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CN106929531A - 一种贝酵母转fzf1基因耐硫转化子的制备及鉴定方法 - Google Patents

一种贝酵母转fzf1基因耐硫转化子的制备及鉴定方法 Download PDF

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CN106929531A
CN106929531A CN201710138164.4A CN201710138164A CN106929531A CN 106929531 A CN106929531 A CN 106929531A CN 201710138164 A CN201710138164 A CN 201710138164A CN 106929531 A CN106929531 A CN 106929531A
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fzf1
sulfur
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张汉尧
张智铭
刘小珍
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Yunnan Yanzhimeng Agricultural Technology Co ltd
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Southwest Forestry University
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Abstract

一种贝酵母转FZF1基因耐硫转化子的制备及鉴定方法，属于培育酵母菌株及鉴定方法。本发明包括：构建FZF1基因表达载体；贝酵母转基因；PCR筛选转化子；贝酵母菌株耐硫性测定；RT‑PCR检测；转化子生长曲线测定；转录组分析等。试验表明转化子A9‑ FZF1‑1和A9‑ FZF1‑2能在含40 mM亚硫酸钠的培养基中生长，同时本发明提供了鉴定增强FZF1基因表达的贝酵母新菌株硫代谢网络的相关基因表达量的方法。

Description

一种贝酵母转FZF1基因耐硫转化子的制备及鉴定方法
技术领域
本发明属于培育酵母菌株及鉴定方法。
背景技术
在酿酒工艺中亚硫酸盐的耐受能力是筛选酿酒菌株的重要指标之一，贝酵母和酿酒酵母是葡萄酒生产的的姊妹菌种，但贝酵母在耐硫水平上相对较弱，即使近年研究中发现了个别对硫有一定耐受能力的菌株，耐硫水平仍远低于商业用酿酒酵母的耐硫能力。
研究表明，在酿酒酵母中与耐硫相关的基因FZF1调节作为“硫泵”SSU1蛋白，将毒害细胞的亚硫酸盐泵出细胞外，可在酿酒过程中保证细胞正常生命活动，同时形成酒品的特殊风味，提高葡萄酒的品质。研究贝酵母的FZF1基因，对于研究贝酵母的耐硫机制及培育新型耐硫贝酵母均有重要意义。贝酵母与耐硫相关基因FZF1的研究的相关文献有本发明人此前发明专利“贝酵母耐硫杂交育种后代的鉴定方法”（申请号：CN201310738413.5）。该方法中我们利用了耐硫亲本与FZF1基因含有一个插入片段而与其它不耐硫的亲本在该片段存在长度差异标记杂交后代，结合含硫培养基进行筛选，获得了6个不同的耐硫贝酵母杂交后代菌株。同时，以DNA序列及ISSR图谱为鉴定依据加上耐硫表型筛选。该方法是首次用杂交的方式培育贝酵母耐硫菌株的报道，但所获得的菌株耐硫水平较低，鉴定方法差异较大，也未涉及转基因转化子的鉴定。
发明内容
本发明旨在培育耐硫水平更高的贝酵母转FZF1基因的新菌株，并提供可供选择的筛选鉴定转FZF1基因的耐硫贝酵母转化子的方法。
本发明以上目的通过以下方法实现：
一、制备贝酵母转FZF1基因耐硫转化子的方法
该方法包括贝酵母FZF1基因重组DNA载体构建和复制，以及克隆的贝酵母耐硫转化子的培养，其中：
（1）以耐硫贝酵母A9的FZF1-1序列和ACY338的FZF1-2序列作为外源基因，用BamH I和Sal I酶切，合成并构建入pGEM–T Easy载体中，构建贝酵母FZF1基因重组DNA载体；
（2）以重组DNA载体为模板，用Bam H I和Sal I对PCR产物进行酶切，引物为：
FZF1-1-L：GCA GGA TCC ATG GCC AAT ACA AAG AAA CCT，
FZF1-1-R ：CAG GTC GAC TTA GTA TTC AAA TAA GCT CCT；
FZF1-2-L： 5′-GCA GGA TCC ATG GCA AAT AAA AAG AAA CTG，
FZF1-2-R：5′-CAG GTC GAC TTA GTA TTC GAA TAA GCT CCT；
引物下划线部分分别是酶切位点，其产物与同样经Bam H I和Sal I双酶切的表达载体PYIP5连接，构建重组质粒PYIP5-FZF1-1和PYIP5-FZF1-2，导入受体细胞克隆。
进一步，所述克隆的贝酵母耐硫转化子培养是收集克隆转化子到含40mM亚硫酸钠和80mM琥珀酸且pH3.5的YPD培养基上培养，挑选生长状况良好的转化子作为贝酵母转FZF1基因耐硫转化子。
二、鉴定贝酵母转FZF1基因耐硫转化子的方法
该鉴定方法是至少选择以下之一种：
（1）用贝酵母转FZF1基因耐硫转化子，以含AmpR基因扩增引物：
AMPR-L： GCTGCGCCTTATCCGGTAAC，
AMPR–R： TCTGCGCGTAATCTGCTGCT；
组成PCR反应体系鉴定PCR产物，取得转化子316bp特征条带。
（2）提取贝酵母转FZF1基因耐硫转化子的总RNA，反转录成cDNA模板进行FZF1基因的RT-PCR定量分析，引物为：
FZF1-1-S-L q： ATG GCC AAT ACA AAG AAA CCT，
FZF1-1-S-R q： TTA GTA TTC AAA TAA GCT CCT；
FZF1-2-L q： ATG GCA AAT AAA AAG AAA CTG，
FZF1-2-R q：TTA GTA TTC GAA TAA GCT CCT；
ACT1-L q： CTG GGA YGA YAT GGA RAA GAT，
ACT2-R q: GYT CRG CCA GGA TCT TCA T；
鉴定结果：转化子的FZF1基因表达量较非转化子明显上升，差异达到显著水平。
进一步，所述的鉴定方法：提取贝酵母转FZF1基因耐硫转化子的总RNA，分析转录组显示：转化子的硫代谢网络相关基因MET16 与CYC1或MET16 与MET17的表达量明显上调。
进一步，所述的鉴定方法：将贝酵母转FZF1基因耐硫转化子置于液体YPD培养基上，记录其生长状况，以测定转化子生长曲线。
本发明的有益效果是：
与现有技术仅用A9杂交以引入FZF1基因不同，本发明同时以A9和ACY338的FZF1基因作为外源基因进行转化，构建重组质粒PYIP5-FZF1-1和PYIP5-FZF1-2导入受体细胞克隆，转移这两种贝酵母菌株转FZF1基因后代到含40mg/L亚硫酸钠的培养基上培养所显示的耐硫能力大幅提高（见表1）。相比之前的发明，本发明调整了增强了基因的表达水平，而不是仅仅引入一个基因而已，因此硫耐受度有较大的提升。并且，本发明进行的是定量检测，而之前的发明是进行定性检测；本发明涉及了表达后水平的检测，而之前发明仅涉及表达前水平的检测（见表1）。
本发明的有益效果是：
与现有技术仅用A9杂交以引入FZF1基因不同，本发明同时以A9和ACY338的FZF1基因作为外源基因进行转化，构建重组质粒PYIP5-FZF1-1和PYIP5-FZF1-2导入受体细胞克隆，转移这两种贝酵母菌株转FZF1基因后代到含40mg/L亚硫酸钠的培养基上培养所显示的耐硫能力提高约10倍（见表1）。相比之前的发明，本发明调整了增强了基因的表达水平，而不是仅仅引入一个基因而已，因此硫耐受度有较大的提升。并且，本发明进行的是定量检测，而之前的发明是进行定性检测；本发明涉及了表达后水平的检测，而之前发明仅涉及表达前水平的检测（见表1）。
表1本发明与发明专利“贝酵母耐硫杂交育种后代的鉴定方法”对比
注：培养基中所用琼脂糖品牌不同，每个培养皿中所含培养基为30mL。
本发明鉴定方法包括以含AmpR基因扩增引物组成PCR反应体系鉴定、RT-PCR检测、转录组分析以及转化子生长曲线测定共四种方法。通过检测得到两种贝酵母菌株转FZF1基因后代所含有的转基因特征带、转化子的FZF1基因表达量或转化子的硫代谢网络相关基因MET16 和CYC1、MET17的表达量变化，以确认新的转基因贝酵母菌株的耐硫性。
该发明在分子水平上提供了检测贝酵母菌株转FZF1基因后代多种方法，这些方法结合使用，可提高了转化子鉴定的准确率，并可以了解到菌株在转录组水平的调控变化，为选育在酿酒过程中耐硫逆境的酵母以及利用具有生产实践意义。
本发明属于云南省林学一流学科建设经费（项目编号51600625）和云南省高校林木遗传改良与繁育重点实验室开放基金（项目编号31360404）资助项目。
附图说明
图1为贝酵母菌株及转化子在含40 mM硫的YPD培养基上的生长状况。其中：1和12为A9；2-11为A9- FZF1-1候选克隆子；13-22为A9- FZF1-2候选克隆子。
图2为贝酵母菌株及质粒PYIP5-FZF1-1的FZF1基因PCR结果。其中2为A9；3-12为转化后的候选克隆子；M为M, 1Kb plus ladder, Invitrogen。
图3为贝酵母菌株及质粒PYIP5-FZF1-2的FZF1基因PCR结果。其中2为A9；3-12为转化后的候选克隆子；M为M, 1Kb plus ladder, Invitrogen。
图4为FZF1基因在不同菌株中的表达水平。其中，**为差异极显著，NS为差异不显著。
图5为不同菌株的生长曲线图。
图6为A9-FZF1-1 vs A9转化菌株与A9在通道富集Go注释中的差异表达基因。
图7为A9-FZF1-2 vs A9转化菌株与A9在通道富集Go注释中的差异表达基因。
以下结合具体实施方式对本发明做进一步说明，具体实施方式的实例包括但并不限于所指出的内容。
具体实施方式
一、贝酵母转FZF1基因耐硫转化子的制备
实施例1：
材料：耐硫贝酵母菌株为A9，菌株引自新西兰奥克兰大学（引入人:张汉尧，2010年），大肠杆菌DH5α，以上菌株均保存于本实验室。贝酵母菌株可向奥克兰大学Richard Gardner教授索要。联系方式如下：
Wine Science Programme, School of Biological Sciences, University ofAuckland, Private Bag 92019, Auckland, New Zealand
大肠杆菌DH5α，基因转化时，用于扩增目标质粒的大肠杆菌菌株，是常规菌株，可向经营生物试剂的公司购买。
试剂：引物由上海生物工程公司合成；Taq DNA聚合酶、dNTPs、RNase购自上海生物工程公司； DNA Marker为1Kb plus ladder，购自 Invitrogen；酵母基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司其他常规试剂为国产分析纯产品。
制备:
FZF1-1序列与耐硫贝酵母A9的一致，亲本起源于贝优酵母（S.eubayanus）, FZF1-2序列则来自贝酵母ACY338。FZF1-1 和 FZF1-2 基因两端分别带有BamH I 和 Sal I 的酶切位点，均合成并构建入pGEM–T Easy载体中，提供服务的公司为恒创基因公司。
（1）提取和纯化贝酵母DNA：
在YPD培养基中分别培养非耐硫贝酵母菌株ACY338和耐硫贝酵母菌株A9，扩增其细胞。收集细胞于离心管，使细胞破碎，释放内含物，使DNA与蛋白质等分离，收集DNA。
其中，YPD培养基是含10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、 20 g/L琼脂、20g/L葡萄糖的固体培养基。
所收集的DNA可在Agrose胶上电泳，以紫外检测仪与标准分子量相比较估算被测DNA的分子量和浓度。
（2）以耐硫贝酵母A9的FZF1-1序列和ACY338的FZF1-2序列作为外源基因，用BamHI和Sal I酶切，合成并构建入pGEM–T Easy载体中，作为贝酵母FZF1基因重组DNA载体；
（3）构建贝酵母FZF1基因表达载体：
以人工合成目的基因并构建在pGEM–T Easy质粒上的重组DNA载体为模板，用Bam H I和Sal I对贝酵母FZF1基因重组DNA载体模板复制的PCR产物进行酶切，引物为：
FZF1-1-L：GCA GGA TCC ATG GCC AAT ACA AAG AAA CCT，
FZF1-1-R ：CAG GTC GAC TTA GTA TTC AAA TAA GCT CCT；
FZF1-2-L： 5′-GCA GGA TCC ATG GCA AAT AAA AAG AAA CTG，
FZF1-2-R：5′-CAG GTC GAC TTA GTA TTC GAA TAA GCT CCT；
引物下划线部分分别是酶切位点，其产物与同样经Bam H I和Sal I双酶切的表达载体PYIP5连接，构建重组质粒PYIP5-FZF1-1和PYIP5-FZF1-2，并通过电击转化进大肠杆菌DH5α中。
（4）制备受体细胞获得克隆的目的基因：
转化实验前2天，于YPDA培养基的培养皿上活化菌株；转化前1天，挑取活化的酵母细胞（单克隆）于YPDA液体培养基中，30°C，200 rpm培养过夜；将培养过夜的酵母细胞液按1：3的比例转接于新的YPDA液体培养基中，于30°C摇床内，200 rpm培养4 h；3 000 g 离心 5分钟收集酵母细胞，用0.5倍体积的无菌水洗酵母细胞；再次3 000 g 离心 5分钟，用0.01倍体积的无菌水重悬酵母细胞，并转入新离心管中，20°C ，3 000 g 离心 5分钟；用0.01倍体积的无菌细胞悬浮液(5 % v/v 甘油，10% v/v 二甲基亚砜)重悬酵母细胞；将重悬的酵母细胞按50 ul分装到1.5 ml离心管中备用。
在LB培养基中扩大培养含重组质粒PYIP5-FZF1-1、PYIP5-FZF1-2的大肠杆菌DH5α，提取重组质粒；将贝酵母菌株A9与重组质粒按体积比（8～10）：1混匀于电击杯中电击，室温静置后加入少量YEP培养液，28℃静置1h，然后28℃，200rpm培养2h，构建作为目的基因的克隆转化子。
以上LB培养基是含胰化蛋白胨 10g/L 酵母提取物 5g/L NaCl 10g/L的液体培养基。YEP培养基是含10g/L牛肉浸膏、10g/L酵母粉、5g/L NaCl，pH为7.0的液体培养基；
（4）收集步骤（3）所克隆的转化子到含40mM亚硫酸钠和80mM琥珀酸且pH3.5的YPD培养基上培养24小时后，挑选生长状况良好的转化子作为贝酵母转FZF1基因耐硫转化子。
二、贝酵母转FZF1基因耐硫转化子的耐硫性鉴定
实施例2：
从生长于40mM亚硫酸钠的培养基上贝酵母转FZF1基因耐硫转化子PYIP5-FZF1-1、PYIP5-FZF1-2中各随机挑选5个转化子，共计10个候选转化子进行PCR分析。PCR步骤包括：
（1）组成PCR反应体系（单位：微升）配方：
2.5 微升 10×PCR buffer (包含 Mg2+),
1 微升的 10 mM 前导链引物
1 微升的 10 mM 后导链引物
0.5 微升的10 mM 10 mM dGTP、dATP、dCTP和dCTP
0.2 微升的5U/μL Taq DNA 聚合酶
2 微升 模板DNA
17.8微升 dH2O
上述PCR反应体系的引物为AmpR基因的引物AMPR-L：GCTGCGCCTTATCCGGTAAC和AMPR–R： TCTGCGCGTAATCTGCTGCT。
（2）PCR反应程序：
①95℃5分钟；②95℃解链30钞；③54℃退火30秒；④72℃延伸60秒；⑤②-④35个循环；⑥72℃延伸7分钟。
（3）PCR产物用凝胶成像系统观察结果：
经1.2%琼脂糖凝胶电泳，该琼脂糖凝胶含0.5 μg·mL-1的溴化乙锭，电压为3～5 V/cm，照像记录。
（4）PCR分析：
贝酵母菌株及转化子的FZF1基因PCR鉴定结果见图3：10个候选转化子均含有转基因特征带，且只有一条大小为316 bp的条带，非转化子不能产生特征带。
实施例3：RT-PCR筛选转基因后耐硫转化子
（1）RNA提取和cDNA合成
提取贝酵母转FZF1基因耐硫转化子在YPD液体培养基中培养24小时后，用于RNA提取。RNA提取用Quaigene试剂盒提供的方法提取，然后将RNA用Fermentas试剂盒反转录成cDNA。
（2）RT-PCR根据Chen等 （2008）年报道的方法操作，RT-PCR引物为：
FZF1-1-S-Lq ATG GCC AAT ACA AAG AAA CCT，
FZF1-1-S-Rq TTA GTA TTC AAA TAA GCT CCT；
FZF1-2-Lq ATG GCA AAT AAA AAG AAA CTG，
FZF1-2-Rq：TTA GTA TTC GAA TAA GCT CCT；
ACT1-Lq CTG GGA YGA YAT GGA RAA GAT ，
ACT2-Rq GYT CRG CCA GGA TCT TCA T。
实验重复3次。T2C –ΔΔ（Kenneth J. Livak and Thomas D. Schmittgen,2001）则被用于分析数据。数据导入Excel 2007进行分析。差异显著性分析，使用单因子的ANOVA方法进行分析。
Kenneth J. Livak and Thomas D. Schmittgen.Analysis of Relative GeneExpression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 22DDCT Method.METHODS 25, 402–408 (2001).
结果：转化子的FZF1基因表达量较非转化子明显上升，差异达到显著水平。
实施例4：
转录组分析。提取贝酵母转FZF1基因耐硫转化子及非转化子的总RNA，进行转录组分析。
结果：转化子的硫代谢网络相关基因的表达量发生明显变化（见表2）。在两种FZF1基因转化子中，MET16的表达量是上调的；JLP1在A9-FZF1-2中表达量上调，INP54在A9-FZF1-1中表达量上调。然而，CYC1和MET17下调。
表2 转化子与出发株A9相比在硫代谢相关基因中上调和下调的基因
GeneID Transformstrains Startingstrain A9 log2Fold p value q value Diff Swiss-Prot-annotation
Unigene1153_All 471.1684 A 1471.051 1.122066 1.33E-57 6.19E-57 Up GN=INP54
Unigene2317_All 16.86287 A 110.6627 2.19378 1.04E-12 2.30E-12 Up GN=MET16
Unigene681_All 13.88707 A 0.001 -5.31614 2.01E-05 3.24E-05 Down GN=CYC1
Unigene2136_All 13.88707 A 0.001 -5.31614 2.01E-05 3.24E-05 Down GN= MET17
Unigene2317_All 30.18016B 110.6627 1.651076 7.22E-10 1.43E-09 Up GN=MET16
Unigene1552_All 19.20556 B 49.60743 1.145612 0.001783 0.002493 Up GN=JLP1
Unigene681_All 18.29101 B 0.001 -5.41648 3.77E-06 6.29E-06 Down GN=CYC1
Unigene2136_All 8.230953 B 0.001 -4.26448 0.002869 0.003932 Down GN= MET17
注：A，A9-FZF1-1；B，A9-FZF1-2。
实施例5：
测定转化子生长曲线。用1%的出发菌株A9及贝酵母转FZF1基因耐硫转化子接种于0.05L的YPD液体培养基，于30℃、220转/分钟下培养，每4小时用分光光度计测量一次其在600nm波长下的光吸收值，测定其生长率。用未接种菌株的YPD液体培养基作为对照，以OD600值为纵坐标以生长时间为横坐标制定菌株的生长曲线。鉴定结果：转化子的生长较快，而非转化子则生长较慢。
SEQUENCE LISTING
<110> 西南林业大学
<120> 制备贝酵母转FZF1基因耐硫转化子的方法
<130> 权利要求书、说明书
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
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atggcaaata aaaagaaact g 21
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<212> DNA
<213> FZF1-1基因序列
<400> 13
atggcaaata aaaagaaact gcactctagg aggtataaat gctcttttga aggctgtggt 60
aaggactaca acagaccaag tttgcttgaa cagcatgaga actctcattt caatcaaaag 120
ccgtatcttt gcgatgagcc gggatgtggc aagaaattca taagaccatg tcacttgaga 180
gttcataaat ggacgcattc acagattaag cccaagccat gcaccttatg cgagaaaaga 240
tttgtcacga accaacaatt aaacagacat ttaagcagcc atgaaagaaa agacaagctc 300
aagtctaaaa tcattactaa gaacgaagaa ccgggcccca atatcaaatc agactacgga 360
ggcaatgaat tgaatttagg cacgacattg cctgaccagc tgcttccact cgatgacaat 420
ctgccacaag actatttgct ccgggctgat gatatgaacg cggtgcggtg tccgtacgta 480
ttgtgtcagg tacttactac ctttgatgac gatttgatca atcatatgtt acaacaccac 540
attgcaagta agcttacttt gccacctgaa gagctgcatc taaacaatca ggcaccagta 600
tcgccatgtt caagtagcac ggacgacgcc tccattccac agctttctgc ggccgccagt 660
agtgacagca gctacagcac cggcaccata gtggaaagcc tggacgaccc agagagttac 720
tggtccgacc accggtgcaa gcatatacat tgccaagagc ttgatcgatt tgcctccgtg 780
tttgacctga tcgaccacta cgatcacgcg cacgcataca tccctgaaac gctggtgaag 840
tacagttaca ttcatctata caagcccaac gtcaggagct tattcgaata ctaa 894
<210> 14
<211> 894
<212> DNA
<213> FZF1-2基因序列
<400> 14
atggcaaata aaaagaaact gcactctagg aggtataaat gctcttttga aggctgtggt 60
aaggactaca acagaccaag tttgcttgaa cagcatgaga actctcattt caatcaaaag 120
ccgtatcttt gcgatgagcc gggatgtggc aagaaattca taagaccatg tcacttgaga 180
gttcataaat ggacgcattc acagattaag cccaagccat gcaccttatg cgagaaaaga 240
tttgtcacga accaacaatt aaacagacat ttaagcagcc atgaaagaaa agacaagctc 300
aagtctaaaa tcattactaa gaacgaagaa ccgggcccca atatcaaatc agactacgga 360
ggcaatgaat tgaatttagg cacgacattg cctgaccagc tgcttccact cgatgacaat 420
ctgccacaag actatttgct ccgggctgat gatatgaacg cggtgcggtg tccgtacgta 480
ttgtgtcagg tacttactac ctttgatgac gatttgatca atcatatgtt acaacaccac 540
attgcaagta agcttacttt gccacctgaa gagctgcatc taaacaatca ggcaccagta 600
tcgccatgtt caagtagcac ggacgacgcc tccattccac agctttctgc ggccgccagt 660
agtgacagca gctacagcac cggcaccata gtggaaagcc tggacgaccc agagagttac 720
tggtccgacc accggtgcaa gcatatacat tgccaagagc ttgatcgatt tgcctccgtg 780
tttgacctga tcgaccacta cgatcacgcg cacgcataca tccctgaaac gctggtgaag 840
tacagttaca ttcatctata caagcccaac gtcaggagct tattcgaata ctaa 894
<210> 15
<211> 297
<212> PRT
<213> FZF1-1氨基酸序列
<400> 15
Met Ala Asn Lys Lys Lys Leu His Ser Arg Arg Tyr Lys Cys Ser Phe
1 5 10 15
Glu Gly Cys Gly Lys Asp Tyr Asn Arg Pro Ser Leu Leu Glu Gln His
20 25 30
Glu Asn Ser His Phe Asn Gln Lys Pro Tyr Leu Cys Asp Glu Pro Gly
35 40 45
Cys Gly Lys Lys Phe Ile Arg Pro Cys His Leu Arg Val His Lys Trp
50 55 60
Thr His Ser Gln Ile Lys Pro Lys Pro Cys Thr Leu Cys Glu Lys Arg
65 70 75 80
Phe Val Thr Asn Gln Gln Leu Asn Arg His Leu Ser Ser His Glu Arg
85 90 95
Lys Asp Lys Leu Lys Ser Lys Ile Ile Thr Lys Asn Glu Glu Pro Gly
100 105 110
Pro Asn Ile Lys Ser Asp Tyr Gly Gly Asn Glu Leu Asn Leu Gly Thr
115 120 125
Thr Leu Pro Asp Gln Leu Leu Pro Leu Asp Asp Asn Leu Pro Gln Asp
130 135 140
Tyr Leu Leu Arg Ala Asp Asp Met Asn Ala Val Arg Cys Pro Tyr Val
145 150 155 160
Leu Cys Gln Val Leu Thr Thr Phe Asp Asp Asp Leu Ile Asn His Met
165 170 175
Leu Gln His His Ile Ala Ser Lys Leu Thr Leu Pro Pro Glu Glu Leu
180 185 190
His Leu Asn Asn Gln Ala Pro Val Ser Pro Cys Ser Ser Ser Thr Asp
195 200 205
Asp Ala Ser Ile Pro Gln Leu Ser Ala Ala Ala Ser Ser Asp Ser Ser
210 215 220
Tyr Ser Thr Gly Thr Ile Val Glu Ser Leu Asp Asp Pro Glu Ser Tyr
225 230 235 240
Trp Ser Asp His Arg Cys Lys His Ile His Cys Gln Glu Leu Asp Arg
245 250 255
Phe Ala Ser Val Phe Asp Leu Ile Asp His Tyr Asp His Ala His Ala
260 265 270
Tyr Ile Pro Glu Thr Leu Val Lys Tyr Ser Tyr Ile His Leu Tyr Lys
275 280 285
Pro Asn Val Arg Ser Leu Phe Glu Tyr
290 295
<210> 16
<211> 297
<212> PRT
<213> FZF1-2氨基酸序列
<400> 16
Met Ala Asn Lys Lys Lys Leu His Ser Arg Arg Tyr Lys Cys Ser Phe
1 5 10 15
Glu Gly Cys Gly Lys Asp Tyr Asn Arg Pro Ser Leu Leu Glu Gln His
20 25 30
Glu Asn Ser His Phe Asn Gln Lys Pro Tyr Leu Cys Asp Glu Pro Gly
35 40 45
Cys Gly Lys Lys Phe Ile Arg Pro Cys His Leu Arg Val His Lys Trp
50 55 60
Thr His Ser Gln Ile Lys Pro Lys Pro Cys Thr Leu Cys Glu Lys Arg
65 70 75 80
Phe Val Thr Asn Gln Gln Leu Asn Arg His Leu Ser Ser His Glu Arg
85 90 95
Lys Asp Lys Leu Lys Ser Lys Ile Ile Thr Lys Asn Glu Glu Pro Gly
100 105 110
Pro Asn Ile Lys Ser Asp Tyr Gly Gly Asn Glu Leu Asn Leu Gly Thr
115 120 125
Thr Leu Pro Asp Gln Leu Leu Pro Leu Asp Asp Asn Leu Pro Gln Asp
130 135 140
Tyr Leu Leu Arg Ala Asp Asp Met Asn Ala Val Arg Cys Pro Tyr Val
145 150 155 160
Leu Cys Gln Val Leu Thr Thr Phe Asp Asp Asp Leu Ile Asn His Met
165 170 175
Leu Gln His His Ile Ala Ser Lys Leu Thr Leu Pro Pro Glu Glu Leu
180 185 190
His Leu Asn Asn Gln Ala Pro Val Ser Pro Cys Ser Ser Ser Thr Asp
195 200 205
Asp Ala Ser Ile Pro Gln Leu Ser Ala Ala Ala Ser Ser Asp Ser Ser
210 215 220
Tyr Ser Thr Gly Thr Ile Val Glu Ser Leu Asp Asp Pro Glu Ser Tyr
225 230 235 240
Trp Ser Asp His Arg Cys Lys His Ile His Cys Gln Glu Leu Asp Arg
245 250 255
Phe Ala Ser Val Phe Asp Leu Ile Asp His Tyr Asp His Ala His Ala
260 265 270
Tyr Ile Pro Glu Thr Leu Val Lys Tyr Ser Tyr Ile His Leu Tyr Lys
275 280 285
Pro Asn Val Arg Ser Leu Phe Glu Tyr
290 295

Claims (5)

1.制备贝酵母转FZF1基因耐硫转化子的方法，包括贝酵母FZF1基因重组DNA载体构建和复制，以及克隆的贝酵母耐硫转化子的培养，其特征是：
（1）以耐硫贝酵母A9的FZF1-1序列和ACY338的FZF1-2序列作为外源基因，用BamH I和Sal I酶切，合成并构建入pGEM–T Easy载体中，构建贝酵母FZF1基因重组DNA载体；
（2）以重组DNA载体为模板，用Bam H I和Sal I对PCR产物进行酶切，引物为：
FZF1-1-L：GCA GGA TCC ATG GCC AAT ACA AAG AAA CCT，
FZF1-1-R ：CAG GTC GAC TTA GTA TTC AAA TAA GCT CCT；
FZF1-2-L： 5′-GCA GGA TCC ATG GCA AAT AAA AAG AAA CTG，
FZF1-2-R：5′-CAG GTC GAC TTA GTA TTC GAA TAA GCT CCT；
引物下划线部分分别是酶切位点，其产物与同样经Bam H I和Sal I双酶切的表达载体PYIP5连接，构建重组质粒PYIP5-FZF1-1和PYIP5-FZF1-2，导入受体细胞克隆。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：所述克隆的贝酵母耐硫转化子培养是收集克隆转化子到含40mM亚硫酸钠和80mM琥珀酸且pH3.5的YPD培养基上培养，挑选生长状况良好的转化子作为贝酵母转FZF1基因耐硫转化子。
3.鉴定贝酵母转FZF1基因耐硫转化子的方法，其特征是：至少选择以下鉴定方法之一种：
（1）用贝酵母转FZF1基因耐硫转化子，以含AmpR基因扩增引物：
AMPR-L： GCTGCGCCTTATCCGGTAAC，
AMPR–R： TCTGCGCGTAATCTGCTGCT；
组成PCR反应体系鉴定PCR产物，取得转化子316bp特征条带；
（2）提取贝酵母转FZF1基因耐硫转化子的总RNA，反转录成cDNA模板进行FZF1基因的RT-PCR定量分析，引物为：
FZF1-1-S-L q： ATG GCC AAT ACA AAG AAA CCT，
FZF1-1-S-R q： TTA GTA TTC AAA TAA GCT CCT；
FZF1-2-L q： ATG GCA AAT AAA AAG AAA CTG，
FZF1-2-R q：TTA GTA TTC GAA TAA GCT CCT；
ACT1-L q： CTG GGA YGA YAT GGA RAA GAT，
ACT2-R q: GYT CRG CCA GGA TCT TCA T；
鉴定结果：转化子的FZF1基因表达量较非转化子明显上升，差异达到显著水平。
4.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征是：提取贝酵母转FZF1基因耐硫转化子的总RNA，分析转录组显示：转化子的硫代谢网络相关基因MET16 与CYC1或MET16 与MET17的表达量明显上调。
5.根据权利要求3或4所述的鉴定方法，其特征是：将贝酵母转FZF1基因耐硫转化子置于液体YPD培养基上，记录其生长状况，以测定转化子生长曲线。
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