DE102011118031B4

DE102011118031B4 - Calicivirus bindende Peptide, dafür kodierende Nukleinsäuren, deren Verwendungen und Verfahren und Kits zur Anreicherung, Immobilisierung und zum Nachweis von Caliciviren

Info

Publication number: DE102011118031B4
Application number: DE201110118031
Authority: DE
Inventors: Claudia Kühn; Elke Boschke; Jörg Opitz; Philipp Quenzel; Gianaurelio Cuniberti; Thomas Bley
Original assignee: Technische Universitaet Dresden
Current assignee: Technische Universitaet Dresden
Priority date: 2011-06-23
Filing date: 2011-06-23
Publication date: 2013-08-01
Anticipated expiration: 2031-06-24
Also published as: DE102011118031A1

Abstract

Calicivirus bindendes Peptid enthaltend mindestens eine der folgenden Sequenzen ...

Description

Die Erfindung betrifft Peptide, die an an die Proteinhülle von Caliciviren, insbesondere von Noroviren, speziell Noroviren der Genogruppe II, binden, sowie die Verwendung dieser Peptide zur Anreicherung, Immobilisierung und zum Nachweis von Caliciviren, insbesondere Noroviren,. Die Erfindung betrifft weiterhin die Kopplung von therapeutisch wirksamen Substanzen an diese Peptide.
Die humanpathogenen Noroviren gehören zu den zur Familie der Caliciviridae. Sie besitzen ein ikosaedrisches Kapsid ohne Hüllmembran. Ihr Durchmesser beträgt rund 38 nm. Innerhalb des Kapsids befindet sich das einzelsträngige RNA-Genom.
Das Kapsid besteht aus 90 Dimeren des Hauptproteins VP1 sowie 1 oder 2 Kopien des VP2-Proteins. Ein VP1-Molekül kann unterteilt werden in die „Shell”-Domäne (S) und die „Protruding”-Domäne (P), wobei letztere wiederum aus den Subdomänen P1 und P2 besteht. Die P2-Subdomäne formt den äußersten Teil des kelchartigen Kapsids und ist die am wenigsten konservierte Region.
Die Infektion mit Noroviren ist die häufigste Ursache akuter Gastroenteritiden in den Wintermonaten [Schneider et al., Deutsches Ärzteblatt (2005) 102 (38) 1–5]. Über 95% der Ausbrüche lassen sich auf Norovirus-Stämme der Genogruppe H (Genotyp II.4) zurückführen. Die hohe Infektiosität ist insbesondere für Gemeinschaftseinrichtungen wie Krankenhäuser, Altersheime und Kreuzfahrtschiffe von Bedeutung, so dass Norovirus-Infektionen laut Infektionsschutzgesetz meldepflichtig sind.
Nur mit einem zeitnahen Nachweis eines Norovirus-Ausbruchs und daran anschließenden strengen hygienischen Maßnahmen lässt die weitere Ausbreitung von Noroviren verhindern.
Bisher standen zur Detektion von Caliciviren, insbesondere Noroviren, nur Antikörper als Moleküle mit spezifischen Bindungseigenschaften zur Verfügung. Diese können in immunologischen Nachweisverfahren (z. B. enzymgekoppeltem Immunadsorptionstest) eingesetzt werden. Weiterhin ist die molekularbiologische Detektion der viralen RNA mittels Reverser Transkriptase-Polymerasekettenreaktion als Goldstandard sowie der direkte Nachweis durch Elektronenmikroskopie möglich.
Methoden zur Detektion von Caliciviren mittels Antikörper gegen Caliciviren, insbesondere Noroviren, sind beispielsweise aus US5,785,968A , US5861241 , US6156883 , US6572862 , US7067638 und US7575753 bekannt.
Methoden zur Detektion viraler RNA sind beispielsweise aus US5559014 und US6942865 bekannt. Einzelne Norovirus bindende Peptide sind aus US 2011/0020786 A1 bekannt.
Die Gewinnung von Antikörpern ist nach dem Stand der Technik sehr arbeitsaufwändig, kostenintensiv und häufig an Tierversuche gebunden. Zudem wird von vielen Herstellern nicht gewährleistet, dass entsprechende Antikörper über einen längeren Zeitraum mit gleich bleibenden Bindungseigenschaften zur Verfügung stehen. Auf Antikörpern basierte Tests zur Detektion von Noroviren besitzen häufig eine ungenügende Sensitivität und Spezifität, falsch-positive und falsch-negative Ergebnisse sind möglich. Der Nachweis mittels RT-PCR ist sensitiver und spezifischer, allerdings deutlich kostenintensiver. Die direkte Detektion mittels Elektronenmikroskopie ist zwar möglich, aber weniger sensitiv.
Die Verfügbarkeit sensitiver und spezifischer Moleküle mit spezifischen Bindungseigenschaften zum Nachweis von Caliciviren, insbesondere Noroviren, in der klinischen Diagnostik ist daher von besonderem Interesse.
Aufgabe der Erfindung ist es, einfache, sensitive, spezifische und möglichst schnell durchführbare Verfahren zur Anreicherung, Immobilisierung, Markierung und/oder zum Nachweis von Caliciviren vorzugsweise von Noroviren, anzugeben, die nicht auf der Verwendung von Antikörpern basieren. Ferner ist es Aufgabe der Erfindung, die entsprechenden Nachweisreagenzien und Kits zur Durchführung dieser Verfahren anzugeben.
In einem ersten Aspekt der Erfindung wird die Aufgabe durch ein oder mehrere Calicivirus bindende Peptide, gemäß Anspruch 1 gelöst.
Diese Peptide enthalten mindestens eine der folgende Aminosäuresequenzen aus Tabelle 1: Tabelle 1:
Besonders bevorzugt ist ein Peptid welches eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 14 enthält.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Aufgabe durch die Verwendung eines oder mehrerer Norovirus bindenden Peptide, das mindestens eine der in Tabelle 2 genannten Aminosäuresequenzen (SEQ ID No. 1 bis 23) enthält zur Anreicherung, Immobilisierung, zum Nachweis und/oder zur Markierung von Caliciviren, insbesondere Noroviren,.
Tabelle 2:
Die erfindungsgemäßen Peptide bzw. erfindungsgemäß verwendeten Peptide binden Caliciviren, insbesondere von Noroviren, speziell Noroviren der Genogruppe II, mit hoher Affinität. Die Peptide binden an die Proteinhülle von Caliciviren, insbesondere Noroviren, und sind daher geeignet, in Anreicherungs- bzw. Nachweisverfahren für Caliciviren, insbesondere Noroviren, speziell Noroviren der Genogruppe II, eingesetzt zu werden.
Die aufwändige Herstellung und Verwendung von Antikörpern in entsprechenden Nachweisverfahren kann so auf vorteilhafte Weise vermieden werden. Die erfindungsgemäßen Peptide lassen sich zudem mit herkömmlichen Syntheseverfahren schnell, einfach, kostengünstig und in sehr hoher Reinheit in vitro herstellen. Daher kann eine gleichbleibende, chargenunabhängige Produktqualität erzielt werden, insbesondere im Hinblick auf die Reinheit und Stabilität. Die Handhabung der in Immobilisierungs- und/oder Nachweisverfahren einzusetzenden Reagenzien wird ebenfalls vereinfacht, so dass insgesamt die Immobilisierung und/oder der Nachweis von Caliciviren, insbesondere Noroviren, schneller, mit höherer Reproduzierbarkeit und mit geringerem Gesamtaufwand ermöglicht werden. Zudem ist es einfacher, Nachweis- und/oder Immobilisierungsverfahren zu miniaturisieren und zu automatisieren, in denen statt Antikörpern die erfindungsgemäßen Peptide bzw. erfindungsgemäß verwendeten Peptide als Moleküle mit spezifischen Bindungseigenschaften verwendet werden.
Besonders bevorzugt verwendet wird ein Peptid welches eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 1 und/oder 14 enthält. Diese Peptide wurden besonders häufig angereichert bzw. weisen eine hohe Affinität für Noroviren auf. Sie sind daher in besonderer Weise geeignet, an Caliciviren, insbesondere Noroviren, in Proben zu binden.
Die erfindungsgemäßen Peptide bzw. erfindungsgemäß verwendeten Peptide wiesen bevorzugt eine Länge von 12 bis 30 Aminosäureresten auf.
Die erfindungsgemäßen Peptide bzw. erfindungsgemäß verwendeten Peptide besitzen eine Affinität für Noroviren. Sie sind daher gut zur Verwendung als Sonden für Caliciviren, insbesondere Noroviren, einsetzbar. Dazu werden sie bevorzugt mit einem leicht detektierbaren Marker versehen.
Bestandteil der Erfindung ist daher auch ein erfindungsgemäßes bzw. ein erfindungsgemäß verwendetes Peptid, das einen detektierbaren Marker enthält. Durch die Kopplung an den detektierbaren Marker eignen sich die erfindungsgemäßen Peptide vorteilhaft zur spezifischen Markierung und zum spezifischen Nachweis von Caliciviren, insbesondere Caliciviren, insbesondere Noroviren.
Geeignete Marker sind dem Fachmann aus zahlreichen Anwendungen, beispielsweise aus ELISA, bekannt. Bei dem detektierbaren Marker handelt es sich beispielsweise um partikuläre Marker (z. B. Goldpartikel), Fluorochrome, Isotope, Markerproteine, wie z. B. fluoreszierende Proteine (z. B. grün fluoreszierendes Protein (GFP)), Amplifikatoren, z. B. Enzyme, die eine Reaktion katalysieren, welche ein Signal bevorzugt in Form eines sichtbaren Farbstoffpräzipitates, einer sichtbaren Farbstoffabspaltung oder Chemo- bzw. Biolumineszenz liefert. Die verschiedenen detektierbaren Marker werden mittels bekannter Verfahren an das erfindungsgemäß eingesetzte Peptid gekoppelt. Werden beispielsweise fluoreszierende Proteine oder Enzyme als Marker eingesetzt, erfolgt die Kopplung des Peptides an den Marker geeigneterweise durch Fusion der für das Peptid kodierenden DNA-Sequenz mit der DNA-Sequenz von GFP bzw. des enzymatisch aktiven Amplifikators mittels üblicher gentechnischer Verfahren. Es ist auch möglich, den detektierbaren Marker erst nach der Bindung an die Viren am Peptid anzubringen. Dazu enthält das Peptid bevorzugt einen Affinitätstag (z. B. Biotin, GST-tag oder myc-tag). Die Anbindung des detektierbaren Markers erfolgt in diesem Fall durch Vermittlung des Affinitätstags, z. B. durch das Biotin-Streptavidin bzw. Biotin-Avidin System. Nach der Bindung des Peptids an Norovirus werden bevorzugt Streptavidin und der biotinylierte detektierbare Marker (z. B. eine katalytisch wirkende Einheit) zugegeben. Streptavidin vermittelt dann die Bindung des detektierbaren Markers (z. B. eine katalytisch wirkenden Einheit) an das Peptid.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist mindestens ein erfindungsgemäßes Peptid und/oder erfindungsgemäß verwendetes Peptid an einen Träger gebunden. Bei dem Träger handelt es sich bevorzugt um eine feste Phase, insbesondere können die in bekannten Anreicherungs- bzw. Nachweisverfahren verwendeten festen Träger eingesetzt werden, z. B. Mikrotiterplatten, Biochips oder Dip-Sticks. Als feste Träger geeignet sind Metallkörper, beispielsweise Goldfolien und goldbeschichtete Träger. Ferner können Kunststoffkörper bzw. kunststoffbeschichtete Körper als feste Träger verwendet werden, beispielsweise Polystyrol- oder Polymethylmethacrylat-Träger. Daneben können auch Glasträger, Gele oder andere, zur Herstellung von Biochips geeignete Träger, verwendet werden.
Indem das erfindungsgemäß eingesetzte Peptid an einen festen Träger gebunden ist, wird es auf vorteilhaft einfache Weise möglich, Caliciviren, insbesondere Noroviren, aus Proben zu immobilisieren, zu gewinnen und/oder z. B. für die nachfolgende Detektion anzureichern. Das erfindungsgemäß eingesetzte Peptid wird durch verschiedene, dem Fachmann bekannte Verfahren an den festen Träger gebunden, beispielsweise durch Adsorption an den festen Träger. Ein mit einer Beschichtung versehener Träger bewirkt ebenfalls die Bindung des Peptids, z. B. bindet ein mit Streptavidin beschichteter Träger das Peptid nach dessen Biotinylierung. Andere mögliche Beschichtungen zum Binden eines Peptids sind solche, die Serumalbumin, Protein A und/oder Protein G umfassen. Das Peptid kann auch mit einem Nukleinsäure-Linker verbunden sein und in dieser Form an den Träger gebunden werden. Das Peptid kann weiterhin mit einem Oligonukleotid verbunden sein, das über ein an dem festen Träger gebundenes komplementäres Oligonukleotid die Bindung des Peptids an den Träger vermittelt. Besonders vorteilhaft ist die Immobilisierung der erfindungsgemäß eingesetzten Peptide an eine bewegliche feste Phase als Träger, wie z. B. bei der Biomagnetischen Separation. Hierbei werden die Peptide mittels kovalenter Bindung beispielsweise über Amino- oder Carboxylgruppen an superparamagnetische Mikro- bzw. Nanopartikel (Beads) gekoppelt. Die Beads lassen sich durch Anlegen eines äußeren Magnetfeldes leicht mit den über die erfindungsgemäß eingesetzten Peptide immobilisierten Caliciviren, insbesondere Noroviren, aus Lösungen und Aerosolen abtrennen. Zudem besitzen die Beads eine hohe verfügbare Oberfläche, so dass ein hoher Anteil des Probenvolumens in Kontakt mit dem Träger tritt. Die verwendeten Materialien sind preiswert und die Handhabung ist einfach.
Der Ausdruck „Peptid”, wie hier verwendet, steht für eine Sequenz von Aminosäuren, die über eine Peptidbindung verknüpft sind, wobei die Aminosäuren bevorzugt aus den zwanzig proteinogenen Aminosäuren ausgewählt sind und worin die Aminosäuren bevorzugt in der L-Konfiguration oder auch in der D-Konfiguration, oder im Fall von Isoleucin und Threonin auch in der D-allo-Konfiguration vorliegen können (nur Inversion eines der beiden chiralen Zentren). Umfasst sind zudem Peptide, die durch Substitutionen und/oder Modifikationen von einem oder mehreren Aminosäureresten durch chemische Gruppen verändert wurden, wobei diese chemischen Gruppen andere als die natürlichen Protein-bildenden Aminosäurereste sind, wie z. B. nicht-proteinogene α-Aminosäuren, β-Aminosäuren oder Peptide mit verändertem Rückgrat. Der Begriff „verändertes Rückgrat” bedeutet, dass mindestens eine Peptidbindung chemisch modifiziert ist, d. h. ersetzt ist durch eine unter physiologischen Bedingungen nicht spaltbare Bindung, die nicht durch Endoproteasen geschnitten werden kann. Bevorzugt ist die nicht spaltbare Bindung eine modifizierte Peptidbindung wie z. B. eine reduzierte Peptidbindung, eine alkylierte Amidbindung oder eine Thioamidbindung. Eine reduzierte Amidbindung ist eine Peptidbindung in der die Carbonylgruppe (C=O) zu einer Hydroxylgruppe (HCOH) oder einer Methylengruppe (CH₂) reduziert ist. Eine alkylierte Amidbindung ist eine entweder am Stickstoff (N-alpha) oder Kohlenstoffatom (C-alpha) alkylierte Peptidbindung. Der Alkylrest hat bevorzugt 1 bis 3 C-Atome. Ein Beispiel ist die N-Methylierung. Außerdem umfasst der Begriff verändertes Rückgrat andere Gruppen, die geeignet sind, eine kovalente Bindung sowohl mit der COOH-Gruppe des vorangegangenen Aminosäurerestes als auch der NH₂-Gruppe des folgenden Aminosäurerestes zu bilden, und die daher nicht notwendigerweise die Peptidrückgrat-Struktur aufrecht erhalten, wie z. B. Zuckeraminosäure-Dipeptid-Isostere, Azapeptide, 6-Homopolymere, gamma-Peptide, Depsipeptide (Esterbrücken im Rückgrat), Y-Lactam-Analoga, Oligo(phenylenethylen)e, vinyloge Sulfonpeptide, poly-N-substituierte Glycine oder Oligocarbamate. Modifikationen des Rückgrats sind an Positionen bevorzugt, die anfällig für enzymatischen Abbau sind, besonders im Bereich von Argininenund Lysinen. Hier wird die Peptidbindung bevorzugt durch eine für Proteasen nicht spaltbare Bindung ersetzt. Diese nicht spaltbare Bindung ist vorzugsweise aus der Gruppe der reduzierten Amidbindungen, alkylierten Amidbindungen oder Thioamidbindungen ausgewählt.
Die N-Termine und C-Termine der Peptide sind entweder frei, an weitere Moleküle gekoppelt (z. B. Träger oder Marker) oder speziell modifiziert. Beispiele für N-terminale Modifikationen sind acetylierte, formylierte und bevorzugt guanidierte N-Termini. Beispiele für C-terminale Modifikationen sind Amide oder Imide oder veresterte C-Termini.
Die Erfindung umfasst auch multimere Konstrukte, die erfindungsgemäße und/oder erfindungsgemäß verwendete Peptide enthält. Die multimeren Konstrukte können linear sein oder verzweigt (z. B. Dendrimere). In einer Ausführungsform können mehrere Peptide als multimere Konstrukte oder Anordnung hergestellt werden. So können beispielsweise optional Aminosäuren (z. B. Gly-Ser-) oder andere Linker basierend auf Aminosäuren oder anderen chemischen Verbindungen an den N- oder C-Terminus angehängt werden, um zwei oder mehr Peptide untereinander zu verknüpfen oder an einen Träger zu koppeln. Diese Anordnung kann die Form von einem oder mehreren der oben beschriebenen synthetischen Peptide gekoppelt an ein Trägerprotein annehmen. Alternativ enthält eine Anordnung mehrere Peptide. In einer weiteren Variante sind die ausgewählten Peptide sequentiell verknüpft und werden als rekombinantes Protein oder Polypeptid exprimiert. In einer Ausführungsform werden mehrere Peptide sequentiell, mit oder ohne Aminosäuren als Spacer dazwischen, verknüpft, um ein größeres rekombinantes Protein zu erhalten. Alternativ kann das rekombinante Protein an ein Trägerprotein fusioniert werden.
In einer anderen Ausführungsform enthalten die multimeren Konstrukte mindestens zwei Peptide, wobei ein Peptid über eine beliebige Aminosäure an die anderen Peptide gekoppelt wird. Eine beliebige Anzahl weiterer Peptide können an beliebige weitere Aminosäuren dieser Peptide angehängt werden. In einer weiteren Ausführungsform einer multimeren Anordnung, welches mindestens zwei Peptide enthält, ist das zweite oder sind die weiteren Peptide an ein verzweigtes Gerüst der anderen Peptide der Grundstruktur gekoppelt.
Die Erfindung umfasst ebenfalls Verfahren zur Anreicherung, Immobilisierung, zum Nachweis und/oder zur Markierung von Caliciviren, insbesondere Noroviren,. Die Durchführung dieser Verfahren erfolgt bevorzugt in festen und flüssigen Stoffsystemen zur Diagnostik und Analyse von Caliciviren, insbesondere Noroviren.
Ein Verfahren zur Anreicherung bzw. Immobilisierung von Caliciviren, insbesondere Noroviren, aus einer Probe umfasst die folgenden Schritte:

a) Bindung mindestens eines erfindungsgemäßen Peptides und/oder erfindungsgemäß verwendeten Peptides (enthaltend mindestens einer der Sequenzen gemäß SEQ ID No. 1 bis 23) an einen Träger und
b) Kontaktieren des Peptides mit der zu untersuchenden Probe, um ein Binden des Peptides an den Noroviren zu ermöglichen.

Schritte a) und b) sind in der Reihenfolge austauschbar und können auch gleichzeitig ausgeführt werden. Das Peptid wird entweder erst an den Träger gebunden (z. B. kovalent) und das trägergebundene Peptid mit der Probe kontaktiert. Alternativ wird das Peptid erst mit der Probe kontaktiert und anschließend an den Träger gebunden oder beide Schritte werden gleichzeitig ausgeführt. Für diese beiden Alternativen enthält das Peptid bevorzugt einen Affinitätstag (wie z. B. His-tag oder Myc-tag oder Biotin) der die Bindung an einen Träger (z. B. Ni- oder Co-Säule, Anti-Myc oder Steptavidin beschichtete Oberfläche) ermöglicht.
Das erfindungsgemäß eingesetzte Peptid bindet sowohl an den Träger als auch an den zu immobilisierenden Norovirus. Dadurch stellt es auf vorteilhaft einfache Weise eine stabile und spezifische Verbindung zwischen dem Träger und dem zu immobilisierenden Norovirus her. Die immobilisierten Caliciviren, insbesondere Noroviren, können anschließend einfach von der Probe abgetrennt werden, beispielsweise indem der Träger absedimentiert, abzentrifugiert oder durch Anlegen eines äußeren Magnetfeldes abgetrennt wird. Wenn der Träger ein Gefäß zur Aufnahme der Probe selbst ist, beispielsweise in Form einer Mikrotiterplatten-Vertiefung, so können die gebundenen Caliciviren, insbesondere Noroviren, durch Waschen des Gefäßes mit einer entsprechenden Waschlösung von der übrigen Probe abgetrennt und somit aufgereinigt und angereichert werden.
Die Reihenfolge, in der die Schritte a) und b) durchgeführt werden, nicht festgelegt. Es hat sich gezeigt, dass die Bindung von Peptiden an einen zu immobilisierenden Virus behindert sein kann, wenn das Peptid vor der Bindung an den Virus bereits an den festen Träger gebunden ist. In einem solchen Fall ist es vorteilhaft, den Schritt b) vor oder gleichzeitig mit dem Schritt a) durchzuführen, indem beispielsweise das Peptid und die zu untersuchende Probe durch Mischen miteinander in Kontakt gebracht werden und gleichzeitig oder anschließend der Träger mit der Mischung in Kontakt gebracht wird.
Wenn jedoch der Schritt a) vor dem Schritt b) durchgeführt wird, beispielsweise indem ein an einen Träger gebundenes Peptid wie zuvor beschrieben verwendet wird, so kann derselbe Träger mehrfach zum Immobilisieren von Caliciviren, insbesondere Noroviren, aus mehreren Proben oder zum Immobilisieren von Caliciviren, insbesondere Noroviren, aus einem Probenstrom verwendet werden. Ein solches Vorgehen kann insbesondere dann vorteilhaft sein, wenn die zu untersuchenden Proben nur geringe Konzentrationen des nachzuweisenden Norovirus besitzen oder wenn die Proben zahlreiche Begleitsubstanzen enthalten, die unspezifisch an den festen Träger binden oder auf andere Weise die Bindung der Peptide an den nachzuweisenden Norovirus stören.
Das erfindungsgemäße Anreicherungsverfahren erlaubt es, auch aus stark verdünnten Proben genügend hohe Zellzahlen von Caliciviren, insbesondere Noroviren, zu isolieren, um einen sicheren und spezifischen Nachweis von Caliciviren, insbesondere Noroviren, zu ermöglichen.
Die Peptide werden mittels dem Fachmann bekannter Verfahren bevorzugt an eine feste Phase als Träger gebunden. Als feste Phase werden bevorzugt magnetische Partikel, vorzugsweise superparamagnetische Mikro- oder Nanopartikel (Beads), verwendet. Nach Kontakt mit einer Probe immobilisieren die Peptide durch ihre spezifische Bindungsfähigkeit die in der Probe enthaltenen Caliciviren, insbesondere Noroviren, an die Trägerphase.
Bestandteil der Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren zum Nachweis von Caliciviren, insbesondere Noroviren, in einer Probe mit den Schritten

a) Kontaktierung der Probe mit mindestens einem erfindungsgemäßen Peptid und/oder erfindungsgemäß verwendeten Peptid (enthaltend mindestens einer der Sequenzen gemäß SEQ ID No. 1 bis 23),
b) Nachweisen der Bindung von Caliciviren an das Peptid.

Das Nachweisverfahren ermöglicht einen spezifischen und sensitiven Nachweis von Caliciviren, insbesondere Noroviren, auch in komplexen Proben.
In einer Variante des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens enthält das Peptid einen wie oben beschriebenen detektierbaren Marker oder Affinitätstag. Das Nachweisen der Bindung von Caliciviren an das Peptid erfolgt bevorzugt durch Nachweis des detektierbaren Markers des Peptides.
Das Verfahren zum Nachweis des detektierbaren Markers richtet sich nach dem eingesetzten Marker.
In einer bevorzugten Ausgestaltungsform des Nachweisverfahrens werden die in der Probe vorhandenen Caliciviren, insbesondere Noroviren, vor dem Nachweisen des detektierbaren Markers mittels des erfindungsgemäßen Immobilisierungs- bzw. Anreichungsverfahrens aus der Probe angereichert bzw. an einem Träger immobilisiert.
Dazu erfolgt zunächst die Immobilisierung von Caliciviren, insbesondere Noroviren, an den erfindungsgemäß eingesetzten, trägergebundenen und nicht markierten Peptiden. Nach einem Waschschritt zur Entfernung der ungebundenen Probenbestandteile (Antigene, andere Zellen) wird ein weiteres erfindungsgemäß eingesetztes nicht an einen Träger gebundenes Peptid mit einem detektierbaren Marker zugegeben, das an die nun ebenfalls an die feste Phase immobilisierten Antigene der Zielzellen bindet und diese auf die oben beschriebene Art und Weise nachweist.
Auf diese Weise kann der nachzuweisende Virus ohne großen Aufwand auch in stark verdünnten Proben oder in Proben mit den Nachweis stark störenden Begleitsubstanzen zuverlässig und mit hoher Sensitivität nachgewiesen werden.
Zweckmäßigerweise wird das Nachweisverfahren und/oder das Immobilisierungs- bzw. Anreicherungsverfahren in Form eines miniaturisierten Assays durchgeführt. Beispielsweise können verschiedene zu untersuchende Proben jeweils in eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte gegeben und dort einem für die jeweilige Vertiefung spezifisch ausgestalteten Nachweisverfahren unterzogen werden. Auf diese Weise können große Probenmengen parallel verarbeitet werden.
In einer alternativen Variante erfolgt der Nachweis der Bindung von Caliciviren ohne Marker – z. B. durch Oberflächenplasmonenresonanz-Spektroskopie, Impedanzspektroskopie (insbesondere Elektrochemische Impedanzspektroskopie) oder Wellenleiter (engl. wave guides). Derartige Techniken sind dem Fachmann bekannt, so z. B. Shiau et al. 2008, Comb Chem High Throughput Screen. 11(3): 231–7 aus, welches hierin als Referenz einbezogen wird. Bevorzugt wird dazu das Calicivirus bindende Peptid (oder die Peptide) an eine Oberfläche des Sensors immoblisiert.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung von Testkits zur spezifischen Markierung, zum Nachweis, zur Immobilisierung und zur Anreicherung von Caliciviren, insbesondere Noroviren, die neben den üblichen Bestandteilen mindestens eines oder mehrere der erfindungsgemäßen und/oder erfindungsgemäß verwendeten Peptide enthalten.
Ein bevorzugt verwendetes Kit zum Anreichern von Caliciviren, insbesondere Noroviren enthält mindestens ein erfindungsgemäßes oder erfindungsgemäß verwendetes Peptid und einen Träger.
Mit einem solchen Kit wird dem Fachmann auf einfache Weise eine Reagenzienzusammenstellung an die Hand gegeben, um die Bindung eines erfindungsgemäßen oder erfindungsgemäß verwendetes Peptids an einen festen Träger ohne großen Aufwand zu ermöglichen. Damit vereinfacht ein solches Kit die Durchführung eines erfindungsgemäßen Immobilisierungs- bzw. Anreicherungsverfahrens. Partikelförmige feste Träger wie z. B. magnetische Beads sind wegen der genannten Vorteile besonders bevorzugt.
Weitere Bestandteile des Kits zur Immobilisierung und zur Anreicherung von Caliciviren, insbesondere Noroviren, sind bevorzugt ausgewählt aus Puffer, insbesondere Waschpuffer, Blockierungsreagenzien sowie Magneten bzw. magnetische Säulen.
Ein bevorzugtes Kit zum Nachweis von Caliciviren, insbesondere Noroviren, enthält mindestens ein mit einem detektierbaren Marker gekoppeltes erfindungsgemäßes oder erfindungsgemäß verwendetes Peptid.
Weitere Bestandteile des Kits zum Nachweis von Caliciviren, insbesondere Noroviren, sind bevorzugt ausgewählt aus Puffern, insbesondere Waschpuffer, Blockierungsreagenzien sowie Virusproteine oder -peptide oder abgetötete Viruspartikel als positive Kontrollen.
Bestandteil der Erfindung sind auch Nukleinsäuren mit mindestens einem für eines der erfindungsgemäßen Peptide kodierenden Abschnitt. Vorteilhaft ermöglichen die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren es, auf einfache Weise die erfindungsgemäßen und/oder erfindungsgemäß verwendeten Peptide herzustellen, beispielsweise, indem die für die Peptide kodierenden Nukleinsäuren in geeignete Organismen (z. B. Escherichia coli) eingebracht und die Peptide so rekombinant gewonnen werden. In besonders bevorzugten Nukleinsäuren ist der für das erfindungsgemäße Peptid kodierende Abschnitt mit einer für ein Markerprotein oder Markerpeptid und/oder Affinitätstag kodierenden Nukleinsäure verbunden, so dass ein Fusionsprotein aus dem erfindungsgemäßen und/oder erfindungsgemäß verwendeten Peptid und dem Markerprotein oder Markerpeptid gebildet wird. Geeignete Markerproteine sind z. B. fluoreszierende Proteine (wie z. B. z. B. GFP) und/oder Enzyme (z. B. Luciferase, Alkalische Phosphatase). Affinitätstags sind z. B. His-tag, Strep-tag oder GST-tag.
Vorzugsweise enthalten die Nukleinsäuren mindestens eine der Sequenzen gemäß SEQ ID No. 24 bis 69, dabei bedeuten die Nukleotidsymbole nach dem fachüblichen IUPAC-Abkürzungsstandard:

R: A oder G
Y: C oder T
S: G oder C
W: A oder T
M: A oder C
H: A oder C oder T
V: A oder C oder G
N: A oder C oder G oder T

Die für die erfindungsgemäßen und/oder erfindungsgemäß verwendeten Peptide kodierenden Nukleinsäuren enthalten bevorzugt folgende Sequenzen: Tabelle 3:
Die Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO. 24 bzw. SEQ ID NO. 47 kodieren dabei für ein Peptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 1 (seq1), die Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO. 25 bzw. SEQ ID NO. 48 für ein Peptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 2 (seq2) usw.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung einer Nukleinsäure, welche mindestens eine der Sequenzen, ausgewählt aus SEQ ID No. 25, 28 bis 35, 37 bis 39, 41 bis 44, 46 und 48, 51 bis 58, 60 bis 62, 64 bis 67 und 69, enthält zur Herstellung eines Calicivirus bindenden Peptides. Die Nukleinsäuren enthalten dazu optional wie oben beschrieben zusätzliche für Markerpeptide oder -proteine oder auch für pharmazeutisch wirksame Peptide oder Proteine kodierende Sequenzen.
Beschrieben werden auch pharmazeutische Zubereitungen, welche mindestens ein Peptid enthalten, welches eine Aminosäuresequenz gemäß einer der SEQ ID No. 1 bis 23 umfasst. Bevorzugt ist das Peptid an ein pharmazeutisch wirksames Agens gebunden, das auch eingeschlossen sein kann, z. B. in Mikrokapseln oder Hydrogele.
Das pharmazeutisch wirksames Agens ist bevorzugt ausgewählt aus antiviralen Wirkstoffen und Wirkstoffen welche das Andocken (Adhäsion) (sogenannte Entry-Inhibitoren), Eindringen, Uncoating, die Reifung (Maturations-Inhibitoren) oder Integrität des Viruscapsids beinflussen. Der Begriff pharmazeutisch wirksames Agens umfasst klassische organische Moleküle aber auch Biomoleküle, insbesondere Peptide, Proteine und Nukleinsäuren.
Beschrieben wird weiterhin die Verwendung dieser an pharmazeutisch wirksame Agentien gekoppelten Peptide für therapeutische Zwecke, insbesondere zur Behandlung von Calicivirusinfektionen, speziell Norovirusinfektionen, vor allem Stämmen der Genogruppe II.
Beschrieben wird auch die Verwendung eines Peptids, welches eine Aminosäuresequenz gemäß einer der SEQ ID No. 1 bis 23 umfasst oder einer wie oben beschriebenen pharmazeutischen Zubereitung, zur Behandlung von Virusinfektionen, insbesondere zur Behandlung von Calicivirusinfektionen, speziell Norovirusinfektionen, vor allem Stämmen der Genogruppe II..
Beschrieben wird auch die Verwendung eines Peptids, welches eine Aminosäuresequenz gemäß einer der SEQ ID No. 1 bis 23 umfasst und welches bevorzugt an ein pharmazeutisch wirksames Agens gebunden ist, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Virusinfektionen, insbesondere zur Behandlung von Calicivirusinfektionen, speziell Norovirusinfektionen, vor allem Stämme der Genogruppe II.
Anhand des folgenden Ausführungsbeispiels wird die Erfindung näher erläutert, ohne diese einzuschränken.
Ausführungsbeispiel
Erfindungsgemäß konnte ein Pool von Peptiden zur bioaffinen, spezifischen Bindung an Caliciviren, insbesondere Noroviren mittels Phagendisplay-Technik ermittelt werden. Dazu wurde eine kommerziell verfügbare M13 Phagenbibliothek (Ph.D.-12 New England Biolabs) eingesetzt, die an der Oberfläche der Phagen Peptide mit einer zufälligen Sequenz und einer Länge von 12 Aminosäuren präsentiert. Die Peptide werden als Fusionsprotein zusammen mit einem kurzen Spacer (Gly-Gly-Gly-Ser – SEQ ID No. 70) am N-terminalen Ende des Hüllproteins pIII exprimiert, welches in fünf Kopien an einem Ende der Phagen vorliegt. Die Diversität der Bibliothek liegt laut Angaben des Herstellers in der Größenordnung von 10⁹ verschiedenen Peptidsequenzen. In vier Biopanningrunden wurden Norovirus-bindende Phagen angereichert Als Zielmolekül dienten Norovirus P2-Partikel (Institut für Virologie, Technische Universität Dresden). Zur Erhöhung der Spezifität kamen dabei verschiedene experimentelle Ansätze zur Durchführung der Biopanningrunden (Immobilisierung der Norovirus P2-Partikel in His SpinTrap Säulen (GE Healthcare) in Runde 1 und 3 bzw. in MaxiSorp 96-Wellplatten (Nunc) Runde 2 und 4) sowie entsprechende Subtraktionsrunden (gegen die Immobilisierungsoberflächen, das Blockierungsreagens, den Histidin-Tag und den diagnostischen Hintergrund humane Stuhlprobe) zum Einsatz. Nach der vierten Runde wurden spezifisch bindende Phagen-Klone isoliert und deren DNA isoliert, mittels PCR vervielfältigt und von der Firma GATC Biotech aufgereinigt und sequenziert.

Die Sequenzen wurden nach ihrer Häufigkeit, mit welcher sie angereichert wurden, benannt. Tabelle 4:

Sequenz	Häufigkeit in %
seq1	25,7
seq2	5,7
seq3	5,7
seq4	5,7
seq5	5,7
seq6	2,9
seq7	2,9
seq8	2,9
seq9	2,9
seq10	2,9
seq11	2,9
seq12	2,9
seq13	2,9
seq14	2,9
seq15	2,9
seq16	2,9
seq17	2,9
seq18	2,9
seq19	2,9
seq20	2,9
seq21	2,9
seq22	2,9
seq23	2,9

Die Bindung der Peptide an Noroviren wurde mittels enzymgekoppelten Immunadsorptionstest (ELISA) überprüft. Hierfür wurden die entsprechenden Zielmoleküle (Norovirus P2-Partikel der Genogruppe II am Beispiel Stamm Kreischa sowie als Negativkontrolle Rinderserumalbumin (BSA)) in den Kavitäten einer Mikrotiterplatte immobilisiert. Anschließend wurden die Phagenklone, welche jeweils eine bestimmte Peptidsequenz auf ihrer Oberfläche präsentieren, zugegeben. Ungebundene Phagen wurden durch mehrfaches Waschen entfernt, während bindende Phagen mittels anti-M13-Antikörpern und einer dadurch ausgelösten Farbreaktion (erhöhte Absorption bei 405 nm) nachgewiesen werden konnten.
In 1 ist das ELISA-Ergebnis für das Peptid seq1 und seq14 zu sehen. Als Negativkontrolle dienten M13KE-Phagen, welcher kein künstliches Peptid auf ihrer Oberfläche präsentieren. Die Signalstärke ist relativ zur Bindung an das Kontrollprotein BSA angegeben. Insbesondere Phagen mit der Peptidsequenz seq14 wiesen eine deutlich höhere Affinität für Noroviren auf.

Claims

Calicivirus bindendes Peptid enthaltend mindestens eine der folgenden Sequenzen:
Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid einen detektierbaren Marker oder Affinitätstag enthält oder dass das Peptid an einen Träger gebunden ist.
Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es an pharmazeutisch wirksames Agens gebunden ist.
Peptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass magnetische Partikel als Träger verwendet werden.
Verwendung eines Peptids enthaltend mindestens eine der folgenden Sequenzen:
zur Anreicherung, Immobilisierung, zum Nachweis und/oder zur Markierung von Caliciviren.
Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid einen detektierbaren Marker oder Affinitätstag enthält oder dass das Peptid an einen Träger gebunden ist.
Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass magnetische Partikel als Träger verwendet werden.
Verfahren zur Immobilisierung bzw. Anreicherung von Caliciviren aus einer Probe mit den folgenden Schritten: a. Binden mindestens eines Peptides, enthaltend mindestens eine der Sequenzen SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 23, an einen Träger, b. Kontaktieren des Peptides mit der Probe.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass magnetische Partikel als Träger verwendet werden.
Verfahren zum Nachweis von Caliciviren in einer Probe mit den folgenden Schritten: a. Kontaktieren der Probe mit mindestens einem Peptid, enthaltend mindestens eine der Sequenzen SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 23, b. Nachweisen der Bindung von Caliciviren an das Peptid.
Verwendung eines Kit mindestens enthaltend: a. Peptid, enthaltend mindestens eine der Sequenzen SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 23, b. einen Träger. zum Anreichern von Caliciviren.
Verwendung eines Kit mindestens enthaltend ein Peptid, enthaltend mindestens eine der Sequenzen SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 23, zum Nachweis von Caliciviren.
Nukleinsäure mit einer für ein Peptid nach Anspruch 1 kodierenden Nukleinsäuresequenz.
Nukleinsäure nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenz mindestens einer der Sequenzen gemäß SEQ ID No. 25, 28 bis 35, 37 bis 39, 41 bis 44, 46 und 48, 51 bis 58, 60 bis 62, 64 bis 67 und 69 enthält.