DE10112107A1

DE10112107A1 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae

Info

Publication number: DE10112107A1
Application number: DE10112107A
Authority: DE
Inventors: Georg Thierbach; Mechthild Rieping
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2000-11-04
Filing date: 2001-03-14
Publication date: 2002-05-08
Also published as: ES2344681T3

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminoäuren, insbesondere L-Threonin, in dem man folgende Schritte durchführt: DOLLAR A a) Fermentation der die gewünschte L-Aminosäure produzierenden Mikroorganismen der Familie Enterobactericeae, in denen man zumindest das poxB-Gen oder dafür kodierende Nukleotidsequenzen abschwächt, insbesondere ausschaltet, DOLLAR A b) Anreicherung der L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Bakterien, und DOLLAR A c) Isolieren der L-Aminosäure.

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, L- Lysin und L-Valin, unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae, in denen das poxB-Gen abgeschwächt wird.

Stand der Technik

L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, L-Lysin und L- Valin, finden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung Anwendung.

Es ist bekannt L-Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen der Enterobacteriaceae, insbesondere Escherichia coli (E. coli) und Serratia marcescens, herzustellen. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen, wie z. B. Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien wie z. B. die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform, durch z. B. Ionenaustauschchromatographie, oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.

Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite wie z. B. das Threonin-Analogon α-Amino-β-Hydroxyvaleriansäure (AHV) oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und L-Aminosäuren wie z. B. L-Threonin produzieren.

Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung L- Aminosäuren produzierender Stämme der Familie Enterobacteriaceae eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die Produktion untersucht.

Aufgabe der Erfindung

Die Erfinder haben sich die Aufgabe gestellt, neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von L- Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, L-Lysin und L-Valin, bereitzustellen.

Beschreibung der Erfindung

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, unter Verwendung von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, die insbesondere bereits L- Threonin produzieren, und in denen die für das Enzym Pyruvat-Oxidase (EC 1.2.2.2) kodierende Nukleotidsequenz (poxB-Gen) abgeschwächt wird.

Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Enzym (Protein) oder Gen inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.

Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Schritte durchführt:

a) Fermentation von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen zumindest das poxB-Gen abgeschwächt wird,
b) Anreicherung der entsprechenden L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, und
c) Isolieren der gewünschten L-Aminosäure.

Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können L-Aminosäuren aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, gegebenenfalls Stärke, gegebenenfalls Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es handelt sich um Vertreter der Familie Enterobacteriaceae, ausgewählt aus den Gattungen Escherichia, Erwinia, Providencia und Serratia. Die Gattungen Escherichia und Serratia werden bevorzugt. Bei der Gattung Escherichia ist insbesondere die Art Escherichia coli und bei der Gattung Serratia insbesondere die Art Serratia marcescens zu nennen.

Geeignete, insbesondere L-Threonin produzierende Stämme der Gattung Escherichia, insbesondere der Art Escherichia coli sind beispielsweise
Escherichia coli TF427
Escherichia coli H4578
Escherichia coli KY10935
Escherichia coli VNIIgenetika MG442
Escherichia coli VNIIgenetika M1
Escherichia coli VNIIgenetika 472T23
Escherichia coli BKIIM B-3996
Escherichia coli kat 13
Escherichia coli KCCM-10132.

Geeignete L-Threonin produzierende Stämme der Gattung Serratia, insbesondere der Art Serratia marcescens sind beispielsweise
Serratia marcescens HNr21
Serratia marcescens TLr156
Serratia marcescens T2000.

L-Threonin produzierende Stämme aus der Familie der Enterobacteriaceae besitzen bevorzugt, unter anderen, ein oder mehrere der genetischen bzw. phänotypischen Merkmale ausgewählt aus der Gruppe: Resistenz gegen α-Amino-β- Hydroxyvaleriansäure, Resistenz gegen Thialysin, Resistenz gegen Ethionin, Resistenz gegen α-Methylserin, Resistenz gegen Diaminobernsteinsäure, Resistenz gegen α- Aminobuttersäure, Resistenz gegen Borrelidin, Resistenz gegen Rifampicin, Resistenz gegen Valin-Analoga wie beispielsweise Valinhydroxamat, Resistenz gegen Purinanaloga wie beispielsweise 6-Dimethylaminopurin, Bedürftigkeit für L-Methionin, gegebenenfalls partielle und kompensierbare Bedürftigkeit für L-Isoleucin, Bedürftigkeit für meso-Diaminopimelinsäure, Auxotrophie bezüglich Threonin-haltiger Dipeptide, Resistenz gegen L-Threonin, Resistenz gegen L-Homoserin, Resistenz gegen L-Lysin, Resistenz gegen L-Methionin, Resistenz gegen L- Glutaminsäure, Resistenz gegen L-Aspartat, Resistenz gegen L-Leucin, Resistenz gegen L-Phenylalanin, Resistenz gegen L-Serin, Resistenz gegen L-Cystein, Resistenz gegen L- Valin, Empfindlichkeit gegenüber Fluoropyruvat, defekte Threonin-Dehydrogenase, gegebenenfalls Fähigkeit zur Saccharose-Verwertung, Verstärkung des Threonin-Operons, Verstärkung der Homoserin-Dehydrogenase I-Aspartatkinase I bevorzugt der feed back resistenten Form, Verstärkung der Homoserinkinase, Verstärkung der Threoninsynthase, Verstärkung der Aspartatkinase, gegebenenfalls der feed back resistenten Form, Verstärkung der Aspartatsemialdehyd- Dehydrogenase, Verstärkung der Phosphoenolpyruvat- Carboxylase, gegebenenfalls der feed back resistenten Form, Verstärkung der Phosphoenolpyruvat-Synthase, Verstärkung der Transhydrogenase, Verstärkung des RhtB-Genproduktes, Verstärkung des RhtC-Genproduktes, Verstärkung des YfiK- Genproduktes, Verstärkung einer Pyruvat-Carboxylase, und Abschwächung der Essigsäurebildung.

Es wurde gefunden, daß Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae nach Abschwächung, insbesondere Ausschaltung des für die Pyruvat-Oxidase (EC 1.2.2.2) kodierenden poxB-Gens in verbesserter Weise L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin produzieren.

Darüber hinaus wurde gefunden, daß Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae nach Abschwächung, insbesondere Ausschaltung des für die Pyruvat-Oxidase (EC 1.2.2.2) kodierenden poxB-Gens geringere Konzentrationen des unerwünschten Nebenproduktes Essigsäure bilden.

Die Nukleotidsequenz des poxB-Gens von Escherichia coli wurde von Grabau und Cronan (Nucleic Acids Research. 14 (13), 5449-5460 (1986)) publiziert und kann ebenfalls der von Blattner et al. (Science 277, 1453-1462 (1997)) publizierten Genomsequenz von Escherichia coli unter der Accession Number AE000188 entnommen werden. Die Nukleotidsequenz des poxB-Gens von Escherichia coli ist in SEQ ID No. 1 und die Aminosäuresequenz des dazugehörigen Genproduktes in SEQ ID No. 2 dargestellt.

Die in den angegebenen Textstellen beschriebenen poxB-Gene können erfindungsgemäß verwendet werden. Weiterhin können Allele des poxB-Gens verwendet werden, die sich aus der Degeneriertheit des genetischen Codes oder durch funktionsneutrale Sinnmutationen ("sense mutations") ergeben.

Zur Erzielung einer Abschwächung können beispielsweise die Expression des poxB-Gens oder die katalytischen Eigenschaften des Enzymproteins herabgesetzt bzw. ausgeschaltet werden. Gegebenenfalls können beide Maßnahmen kombiniert werden.

Die Verringerung der Genexpression kann durch geeignete Kulturführung, durch genetische Veränderung (Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression oder auch durch Antisense-RNA Technik erfolgen. Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann unter anderem beispielsweise bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191-195 (1998)), bei Carrier und Keasling (Biotechnology Progress 15, 58-64 (1999), Franch und Gerdes (Current Opinion in Microbiology 3, 159-164 (2000)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie beispielsweise dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990).

Mutationen, die zu einer Veränderung bzw. Herabsetzung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind aus dem Stand der Technik bekannt. Als Beispiele seien die Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Yano et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95, 5511-5515 (1998), Wente und Schachmann (Journal of Biological Chemistry 266, 20833-20839 (1991) genannt. Zusammenfassende Darstellungen können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.

Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen in Betracht. In Abhängigkeit von der Wirkung des Aminosäureaustausches auf die Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen ("missense mutations") oder Nichtsinnmutationen ("nonsense mutations") gesprochen. Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar in einem Gen führen zu Rasterverschiebungsmutationen ("frame shift mutations"), die dazu führen, daß falsche Aminosäuren eingebaut werden oder die Translation vorzeitig abbricht. Deletionen von mehreren Kodonen führen typischerweise zu einem vollständigen Ausfall der Enzymaktivität. Anleitungen zur Erzeugung derartiger Mutationen gehören zum Stand der Technik und können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.

Ein Beispiel für ein Plasmid, mit Hilfe dessen das poxB-Gen von Escherichia coli durch ortsspezifische Mutagenese abgeschwächt, insbesondere ausgeschaltet werden kann, ist das Plasmid pMAK705ΔpoxB (Fig. 1). Es enthält neben Resten von Polylinkersequenzen lediglich einen Teil der 5'- und einen Teil der 3'-Region des poxB-Gens. Ein 340 bp langer Abschnitt der Kodierregion fehlt (Deletion). Die Sequenz dieser für die Mutagenese des poxB-Gens einsetzbaren DNA ist in SEQ ID No. 3 dargestellt.

Die Deletionsmutation des poxB-Gens kann durch Gen- bzw. Allelaustausch in geeignete Stämme eingebaut werden.

Eine gebräuchliche Methode ist die von Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 174, 4617-4622 (1989)) beschriebene Methode des Genaustauschs mit Hilfe eines konditional replizierenden pSC101-Derivates pMAK705. Andere im Stand der Technik beschriebene Methoden wie beispielsweise die von Martinez-Morales et al. (Journal of Bacteriology 1999, 7143-7148 (1999)) oder die von Boyd et al. (Journal of Bacteriology 182, 842-847 (2000)) können gleichfalls benutzt werden.

Nach erfolgtem Austausch liegt in dem betreffenden Stamm die in SEQ ID No. 4 dargestellte Form des ΔpoxB-Allels vor, die ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist.

Es ist ebenfalls möglich, Mutationen im poxB-Gen oder Mutationen, die die Expression des poxB-Gens betreffen, durch Konjugation oder Transduktion in verschiedene Stämme zu überführen.

Weiterhin kann es für die Produktion von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin mit Stämmen der Familie Enterobacteriaceae vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung des poxB-Gens ein oder mehrere Enzyme des bekannten Threonin-Biosyntheseweges oder Enzyme des anaplerotischen Stoffwechsels oder Enzyme für die Produktion von reduziertem Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid- Phosphat zu verstärken.

Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor oder ein Gen verwendet, das für ein entsprechendes Enzym bzw. Protein mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.

So können beispielsweise gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe

- das für die Aspartatkinase, die Homoserin-Dehydrogenase, die Homoserinkinase und die Threoninsynthase kodierende thrABC-Operon (US-A-4,278,765),
- das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende pyc-Gen (DE-A-198 31 609),
- das für die Phosphoenolpyruvat-Synthase kodierende pps- Gen (Molecular and General Genetics 231: 332 (1992)),
- das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxylase kodierende ppc-Gen (Gene 31: 279-283 (1984)),
- die für die Transhydrogenase kodierenden Gene pntA und pntB (European Journal of Biochemistry 158: 647-653 (1986)),
- das Homoserinresistenz vermittelnde Gen rhtB (EP-A-0 994 190),
- das für die Malat : Chinon Oxidoreduktase kodierende mqo- Gen (DE 100 34 833.5),
- das Threoninresistenz vermittelnde Gen rhtC (EP-A-1 013 765),
- das für den Threoninexport kodierende thrE-Gen von Corynebacterium glutamicum (DE 100 26 494.8) und
- das für die Glutamat-Dehydrogenase kodierende gdhA-Gen (Nucleic Acids Research 11: 5257-5266 (1983); Gene 23: 199-209 (1983))

verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.

Weiterhin kann es für die Produktion von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung des poxB-Gens eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe

- das für die Threonin-Dehydrogenase kodierende tdh-Gen (Ravnikar und Somerville, Journal of Bacteriology 169, 4716-4721 (1987)),
- das für die Malat-Dehydrogenase (E.C. 1.1.1.37) kodierende mdh-Gen (Vogel et al., Archives in Microbiology 149, 36-42 (1987)),
- das Genprodukt des offenen Leserahmens (orf) yjfA (Accession Number AAC77180 des National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA),
- das Genprodukt des offenen Leserahmens (orf) ytfP (Accession Number AAC77179 des National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA) und
- das für das Enzym Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende pckA-Gen (Medina et al. (Journal of Bacteriology 172, 7151-7156 (1990))

abzuschwächen, insbesondere auszuschalten oder die Expression zu verringern.

Weiterhin kann es für die Produktion von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung des poxß-Gens unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).

Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können im batch - Verfahren (Satzkultivierung), im fed batch (Zulaufverfahren) oder im repeated fed batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.

Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.

Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und gegebenenfalls Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.

Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.

Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten, wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.

Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff haltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 25°C bis 45°C und vorzugsweise bei 30°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum an L- Aminosäuren bzw. L-Threonin gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.

Die Analyse von L-Aminosäuren kann durch Anionenaustauschchromatographie mit anschließender Ninhydrin Derivatisierung erfolgen, so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174) beschrieben.

Eine Reinkultur des Escherichia coli K-12 Stammes DHSα/pMAK705 wurde am 12. September 2000 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß Budapester Vertrag als DSM 13720 hinterlegt.

Eine Reinkultur des Escherichia coli K-12 Stammes MG442ΔpoxB wurde am 02. Oktober 2000 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß Budapester Vertrag als DSM 13762 hinterlegt.

Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, wie z. B. L-Threonin, L- Isoleucin, L-Valin, L-Methionin, L-Homoserin und L-Lysin, insbesondere L-Threonin.

Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli sowie alle Techniken zur Restriktion, Klenow- und alkalische Phosphatasebehandlung werden nach Sambrook et al. (Molecular Cloning - A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press) durchgeführt. Die Transformation von Escherichia coli wird, wenn nicht anders beschrieben, nach Chung et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, USA (1989) 86: 2172-2175) durchgeführt.

Die Bebrütungstemperatur bei der Herstellung von Stämmen und Transformanten ist 37°C. Bei dem Genaustauschververfahren nach Hamilton et. al werden Temperaturen von 30°C und 44°C verwendet.

Beispiel 1 Konstruktion der Deletionsmutation des poxB-Gens

Teile der 5'- und 3'-Region des poxB-Gens werden aus Escherichia coli K12 unter Anwendung der Polymerase- Kettenreaktion (PCR) sowie synthetischen Oligonukleotiden amplifiziert. Ausgehend von der Nukletidsequenz des poxB- Gens in E. coli K12 MG1655 (SEQ ID No. 1) werden folgende PCR-Primer synthetisiert (MWG Biotech, Ebersberg, Deutschland):

Die für die PCR eingesetzte chromosomale E. coli K12 MG1655 DNA wird nach Herstellerangaben mit "Qiagen Genomic-tips 100/G" (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Ein ca. 500 Basenpaare (bp) grosses DNA-Fragment aus der 5'-Region des poxB-Gens (mit poxB1 bezeichnet) und ein ca. 750 bp grosses DNA-Fragment aus der 3'-Region des poxB-Gens (mit poxB2 bezeichnet) kann mit den spezifischen Primern unter Standard-PCR-Bedingungen (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) mit der Taq-DNA-Polymerase (Gibco-BRL, Eggenstein, Deutschland) amplifiziert werden. Die PCR-Produkte werden den Herstellerangaben entsprechend jeweils mit dem Vektor pCR2.1TOPO (TOPO TA Cloning Kit, Invitrogen, Groningen, Niederlande) ligiert und in den E. coli Stamm TOP10F' transformiert.

Die Selektion Plasmid tragender Zellen erfolgt auf LB Agar, der mit 50 µg/ml Ampicillin versetzt ist. Nach der Plasmid DNA Isolierung wird der Vektor pCR2.1TOPOpoxB1 mit den Restriktionsenzymen Ech136II und XbaI gespalten und das poxB1-Fragment nach der Auftrennung im 0,8%igen Agarosegel mit Hilfe des QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Der Vektor pCR2.1TOPOpoxB2 wird nach der Plasmid DNA Isolierung mit den Enzymen EcoRV und XbaI gespalten und mit dem isolierten poxB1-Fragment ligiert. Der E. coli Stamm DH5α wird mit dem Ligationsansatz transformiert und Plasmid tragende Zellen auf LB Agar, der mit 50 µg/ml Ampicillin versetzt ist, selektioniert. Nach der Plasmid DNA Isolierung werden durch die Kontrollspaltung mit den Enzymen HindIII und XbaI solche Plasmide nachgewiesen, in denen die in SEQ ID No. 3 dargestellte mutagene DNA Sequenz kloniert vorliegt. Eines der Plasmide wird als pCR2.1TOPOΔpoxB bezeichnet.

Beispiel 2 Konstruktion des Austauschvektors pMAK705ΔpoxB

Das in Beispiel 1 beschriebene poxB-Allel wird aus dem Vektor pCR2.1TOPOΔpoxB nach der Restriktion mit den Enzymen HindIII und XbaI und Auftrennung im 0,8%igen Agarosegel isoliert und mit dem Plasmid pMAK705 (Hamilton et al. (1989) Journal of Bacteriology 174, 4617-4622), das mit den Enzymen HindIII und XbaI verdaut wurde, ligiert. Der Ligationsansatz wird in DH5α transformiert und Plasmid tragende Zellen auf LB Agar, der mit 20 µg/ml Chloramphenicol versetzt ist, selektioniert. Die erfolgreiche Klonierung wird nach Plasmid DNA Isolierung und Spaltung mit den Enzymen HindIII und XbaI nachgewiesen. Der entstandene Austauschvektor pMAK705ΔpoxB (= pMAK705deltapoxB) ist in Fig. 1 dargestellt.

Beispiel 3 Ortsspezifische Mutagenese des poxB-Gens in dem E. coli Stamm MG442

Der L-Threonin produzierende E. coli Stamm MG442 ist in der Patentschrift US-A-4,278,765 beschrieben und bei der Russischen Nationalsammlung für industrielle Mikroorganismen (VKPM, Moskau, Russland) als CMIM B-1628 hinterlegt.

Für den Austausch des chromosomalen poxB-Gens gegen das Plasmid-kodierte Deletionskonstrukt wird MG442 mit dem Plasmid pMAK705ΔpoxB transformiert. Der Genaustausch erfolgt mit dem von Hamilton et al. (1989) Journal of Bacteriology 174, 4617-4622) beschriebenen Selektionsverfahren und wird durch Standard-PCR-Methoden (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) mit folgenden Oligonukleotid Primern verifiziert:

Der erhaltene Stamm wird als MG442ΔpoxB bezeichnet.

Beispiel 4 Herstellung von L-Threonin mit dem Stamm MG442ΔpoxB

MG442ΔpoxB wird auf Minimalmedium mit der folgenden Zusammensetzung vermehrt: 3,5 g/l Na₂HPO₄.2H₂O, 1,5 g/l KH₂PO₄, 1 g/l NH₄Cl, 0,1 g/l MgSO₄.7H₂O, 2 g/l Glucose, 20 g/l Agar. Die Bildung von L-Threonin wird in batch Kulturen von 10 ml, die in 100 ml Erlenmeierkolben enthalten sind, überprüft. Dazu wird 10 ml Vorkulturmedium der folgenden Zusammensetzung: 2 g/l Hefeextrakt, 10 g/l (NH₄)₂SO₄, 1 g/l KH₂PO₄, 0,5 g/l MgSO₄.7H₂O, 15 g/l CaCO₃, 20 g/l Glucose beimpft und für 16 Stunden bei 37°C und 180 rpm auf einem ESR Inkubator der Firma Kühner AG (Birsfelden, Schweiz) inkubiert. 250 µl dieser Vorkultur werden in 10 ml Produktionsmedium (25 g/l (NH₄)₂SO₄, 2 g/l KH₂PO₄, 1 g/l MgSO₄.7H₂O, 0,03 g/l FeSO₄.7H₂O, 0,018 g/l MnSO₄.1H₂O, 30 g/l CaCO₃, 20 g/l Glucose) überimpft und für 48 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wird die optische Dichte (OD) der Kultursuspension mit einem LP2W-Photometer der Firma Dr. Lange (Berlin, Deutschland) bei einer Messwellenlänge von 660 nm bestimmt.

Anschließend wird die Konzentration an gebildetem L- Threonin im steril filtrierten Kulturüberstand mit einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenreaktion mit Ninhydrindetektion bestimmt.

In Tabelle 1 ist das Ergebnis des Versuches dargestellt.

Tabelle 1

Beispiel 5 Herstellung von L-Threonin mit dem Stamm MG442ΔpoxB/pMW218gdhA 5.1 Amplifizierung und Klonierung des gdhA-Gens

Das Glutamat-Dehydrogenase-Gen aus Escherichia coli K12 wird unter Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) sowie synthetischen Oligonukleotiden amplifiziert.

Ausgehend von der Nukleotidsequenz für das gdhA-Gen in E. coli K12 MG1655 (GenBank: Accession Nr. AE000270 und Nr. AE000271) werden PCR-Primer synthetisiert (MWG Biotech, Ebersberg, Deutschland):

Die für die PCR eingesetzte chromosomale E. coli K12 MG1655 DNA wird nach Herstellerangaben mit "QIAGEN Genomic-tips 100/G" (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Ein ca. 2150 bp großes DNA-Fragment, das den gdhA-Kodierbereich und ca. 350 bp 5'-flankierende und ca. 450 bp 3'-flankierende Sequenzen umfaßt, kann mit den spezifischen Primern unter Standard-PCR-Bedingungen (Innis et al.: PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press) mit der Pfu-DNA Polymerase (Promega Corporation, Madison, USA) amplifiziert werden. Das PCR-Produkt wird in das Plasmid pCR2.1TOPO kloniert und in den E. coli Stamm TOP10 transformiert (Invitrogen, Leek, Niederlande, Produktbeschreibung TOPO TA Cloning Kit, Cat. No. K4500-01). Die erfolgreiche Klonierung wird durch Spaltung des Plasmids pCR2.1TOPOgdhA mit den Restriktionsenzymen EcoRI und EcoRV nachgewiesen. Dazu wird die Plasmid DNA mittels des "QIAprep Spin Plasmid Kits" (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert und nach der Spaltung in einem 0,8%igen Agarosegel aufgetrennt.

5.2 Klonierung des gdhA-Gens in den Plasmidvektor pMW218

Das Plasmid pCR2.1TOPOgdhA wird mit dem Enzym EcoRI gespalten, der Spaltungsansatz im 0,8%igen Agarosegel aufgetrennt und das 2,1 kbp große gdhA-Fragment mit Hilfe des "OIAquick Gel Extraction Kit" (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Das Plasmid pMW218 (Nippon Gene, Toyama, Japan) wird mit dem Enzym EcoRI gespalten und mit dem gdhA-Fragment ligiert. Der E. coli Stamm DH5α wird mit dem Ligationsansatz transformiert und pMW218 tragende Zellen durch Ausplattieren auf LB Agar (Lennox, Virology 1955, 1: 190), der mit 20 µg/ml Kanamycin versetzt ist, selektioniert.

Die erfolgreiche Klonierung des gdhA-Gens kann nach der Plasmid DNA-Isolierung und Kontrollspaltung mit EcoRI und EcoRV nachgewiesen werden. Das Plasmid wird als pMW218gdhA (Fig. 2) bezeichnet.

5.3 Herstellung des Stammes MG442ΔpoxB/pMW218gdhA

Der in Beispiel 3 erhaltene Stamm MG442ΔpoxB und der Stamm MG442 werden mit dem Plasmid pMW218gdhA transformiert und Transformanten auf LB-Agar selektioniert, der mit 20 µg/ml Kanamycin supplementiert ist. Auf diese Weise entstehen die Stämme MG442ΔpoxB/pMW218gdhA und MG442/pMW218gdhA.

5.4 Herstellung von L-Threonin

Die Herstellung von L-Threonin durch die Stämme MG442ΔpoxB/pMW218gdhA und MG442/pMW218gdhA wird wie in Beispiel 4 beschrieben geprüft. Das Minimalmedium und das Vorkulturmedium werden bei diesen beiden Stämmen zusätzlich mit 20 µg/ml Kanamycin supplementiert.

In Tabelle 2 ist das Ergebnis des Versuches zusammengefasst.

Tabelle 2

Beispiel 6 Herstellung von L-Threonin mit dem Stamm MG442ΔpoxB/pMW219rhtC 6.1 Amplifizierung des rhtC-Gens

Das rhtC-Gen aus Escherichia coli K12 wird unter Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) sowie synthetischen Oligonukleotiden amplifiziert. Ausgehend von der Nukleotidsequenz für das rhtC-Gen in E. coli K12 MG1655 (GenBank: Accession Nr. AE000458, Zakataeva et al. (FEBS Letters 452, 228-232 (1999)) werden PCR-Primer synthetisiert (MWG Biotech, Ebersberg, Deutschland):

Die für die PCR eingesetzte chromosomale E. coli K12 MG1655 DNA wird nach Herstellerangaben mit "QIAGEN Genomic-tips 100/G" (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Ein ca. 800 bp großes DNA-Fragment kann mit den spezifischen Primern unter Standard-PCR-Bedingungen (Innis et al.: PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press) mit der Pfu-DNA Polymerase (Promega Corporation, Madison, USA) amplifiziert werden.

6.2 Klonierung des rhtC-Gens in den Plasmidvektor pMW219

Das Plasmid pMW219 (Nippon Gene, Toyama, Japan) wird mit dem Enzym SmaI gespalten und mit dem rhtC-PCR-Fragment ligiert. Der E. coli Stamm DH5α wird mit dem Ligationsansatz transformiert und pMW219 tragende Zellen auf LB Agar, der mit 20 µg/ml Kanamycin supplementiert ist, selektioniert. Die erfolgreiche Klonierung kann nach der Plasmid DNA-Isolierung und Kontrollspaltung mit KpnI, HindIII und NcoI nachgewiesen werden. Das Plasmid pMW219rhtC ist in Fig. 3 dargestellt.

6.3 Herstellung des Stammes MG442ΔpoxB/pMW219rhtC

Der in Beispiel 3 erhaltene Stamm MG442ΔpoxB und der Stamm MG442 werden mit dem Plasmid pMW219rhtC transformiert und Transformanten auf LB-Agar selektioniert, der mit 20 µg/ml Kanamycin supplementiert ist. Auf diese Weise entstehen die Stämme MG442ΔpoxB/pMW219rhtC und MG442/pMW219rhtC.

6.4 Herstellung von L-Threonin

Die Herstellung von L-Threonin durch die Stämme MG442ΔpoxB/pMW219rhtC und MG442/pMW219rhtC wird wie in Beispiel 4 beschrieben geprüft. Das Minimalmedium und das Vorkulturmedium werden bei diesen beiden Stämmen zusätzlich mit 20 µg/ml Kanamycin supplementiert.

In Tabelle 3 ist das Ergebnis des Versuches zusammengefasst.

Tabelle 3

Beispiel 7 Ortsspezifische Mutagenese des poxB-Gens in dem E. coli Stamm TOC21R

Der L-Lysin produzierende E. coli Stamm pDA1/TOC21R ist in der Patentanmeldung F-A-2511032 beschrieben und bei der Collection Nationale de Culture de Microorganisme (CNCM, Institut Pasteur, Paris, Frankreich) unter der Nummer I-167 hinterlegt. Der Stamm und der plasmidfreie Wirt sind ebenfalls bei Dauce-Le Reverend et al. (European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology 15 : 227-231 (1982)) unter der Bezeichnung TOCR21/pDA1 beschrieben.

Von Stamm pDA1/TOC21R wird nach Kultur im Antibiotika freien LB-Medium für ungefähr sechs Generationen ein Derivat isoliert, das das Plasmid pDA1 nicht mehr enthält. Der entstandene Stamm ist Tetracyclin-sensitiv und wird als TOC21R bezeichnet.

Für den Austausch des chromosomalen poxB-Gens gegen das Plasmid-kodierte Deletionskonstrukt wird TOC21R mit dem Plasmid pMAK705ΔpoxB (Beispiel 2) transformiert. Der Genaustausch erfolgt mit dem von Hamilton et al. (1989) Journal of Bacteriology 174, 4617-4622) beschriebenen Selektionsverfahren und wird durch Standard-PCR-Methoden (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) mit folgenden Oligonukleotid Primern verifiziert:

Der erhaltene Stamm wird als TOC21RΔpoxB bezeichnet.

Beispiel 8 Herstellung von L-Lysin mit dem Stamm TOC21RΔpoxB

Die Bildung von L-Lysin durch die Stämme TOC21RΔpoxB und TOC21R wird in batch Kulturen von 10 ml, die in 100 ml Erlenmeierkolben enthalten sind, überprüft. Dazu wird 10 ml Vorkulturmedium der folgenden Zusammensetzung: 2 g/l Hefeextrakt, 10 g/l (NH₄)₂SO₄, 1 g/l KH₂PO₄, 0, 5 g/l MgSO₄.7H₂O, 15 g/l CaCO₃, 20 g/l Glucose beimpft und für 16 Stunden bei 37°C und 180 rpm auf einem ESR Inkubator der Firma Kühner AG (Birsfelden, Schweiz) inkubiert. 250 µl dieser Vorkultur werden in 10 ml Produktionsmedium (25 g/l (NH₄)₂SO₄, 2 g/l KH₂PO₄, 1 g/l MgSO₄.7H₂O, 0,03 g/l FeSO₄.7H₂O, 0,018 g/l MnSO₄.1H₂O, 30 g/l CaCO₃, 20 g/l Glucose, 25 mg/l L-Isoleucin und 5 mg/l Thiamin) überimpft und für 72 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wird die optische Dichte (OD) der Kultursuspension mit einem LP2W-Photometer der Firma Dr. Lange (Berlin, Deutschland) bei einer Messwellenlänge von 660 nm bestimmt.

Anschließend wird die Konzentration an gebildetem L-Lysin im steril filtrierten Kulturüberstand mit einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenreaktion mit Ninhydrindetektion bestimmt.

In Tabelle 4 ist das Ergebnis des Versuches dargestellt.

Tabelle 4

Beispiel 9 Ortsspezifische Mutagenese des poxB-Gens in dem E. coli Stamm B-1288

Der L-Valin produzierende E. coli Stamm AJ 11502 ist in der Patentschrift US-A-4391907 beschrieben und bei dem National Center for Agricultural Utilization Research (Peoria, Illinois, USA) als NRRL B-12288 hinterlegt.

Von Stamm AJ 11502 wird nach Kultur im Antibiotika-freien LB-Medium für ungefähr sechs Generationen ein plasmidfreies Derivat isoliert. Der entstandene Stamm ist Ampicillin sensitiv und wird als AJ11502kur bezeichnet.

Für den Austausch des chromosomalen poxB-Gens gegen das Plasmid-kodierte Deletionskonstrukt wird AJ11502kur mit dem Plasmid pMAK705ΔpoxB (Siehe Beispiel 2) transformiert. Der Genaustausch erfolgt mit dem von Hamilton et al. (1989) Journal of Bacteriology 174, 4617-4622) beschriebenen Selektionsverfahren und wird durch Standard-PCR-Methoden (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) mit folgenden Oligonukleotid Primern verifiziert:

Der erhaltene Stamm wird als AJ11502kurΔpoxB bezeichnet. Aus Stamm NRRL B-12288 wird das in der Patentschrift US-A-4391907 beschriebene Plasmid isoliert, welches die genetische Information bezüglich der Valin-Produktion trägt. Der Stamm AJ11502kurΔpoxB wird mit diesem Plasmid transformiert. Eine der erhaltenen Transformanten wird als B-12288ΔpoxB bezeichnet.

Beispiel 10 Herstellung von L-Valin mit dem Stamm B-12288ΔpoxB

Die Bildung von L-Valin durch die Stämme B-12288ΔpoxB und NRRL B-12288 wird in batch Kulturen von 10 ml, die in 100 ml Erlenmeierkolben enthalten sind, überprüft. Dazu wird 10 ml Vorkulturmedium der folgenden Zusammensetzung: 2 g/l Hefeextrakt, 10 g/l (NH₄)₂SO₄, 1 g/l KH₂PO₄, 0,5 g/l MgSO₄.7H₂O, 15 g/l CaCO₃, 20 g/l Glucose und 50 mg/l Ampicillin beimpft und für 16 Stunden bei 37°C und 180 rpm auf einem ESR Inkubator der Firma Kühner AG (Birsfelden, Schweiz) inkubiert. 250 µl dieser Vorkultur werden in 10 ml Produktionsmedium (25 g/l (NH₄)₂SO₄, 2 g/l KH₂PO₄, 1 g/l MgSO₄.7H₂O, 0,03 g/l FeSO₄.7H₂O, 0,018 g/l MnSO₄.1H₂O, 30 g/l CaCO₃, 20 g/l Glucose, 5 mg/l Thiamin und 50 mg/l Ampicillin) überimpft und für 72 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wird die optische Dichte (OD) der Kultursuspension mit einem LP2W-Photometer der Firma Dr. Lange (Berlin, Deutschland) bei einer Messwellenlänge von 660 nm bestimmt.

Anschließend wird die Konzentration an gebildetem L-Valin im steril filtrierten Kulturüberstand mit einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenreaktion mit Ninhydrindetektion bestimmt.

In Tabelle 5 ist das Ergebnis des Versuches dargestellt.

Tabelle 5

Beschreibung der Figuren

Fig. 1 pMAK705ΔpoxB (= pMAK705deltapoxB)

Fig. 2 pMW218gdhA

Fig. 3 pMW219rhtC

Längenangaben sind als ca. -Angaben aufzufassen. Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben folgende Bedeutung:
cat: Chloramphenicolresistenzgen
rep-ts: temperatursensitive Replikationsregion des Plasmides pSC101
poxB1: Teil der 5'-Region des poxB-Gens
poxB2: Teil der 3'-Region des poxB-Gens
kan: Kanamycinresistenzgen
gdhA: Glutamat-Dehydrogenase-Gen
rhtC: Threoninresistenz vermittelndes Gen

Die Abkürzungen für die Restriktionsenzyme haben folgende Bedeutung:
BamHI: Restriktionsendonuklease aus Bacillus amyloliquefaciens
BglII: Restriktionsendonuklease aus Bacillus globigii
ClaI: Restriktionsendonuklease aus Caryphanon latum
Ecl136II Restriktionsendonuklease aus Enterobacter cloacae RFL136 (= Ecl136)
EcoRI: Restriktionsendonuklease aus Escherichia coli
EcoRV: Restriktionsendonuklease aus Escherichia coli
HindIII: Restriktionsendonuklease aus Haemophilus influenzae
KpnI: Restriktionsendonuklease aus Klebsiella pneumoniae
PstI: Restriktionsendonuklease aus Providencia stuartii
PvuI: Restriktionsendonuklease aus Proteus vulgaris
SacI: Restriktionsendonuklease aus Streptomyces achromogenes
SalI: Restriktionsendonuklease aus Streptomyces albus
SmaI: Restriktionsendonuklease aus Serratia marcescens
XbaI: Restriktionsendonuklease aus Xanthomonas badrii
XhoI: Restriktionsendonuklease aus Xanthomonas holcicola

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Verfahren zur fermentativen Herstellung von L- Aminosäuren, dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Schritte durchführt:

a) Fermentation der die gewünschte L-Aminosäure produzierenden Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen man zumindest das poxB-Gen oder dafür kodierende Nukleotidsequenzen abschwächt, insbesondere ausschaltet,
b) Anreicherung der L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Bakterien, und
c) Isolieren der L-Aminosäure.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß L-Threonin, L-Valin oder L-Lysin hergestellt wird.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen einsetzt, in denen man zusätzlich weitere Gene des Biosyntheseweges der gewünschten L-Aminosäure verstärkt.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung der gewünschten L-Aminosäure verringern.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Expression des (der) Polynukleotides (e), das (die) für das poxB-Gen kodiert (kodieren) abschwächt, insbesondere ausschaltet.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die regulatorischen und/oder katalytischen Eigenschaften des Polypeptids (Enzymprotein) verringert, für das das Polynukleotid poxB kodiert.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von L-Aminosäuren Mikroorganismen der Familie Enterobactericeae fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe:

1. 7.1 das für die Aspartatkinase, die Homoserin- Dehydrogenase, die Homoserinkinase und die Threoninsynthase kodierende thrABC-Operon,
2. 7.2 das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende pyc- Gen,
3. 7.3 das für die Phosphoenolpyruvat-Synthase kodierende pps-Gen,
4. 7.4 das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxylase kodierende ppc-Gen,
5. 7.5 die für die Transhydrogenase kodierende Gene pntA und pntB,
6. 7.6 das Homoserinresistenz vermittelnde Gen rhtB,
7. 7.7 das für die Malat : Chinon Oxidoreduktase kodierende mqo-Gen,
8. 7.8 das Threoninresistenz vermittelnde Gen rhtC,
9. 7.9 das für den Threoninexport kodierende thrE-Gen, und
10. 7.10 das für die Glutamat-Dehydrogenase kodierende gdhA-Gen

verstärkt, insbesondere überexprimiert.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von L-Aminosäuren Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe:

1. 8.1 das für die Threonin-Dehydrogenase kodierende tdh- Gen,
2. 8.2 das für die Malat-Dehydrogenase kodierende mdh- Gen,
3. 8.3 das Genprodukt des offenen Leserahmens (orf) yjfA,
4. 8.4 das Genprodukt des offenen Leserahmens (orf) ytfP, und
5. 8.5 das für das Enzym Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende pckA-Gen,

abschwächt, insbesondere ausschaltet oder die Expression verringert.

9. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von L-Threonin den Stamm MG442ΔpoxB transformiert mit dem Plasmid pMW218gdhA, dargestellt in Fig. 2, einsetzt.

10. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von L-Threonin den Stamm MG442ΔpoxB transformiert mit dem Plasmid pMW219rhtC, dargestellt in Fig. 3, einsetzt.

11. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von L-Lysin den Stamm TOC21RΔpoxB einsetzt.

12. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von L-Valin den Stamm B-12288ΔpoxB einsetzt.

13. L-Aminosäuren produzierende Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen das poxB-Gen oder dafür kodierende Nukleotidsequenzen abgeschwächt, insbesondere ausgeschaltet sind, die eine Resistenz gegen α-Amino-β-Hydroxyvaleriansäure und gegebenenfalls eine kompensierbare partielle Bedürftigkeit für L- Isoleucin aufweisen.

14. Escherichia coli K-12 Stamm MG442ΔpoxB hinterlegt bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) unter der Nr. DSM 13762.

15. Plasmid pMAK705ΔpoxB, das Teile der 5'- und der 3'-Region des poxB-Gens, entsprechend SEQ ID No. 3, enthält, dargestellt in Fig. 1.

16. Plasmid pMW218gdhA dargestellt in Fig. 2.

17. Plasmid pMW219rhtC dargestellt in Fig. 3.

18. Isoliertes Polynukleotid aus Mikroorganismen der Familie Enterobactericeae, enthaltend eine für die 5'- und 3'-Region des poxB-Gens kodierende Polynukleotidsequenz dargestellt in SEQ ID No. 4 insbesondere geeignet als Bestandteil von Plasmiden für die ortsspezifische Mutagenese des poxB-Gens.

19. L-Threonin produzierende Stämme der Familie Enterobacteriaceae, enthaltend eine Mutation im poxB- Gen entsprechend SEQ ID No. 4.