.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass es sich bei der planaren Oberfläche um einen Chip handelt.

In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Oberfläche ein Materi al umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die Silikate, Keramik, Glas, Metalle, organi sche Trägermaterialien, Cellulose, Nitrocellulose, PTFE-Membranen, Polypropylen, Gold, Titandioxid und Siliziumoxid umfasst.

In einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die planare Ober fläche eine nicht-poröse Oberfläche ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Umsetzung der zu immobili sierenden Verbindung mit der Oberfläche unter Mirkowellenbestrahlung erfolgt.

In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung einer Anordnung umfassend mindestens zwei verschiedene Verbindungen an mindestens zwei verschiedenen Stellen einer planaren Oberfläche, wobei die erste Verbin dung an einer ersten Stelle der planaren Oberfläche und die zweite Verbindnung an einer zweiten Stelle der planaren Oberfläche nach einem der erfindungsgemäßen Verfahren immo bilisiert wird.

In einem noch weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch eine planare Oberfläche her stellbar nach einem der erfindungsgemäßen Verfahren.

Schließlich wird die Aufgabe in einem weiteren Aspekt durch eine planare Oberfläche umfas send eine daran kovalent immobilisierte Verbindung, wobei zwischen der immobilisierten Verbindung und der Oberfläche ein heterocyclisches Ringsystem angeordnet ist, das erst durch den Immobilisierungsvorgang ausgebildet wird.

In einer Ausführungsform der planaren Oberfläche ist vorgesehen, dass das heterocyclische Ringsystem aus 3-12 Atome besteht, wobei 1-7 Atome entweder Stickstoff, Schwefel oder Sauerstoff sind.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass die heterocyclischen Ringsysteme ausgewählt sind aus der Gruppe, die Thiazole, Aminothiazole, Imidazole, Benzimidazole, Indole, Tetrahydroisoquinoline, Tetrahydro-β-carboline, Dihydroquinazolin, Oxidationspro dukte aus ortho-Amino-Benzoesäurederive und Pyrazole umfassen.

In einer noch weiteren Ausführungsform ist vorgesehen das heterocyclische Ringsystem eines der folgenden Strukturelemente 1, 2, 3, 4, oder 5 umfasst:

wobei die Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt sind und worin
X O, S oder NH, bevorzugterweise NH ist;
A ein fusioniertes Ringsystem aus 4 bis 8 Atomen ist, bevorzugterweise Aryl ist;
Y S oder O, bevorzugterweise O ist;
R^1-R³ Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Aryl, Heteroatome, Heterocyclen oder Biomolekül;
R⁴-R⁹ Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Aryl, Heteroatome, Heterocyclen, Biomo lekül oder H, D, T ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass das heterocycylische Ringsystem das Strukturelement 2 oder 3 umfasst. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass das heterocycylische Ringsystem das Strukturelement 4 oder 5 umfasst.

In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Aufgabe gelöst durch eine durch das erfin dungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer Anordnung herstellbaren Anordnung.

In einem noch weiteren Aspekt der Erfindung wird die Aufgabe durch eine Anordnung gelöst, die eine erfindungsgemäße planare Oberfläche umfasst. In einer bevorzugten Ausführungs form handelt es sich bei der Anordnung um eine durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer Anordnung herstellbaren Anordnung.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch eine Verwendung einer erfindungs gemäßen Anordnung oder einer erfindungsgemäßen planaren Oberfläche in einem Verfahren zur Bestimmung der Substratspezifität einer enzymatischen Aktivität umfassend die folgen den Schritte:

- Bereitstellen eines Satzes von Aminosäuresequenzen auf der planaren Oberflä che eines Trägermaterials, wobei die Aminosäuresequenzen gerichtet immobilisiert sind,
- Kontaktieren und/oder Inkubieren einer enzymatischen Aktivität mit der mit dem Satz von Aminosäuresequenzen, und
- Nachweis einer Reaktion zwischen einer der immobilisierten Aminosäurese quenzen und der enzymatischen Aktivität,

wobei

- die planare Oberfläche eine erfindungsgemäße planare Oberfläche oder eine planare Oberfläche einer erfindungsgemäßen Anordnung ist, und
- bei der Umsetzung der enzymatischen Aktivität mit dem Satz von Aminosäuren eine Änderung des Molekulargewichts mindestens einer der Aminosäuresequenzen erfolgt.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Änderung des Molekulargewichts durch Ausbildung oder Spaltung einer kovalenten Bindung an einer der Aminosäuresequenzen er folgt, bevorzugterweise an derjenigen Aminosäuresequenz, die mit der enzymatischen Aktivi tät reagiert. Dabei ist besonders bevorzugt, wenn der Nachweis der Reaktion an der oder unter Verwendung der auf der Oberfläche des Trägermaterials immobilisierten Aminosäuresequenz erfolgt.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Nachweis der Reaktion durch Detektion der Änderung des Molekulargewichts erfolgt.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dadurch gekennzeichnet, dass der Nach weis durch ein Nachweisverfahren erfolgt, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die Autoradio graphie, Plasmonresonanzspektroskopie und Fluoreszenzspektroskopie umfasst.

In einer noch weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass die enzymatische Aktivität aus gewählt ist aus der Gruppe, die Kinasen, Sulfotransferasen, Glycosyltransferasen, Ace tyltransferasen, Farnesyltransferasen Palmityltransferasen, Phosphatasen, Sulfatasen, Ester asen, Lipasen, Acretylasen und Proteasen umfasst.

Unter Naturstoffen sollen, soweit hierin keine gegenteiligen Angaben gemacht werden insbe sondere eine aus tierischen oder pflanzlichen Organismen isolierbare Verbindung, bzw. das vollsynthetisch erhaltende Analoga mit einem Molekulargewicht unter 1000 kDa verstanden werden.

Der vorliegenden Erfindung liegt die überraschende Erkenntnis zugrunde, dass mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Immobilisierung von Verbindungen, insbesondere von Aminosäuresequenzen, erfolgen kann und die solchermaßen immobilisierten Aminosäurese quenzen infolge des bei der Umsetzung der zu immobilisierenden Verbindung und der Ober fläche entstehenden heterocyclischen Ringsystems besonders stabil ist hinsichtlich der Auflö sung der Immobilisierung (Säure- und Basenstabilität der Immobilisierung). Weiterhin haben die Erfinder überraschend festgestellt, dass unter Verwendung des erfindungsgemäßen Immo bilisierungsverfahrens die Immobilisierungseffizienz, die sich bei Kenntnis der Konzentration der verwendeten Ausgangskonzentrationen aus der Beladungs- oder Immobilisierungsdichte berechnen lässt, kontrolliert werden kann. Die Immobilisierungsdichte wiederum ist Voraus setzung für die Durchführung quantitativer Untersuchungen, wie eingangs geschildert.

Ohne im folgenden darauf festgelegt sein zu wollen, scheint die Bestimmung der Immobilsie rungsdichte im wesentlichen darauf zu beruhen, dass sich bei der Immobilisierung zwischen der zu immobilisierenden Verbindung und der Oberfläche, an die die Verbindung immobili siert werden soll, ein heterocyclisches Ringsystem ausbildet. Infolge der Absorptionseigen schaften des neugebildeten heterocyclischen Ringsystems kann direkt auf die an einem Ort der Oberfläche immobilisierte Menge der Verbindung gefolgert werden. Es ist im Rahmen der Kenntnisse des Fachmanns auf dem Gebiet, dass die reaktive Gruppe der zu immobilisie renden Verbindung und die reaktive Gruppe der Oberfläche, und gegebenenfalls eine weitere hinzutretende Gruppe, die von einem dritten Reaktionspartner oder einer zweiten reaktiven Gruppe der zu immobilisierenden Verbindung oder einer zweiten reaktiven Gruppe der Oberfläche stammen kann, (wobei die Gesamtheit der vorstehend genannten reaktiven Gruppen oder Teilen davon) zur Ausbildung des heterocyclischen Ringsystems führt) so derivatisiert ist, das das sich in Folge der Immobilisierung ausbildende heterocyclische Ringsystem einen Chromophor enthält bzw. darstellt, der einen spezifischen Nachweis erlaubt. Der Nachweis erfolgt typischerweise mittels UV-Vis-, Fluoreszenz- oder Infrarot-Spektroskopie

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Immobilisierungsverfahrens handelt es sich um eine gerichtete Immobilisierung. Bei der gerichteten Immobilisierung soll sichergestellt werden, dass unter den jeweiligen Reaktionsbedingungen im wesentlichen nur eine spezielle Verknüpfung zwischen der zu immobilisierenden Verbindung, bei der es sich bevorzugterweise um eine Aminosäuresequenz handelt, und der Oberfläche hergestellt wird. Im Falle der Immobilisierung von Aminosäuresequenzen hängt die Auswahl der reaktiven Gruppe auf seiten der Aminosäuresequenzen im wesentlichen von der Einzelsequenz ab.

Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass der Immobilisierung von mehreren ver schiedenen Aminosäuresequenzen eine allen Aminosäuresequenzen einheitliche terminale Struktur vorgesehen ist und diese terminale Struktur für die spezifische Reaktion mit der O berfläche, insbesondere einer aktivierten Oberfläche, zur Verfügung gestellt und bei der Im mobilisierung verwendet wird. Typischerweise werden bei den chemoselektiven Reaktionen in der Aminosäuresequenz enthaltene Amino- bzw. Carboxylgruppen nicht beeinträchtigt. Beispiele für geeignete Reaktionen sind die Bildung von Amidbindungen aus Thioestern und 1,2-Aminothiolen (Fig. 1E), die Bildung von Thioamidbindungen aus Dithioestern und 1,2- Aminothiolen, die Bildung von Oximen aus Amino-oxy-Verbindungen und Aldehyden (Fig. 1A, R⁴ = H), die Bildung von Oximen aus Amino-oxy-Verbindungen und Ketonen (Fig. 1A, R⁴ nicht H), die Bildung von Hydrazonen aus Hydrazinen und Aldehyden (Fig. 1C, R⁴ = H), die Bildung von Hydrazonen aus Hydraziden und Ketonen, (Fig. 1C, R⁴ nicht H), die Bildung von Thiosemicarbazonen aus Thiosemicarbaziden und Aldehyden (Fig. 1B, R⁴ = H), die Bildung von Thiosemicarbazonen aus Thiosemicarbaziden und Ketonen (Fig. 1B, R⁴ nicht H), die Bildung von Thioestern aus Thiocarboxylaten und alpha-Halocarbonylen (Fig. 1D) und Succinimiden aus Mercaptanen und Maleinimiden (Fig. 1F).

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind die folgenden heterocyclischen Ringsysteme und die sie aufbauenden reaktiven Gruppen besonders bevorzugt. Die reaktiven Gruppen sind erste und zweite reaktive Gruppen der beiden Reaktionspartner. Grundsätzlich ist es möglich, dass eine jede der hierin beschriebenen ersten oder zweiten reaktiven Gruppe diejenige der zu immobilisierenden Verbindung oder diejenige der Oberfläche ist. Die Auswahl, welche reak tive Gruppe an der zu immobilisierenden Verbindung vorliegt und welche an der Oberfläche vorliegt, hängt von der Art der zu immobilisierenden Verbindung bzw. der für die Immobili sierung zur Verfügung stehenden Oberfläche ab. Entscheiden bei der Auswahl der entspre chenden Gruppen ist die Fähigkeit der Ausbildung eines heterocyclischen Ringsystems. Die nachfolgenden heterocyclischen Ringsysteme sind besonders bevorzugt:
Imidazole aus 1,2-Diketonen und Aminen, Benzimidazole aus Phenylendiaminderivaten und Aldehyden, Indole aus Arylhydrazinen und Aldehyden, Tetrahydroisoquinoline aus Arylami nen und Aldehyden, Tetrahydro-β-carboline und entsprechende Tetrahydroimidazopyridine aus Heteroarylaminen und Aldehyden, Dihydroquinazoline sowie deren Oxidationsprodukte aus ortho-Amino-Benzoesäurederivaten und Aldehyden, Pyrazole aus Hydrazinen und 2- Cyan-Aldeyden, Cycloaddition zweier Olefine, Cycloaddition von Olefinen und Iminen, Cyc loaddition von Iminen und Säurehalogeniden.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Immobilisie rung ist vorgesehen, dass in der zu immobilisierenden oder zu konjugierenden Verbindung eine Anilinfunktion enthalten, die so angeordnet ist, das sie einen Heterocyclus mit einem entsprechenden Reaktionspartner (Oberfläche oder anderes Biomolekül) bilden kann.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass in der zu immobilisierenden oder zu konjugierenden Verbindung eine Thioamid-Funktion enthalten ist, die so angeordnet ist, daß sie einen Heterocyclus mit einem entsprechenden Reaktionspartner (Oberfläche oder anderes Biomolekül) bilden kann.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass in der zu immobilisierenden oder zu konjugierenden Verbindung eine Thioharnstofffunktion enthalten ist, die so angeordnet ist, daß sie einen Heterocyclus mit einem entsprechenden Reaktionspartner (Oberfläche oder an deres Biomolekül) bilden kann.

Unter gerichteter Immobilisierung soll hierin unter Ergänzung dessen, was bereits eingangs hierzu ausgeführt wurde, insbesondere verstanden werden, dass im Falle der Immobilisierung einer Aminosäuresequenz jede Aminosäuresequenz über eine definierte reaktive Gruppe oder Ansammlung reaktiver Gruppen an die Oberfläche gebunden wird. Infolge dieser Bin dungsspezifität wird erreicht, dass sich im Rahmen der üblichen Entropien die einzelnen A minosäuresequenzen in einem energetisch bevorzugten Zustand befinden werden, so dass die solchermaßen immobilisierten Aminosäuresequenzen in weitgehend ähnlichen Sekundär- und Tertiärstrukturen vorliegen.

Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die Aminosäuresequenzen in situ auf der Oberfläche der Anordnung synthetisiert werden, wobei hier alle möglichen Formen denkbar sind, d. h. sequentielles Anfügen der die Aminosäuresequenz aufbauenden einzelnen Amino säuren, ebenso wie die Verwendung von Block-Synthesetechniken, bei denen Gruppierungen von Aminosäuren zusammengefügt werden und dann die einzelnen Blöcke sequentiell anei nandergereiht werden und die Blöcke oder Aneinanderreihungen davon sodann immobilisiert werden bzw. an bereits immobilisierte Aminosäuresequenzen angefügt werden. Entscheiden ist dabei in einem jeden Fall die Ausbildung eines heterocyclischen Ringsystems infolge der Immobilisierung.

Die Tatsache, dass verschiedene Aspekte des hierin offenbarten Immobilisierungsverfahrens anhand der Immobilisierung von Aminosäuresequenzen erläutert wurden, beschränkt den Of fenbarungsgehalt nicht, da die dabei aufgezeigten Richtlinien und Vorgehensweisen sinnge mäß auch bei allen anderen zu immobilisierenden oder immobilisierbaren Verbindungen gel ten bzw. Anwendung finden.

Das erfindungsgemäße Immobilisierungsverfahren kann auch als Konjugationsverfahren be zeichnet bzw. ausgeführt werden. Unter Konjugation soll dabei insbesondere verstanden wer den die gerichtete Verknüpfung von verschiedenen Biomolekülen, wobei sich diese Moleküle in ihrer Größe hinreichend unterscheiden, sodass eines dieser Biomoleküle als Oberfläche betrachtet werden kann und das (die) andere(n) Biomolekül(e) die auf der Oberfläche des ers ten Biomoleküls zu immobilisierende(n) Verbindung(en) darstellt/darstellen. Solche Konjuga tionsverfahren können zur regioselektiven Markierung von Biomolekülen mit meist kleinen Verbindungen, die in nachgeschalteten Experimenten als Sonden geeignet sind, dienen. Beispiele für solche Sonden sind Fluoreszenzmarkierungen, Elektronen-Spin-Resonanz- Markierungen, radioaktive Markierungen und Biotinylierungen.

Weiterhin ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die reaktive Gruppe der Ober fläche des Trägermaterials auf einer wiederum selbst immobilisiert vorliegenden Verbindung angeordnet oder enthalten ist. Diese Verbindung wird hierin auch als primär immobilisierte Verbindung bezeichnet. Bevorzugterweise ist diese primär immobilisierte Verbindung eben falls unter Ausbildung eines heterocyclischen Ringsystems an die Oberfläche eines Trägerma terials gebunden.

Die Erfindung wird im folgenden anhand der Beispiele und Figuren erläutert, aus denen sich weitere Merkmale, Ausführungsformen und Vorteile ergeben. Dabei zeigt

Fig. 1 eine Übersicht verschiedener chemoselektiver Reaktionen;

Fig. 2 eine Übersicht verschiedener erfindungsgemäßer Immobilisierungsreak tionen, die zur Ausbildung eines Thiazol-Ringes führen;

Fig. 3 eine Darstellung verschiedener Kombinationen von Thioamiden als ers ter reaktiver Gruppe der zu immobilisierenden Verbindung und erster reaktiven Gruppe der Oberfläche, die zur Ausbildung von heterocycli schen Ringsystemen führen;

Fig. 4 die Synthese und Immobilisierung eines ortho-Amino-Benzoyl-Peptids an einer Aldehyd-funktionalisierten Oberfläche unter Ausbildung eines substituierten 2,3,4a,8a-tetrahydro-1H-quinazolin-4-ons;

Fig. 5 Immobilisierung eines Biomoleküls auf einer Oberfläche, die durch ei ne ebenfalls unter Bildung eines heterocyclischen Ringsystems verlau fende primäre Immobilisierungsreaktion modifiziert wurde;

Fig. 6 das Resultat der Inkubation einer modifizierten Glasoberfläche mit ei ner Kinase; und

Fig. 7 das Resultat der Inkubation einer modifizierten Glasoberfläche mit ei ner Kinase.

Im folgenden werden die einzelnen Figuren näher erläutert.

Fig. 1 zeigt eine Übersicht verschiedener chemoselektiver Reaktionen nach dem Stand der Technik: A) Aldehyde (R⁴ = H) oder Ketone (R⁴ nicht H) und Amino-oxy-Verbindungen rea gieren zu Oximen, B) Aldehyde (R⁴ = H) oder Ketone (R⁴ nicht H) und Thiosemicarbazide reagieren zu Thiosemicarbazonen, C) Aldehyde (R⁴ = H) oder Ketone (R⁴ nicht H) und Hydra zide reagieren zu Hydrazonen D) Thiocarboxylate und -Halocarbonyle reagieren zu Thi oestern, E) Thioester und β-Aminothiole reagieren zu β-Mercaptoamiden, F) Mercaptane und Maleinimide reagieren zu Succinimiden.

Fig. 2 zeigt eine Übersicht verschiedener erfindungsgemäßer Immobilisierungsreaktionen, die zur Ausbildung eines Thiazol-Ringes führen. In Fig. 2A wird ausgegangen von einem alpha-Keton (IX), das an der Festphase zu einem alpha-Bromketon (IV) bromiert wird. Ein entweder geschütztes oder ungeschütztes Peptid bzw. Biomolekül, das entweder C-terminal oder N-terminal oder aber an einer definierten Position innerhalb des Biomoleküls eine Thio amidfunktion (Va) trägt, unter Ausbildung eines Thiazols (VI) immobilisert. In Fig. 2B wird die Immobilsierung eines Thioharnstoff-Derivates (Vb) eines entweder geschützt oder unge schützt vorliegenden Peptids bzw. Biomoleküls mit einem an der Festphase immobilisiert vorliegenden alpha-Bromketon (IV) unter Ausbildung eines Aminothiazols (VIII) dargestellt. In Fig. 2C wird schließlich, ausgehend von einem alpha-Bromketon (IV), die Immobilisierung eines Amino-oxy-Peptids bzw. Biomoleküls beschrieben. Diese Immobilisierung stellt ein Beispiel für die chemoselektive Immobilisierung dar, bei der durch Anlegen spezifischer Re aktionsbedingungen, hier pH 5, eine chemoselektive Reaktion erst ermöglicht wird. Das al pha-Bromketon wird wie in der in Beispiel 9 beschriebenen ersten Alternative zu einem al pha-Isothiocyanatoketon (X) umgesetzt und dieses mit dem Amino-oxypeptid bzw. Biomole kül (XI) unter intermediärer Ausbildung eines Thioharnstoffs zu einem Hydroxylaminothiazol (XII) umgesetzt. Die Reste R⁴ und R⁵ stellen dabei Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Cycloalkyl- oder Aryl-Reste, bzw. Heterocyclen oder Oberflächen oder H, D, bzw. T dar, wobei Alkyl für verzweigte und unverzweigte C_1-20-Alkyl, C_3-20-Cycloalkyl, bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C_1-12-Alkyl, C_3-12-Cycloalkyl und besonders bevorzugt für verzweigte und un verzweigte C_1-6-Alkyl, C_3-6-Cycloalkyl-Reste steht. Alkenyl steht für verzweigte und unver zweigte C_2-20-Alkenyl, verzweigte und unverzweigte C_1-20-Alkyl-O-C_2-20-alkenyl, C_1-20(-O/S- C_2-20)_2-20alkenyl, Aryl-C_2-20-alkenyl, verzweigte und unverzweigte Heterocyclyl-C_2-20- alkenyl, C_3-20-Cycloalkenyl, bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C_2-12-Alkenyl, ver zweigte und unverzweigte C_1-12(-O/S-C_2-12)_2-12alkenyl, besonders bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C_2-6-Alkenyl, verzweigte und unverzweigte C_1-6(-O/S-C_2-8)_2-8alkenyl- Reste; Alkinyl steht für verzweigte und unverzweigte C_2-20-Alkinyl, verzweigte und unver zweigte C_1-20(-O/S-C_2-20)_2-20alkinyl, bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C_2-12- Alkinyl, verzweigte und unverzweigte C_1-12(-O/S-C_2-12)_2-12alkinyl, besonders bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C_2-6-Alkinyl, verzweigte und unverzweigte C_1-6(-O/S-C_2-8)_2- ₈alkinyl-Reste; Cycloalkyl steht für überbrückte und nicht-überbrückte C_3-40-CYcloalkyl, be vorzugt für überbrückte und nicht-überbrückte C_3-26-Cycloalkyl, besonders bevorzugt für ü berbrückte und nicht-überbrückte C_3-15-Cycloalkyl-Reste, Aryl steht für substituierte und un substituierte mono- oder multi-verknüpfte Phenyl-, Pentalenyl-, Azulenyl-, Anthracenyl-, In dacenyl-, Acenaphtyl, Fluorenyl, Phenalenyl, Phenanthrenyl, bevorzugt für substituierte und unsubstituierte mono- oder multi-verknüpfte Phenyl-, Pentalenyl-, Azulenyl-, Anthracenyl-, Indenyl-, Indacenyl-, Acenaphtyl-, Fluorenyl, besonders bevorzugt für substituierte und un substituierte mono- oder multi-verknüpfte Phenyl-, Pentalenyl-, Anthracenyl-Reste, sowie deren teilhydrierte Derivate. Heterocyclen können sein ungesättigte und gesättigte 3-15- gliedrige mono-bi und tricyclische Ringe mit 1-7 Heteroatomen, bevorzugt 3-10-gliedrige mono-bi und tricyclische Ringe mit 1-5 Heteroatomen und besonders bevorzugt: 5, 6 und 10- gliedrige mono-bi und tricyclische Ringe mit 1-3 Heteroatomen.

Zusätzlich können am Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Aryl, Heteroatome, Heterocyclen, Biomolekül oder Naturstoff 0 bis 30 (bervorzugt 0 bis 10, besonders bevorzugt 0 bis 5) der folgende Substituenten einzeln oder in Kombination untereinander auftreten; Fluor, Chlor, Brom, Iod, Hydroxyl, Amid, Ester, Säure, Amin, Acetal, Ketal, Thiol, Ether, Phosphat, Sulfat, Sulfoxyd, Peroxyd, Sulfonsäure, Thioether, Nitril, Harnstoffe, Carbamat, wobei folgende be vorzugt sind: Fluor, Chlor, Brom, Hydroxyl, Amid, Ester, Säure, Amin, Ether, Phosphat, Sul fat, Sulfoxyd, Thioether, Nitril, Harnstoffe, Carbamat, und besonders bevorzugt: Chlor, Hy droxyl, Amid, Ester, Säure, Ether, Nitril.

Fig. 3 zeigt eine Darstellung verschiedener Kombinationen von Thioamiden als erster reakti ver Gruppe in der zu immobilisierenden Verbindung und verschiedener erster reaktiver Grup pen der Oberfläche, die zur Immobilisierung von Biomolekülen unter Ausbildung von hetero cyclischen Ringsystemen führen. Dabei wird beispielhaft als die zu immobilisierende Verbindung ein Biomolekül, insbesondere ein Peptid, verwendet. Gemäß Fig. 3A kommt es unter Verwendung einer Thioamid-Funktion des Peptids (XVII) zusammen mit einer 1,2- Aminothiol-Funktion der Oberfläche (X = S, XVIIIa) zur Ausbildung eines Thiazolins (XIXa) bzw. zusammen mit einer 1,2-Aminoalkohol-Funktion der Oberfläche (X = O, XVIIIb) zur Ausbildung eines Oxazolins (XIXb) bzw. zusammen mit einer 1,2-Diamino-Funktion der Oberfläche (X = NH, XVIIIc) zur Ausbildung eines Imidazolins (XIXc). In Fig. 3B wird er sichtlich, das die Umsetzung unter Verwendung einer Thioamid-Funktion des Peptids (XX) zusammen mit einer ortho-Phenylendiamin-Funktion (XXI) auf der Oberfläche zur Ausbil dung eines Benzimidazols (XXII) führt. In Fig. 3C wird deutlich, das unter Verwendung einer Thioamid-Funktion des Peptids (XXIII) zusammen mit einer alpha-Halo-Keto-Funktion (XXIV, Y = Cl, Br, J; bevorzugt Br, Cl; besonders bevorzugt Br) auf der Oberfläche Biomole küle unter Bildung von Thiazolen (XXV) immobilisiert werden können. Schließlich wird in Fig. 3D dargestellt, das unter Verwendung einer Thioamid-Funktion des Peptids (XXVI) zu sammen mit einer Hydrazid-Funktion (XXVII) auf der Oberfläche Oxadiazole gebildet wer den können. Die Reste R⁴-R⁹ stellen dabei Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Cycloalkyl- oder Aryl- Reste, bzw. Heterocyclen oder Oberflächen oder H, D, bzw. T dar, wobei Alkyl für verzweig te und unverzweigte C_1-20-Alkyl, C_3-20-Cycloalkyl, bevorzugt für verzweigte und unverzweig te C_1-12-Alkyl, C_3-12-Cycloalkyl und besonders bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C_1- ₆-Alkyl, C_3-6-Cycloalkyl-Reste steht. Alkenyl steht für verzweigte und unverzweigte C_2-20- Alkenyl, verzweigte und unverzweigte C_1-20-Alkyl-O-C_2-20-alkenyl, C_1-20(-O/S-C_2-20)_2- ₂₀alkenyl, Aryl-C_2-20-alkenyl, verzweigte und unverzweigte Heterocyclyl-C_2-20-alkenyl, C_3-20- Cycloalkenyl, bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C_2-12-Alkenyl, verzweigte und un verzweigte C_1-12(-O/S-C_2-12)_2-12alkenyl, besonders bevorzugt für verzweigte und unverzweig te C_2-6-Alkenyl, verzweigte und unverzweigte C_1-6(-O/S-C_2-8)_2-8alkenyl-Reste; Alkinyl steht für verzweigte und unverzweigte C_2-20-Alkinyl, verzweigte und unverzweigte C_1-20(-O/S-C_2- ₂₀)_2-20alkinyl, bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C_2-12-Alkinyl, verzweigte und un verzweigte C_1-12(-O/S-C_2-12)_2-12alkinyl, besonders bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C_2-6-Alkinyl, verzweigte und unverzweigte C_1-6(-O/S-C_2-8)_2-8alkinyl-Reste; Cycloalkyl steht für überbrückte und nicht-überbrückte C_3-40-Cycloalkyl, bevorzugt für überbrückte und nicht überbrückte C_3-26-Cycloalkyl, besonders bevorzugt für überbrückte und nicht-überbrückte C_3- ₁₅-Cycloalkyl-Reste, Aryl steht für substituierte und unsubstituierte mono- oder multi verknüpfte Phenyl-, Pentalenyl-, Azulenyl-, Anthracenyl-, Indacenyl-, Acenaphtyl, Fluorenyl, Phenalenyl, Phenanthrenyl, bevorzugt für substituierte und unsubstituierte mono- oder multiverknüpfte Phenyl-, Pentalenyl-, Azulenyl-, Anthracenyl-, Indenyl-, Indacenyl-, Acenaphtyl-, Fluorenyl, besonders bevorzugt für substituierte und unsubstituierte mono- oder multi verknüpfte Phenyl-, Pentalenyl-, Anthracenyl-Reste, sowie deren teilhydrierte Derivate. Hete rocyclen können sein ungesättigte und gesättigte 3-15-gliedrige mono-bi und tricyclische Ringe mit 1-7 Heteroatomen, bevorzugt 3-10-gliedrige mono-bi und tricyclische Ringe mit 1- 5 Heteroatomen und besonders bevorzugt: 5, 6 und 10-gliedrige mono-bi und tricyclische Rin ge mit 1-3 Heteroatomen.

Fig. 4 zeigt die Immobilisierung eines Biomoleküls unter Ausbildung eines substituierten 2,3,4a,8a-tetrahydro-1H-quinazolin-4-ons (XIII). Ausgehend von einer amino-modifizierten Festphase erfolgt die Addition eines Bausteins unter Ausbildung einer kovalenten Bindung. Nach der schrittweisen Synthese des Biomoleküls an der festen Phase wird dieses durch die Zugabe von Isatosäure (XIV) unter Ausbildung eines ortho-Amino-Benzoyl-Biomoleküls (XV), das nachfolgend von der Festphase mittels Säureeinwirkung als ortho-Amino-Benzoyl- Biomolekül-Amid (XVI) abgespalten wird. Das erhaltene ortho-Amino-Benzoyl-Biomolekül- Amid (XVI) wird mit einem Glasträger in Kontakt gebracht, dessen Oberfläche eine Aldehyd- Funktion aufweist, und es kommt zur Ausbildung eines eines substituierten 2,3,4a,8a- tetrahydro-1H-quinazolin-4-ons (XIII).

Fig. 5 zeigt eine spezielle Ausführung der Immobilisierung eines Biomoleküls, bei der die Oberfläche durch eine ebenfalls unter Ausbildung eines heterocyclische Ringsystems verlau fenden Reaktion modifiziert wird. Ausgehend von einer mit einem Thioamid (Z¹ = CR⁴R⁵, XXIXa) bzw. einem Thioharnstoff (Z¹ = NR⁴, XXIXb) modifizierten Oberfläche erhält man nach Behandlung mit 1,4-Dibrom-2,3-diketobutan (XXX) immobilisierte bromacetylierte Thiazole (Z¹ = CR⁴R⁵, XXXIa) bzw. bromacetylierte Aminothiazole (Z¹ = NR⁴, XXXIb). Diese Funktionen können für eine Immobilisierungsreaktion eines mit einer Thioamid-Funktion (Z² = CR⁴R⁵, Va) bzw. Thioharnstoff-Funktion (Z² = NR⁴, Vb) versehenen Biomoleküls ver wendet werden. Je nach Kombination des derivatisierten Biomoleküls und der in einer primä ren Immobilisierungsreaktion modifizierten Oberfläche erhält man XXXIIa (Z¹ = NR⁴, Z² = NR⁴), XXXIIb (Z¹ = CR⁴R⁵, Z² = NR⁴), XXXIIc (Z¹ = CR⁴R⁵, Z² = CR⁴R⁵) bzw. XXXIId (Z¹ = NR⁴, Z¹ = CR⁴R⁵). Die Reste R⁴ und R⁵ stellen dabei Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Cycloal kyl- oder Aryl-Reste, bzw. Heterocyclen oder Oberflächen oder H, D, bzw. T dar, wobei Al kyl für verzweigte und unverzweigte C_1-20-Alkyl, C_3-20-Cycloalkyl, bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C_1-12-Alkyl, C_3-12-Cycloalkyl und besonders bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C_1-6-Alkyl, C_3-6-Cycloalkyl-Reste steht. Alkenyl steht für verzweigte und un verzweigte C_2-20-Alkenyl, verzweigte und unverzweigte C_1-20-Alkyl-O-C_2-20-alkenyl, C_1-20(- O/S-C_2-20)_2-20alkenyl, Aryl-C_2-20-alkenyl, verzweigte und unverzweigte Heterocyclyl-C_2-20- alkenyl, C_3-20-Cycloalkenyl, bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C_2-12-Alkenyl, ver zweigte und unverzweigte C_1-12(-O/S-C_2-12)_2-12alkenyl, besonders bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C_2-6-Alkenyl, verzweigte und unverzweigte C_1-6(-O/S-C_2-8)_2-8alkenyl- Reste; Alkinyl steht für verzweigte und unverzweigte C_2-20-Alkinyl, verzweigte und unver zweigte C_1-20(-O/S-C_2-20)_2-20alkinyl, bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C_2-12- Alkinyl, verzweigte und unverzweigte C_1-12(-O/S-C_2-12)_2-12alkinyl, besonders bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C_2-6-Alkinyl, verzweigte und unverzweigte C_1-6(-O/S-C_2-8)_2- ₈alkinyl-Reste; Cycloalkyl steht für überbrückte und nicht-überbrückte C_3-40-Cycloalkyl, be vorzugt für überbrückte und nicht-überbrückte C_3-26-Cycloalkyl, besonders bevorzugt für ü berbrückte und nicht-überbrückte C_3-15-Cycloalkyl-Reste, Aryl steht für substituierte und un substituierte mono- oder multi-verknüpfte Phenyl-, Pentalenyl-, Azulenyl-, Anthracenyl-, In dacenyl-, Acenaphtyl, Fluorenyl, Phenalenyl, Phenanthrenyl, bevorzugt für substituierte und unsubstituierte mono- oder multi-verknüpfte Phenyl-, Pentalenyl-, Azulenyl-, Anthracenyl-, Indenyl-, Indacenyl-, Acenaphtyl-, Fluorenyl, besonders bevorzugt für substituierte und un substituierte mono- oder multi-verknüpfte Phenyl-, Pentalenyl-, Anthracenyl-Reste, sowie deren teilhydrierte Derivate. Heterocyclen können sein ungesättigte und gesättigte 3-15- gliedrige mono-bi und tricyclische Ringe mit 1-7 Heteroatomen, bevorzugt 3-10-gliedrige mono-bi und tricyclische Ringe mit 1-5 Heteroatomen und besonders bevorzugt: 5, 6 und 10- gliedrige mono-, bi- und tricyclische Ringe mit 1-3 Heteroatomen.

Fig. 6 Eine mit Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-thioamid modifizierte Glasoberfläche (vgl. Beispiel 5 und Fig. 5, XXXIIc) (Aminosäuresequenz wurde in 200 mM Natrium- Phosphatpuffer pH 5.5 gelöst und bei RT wurde jeweils 1 nL dieser Lösung in einer Anord nung von 70 Reihen und 168 Spalten (gesamt 11760 Spots) auf die bromketo funktionalisierten Glasoberflächen (Fig. 5, XXXIa) mittels eines NanoPlotters der Firma Ge sim aufgebracht. Dabei betrug der Spot-zu-Spot-Abstand 0.3 mm. Anschließend wurden die so behandelten Glasoberflächen 2 min mit einer Mikrowelle behandelt und dann 3 Stunden bei RT inkubiert (vgl. Beispiel 12)) wurde zunächst mit 10 ml 100 µM ATP-Lösung in 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 7.5 für 10 Minuten vorinkubiert. Anschließend wurde die modifi zierte Glas-Oberfläche mit einer zweiten Glasoberfläche abgedeckt und in den entstandenen Zwischenraum Proteinkinase A (10 U/mL) zusammen mit ATP/γ³²P-ATP-Mischung (100 µM/mL; 100 µCi/mL) mittels Kapillarkraft eingebracht. Nach 30 minütiger Inkubation bei 25°C wurde die Phosphorylierung der entsprechenden Peptide mittels eines Phosphorlmages von FUJIFILM detektiert (vgl. Beispiel 13). Es wird deutlich, das einerseits die Verknüpfung des immobilisierten Kinasesubstrates von der Proteinkinase A toleriert wird und das anderer seits die Modifikation der Glasoberflächen gleichmäßig und ohne größere Schwankungen in der Immobilisierungsdichte verläuft. Weiterhin ist klar, das die Auflösung des hier verwende ten Phosphorlmages ausreichend ist, um selbst mehr als 11000 Meßpunkte pro Biochip zu analysieren.

Fig. 7 Eine mit dem Peptid thioxoCit-βAla-Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-NH₂ (Fig. 2B, Vb, R⁴ = H) modifizierte Glasoberfläche (vgl. Beispiel 11 und Fig. 2B, VIII, R⁴ = H) wurde zunächst mit 10 ml 100 µM ATP-Lösung in 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 7.5 für 10 Minuten vorinkubiert. Anschließend wurde die modifizierte Glas-Oberfläche mit einer zweiten Glasober fläche abgedeckt und in den entstandenen Zwischenraum Proteinkinase A (10 U/mL) zusam men mit ATP/γ³²P-ATP-Mischung (100 µM/mL; 100 µCi/mL) mittels Kapillarkraft einge bracht. Nach 30 minütiger Inkubation bei 25°C wurde die Phosphorylierung der entsprechen den Peptide mittels eines Phosphorlmages von FUJIFILM detektiert (vgl. Beispiel 14). Es wird deutlich, das einerseits die Verknüpfung des immobilisierten Kinasesubstrates von der Proteinkinase A toleriert wird und das andererseits die Modifikation der Glasoberflächen gleichmäßig und ohne größere Schwankungen in der Immobilisierungsdichte verläuft. Wei terhin ist klar, das die Auflösung des hier verwendeten Phosphorlmages ausreichend ist, um mehr als 950 Meßpunkte pro Biochip zu analysieren.

Die nachfolgenden Beispiele betreffen die Funktionalisierung von Glas, dessen Oberfläche als Oberfläche für eine Immobilisierung erforderlich ist (Beispiele 1 bis 9), die Immobilisierung von verschiedenen mit einer reaktiven Gruppe versehenen Peptide an eine Oberfläche (Bei spiele 10 bis 12) und die Analyse von Kinase vermittelter Peptidmodifikation unter Verwen dung der erfindungsgemäß immobilisierten Peptide. Dabei wurden die nachfolgend aufgelis teten Abkürzungen verwendet:
Ala = L-Alanin
Arg = L-Arginin
ATP = Adenosin-5'-triphosphat
Ala = Alanin, 3-Aminopropionsäure
Boc = tertiär-Butoxycarbonyl
cDNA = complementary DNA
Cit = L-Citrullin
DCM = Dichlormethan
DIC = N,N'-Diisopropylcarbodiimid
DMF = N,N'-Dimethylformamid
DNA = deoxyribonucleic acid
DTT = 1,4-dithio-DL-threitol
EGTA = Ethylenglycol-bis-(2-aminoethyl)-N,N,N',N'-tetraessigsäure
Fmoc = 9-Fluorenylmethoxycarbonyl
Gly = Glycin
HBTU = O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat
HPLC = high-performance liquid chromatography
L = Liter
Leu = L-Leucin
M = molar
MBHA = Methylbenzhydrylamin
MBP = myelin basic protein
MeOH = Methanol
mL = Milliliter
mM = millimolar
mRNA = messenger RNA
Pbf = 2,2,4,6,7-Pentamethyl-dihydrobenzofuran-5-sulfonyl
PNA = peptide nucleic acid
PTFE = Polytetrafluorethylen
RNA = ribonucleic acid
RP = reversed-phase
RT = Raumtemperatur
SDS = Natriumlaurylsulfat
Ser = L-Serin
tBu = tertiär-Butyl
TFA = Trifluoressigsäure
THF = Tetrahydrofuran
Tris = 2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol
Tween20 = Polyoxyethylen-Sorbitant-Monolaurat (Wz. der Fa. Atlas Chemie)

Dabei wurden die folgenden Reagenzien und Lösungsmittel benutzt:
Brom, tert.-Butyl-Methyl-Ether, 1,3-Diisopropylcarbodiimid, N,N-Diisopropylethylamin Eis essig, Glycerol, Harnstoff, 40%ige Hydroxylaminlösung, Piperidin, Triethylamin, Dichlor methan, Diethylether, N,N-Dimethylformamid, Ethanol, Methanol, und Tetrahydrofuran stammen von Merck Eurolab (Darmstadt, Deutschland). Oxalylchlorid, Natriumthiocyanat, Trifluoressigsäure, Dimethylsulfoxid, Thioacetamid, Lawessons Reagenz, Ameisensäure, und Thioharnstoff wurden von Fluka (Deisenhofen, Deutschland) bezogen. Adenosin-5'- triphosphat, 2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol-hydrochlorid, Natriumchlorid, Mag nesiumchlorid, 1,4-dithio-DL-threitol, Natriumlaurylsulfat, Polyoxyethylen-Sorbitant- Monolaurat, und Ethylenglycol-bis-(2-aminoethyl)-N,N,N',N'-tetraessigsäure stammen von Sigma (Taufkirchen, Deutschland). Das Rink-Amid-MBHA-Harz, (Benzotriazol-1-yl)- N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat, sowie alle Fmoc-Aminosäure- pentafluorphenylester wurde bei der Firma Novablochem (Bad Soden, Deutschland) bezogen. Zur SPOT-Synthese wurden Zellulose Membranen "Whatman 50" (Whatman Maidstone, UK) verwendet.

Chromatographie und physikalische Daten

RP-18-HPLC-MS-Analysen wurden durch Chromatographie unter Verwendung eines Hew lett Packard Serie 1100-Systems (Entgaser G1322A, Quaternäre Pumpe G1311A, Automati scher Probengeber G1313A, Thermostatisiertes Säulenfach G 1316A, Variabler UV-Detektor G1314A) und gekoppelter ESI-MS (Finnigan LCQ Ion-Trap-Massenspektrometer) durchge führt. Die Trennung erfolgte an RP-18-Säulenmaterial (Vydac 218 TP5215, 2.1 × 150 mm, 5 µm, C18, 300 A mit Vorsäule) bei 30°C und einem Fluß von 0.3 mL/min unter Anwendung eines linearen Gradienten für alle Chromatogramme (5-95% B innerhalb von 25 min, wobei A: 0.05% TFA in Wasser und B: 0.05% TFA in CH₃CN). Die UV-Detektion erfolgte bei = 220 nm.

Präparative HPLC wurde mit einem System der Firma Merck/Hitachi (Quaternäre Pumpe L- 6250, Variabler UV-Detektor L-/400, Interface D-7000, Software: HPLC Systemmanager D- 7000 für NT 4.0) unter Verwendung einer Säule der Firma Merck Eurolab (LiChrospher 100, RP18, 10 × 250 mm) bei einem Lösungsmittelfluß von 6.0 mL/min durchgeführt. Das verwen dete Lösungsmittelsystem setzte sich aus den Komponenten A (H₂O/0.1 Vol-% TFA) und B (CH₃CN/0.1 Vol-% TFA) zusammen.

Geräte zur Herstellung der löslichen Peptide

Die zur Immobilisierung verwendeten Peptide wurden als C-terminale Peptidamide mit Hilfe eines parallelen Syntheseautomaten "Syro" (MultiSynTech, Witten, Deutschland) nach dem Standard Fmoc-Protokoll an Rink-Amid-MBHA-Harz synthetisiert. Alle erhaltenen Peptide wurden, nach Spaltung vom Harz und Abspaltung aller Schutzgruppen, mittels HPLC-MS analysiert und zeigten die gewünschten Molekülionensignale. Nach anschließender HPLC- Reinigung wurden die Peptide lyophilisiert und bei -20°C gelagert.

Die zur Imobilisierung verwendeten Peptide (13mere Peptide der Proteine MBP, Casein, Histon H1) wurden nach der Standard-SPOT-Synthesemethode automatisch mit dem Gerät Autospot AMS 222 (Abimed, Langenfeld, Deutschland) unter Anwendung der Steuersoftware Autospot XL Ver. 2.02 durchgeführt. Die Waschschritte erfogten in Edelstahlschalen (Merck Eurolab), die auf einem Wipptisch bewegt wurden.

Beispiel 1 Aldehyd-Funktionalisierung aminopropylsilylierter Glasoberflächen

4-Carboxybenzaldehyd (Fluka, 21873) wurde 0.3 M in DMF gelöst. Die resultierende Mi schung wurde durch die Zugabe von einem halben Äquivalent DIC 15 min bei RT aktiviert. Mit Druckluft gereinigte aminopropylsilylierte Glasoberflächen (2.5 × 7.5 cm; Sigma, Silane- Prep™, S4651) wurden mit der so erhaltenen aktivierten Carboxybenzaldehyd-Lösung über schichtet und drei Stunden bei RT inkubiert. Anschließend wurden die so behandelten Glas oberflächen fünfmal mit jeweils 30 mL DMF je 3 Minuten bei RT gewaschen. Nach dreima ligem Waschen je drei Minuten mit jeweils 30 mL DCM bei RT wurden die Glasoberflächen getrocknet und bis zur weiteren Verwendung bei 4°C gelagert.

Beispiel 2 Keton-Funktionalisierung aminopropylsilylierter Glasoberflächen

Lävulinsäure (Fluka, 61380) wurde 0.3 M in DMF gelöst. Die resultierende Mischung wurde durch die Zugabe von einem halben Äquivalent DIC 15 min bei RT aktiviert. Mit Druckluft gereinigte aminopropylsilylierte Glasoberflächen (2.5 × 7.5 cm; Sigma, Silane-Prep™, S4651) wurden mit der so erhaltenen Lävulinsäureanhydrid-Lösung überschichtet und drei Stunden bei RT inkubiert. Anschließend wurden die so behandelten Glasoberflächen fünfmal mit jeweils 30 mL DMF je 3 Minuten bei RT gewaschen. Nach dreimaligem Waschen je drei Minuten mit jeweils 30 mL DCM bei RT wurden die Glasoberflächen getrocknet und bis zur weiteren Verwendung bei 4°C gelagert.

Beispiel 3 Thioamid-Funktionalisierung aminopropylsilylierter Glasoberflächen (Fig. 5, XXIXa)

Bernsteinsäure-mono-thioamid wurde 0.2 M in DMF gelöst. Die resultierende Mischung wurde durch die Zugabe von einem halben Äquivalent DIC 15 min bei RT aktiviert. Mit Druckluft gereinigte aminopropylsilylierte Glasoberflächen (2.5 × 7.5 cm; Sigma, Silane- Prep™, S4651) wurden mit der so erhaltenen modifizierten Bernsteinsäureanhydrid-Lösung überschichtet und drei Stunden bei RT inkubiert. Anschließend wurden die so behandelten Glasoberflächen (Fig. 5, XXIXa) fünfmal mit jeweils 30 mL DMF je 3 Minuten bei RT gewa schen. Nach dreimaligem Waschen je drei Minuten mit jeweils 30 mL DCM bei RT wurden die Glasoberflächen getrocknet und bis zur weiteren Verwendung bei 4°C gelagert.

Beispiel 4 Bromoketon-Funktionalisierung aminopropylsilylierter Glasoberflächen

1,4-Dibrom-2,3-Diketobutan (Aldrich, D3,916-9) (Fig. 5. XXX) wurde 0.2 M in DMF 0.1% Triethylamin gelöst. Mit Druckluft gereinigte aminopropylsilylierte Glasoberflächen (2.5 × 7.5 cm; Sigma, Silane-Prep™, S4651) wurden mit Lösung überschichtet und sieben Stunden bei RT inkubiert. Anschließend wurden die so behandelten Glasoberflächen fünfmal mit je weils 30 mL DMF je 3 Minuten bei RT gewaschen. Nach dreimaligem Waschen je drei Minu ten mit jeweils 30 mL DCM bei RT wurden die Glasoberflächen getrocknet und bis zur weite ren Verwendung bei 4°C gelagert.

Beispiel 5 Bromoketon-Funktionalisierung thioamidmodifizierter Glasoberflächen (vgl. Fig. 5)

Die in diesem Beispiel gezeigten Strukturen (XXXIa) ermöglichen eine einfache und mit gu ten Ausbeuten verlaufende Oberflächenmodifikation)

Mit Bernsteinsäure-mono-thioamid umgesetzte aminopropylsilylierte Glasoberflächen (2.5 × 7.5 cm; Sigma, Silane-Prep™, S4651, vgl. Beispiel 3) wurden mit einer 0.1 M 1,4-Dibrom- 2,3-Diketobutan-Lösung (Fig. 5, XXX) in Ethanol überschichtet und drei Stunden bei RT inkubiert. Anschließend wurden die so behandelten Glasoberflächen (Fig. 5, XXXIa) fünfmal mit jeweils 30 mL Ethanol je 3 Minuten bei RT gewaschen. Nach dreimaligem Waschen je drei Minuten mit jeweils 30 mL DCM bei RT wurden die Glasoberflächen getrocknet und bis zur weiteren Verwendung bei 4°C gelagert.

Beispiel 6 Bromoketon-Funktionalisierung phenylthioharstoffmodifizierter Glasober flächen (vgl. Fig. 5)

Die in diesem Beispiel gezeigten Strukturen (XXXIb) ermöglichen eine einfache und mit gu ten Ausbeuten verlaufende Oberflächenmodifikation)

Mit 4-Carboxyphenylthioharstoff (Fig. 5, XXIXb) umgesetzte aminopropylsilylierte Glas oberflächen (2.5 × 7.5 cm; Sigma, Silane-Prep™, S4651) wurden mit einer 0.1 M 1,4- Dibrom-2,3-Diketobutan-Lösung (Fig. 5, XXX) in Ethanol überschichtet und drei Stunden bei RT inkubiert. Anschließend wurden die so behandelten Glasoberflächen (Fig. 5, XXXIb) fünfmal mit jeweils 30 mL Ethanol je 3 Minuten bei RT gewaschen. Nach dreimaligem Wa schen je drei Minuten mit jeweils 30 mL DCM bei RT wurden die Glasoberflächen getrocknet und bis zur weiteren Verwendung bei 4°C gelagert.

Beispiel 7 Brombrenztraubensäure-Funktionalisierung aminopropylsilylierter Glas oberflächen

Diese Oberflächenmodifikation zeigt, daß es möglich, auch sehr kleine Strukturen zur Um wandlung einer aminofunktionalisierten in eine bromketonfunktionalisierte Glasoberfläche zu benutzten. Dabei stellt die Brombrenztraubensäure die kleinste mögliche Verbindung dar, die sowohl die für die Amidbindungsknüpfung notwendige Carboxyl-Funktion als auch die für die nachfolgende Immobilisierung des Biomoleküls notwendige alpha-Brom-Keto-Funktion enthält.

Natriumpyruvat wurde mit Oxalylchlorid in in das entsprechende Säurechlorid überführt. Mit Druckluft gereinigte aminopropylsilylierte Glasoberflächen (2.5 × 7.5 cm; Sigma, Silane- Prep™, S4651) wurden mit der so erhaltenen Lösung überschichtet und 5 Stunden bei RT inkubiert. Anschließend wurden die so behandelten Glasoberflächen fünfmal mit jeweils 30 mL DMF je 3 Minuten bei RT gewaschen. Nach jeweils dreimaligem Waschen je drei Minu ten mit jeweils 30 mL Methanol und DCM bei RT wurden die Glasoberflächen getrocknet. Die so erhaltenen Brenztraubensäure-modifizierten Glasoberflächen wurden durch einstündi ge Behandlung mit einer Lösung von 0.1 mL Brom in 10 mL Eisessig in die Brombrenztraubensäure-modifizierten Glasoberflächen überführt. Nach jeweils dreimaligem Waschen je drei Minuten mit jeweils 30 mL Methanol und DCM bei RT wurden die Glasoberflächen getrocknet und bis zur weiteren Verwendung bei 4°C gelagert.

Beispiel 8 Bromacetophenon-Funktionalisierung aminopropylsilylierter Glasoberflä chen (vgl. Fig. 2A, IX)

4-Acetylbenzoesäure (Fluka, 00932) wurde 0.3 M in DMF gelöst. Die resultierende Mischung wurde durch die Zugabe von einem halben Äquivalent DIC 15 min bei RT aktiviert. Mit Druckluft gereinigte aminopropylsilylierte Glasoberflächen (2.5 × 7.5 cm; Sigma, Silane- Prep™, S4651) wurden mit der so erhaltenen 4-Acetylbenzoesäureanhydrid-Lösung über schichtet und 3 Stunden bei RT inkubiert. Anschließend wurden die so behandelten Glasober flächen (Fig. 2, IX) fünfmal mit jeweils 30 mL DMF je 3 Minuten bei RT gewaschen. Nach jeweils dreimaligem Waschen je drei Minuten mit jeweils 30 mL Methanol und DCM bei RT wurden die Glasoberflächen getrocknet. Die so modifizierten Glasoberflächen wurden durch einstündige Behandlung mit einer Lösung von 0.1 mL Brom in 10 mL Eisessig in die Broma cetophenon-modifizierten Glasoberflächen (Fig. 2, IV) überführt. Nach jeweils dreimaligem Waschen je drei Minuten mit jeweils 30 mL Methanol und DCM bei RT wurden die Glas oberflächen getrocknet und bis zur weiteren Verwendung bei 4°C gelagert.

Beispiel 9 Thiocyanato-acetophenon-Funktionalisierung aminopropylsilylierter Glas oberflächen (vgl. Fig. 2C)

Bromacetophenon-modifizierte (Fig. 2, IV, vgl. Beispiel 8), aminopropylsilylierte Glasober flächen (2.5 × 7.5 cm; Sigma, Silane-Prep™, S4651) wurden mit einer 0.1 M Lösung von Natrium-thiocyanat in Ethanol überschichtet und fünf Stunden bei 50°C inkubiert. Anschlie ßend wurden die so behandelten Glasoberflächen (Fig. 2, X) fünfmal mit jeweils 30 mL Etha nol je 3 Minuten bei RT gewaschen. Nach dreimaligem Waschen je drei Minuten mit jeweils 30 mL DCM bei RT wurden die Glasoberflächen getrocknet und bis zur weiteren Verwen dung bei 4°C gelagert.

Beispiel 10 Immobilisierung von Anthraniloyl-peptiden an aldehyd-funktionalisierten Glasoberflächen (vgl. Fig. 4)

a) Die zur Immobilisierung verwendeten Peptide (jeweils 13mere Peptide, die die gesamte Primärstruktur der Proteine MBP, Casein und Histon H1 repräsentieren) wurden nach Stan dard-SPOT-Synthesemethoden (R. Frank, Tetrahedron, 48, 1992, S. 9217-9232; A. Kramer und J. Schneider-Mergener, Methods in Molecular Biology, vol 87: Combinatorial Peptide Libra ry Protocols, S. 25-39, edited by: S. Cabilly; Humana Press Inc., Totowa, NJ) an Cellulose als C-terminale Peptidamide synthetisiert. Dabei wurden entsprechend geschützte Fmoc- Aminosäurepentafluorphenylester in DMF gelöst und jeweils 1 µL aufgespottet. Die Kupp lungsreaktion erfolgte doppelt jeweils 25 min bei RT. Die Abspaltung der Fmoc- Schutzgruppe erfolgte unter Verwendung von 20% Piperidin in DMF 20 min bei RT. Nach der letzten Fmoc-Abspaltung wurden die N-Termini der cellulose-gebundenen Peptide durch eine fünfstündige Inkubation mit einer gesättigten Lösung von Isatosäure in DMF bei 50°C in die entsprechenden ortho-aminobenzoylierten Derivate überführt. Die Abspaltung der perma nenten Schutzgruppen (tBu für Serin, Threonin, Tyrosin, Glutaminsäure und Asparaginsäure; Boc für Lysin; Trityl für Asparagin, Glutamin, Cystein, Histidin und Pbf für Arginin) erfolgte durch zweistündige Behandlung mit 97% Trifluoressigsäure bei RT. Anschließend wurden die cellulose-gebundenen Peptide mit DCM, MeOH und Diethylether gewaschen und im Va kuum getrocknet. Die Abspaltung der Peptide von der Cellulose erfolgte unter Verwendung von Ammoniakgas 24 Stunden bei RT. Die Spots mit den physikalisch adsorbierten Peptiden wurden ausgestanzt und in 96-well Mikrotiterplatten überführt. Nach Ablösen der Peptide mit je 200 µL 20% Methanol unter Ultraschallbedingungen wurden die Proben filtriert, in 384well Mikrotiterplatten überführt, lyophilisiert und bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert.
b) Die in Mikrotiterplatten vorliegenden ortho-Aminobenzoyl-Peptide wurden in 200 mM Natrium-Phosphatpuffer pH 6.0 gelöst (finale Konzentation der Peptide 0.5 mM), der 15 Vol% DMSO enthielt. Anschließend wurde bei RT jeweils 0.01 µL dieser Lösung auf die aldehyd-modifizierten Glasoberflächen (vgl. Beispiel 1 und Fig. 4) mittels eines NanoPlotters der Firma Gesim aufgebracht und diese vier Stunden bei RT inkubiert. Nach dreimaligem Waschen bei RT mit jeweils 100 mL destilliertem Wasser wurden die modifizierten Glasober flächen (Fig. 4, XIII) mit 30 mL einer 40%igen wässrigen Lösung Hydroxylamin 30 Minuten bei RT inkubiert, um die restlichen Aldehydfunktionen zu deaktivieren. Danach wurden die Glasoberflächen jeweils fünfmal je 3 Minuten mit je 50 mL Wasser bei RT und anschließend jeweils zweimal je 3 Minuten mit je 50 mL Methanol bei RT gewaschen. Die so behandelten Glasoberflächen wurden getrocknet und bis zur weiteren Verwendung bei 4°C gelagert.

Beispiel 11 Immobilisierung thioxocitrullinhaltiger Peptide an bromacetophenon- funktionalisierte Glasoberflächen (vgl. Fig. 2B)

a) Das zur Immobilisierung verwendete Peptid thioxoCit-βAla-Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu- Gly-NH₂ (Fig. 2B, Vb, R⁴ = H) wurde nach Standardmethoden der Fmoc-basierenden Chemie an der festen Phase als C-terminales Peptidamid synthetisiert. Dabei wurden entsprechend geschützte Fmoc-Aminosäuren mit einem Äquivalent HBTU und drei Äquivalenten Dii sopropylamin in DMF aktiviert und an Rink-Amind-MBHA-Harz in DMF gekoppelt. Die Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe erfolgte unter Verwendung von 20% Piperidin in DMF 30 min bei RT. Die Abspaltung der permanenten Schutzgruppen (tBu für Serin und Pbf für Arginin) und die gleichzeitige Ablösung vom Polymer erfolgte durch zweistündige Behand lung mit 97% Trifluoressigsäure bei RT. Die resultierende Mischung wurde filtriert und das Filtrat durch Zugabe von tert.Butyl-Methyl-Ether gefällt. Der Niederschlag wurde abgetrennt und mittels HPLC an RP18-Material mit Acetonitril/Wasser Mischungen (0.1% Trifluoressig säure) gereinigt. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen wurden lyophilisiert und bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert.
b) Das Peptid thioxoCit-βAla-Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-NH₂ (Fig. 2B, Vb, R⁴ = H) wur de in 200 mM Natrium-Phosphatpuffer pH 5.5 gelöst (finale Konzentation 1 mM) der 30 Vol% Glycerol enthielt. Anschließend wurden bei RT jeweils 1 nL dieser Lösung in einer Anordnung von 70 Reihen und 168 Spalten (gesamt 11760 Spots) auf die bromacetophenonfunktionalisierten Glasoberflächen (Fig. 2B, IV, vgl. Beispiel 8) mittels eines NanoPlotters der Firma Gesim aufgebracht. Dabei betrug der Spot-zu-Spot-Abstand 0.3 mm. Anschließend wurden die so behandelten Glasoberflächen (Fig. 2B, VIII, R⁴ = H) 3 Stunden bei RT inku biert. Nach dreimaligem Waschen bei RT mit jeweils 100 mL destilliertem Wasser wurden die modifizierten Glasoberflächen mit 30 mL einer 3%igen wässrigen Lösung von Thioace tamid 30 Minuten bei RT inkubiert, um die restlichen Bromacetophenon-funktionen zu deak tivieren. Danach wurden die Glasoberflächen jeweils fünfmal je 3 Minuten mit je 50 mL Wasser bei RT und anschließend jeweils zweimal je 3 Minuten mit je 50 mL Methanol bei RT gewaschen. Die so behandelten Glasoberflächen wurden getrocknet und bis zur weiteren Verwendung bei 4°C gelagert.

Beispiel 12 Immobilisierung thioamidhaltiger Peptide an bromketon-funktionalisierte Glasoberflächen (vgl. Fig. 5)

a) Das zur Immobilisierung verwendete Peptid Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-thioamid (Kemptide-thioamid) (Fig. 5, Va) wurde nach Standardmethoden der Fmoc-basierenden Chemie an der festen Phase als C-terminales Peptidthioxoamid synthetisiert. An Rink-Amid- MBHA-Harz gebundenes Fmoc-Gly-OH wurde 3 Stunden mit Lawessons Reagenz in THF am Rückfluß gekocht. Anschließend wurde das Harz mit THF und DCM gewaschen, 1 Stun de mit DMF geschüttelt und dann mit DMF, DCM und Methanol gewaschen. Nach Entfernen der Fmoc-Schutzgruppe mit 50% Morpholin in DMF (40 min) wurden die entsprechend ge schützten Fmoc-Aminosäuren mit einem Äquivalent HBTU und drei Äquivalenten Diisopro pylamin in DMF aktiviert gekoppelt. Die Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe erfolgte unter Verwendung von 20% Piperidin in DMF 30 min bei RT. Die Abspaltung der permanenten Schutzgruppen (tBu für Serin und Pbf für Arginin) und die gleichzeitige Ablösung vom Po lymer erfolgte durch zweistündige Behandlung mit 97% Trifluoressigsäure bei RT. Die resul tierende Mischung wurde filtriert und das Filtrat durch Zugabe von tert.Butyl-Methyl-Ether gefällt. Der Niederschlag wurde abgetrennt und mittels HPLC an RP18-Material mit Aceto nitril/Wasser Mischungen (0.1% Trifluoressigsäure) gereinigt. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen wurden lyophilisiert und bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert.
b) Das Peptid Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-thioamid (Fig. 5, Va) wurde in 200 mM Natri um-Phosphatpuffer pH 5.5 gelöst (finale Konzentation 1 mM) der 50 Vol% Glycerol enthielt. Anschließend wurden bei RT jeweils 1 nL dieser Lösung in einer Anordnung von 70 Reihen und 168 Spalten (gesamt 11760 Spots) auf die bromketon-funktionalisierten Glasoberflächen (vgl. Beispiel 5 und Fig. 5, XXXIa) mittels eines NanoPlotters der Firma Gesim aufgebracht. Dabei betrug der Spot-zu-Spot-Abstand 0.3 mm. Anschließend wurden die so behandelten Glasoberflächen 2 min mit einer Mikrowelle behandelt und dann 3 Stunden bei RT inkubiert. Nach dreimaligem Waschen bei RT mit jeweils 100 mL destilliertem Wasser wurden die mo difizierten Glasoberflächen (Fig. 5, XXXIIc) mit 30 mL einer 3%igen wässrigen Lösung von Thioacetamid 30 Minuten bei RT inkubiert, um die restlichen alpha-Bromketonfunktionen zu deaktivieren. Danach wurden die Glasoberflächen jeweils fünfmal je 3 Minuten mit je 50 mL Wasser bei RT und anschließend jeweils zweimal je 3 Minuten mit je 50 mL Methanol bei RT gewaschen. Die so behandelten Glasoberflächen wurden getrocknet und bis zur weiteren Verwendung bei 4°C gelagert.

Beispiel 13 Analyse Kinase vermittelter Peptidmodifikationen an modifizierten Glas oberflächen (Fig. 5, XXXII)

Eine mit dem Peptid Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-thioamid modifizierte Glasoberfläche (vgl. Beispiel 12 und Fig. 5, XXXIIc) wurde mit 10 ml 100 µM ATP in Kinasepuffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 30 mM MgCl₂, 4 mM DTT, 2 mM EGTA, pH 7,5) 10 Minuten bei RT inkubiert. Die Glasoberfläche wurde getrocknet und anschließend wurde auf die Peptid modifizierte Glasoberfläche eine zweite, nichtmodifizierte Glasoberfläche gleicher Abmes sungen gelegt. Dann wurden 50 µL einer Mischung aus Proteinkinase A (Sigma, P26452, 10 U/mL), 100 µM/mL ATP und 100 µCi/mL γ-³²P-ATP (Amersham, 9,25 mBq/250 µCi/25 µL, Aktivität < 5000 Ci/mmol) in Kinasepuffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 30 mM MgCl₂, 4 mM DTT, 2 mM EGTA, pH 7,5) durch Kapillarkräfte in den Spalt, der durch die auf der mo difizierten Glasoberfläche aufliegende zweite Glasoberfläche gebildet wird, aufgegeben. An schließend wurde 30 min bei RT in einer nahezu wassergesättigten Atmosphäre inkubiert. Um den durch unspezifische Bindung von ATP- bzw. Kinase-Molekülen an die Glasoberflächen verursachten Hintergrund zu verringern, wurde die modifizierte Glasoberfläche wie folgt ge waschen:

- 3mal 3 Minuten bei RT mit Waschpuffer (1% SDS und 1% Tween20 in 50 mM TRIS-Puffer, pH 7.5, 200 mM NaCl)
- 2mal 3 Minuten bei RT mit 1 M NaCl-Lösung
- 2mal 3 Minuten bei RT mit destilliertem Wasser
- 2mal 3 Minuten bei RT mit 80%iger Ameisensäure in Ethanol
- 2mal 3 Minuten bei RT mit destilliertem Wasser
- 2mal 5 Minuten bei 50°C mit einer Lösung, die 6 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff und 1% SDS enthielt
- 3mal 3 Minuten bei RT mit destilliertem Wasser
- 3mal 3 Minuten bei RT mit Methanol

Nach dem Trocknen der Glasoberfläche wurde die in den glasoberflächen-gebundenen Pepti den eingebaute Menge an radioaktivem Phosphat mittels eines PhosphorImager-Systems (FLA-3000, FUJIFILM) bestimmt (vgl. Fig. 6).

Beispiel 14 Analyse Kinase vermittelter Peptidmodifikationen an modifizierten Glas oberflächen (Fig. 2B, VIII, R⁴ = H)

Eine mit dem Peptid thioxoCit-βAla-Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-NH₂ (Fig. 2B, Vb, R⁴ = H) modifizierte Glasoberfläche (vgl. Beispiel 11 und Fig. 2B, VIII, R⁴ = H) wurde mit 10 ml 10 µM ATP in Kinasepuffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 30 mM MgCl₂, 4 mM DTT, 2 mM EGTA, pH 7,5) 10 Minuten bei RT inkubiert. Die Glasoberfläche wurde getrock net und anschließend wurde auf die Peptidmodifizierte Glasoberfläche eine zweite, nichtmo difizierte Glasoberfläche gleicher Abmessungen gelegt. Dann wurden 50 µL einer Mischung aus Proteinkinase A (Sigma, P26452, 10 U/mL), 100 µM/mL ATP und 100 µCi/mL γ-³²P-ATP (Amersham, 9,25 mBq/250 µCi/25 µL, Aktivität < 5000 Ci/mmol) in Kinasepuffer (50 mM Tris- HCl, 150 mM NaCl, 30 mM MgCl₂, 4 mM DTT, 2 mM EGTA, pH 7,5) durch Kapillarkräfte in den Spalt, der durch die auf der modifizierten Glasoberfläche aufliegende zweite Glasoberflä che gebildet wird, aufgegeben. Anschließend wurde 30 min bei RT in einer nahezu wasserge sättigten Atmosphäre inkubiert. Um den durch unspezifische Bindung von ATP- bzw. Kinase- Molekülen an die Glasoberflächen verursachten Hintergrund zu verringern, wurde die modifi zierte Glasoberfläche wie folgt gewaschen:

Nach dem Trocknen der Glasoberfläche wurde die in den glasoberflächen-gebundenen Pepti den eingebaute Menge an radioaktivem Phosphat mittels eines Phosphorlmager-Systems (FLA-3000, FUJIFILM) bestimmt (vgl. Fig. 7).

Die in der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen sow 00340 00070 552 001000280000000200012000285910022900040 0002010118698 00004 00221ie den Zeichnungen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen wesentlich sein.

Claims

1. Verfahren zur Immobilisierung von Verbindungen auf einer Oberfläche umfassend die Schritte

dadurch gekennzeichnet, dass beim Umsetzen der beiden Reaktionspartner ein hetero cyclisches Ringsystem ausgebildet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das heterocyclische Ring system zwischen dem ersten und dem zweiten Reaktionspartner ausgebildet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das heterocyclische Ringsystem aus Teilen der ersten reaktiven Gruppe des ersten Reaktionspartners und der ers ten reaktiven Gruppe des zweiten Reaktionspartners gebildet wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass das hete rocyclische Ringsystem aus der Gruppe, die Thiazole, Aminothiazole, Imidazole, Benzimida zole, Indole, Tetrahydroisoquinoline, Tetrahydro-β-carboline, Dihydroquinazolin, Oxidati onsprodukte aus ortho-Amino-Benzoesäurederive und Pyrazole.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das hete rocyclische Ringsystem folgende Strukturelemente umfasst:
wobei die Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt sind und worin
X O, S oder NH, bevorzugterweise NH ist;
A ein Ringsystem aus 4 bis 8 Atomen ist, bevorzugterweise Aryl ist;
Y S oder O, bevorzugterweise O ist;
R¹-R³ Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Aryl, Heteroatome, Heterocyclen oder Biomolekül
R⁴-R⁹ Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Aryl, Heteroatome, Heterocyclen, Biomo lekül oder H, D, T ist

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die reakti ve Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe, die Thioamine, Thiocarbonyle, Thioharnstoffe, Hydroxylamino, alpha-Isothiocyanatoketone, Anthranilsäureamide, Aniline, Aldehyde, Keto ne, 1,2-Diketone, Amine, Aminooxyderivate, Arylhydrazine, Arylamine, Heteroarylamine, ortho-Amino-Benzoesäure, Hydrazine, 2-Cyan-Aldehyde, Imine und Säurehalogenide um fasst.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die erste reaktive Gruppe der zu immobilisierenden Verbindung eine reaktive Gruppe ist, die ausge wählt ist aus der Gruppe, die Thioamid, Anilin, Thioharnstoff, Thiocarbonyl, Anthranilsäure, Anthranilsäureamid und Hydroxylamino enthält.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die erste reaktive Gruppe der Oberfläche eine reaktive Gruppe ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die Carbonyl, Keto und Aldehyd umfasst.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Um setzen eine chemoselektive Reaktion ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Im mobilisierung eine gerichtete Immobilisierung ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der ent stehende heterocyclische Ring sich in seinem Absorptions-/Emmisionsverhalten von den E dukten unterscheidet.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die zu immobilisierende Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, die Nukleinsäuren, Gene, chromosomale Nukleinsäuren, cDNA, Oligonukleotide, Polynukleotide, Primer, Sonden, PNA, Peptide, Polypeptide, Proteindomänen, Proteine, Zucker, Polyzucker, Lipide, Polylipi de, Naturstoffe und niedermolekulare Verbindungen umfasst.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die O berfläche eine planare Oberfläche ist.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der planaren Oberfläche um einen Chip handelt.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die O berfläche ein Material umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die Silikate, Keramik, Glas, Metalle, organische Trägermaterialien, Cellulose, Nitrocellulose, PTFE-Membranen, Polypropylen, Gold, Titandioxid und Siliziumoxid umfasst.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die planare Oberfläche eine nicht-poröse Oberfläche ist.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Um setzung der zu immobilisierenden Verbindung mit der Oberfläche unter Mirkowellenbestrah lung erfolgt.

18. Verfahren zur Herstellung einer Anordnung umfassend mindestens zwei verschiedene Verbindungen an mindestens zwei verschiedenen Stellen einer planaren Oberfläche, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Verbindung an einer ersten Stelle der planaren Oberfläche und die zweite Verbidnung an einer zweiten Stelle der planaren Oberfläche nach einem der Ver fahren nach einem der vorangehenden Ansprüche immobilisiert wird.

19. Planare Oberfläche herstellbar nach einem Verfahren gemäß einem der vorangehen den Ansprüche.

20. Planare Oberfläche umfassend eine daran kovalent immobilisierte Verbindung, wobei zwischen der immobilisierten Verbindung und der Oberfläche ein heterocyclisches Ringsys tem angeordnet ist, das erst durch den Immobilisierungsvorgang ausgebildet wird.

21. Planare Oberfläche nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass das heterocyclische Ringsystem ausgewählt ist aus der Gruppe, die Thiazole, Aminothiazole, Imidazole, Benzimidazole, Indole, Tetrahydroisoquinoline, Tetrahydro-β-carboline, Dihydro quinazolin, Oxidationsprodukte aus ortho-Amino-Benzoesäurederive und Pyrazole.

22. Planare Oberfläche nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass das heterocyclische Ringsystem folgende Strukturelemente umfasst:
wobei die Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt sind und worin
X O, S oder NH, bevorzugterweise NH ist;
A ein fusioniertes Ringsystem aus 4 bis 8 Atomen ist, bevorzugterweise Aryl ist;
Y S oder O, bevorzugterweise O ist;
R¹-R³ Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Aryl, Heteroatome, Heterocyclen oder Biomolekül
R⁴-R⁹ Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Aryl, Heteroatome, Heterocyclen, Biomo lekül oder H, D, T ist

23. Anordnung herstellbar nach Anspruch 18.

24. Anordnung, insbesondere nach Anspruch 23, umfassend eine planare Oberfläche nach einem der vorangehenden Ansprüche.

25. Verwendung einer Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche oder einer planaren Oberfläche nach einem der vorangehenden Ansprüche in einem Verfahren zur Be stimmung der Substratspezifität einer enzymatischen Aktivität umfassend die folgenden Schritte:

dadurch gekennzeichnet, dass

- die planare Oberfläche eine planare Oberfläche nach einem der Ansprüche 1 bis 17 oder eine planare Oberfläche einer Anordnung nach einem der Ansprüche 23 bis 24 ist, und
- bei der Umsetzung der enzymatischen Aktivität mit dem Satz von Aminosäuren eine Änderung des Molekulargewichts mindestens einer der Aminosäuresequenzen erfolgt.

26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Änderung des Mole kulargewichts durch Ausbildung oder Spaltung einer kovalenten Bindung an einer der Ami nosäuresequenzen erfolgt, bevorzugterweise an derjenigen Aminosäuresequenz, die mit der enzymatischen Aktivität reagiert.

27. Verfahren nach Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis der Reaktion durch Detektion der Änderung des Molekulargewichts erfolgt.

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis durch ein Nachweisverfahren erfolgt, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die Auto radiographie, Plasmonresonanzspektroskopie und Fluoreszenzspektroskopie umfasst.

29. Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass die en zymatische Aktivität ausgewählt ist aus der Gruppe, die Kinasen, Sulfotransferasen, Glyco syltransferasen, Acetyltransferasen, Farnesyltransferasen Palmityltransferasen, Phosphatasen, Sulfatasen, Esterasen, Lipasen, Acretylasen und Proteasen umfasst.