DE10116101B4

DE10116101B4 - Nukleinsäurekonstrukt und Mikroorganismus mit die Sulfitbildung erhöhenden Sequenzen

Info

Publication number: DE10116101B4
Application number: DE2001116101
Authority: DE
Inventors: Ute Donalies; Ulf Stahl
Original assignee: Donalies Ute Dipl-Ing
Current assignee: Donalies Ute Dipl-Ing
Priority date: 2001-03-30
Filing date: 2001-03-30
Publication date: 2005-07-28
Anticipated expiration: 2021-03-31
Also published as: DE10116101A1

Abstract

Nukleinsäurekonstrukt mit zumindest einer ersten Teilsequenz, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus "für die Sulfitbildung in einem Mikroorganismus erhöhende Proteine oder Enzyme codierende Sequenzen" in Kombination mit einer zweiten Teilsequenz, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus "für den Transport von Sulfit aus einer Zelle erhöhende Proteine oder Enzyme codierende Sequenzen".

Description

Die Erfindung betrifft ein Nukleinsäurekonstrukt mit zumindest einer für ein die Sulfitbildung in einem Mikroorganismus erhöhendes Protein oder Enzym codierenden Teilsequenz, ein hiermit transformierter Mikroorganismus, die Herstellung eines solchen Mikroorganismus sowie Verwendungen solcher Mikroorganismen.

Hintergrund der Erfindung.

Nukleinsäurekonstrukte und Mikroorganismen des eingangs genannten Aufbaus finden weitverbreitete Anwendung im Bereich der Lebensmitteltechnologie, und zwar im Rahmen solcher Herstellungsverfahren, die mit Gärverfahrenstufen arbeiten. Hier sind insbesondere das Bäckereiwesen, das Brauwesen sowie das Winzerwesen zu nennen. Folgend werden weitere Hintergünde exemplarisch anhand des Brauwesens näter erläutert.

Im abgefüllten Bier kann es nach einiger Zeit, in Abhängigkeit von den Lagerbedingungen, zur Ausbildung eines Alterungsgeschmackes kommen. Für diesen Alterungsgeschmack sind vor allem Carbonyle, die durch Oxidation von Bierinhaltstoffen entstehen, verantwortlich.

Sulfit spielt eine wichtige Rolle für die Geschmacksstabilität. Es wirkt als Antioxidans und bildet Komplexe mit Carbonylen. Diese Sulfit-Carbonyl-Komplexe sind geschmacklich nicht mehr relevant. Sulfit gelangt während der Gärung als Zwischenprodukt des Hefestoffwechsels ins Bier. Da ein Zusatz von Schwefeldioxid zum Bier aufgrund des Reinheitsgebotes nicht erlaubt ist, sind modifizierte Hefestämme wünschenswert, die eine erhöhte Sulfitproduktion aufweisen.

Die Oxidation von Bierinhaltstoffen erfolgt über einen radikalischen Mechanismus. Dabei wird Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid reduziert. Bei dieser Reaktion wirken Schwermetallspuren katalytisch. In Fenton-Reaktionen reagieren Metallionen mit dem Wasserstoffperoxid, es entstehen Hydroxylionen und Hydroxylradikale. Letztere sind außerordentlich reaktiv. Sie können aus höheren Alkoholen Wasserstoff abstrahieren und so oxidative Reaktionen einleiten. Sulfit wirkt als Radikalfänger und ist dadurch in der Lage sauerstoffaktivierte Radikalreaktionen zu verhindern. Außerdem kann Sulfit mit flüchtigen Carbonylverbindungen Komplexe bilden. Da diese Komplexe nicht stabil sind, liegt ein Gleichgewicht zwischen freiem Sulfit, gebundenem Sulfit und freien Carbonylen vor.

Sulfit ist ein Zwischenprodukt bei der Biosynthese schwefelhaltiger Aminosäuren. Es entsteht durch Reduktion von Sulfat, das aus der Würze aufgenommen wird. Die Sulfitbildung beginnt mit der Aufnahme von Sulfat, das über einen aktiven Transportmechanismus (Permeasen) aus der Würze in die Zelle gelangt. Vor der Reduktion muß das Sulfat aktiviert werden. Diese Aktivierung erfolgt enzymatisch (ATP-Sulfurylase und Adenosin-5'-phosphosulfat (APS)-Kinase) in zwei Schritten unter Verbrauch von zwei Molekülen ATP. Das aktivierte Sulfat wird enzymatisch (Phosphoadenosin-5'-phosphosulfat(PAPS)-Reduktase) zu Sulfit und weiter zu Sulfid reduziert (Sulfitreduktase), welches für die Biosynthese der schwefelhaltigen Aminosäuren Methionin und Cystein verwendet wird. Dieser Stoffwechselweg wird auf zwei Ebenen reguliert. Zum einen liegt eine Kontrolle der Enzymaktivität vor, die durch Substrat- oder Feedbackhemmung, d.h. Rückkopplungshemmung durch nachfolgende Produkte, erfolgt. Zum anderen wird die Genexpression reguliert. Die Regulation erfolgt entsprechend dem Bedarf an schwefelhaltigen Aminosäuren. Methionin hemmt als Endprodukt die Bildung vieler Enzyme dieses Biosyntheseweges. Dementsprechend verläuft die Sulfitbildung und -ausscheidung während der Gärung in vier Phasen. In der ersten Phase wird kein Sulfit ausgeschieden, da die Expression der Enzyme der Sulfatreduktion durch Methionin in der Würze reprimiert ist. In der zweiten Phase wird Sulfat reduziert. Durch das Zellwachstum ist ein verstärkter Bedarf an Aminosäuren bedingt. Daher wird das gebildete Sulfit zum größten Teil zu Sulfid reduziert und für die Biosynthese der schwefelhaltigen Aminosäuren verbraucht. Es wird kaum Sulfit ausgeschieden. In der dritten Phase kommt es zu einer verstärkten Sulfitausscheidung, da das Hefewachstum stoppt und damit der Aminosäurenbedarf sinkt. In der letzten Phase ist der vergärbare Extrakt annähernd verbraucht. Der Stoffwechsel und damit die Sulfitbildung verlangsamt sich und kommt zum Stillstand.

Schwefeldioxid bzw. Sulfit spielt die folgende Rolle bei der Bieralterung. Im Bier liegt ein Gleichgewicht zwischen freien Carbonylen, Carbonyl-Sulfit-Komplexen und freiem Sulfit vor. Die Carbonyle stehen im Gleichgewicht mit ihren korrespondierenden Alkoholen. Der Einfluß des Schwefeldioxids auf die Geschmacksstabilität muß unter zwei Gesichtspunkten betrachtet werden: Die Wirkung während der Gärung bzw. während der Lagerung. Während der Gärung werden viele Würzecarbonyle zu den entsprechenden korrespondierenden Alkoholen reduziert. Das gebildete Schwefeldioxid kann durch Komplexbildung mit diesen Carbonylen ihre Reduktion behindern. So können die Carbonyle in Form von Sulfit-Komplexen ins fertige Bier gelangen. Nach Aufspaltung der Komplexe tragen sie zum Alterungsgeschmack bei. Normalerweise beginnt die Sulfitausscheidung aber verzögert und die Reduktion der Würzecarbonyle findet sehr schnell statt. Deshalb kann man davon ausgehen, daß zu dem Zeitpunkt an dem Sulfit ausgeschieden wird, bereits übenwiegend die reduzierten Formen vorliegen und eine Sulfit-Würzecarbonyl-Komplexbildung kaum noch erfolgt. Während der Lagerung wirkt sich das im Bier enthaltene Sulfit positiv auf die Geschmacksstabilität aus. Durch die Komplexbildung des Sulfits mit geschmacksaktiven Carbonylen wird das Auftreten eines Alterungsgeschmackes verzögert.

Eine Erhöhung der Sulfitausscheidung kann auf mehreren Wegen erreicht werden. Zum einen kann im Hefestoffwechsel die Sulfitbildung verstärkt, zum anderen die weitere Umsetzung des Sulfits verhindert oder eingeschränkt werden.

Aus der Literaturstelle DE 199 23 950 A1 ist es bekannt, eine Verstärkung der Sulfitbildung durch Einbringen von zusätzlichen Kopien derjenigen Gene zu bewerkstelligen, deren Genprodukte regulativ an der Sulfitbildung beteiligt sind. Im Einzelnen ist beschrieben, daß eine Überexpression der Hefe Gene MET14 und MET 16 unter Kontrolle der HSP26- und HSP30-Promotoren in Hefestämmen zu einer erhöhten Bildung von Sulfit im Rahmen einer Gärverfahrenstufe führt. Das Genprodukt von MET16 ist die PAPS-Reduktase, die die Reduktion des aktivierten Sulfats zum Sulfit bewirkt. Das Genprodukt von MET14 ist die APS Kinase. Es wurde insbesondere gezeigt, daß MET14 einen starken Einfluß hat. Dessen Genprodukt scheint einen geschwindigkeitsbestimmmenden Schritt, bei der biochemischen Sulfatreduktion zu Sulfit zu katalysieren. Die insofern bekannten Maßnahmen führen nicht nur zu Erhöhung der Sulfitkonzentration an sich, sondern zudem zu einer Erhöhung in einer späten Wachstumsphase der Mikroorganismen, wodurch eine störende (frühe) Komplexbildung zwischen Sulfit und Würzecarbonylen vermieden wird. Vielmehr kann Sulfit gleichsam konserviert und in das Endprodukt übertragen werden, wo es die gewünschte Alterungsstabilität durch Einfang von Radikalen und Carbonylen bewirkt. Nachteilig ist allerdings, daß eine Erhöhung der Sulfitkonzentration in einer Zelle durch Wirkung von nachgeschalteten Sulfitreduktasen gleichsam konterkariert werden können mit den Ergebnis, daß die Sulfitkonzentration im Endprodukt trotz der Erhöhung der Sulfitbildung nicht befriedigend ist. Zudem stört die auch sich erhöhende Bildung von Sulfid in beachtlichem Maße.

Bezüglich weiterführender Informationen zur Klonierung, zur Sequenz sowie der Regulierung von MET14 wird beispielsweise auf die Literaturstelle Korch, Ch. et al., Mol Gen Genet., 229:96-108 (1991) verwiesen.

Aus der Literaturstelle Park, H. et al, Yeast, 16:881-888 (2000) ist ein Gen bekannt, welches für ein Plasma Membran Protein, SSU1, codiert, das Sulfit aus einer Zelle ausschleust. Dies wird vor dem Hintergrund beschrieben, daß Sulfit potentiell zelltoxisch ist und daher wünschenswerterweise aus einer Zelle entfernt wird. Weiterhin ist beschrieben, daß Saccharomyces cerevisiae, welche mit einer Mehrzahl von SSU1 Kopien oder mit einem dominanten Allel (FZF1-4) eines Transkriptionsaktivators transformiert ist, Sulfit in erhöhtem Ausmaß in den extrazellulären Raum ausschüttet.

Technisches Problem der Erfindung.

Der Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, ein Nukleinsäurekonstrukt anzugeben, mittels welchem Mikroorganismen zum Einsatz in lebensmitteltechnischen Gärverfahrenstufen erzeugt werden können, die zu einer erhöhten Sulfitkonzentration in dem das Endprodukt bildenden Lebensmittel führen.

Grundzüge der Erfindung.

Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung ein Nukleinsäurekonstrukt mit zumindest einer ersten Teilsequenz, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus "für die Sulfitbildung in einem Mikroorganismus erhöhende Proteine oder Enzyme codierende Sequenzen" in Kombination mit einer zweiten Teilsequenz, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus "für den Transport von Sulfit aus einer Zelle erhöhende Proteine oder Enzyme codierende Sequenzen".

Mit einem solchen Konstrukt lassen sich gentechnisch Mikroorganismen erstellen, bei welchen einerseits (in einer späten Wachstumsphase) vermehrt Sulfit gebildet wird, und andererseits das Sulfit praktisch unmittelbar nach seiner Bildung aus der Zelle ausgeschleust und so einer störenden Einwirkung von Sulfit-Reduktasen entzogen wird. Hierbei findet auch keine Verschiebung zu einer früheren Sulfitbildung statt, wie im Falle einer (zum Ausschleusen alternativen) Inhibierung von Sulfit-Reduktase zu beobachten ist. Im Ergebnis lassen sich Lebensmittel, insbesondere Bier, herstellen, die einen hohen Gehalt an Sulfit aufweisen, ohne das Sulfit dem Lebensmittel zugesetzt zu werden braucht. Man erhält ein lange Zeit alterungsstabiles, insbesondere geschmackstabiles, Lebensmittel.

Weiterhin lehrt die Erfindung einen Mikroorganismus, in welchen ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurenkonstrukt eingeschleust ist, sowie ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Mikroorganismus, wobei das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt in einen natürlichen oder modifizierten Basis-Mikroorganismus eingeschleust wird. Hinsichtlich des Mikroorganismus ist anzumerken, daß dieser vorzugsweise ausschließlich mit Genen des Basis-Mikroorganismus gebildet sein kann, wobei die an sich natürlicherweise in dem Basis-Mikroorganismus vorkommenden Gene bzw. deren Teilsequenzen oder Promotorsequenzen lediglich anders zueinander positioniert sind. Dies gilt insbesondere hinsichtlich der Anordnung von Promotorsequenzen, welche fremde Promotoren in dem Sinne sein können, daß sie zwar in dem Mikroorganismus in einem (anderen) Gen natürlicherweise vorkommen, nunmehr jedoch Teil eines Gens bilden, in welchem sie natürlicherweise nicht vorkommen. In einer solchen Ausführungsform handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Mikroorganismus nicht um einen gentechnisch veränderten Mikroorganismus, da keinerlei artfremden Sequenzen oder Teilsequenzen exprimiert werden.

Schließlich lehrt die Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen Mikroorganismus zur Herstellung von Lebensmitteln oder Getränken, welche mittels zumindest einer Gärverfahrenstufe erhältlich sind, wobei der Mikroorganismus in der Gärverfahrenstufe eingesetzt wird.

Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung.

Zweckmäßigerweise weist das Nukleinsäurekonstrukt eine die erste Teilsequenz und/oder die zweite Teilsequenz kontrollierenden Promotorsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus "HSP-Gene, SSA-Gene, HSP26, HSP30, YPG1, HXK1, MOL1 (TH14), HSP104, HSP78, HXT3, UBI4, HSP12, HSP78, HSP104, ADH1, ADH2, PGK und GAP", auf. Es versteht sich, daß zum Zwecke der Transkription beider Teilsequenzen auch mehrere Promotor eingerichtet sein können. Die zweite Teilsequenz wird vorzugsweise von der geneigenen Promotorsequenz kontrolliert.

Bevorzugterweise ist die erste Teilsequenz ausgewählt aus der Gruppe der Hefegene bestehend aus "MET 14, MET 16, von vorstehenden Genen verschiedene Gene, welche für ein Polypeptid mit APS-Kinase und/oder PAPS-Reduktase Aktivität codieren und Homologe oder Allele solcher Gene", vorzugsweise aus Saccharomyces cerevisiae. Höchstvorzugsweise handelt es sich um MET14, optional zusätzlich MET16, aus Saccharomyces cerevisiae.

Die zweite Teilsequenz ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe der Hefegene bestehend aus "SSU1, FZF1, FZF1-4, von vorstehenden Genen verschiedene Gene, welche für ein den Sulfittransport aus einer Zelle codierendes Protein oder eines Transskriptionsaktivator eines solchen Proteins codieren, und Homologe oder Allele solcher Gene", vorzugsweise aus Saccharomyces cerevisiae.

Die zweite Teilsequenz und/oder die Promotorsequenz können jeweils unabhängig voneinander in einer Kopie oder einer Mehrzahl von Kopien eingerichtet sein. Die erste Teilsequenz, die zweite Teilsequenz und/oder die Promotorsequenz können durch Substition, Insertion, Deletion, Inversion und/oder Addition modifiziert sein.

Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurekonstrukt kann in linearer oder zirkulärer Form, vorliegen, in ersterem Falle vorzugsweise durch endständige Gruppen gegen Abbau durch DNasen oder RNasen geschützt.

Ein erfindungsgemäßer Mikroorganismus ist bevorzugterweise eine Hefe oder ein Bakterium, vorzugsweise ein Hefestamm der Gattung Saccharomyces, Brettanomyces oder Kluyveromyces, höchstvorzugsweise eine Art ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus "Saccharomyces cerevisiae, ober- oder untergärige Brauhefen, Weinhefen, Sekthefen, Sakehefen, Sherryhefen, Brennereihefen, oder Bäckereihefen". Die Sequenzen des Nukleinsäurekonstrukts können in episomaler Form oder in das Genom integriert vorliegen. Letzteres ist aus Gründen der stabilen Transformation bevorzugt.

Es können im Rahmen eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung eines Lebensmittels mehrere unterschiedliche erfindungsgemäße Mikroorganismen, optional zusammen mit hiervon verschiedenen (natürlichen oder modifizierten) Mikroorganismen, eingesetzt werden.

Zur Kontrolle einer Transformation kann in einem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt ein üblicher Selektionsmarker eingerichtet sein. Ein Beispiel für einen Selektionsmarker ist URA3 für eine Selektion auf einem Minimalmedium ohne Uracil. Es ist möglich, nach einer Selektion den Selektionsmarker aus dem Mikroorganismus wieder zu entfernen. Nach der Selektion mit einem Selektionsmarker können selektierte Klone einer Nachseleketion unterworfen werden, wobei die selektierten Klone sowie untransformierte Mikroorganismen gleicher Art einer Bestimmung der Sulfitbildung unterworfen werden, wobei die Bestimmung gemäß den folgenden Beispielen erfolgt, und wobei solche Klone nachselektiert werden, deren Sulfitbildung um zumindest einen Faktor 2, vorzugsweise zumindest einen Faktor 8, höchstvorzugsweise zumindest einen Faktor 10, höher als jene der untransformierten Mikroorganismen ist.

Vorzugsweise werden Promotorsequenzen eingesetzt, die unabhängig von der Aminosäurenzusammensetzung des Mediums, in welchen die Mikroorganismen kultiviert werden, sind.

Definitionen.

Die Bezeichnungen Sulfit und SO₂werden in den Zusammenhängen der Erfindung als Synonyme verwendet.

Ein Gen weist eine codierende Region, beispielsweise die erste oder zweite Teilsequenz und eine Promotorsequenz auf. Es können auch funktionslose Sequenzen enthalten bzw. zwischengeschaltet sein.

Ein Nukleinsäurekonstrukt bezeichnet eine Gesamtsequenz, welche keiner in einem natürlicherweise vorkommenden Mikroorganismus identisch gleicht. Es kann sich insbesondere um ein künstlich erzeugtes Plasmid handeln.

Bezüglich der Sequenzinformation zu im Rahmen der Erfindung eingesetzten ersten Teilsequenzen und/oder Promotorsequenzen wird hiermit auf die Literaturstelle DE 199 23 950 A1 verwiesen und deren Offenbarungsgehalt insofern in den Offenbarungsgehalt dieser Beschreibung inkorporiert. Zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Mikroorganismus können natürliche und/oder künstliche und/oder fremde Promotoren eingesetzt werden. Natürlich bezeichnet in dem betreffenden Mikroorganismus natürlicherweise vorkommende Sequenzen. Künstlich bezeichnet in keinem natürlichen Mikroorganismus vorkommende Sequenzen. Fremd bezeichnet natürlicherweise in Mikroorganismen anderer Art vorkommende Sequenzen.

Bezüglich der Sequenzinformation zu im Rahmen der Erfindung eingesetzten zweiten Teilsequenzen und/oder Promotorsequenzen wird hiermit auf die Literaturstelle Hoon Park et al., Yeast, 16:881-888 (2000) verwiesen und deren Offenbarungsgehalt sowie die darin genannten Literaturstellen insofern in den Offenbarungsgehalt dieser Beschreibung inkorporiert. Es werden vorzugsweise nur solche zweite Teilsequenzen eingesetzt, die nicht zu einer verstärkten Apotose führen.

Der Ausdruck des Proteins umfaßt im Rahmen der Erfindung auch Polypeptide.

Transport von Sulfit aus einer Zelle bezeichnet den Durchtritt von SO₃ ^2- oder HSO₃ ^- Ionen durch eine äußere Zellmebran. Eine Erhöhung des Transportes bezeichnet eine Transportrate durch die Zellmembran eines gentechnisch veränderten Mikroorganismus bei definiertem Konzentrationsgefälle über die Zellmembran, welche größer als die Transportrate in einem gentechnisch nicht veränderten Mikroorganismus gleicher Art ist. Die Erhöhung der Transportrate beträgt vorzugsweise mehr als ein Faktor 1,10, höchstvorzugsweise mehr als 2,00, Idealerweise mehr als 10,00.

Eine Promotorsequenz kann bis zu 1000 Basenpaare und mehr vor dem Transkriptionsstart umfassen. Eine Promotorsequenz kann zwischen regulierenden Elementen auch nicht regulierende Bereiche umfassen. Bevorzugterweise werden verzögert angeschaltete Promotoren eingesetzt, wie beispielsweise HSP26 HSP30. Verzögert angeschaltete Promotoren sind solche, die eine Transkription in der stationären Wachstumsphase, im letzten Drittel der exponentiellen Wachstumsphase, und/oder bei 60% bis 90% der in einer Wachstumsphase erreichbaren maximalen Zellzahl, initiieren, i.e. maximal 30%, vorzugsweise maximal 10%, der maximal erreichbaren Sulfitkonzentration wird vor den genannten Zeitpunkten eingestellt. Zur Bestimmung von Sulfit bzw. SO₂ wird beispielsweise auf die Literaturstelle Grant, Anal. Chem., 19:345-346 (1947) oder das per 30.03.2001 vertriebene enzymatische Testkit "TC-SULFIT" der Firma r-Biopharm verwiesen.

Die Erfindung umfaßt auch den Einsatz von Teilsequenzen, die beispielsweise nicht für MET14 codieren, jedoch zur Expression eines (anderen) Proteins führen, welche trotz der strukturellen Unterschiede mindestens die gleiche Aktivität von MET14 entwickeln. Entsprechendes gilt in aller Allgemeinheit für die erste und die zweite Teilsequenz sowie die Promotorsequenz. Als zu einem Gen homologe Gene sind solche Gene bezeichnet, die für Proteine codieren, deren Aminosäurensequenz zu zumindest 60%, vorzugsweise zu zumindest 80%, höchstvorzugsweise zu zumindest 95%, der Sequenz des Genes, zu dem Homologie besteht, gleichen.

Wenn ein erfindungsgemäßes Konstrukt einen Transkriptionsaktivator umfaßt, so genügt es mitunter, das hierdurch aktivierbare Gen nicht einzuführen, sofern es natürlicherweise in dem erfindungsgemäßen Mikroorganismus vorliegt. Wenn dagegen kein Transkriptionsaktivator eingesetzt wird, so muß eine Mehrzahl von Kopien des Gens eingesetzt werden, i.e. der erfindungsgemäße Mikroorganismus enthält letztendlich eine Mehrzahl von diesen (natürlichen und/oder künstlichen und/oder fremden) Genen.

Eine modifizierte Sequenz ist in zumindest einem Nukleotid verändert.

Das Einschleusen eines Nukleinsäurekonstrukts kann nach allen dem Fachmann vertrauten Methoden, beispielsweise Transformation, Transfektion, Lipofektion, Konjugation oder Kreuzung erfolgen. In letzterem Fall ist das Nukleinsäurekonstrukt bereits in das Genom eines (anderen) Mikroorganismus integriert.

Im Folgenden wird die Erfindung anhand von lediglich Ausführungsformen darstellenden Beispielen näher erläutert.
Beispiel 1: Herstellung eines erfindungsgemäßen Plasmids Folgend wird die Klonierung eines erfindungsgemäßen Plasmids beschrieben. Als Ausgangsplasmid wurde YEP358 (siehe Myers, A. M., Tzagoloff, A., Kinney, D. M., Lusty, C. J. (1986): Yeast shuttle and integrative vectors with multiple cloning sites suitable for construction of lacZ fusions. Gene 45, 299-310) eingesetzt. Aus dem replikativen Vektor YEP358 wurde über Restriktion mit PvuII und darauffolgende Selbstligation das lacZ Gen entfernt. Das resultierende Plasmid wird mit YEP358-2 bezeichnet und ist in der 1 dargestellt.
Das SSU1-Gen, die codierende Sequenz (CDS) des MET14-Gens sowie der HSP26-Promotor wurden über PCR hergestellt. Durch die Primer wurden Fragmente mit folgenden endständigen Restriktionsschnittstellen erzeugt:

– SSU1 (Promoter und CDS): BamHI/EcoRI
– HSP26-Promoter: EcoRI/NcoI
– MET14 (CDS): NcoI/HindIII

Als Primer wurden eingesetzt:
Die PCR-Reaktion wurde gemäß dem folgenden Programm durchgeführt:
Die PCR Fragmente wurden in das Plasmid YEP358-2 folgendermaßen kloniert:

1. Der HSP26-Promoter wurde über NcoI in dem Klonierungsplasmid pBluescript SK(+) (Fa. Stratagene) vor die codierende Sequenz des MET14-Gens kloniert.
2. Das neu entstandene HSP26/MET14-Fragment wurde über EcoRI/HindIII aus dem Bluescriptvector ausgeschnitten und in das Plasmid YEP358-2 ligiert. Das so erhaltene Plasmid wird YEP26-14 genannt und ist in der 2 dargestellt.
3. Das SSU1-Gen wurde über BamHI/EcoRI in das Plasmid YEP358-2 kloniert. Das so erhaltene Plasmid wird YEPS1 genannt und ist in 3 dargestellt.
4. Das HSP26/MET14-Fragment wurde über XhoI/BamHI aus dem Bluescriptvector ausgeschnitten und über SalI/BamHI in das Plasmid YEPS1 kloniert (XhoI und SalI erzeugen die gleichen überhängenden Enden). Das so erhaltene Plasmid wird YEPS1/26-14 genannt und ist in 4 dargestellt.

Beispiel 2: Herstellung eines erfindungsgemäßen Mikroorganismus
Es wurde der folgende Stamm transformiert:
Die Hefe wurden durch Elektroporation (siehe Becker, D. M., Guarente, L. (1991): High-efficiency transformation of yeast by electroporation. Meth. Enzymol. 194, 182-187) mit dem Plasmid YEPS1/26-14 transformiert. Die Selektion erfolgt auf Minimalmedium ohne Uracil (URA3 als Selektionsmarker). Die erhaltenen Mikroorganismen werden L3/YEPS1/26-14 genannt.
Beispiel 3: Herstellung von Vergleichs-Mikroorganismen.
Es wurde in einem dem Beispiel 2 identischen Weise gearbeitet, mit der Ausnahme, daß Transformation jeweils mit den Plasmiden YEP358-2, YEP26-14 oder YEPS1 erfolgte. So wurden Mikroorganismen erhalten, die weder Überexpression von MET14 noch von SSU1 zeigten (L3/YEP358-2), Mikroorganismen, die Überexpression von MET1 nicht jedoch von SSU1 zeigten (L3/YEP26-14) und Mikroorganismen, die Überexpression von SSU1, nicht jedoch von MET14 zeigten (L3/YEPS1). Weiterhin wurde zu Vergleichszwecken der untransformierte Stamm (L3) eingesetzt.
Beispiel 4: Durchführung von Messungen zur Sulfitbildung mit Mikroorganismen.
Mit den Mikroorganismen aus den Beispielen 2 und 3 wurden die folgenden Untersuchungen durchgeführt.
Verschiedene erfindungsgemäße Klone aus der Selektion nach Beispiel 2 wurden in B-Medium (siehe Cherst, H., Surdin-Kerjan, Y. (1992): Genetic analysis of a new mutation conferring cysteine auxotrophy in Saccharomyces cerevisiae: updating of the sulfur metabolism pathway. Genetics 130, 51-58) angezogen und auf ihr Sulfitbildungsvermögen getestet. Aus einer Übernachtkultur wurden je 20 ml B-Medium mit einer OD600nm = 0,5 angeimpft und bei 30 °C aerob geschüttelt. Nach 24 h wurde die OD600nm und das Sulfit im Kulturüberstand gemessen. Die Sulfitmessung erfolgte mit einem enzmatischen Sulfit-Test-Kit (Fa. r-Biopharm). In der 5 erkennt man, daß erhaltenen Klone durchweg eine beachtlich erhöhte Sulfitbildung zeigten. Die Erhöhung varierte zwischen einem Faktor von ca. 3-4 bis zu mehr als 10. In der 6 sind Mittelwerte der drei besten Klone der 5 dargestellt.
Mit einem ausgewählten erfindungsgemäßen Klon wurden Gärversuche durchgeführt und mit Gärversuchen verglichen, die mit Mikroorganismen aus dem Beispiel 3 durchgeführt worden waren. Die Gärversuche wurden in Erlenmeyerkolben mit Gäraufsätzen durchgeführt Die Gärung erfolgte in je 250 ml B-Medium bzw. Würze. Es wurde aus einer Übernachtkultur eine Ausgangszellzahl von 1·107 Zellen/ml eingestellt. Zu den Probenahmezeiten wurde die OD600nm und der pH-Wert gemessen, die Zellen abzentrifugiert und die Probenüberstände für die Sulfitmessungen bei –20°C aufbewahrt.
Es zeigt sich aus der 7, daß durch Überexpression von MET14 in Kombination mit SSU1 die Mikroorganismen bzw. Hefen die 4-10fache Sulfitmenge bilden können. Die Stämme, die nur entweder MET14 oder SSU1 überexprimieren, zeigen dagegen eine deutlich schwächere bzw. keine Erhöhung in der Sulfitbildung im Vergleich zu dem erfindungsgemäßen Stamm, der beide Gene überexprimieren. Da das MET14-Gen unter der Kontrolle eines Promoters ist, der unabhängig von der Aminosäurezusammensetzung des Mediums funktioniert, ist die von den Hefen gebildete Sulfitmenge (pro Zellzahl) in B-Medium und in Würze vergleichbar.

Claims

Nukleinsäurekonstrukt mit zumindest einer ersten Teilsequenz, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus "für die Sulfitbildung in einem Mikroorganismus erhöhende Proteine oder Enzyme codierende Sequenzen" in Kombination mit einer zweiten Teilsequenz, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus "für den Transport von Sulfit aus einer Zelle erhöhende Proteine oder Enzyme codierende Sequenzen".
2. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1 mit zumindest einer die erste Teilsequenz und/oder die zweite Teilsequenz kontrollierenden Promotorsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus "HSP-Gene, SSA-Gene, HSP26, HSP30, YPG1, HXK1, MOL1 (TH14), HSP104, HSP78, HXT3, UBI4, HSP12, HSP78, HSP104, ADH1, ADH2, PGK und GAP".
Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1 oder 2, wobei die erste Teilsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe der Hefegene bestehend aus "MET 14, MET 16, von vorstehenden Genen verschiedene Gene, welche für APS-Kinase und/oder PAPS-Reduktase Aktivität codieren, und Homologe oder Allele solcher Gene", vorzugsweise aus Saccharomyces cerevisiae, höchstvorzugsweise MET14, optional zusätzlich MET16, aus Saccharomyces cerevisiae ist.
Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die zweite Teilsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe der Hefegene bestehend aus "SSU1, FZF1, FZF1-4, von vorstehenden Genen verschiedene Gene, welche für ein den Sulfittransport aus einer Zelle codierendes Protein oder einen Transskriptionsaktivator eines solchen Proteins codieren, und Homologe oder Allele solcher Gene", vorzugsweise aus Saccharomyces cerevisiae.
Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die erste Teilsequenz, die zweite Teilsequenz und/oder die Promotorsequenz jeweils unabhängig voneinander in einer Kopie oder einer Mehrzahl von Kopien eingerichtet sind.
Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die erste Teilsequenz, die zweite Teilsequenz und/oder die Promotorsequenz durch Substition, Insertion, Deletion, Inversion und/oder Addition modifiziert ist.
Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in linearer oder zirkulärer Form.
Mikroorganismus, in welchen ein Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 7 eingeschleust ist.
Mikroorganismus nach Anspruch 8, welcher eine Hefe oder ein Bakterium, vorzugsweise ein Hefestamm der Gattung Saccharomyces, Brettanomyces oder Kluyveromyces, höchstvorzugsweise eine Art ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus "Saccharomyces cerevisiae, ober- oder untergärige Brauhefen, Weinhefen, Sekthefen, Sakehefen, Sherryhefen, Brennereihefen, oder Bäckereihefen", ist.
Mikroorganismus nach Anspruch 8 oder 9, wobei die Sequenzen des Nukleinsäurekonstrukts in episomaler Form oder in das Genom integriert vorliegen.
Verfahren zur Herstellung eines Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei das Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in einen natürlichen oder modifizierten Basis-Mikroorganismus eingeschleust wird.
Verwendung eines Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 8 bis 10 zur Herstellung von Lebensmitteln oder Getränken, welche mittels zumindest einer Gärverfahrenstufe erhältlich sind, wobei der Mikroorganismus in der Gärverfahrenstufe eingesetzt wird.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei mehrere unterschiedliche Mikroorganismen nach einem der Ansprüche 8 bis 10, optional zusammen mit hiervon verschiedenen Mikroorganismen, eingesetzt werden.