DE10102823A1 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Threonin - Google Patents

Abstract

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Threonin unter Verwendung von Enterobacteriaceae, die insbesondere bereits L-Threonin produzieren und in denen die für das thrE-Gen codierende(n) Nukleotidsequenz(en) coryneformer Bakterien verstärkt, insbesondere überexprimiert, werden.

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Threonin unter Verwendung von Enterobacteriaceae, in denen das thrE-Gen coryneformer Bakterien verstärkt wird.

Stand der Technik

L-Threonin findet in der Tierernährung, in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie Anwendung. Es ist bekannt, daß L-Threonin durch Fermentation von Stämmen der Enterobacteriaceae, insbesondere Escherichia coli und Serratia marcescens, hergestellt werden kann. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet, Verfahrensbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen, wie z. B. Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien wie z. B. die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform, durch z. B. Ionenaustauschchromatographie, oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.

Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite wie z. B. das Threonin-Analogon α-Amino-β-Hydroxyvaleriansäure (AHV) oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Aminosäuren sind und L-Threonin produzieren.

Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung L-Threonin produzierender Stämme der Enterobacteriaceae eingesetzt, indem man einzelne Threonin-Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die L-Threonin-Produktion untersucht.

Aufgabe der Erfindung

Die Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von L- Threonin bereitzustellen.

Beschreibung der Erfindung

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Threonin unter Verwendung von Enterobacteriaceae, die insbesondere bereits L-Threonin produzieren und in denen die für das thrE-Gen codierende(n) Nukleotidsequenz(en) coryneformer Bakterien verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.

Insbesondere handelt es sich um ein Verfahren zur Herstellung von L-Threonin, dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Schritte durchführt:

• a) Fermentation von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae in denen zumindest das thrE-Gen coryneformer Bakterien verstärkt (überexprimiert) wird, ggf. in Kombination mit weiteren Genen,
• b) Anreicherung des L-Threonins im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, und
• c) Isolieren des L-Threonins.

Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor oder ein Gen verwendet, das für ein entsprechendes Enzym bzw. Protein mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.

Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können L-Threonin aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es handelt sich um Vertreter der Enterobacteriaceae, insbesondere der Gattungen Escherichia und Serratia. Bei der Gattung Escherichia ist insbesondere die Art Escherichia coli und bei der Gattung Serratia insbesondere die Art Serratia marcescens zu nennen.

Geeignete L-Threonin produzierende Stämme der Gattung Escherichia, insbesondere der Art Escherichia coli sind beispielsweise
Escherichia coli TF427
Escherichia coli H4578
Escherichia coli KY10935
Escherichia coli VNIIgenetika MG-442
Escherichia coli VNIIgenetika M1
Escherichia coli VNIIgenetika 472T23
Escherichia coli BKIIM B-3996
Escherichia coli kat 13
Escherichia coli KCCM-10132

Geeignete L-Threonin produzierende Stämme der Gattung Serratia, insbesondere der Art Serratia marcescens sind beispielsweise
Serratia marcescens HNr21
Serratia marcescens TLr156
Serratia marcescens T2000

Es wurde gefunden, daß Enterobacteriaceae nach Überexpression des für den Threoninexport kodierenden thrE- Gens coryneformer Bakterien in verbesserter Weise L- Threonin produzieren.

Nukleotidsequenzen des thrE-Gens coryneformer Bakterien sind in der SEQ ID No 1 und SEQ ID No 3 und die sich daraus ergebenden Aminosäuresequenzen der Exportproteine in SEQ ID No 2 und SEQ ID No 4 dargestellt.

Das in der SEQ ID No 1 und SEQ ID No 3 dargestellte thrE- Gen kann erfindungsgemäß verwendet werden. Weiterhin können Allele des thrE-Gens coryneformer Bakterien verwendet werden, die sich aus der Degeneriertheit des genetischen Codes oder durch funktionsneutrale Sinnmutationen (sense mutations) ergeben.

Zur Erzielung einer Überexpression kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich die Expression im Verlaufe der fermentativen L-Threonin-Produktion zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.

Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Chang und Cohen (Journal of Bacteriology 134: 1141-1156 (1978)), bei Hartley und Gregori (Gene 13: 347-353 (1981)), bei Amann und Brosius (Gene 40: 183-190 (1985)), bei de Broer et al. (Proceedings of the National of Sciences of the United States of America 80: 21-25 (1983)), bei LaVallie et al. (BIO/TECHNOLOGY 11, 187-193 (1993)), in PCT/US97/13359, bei Llosa et al. (Plasmid 26: 222-224 (1991)), bei Quandt und Klipp (Gene 80: 161-169 (1989)), bei Hamilton (Journal of Bacteriology 171: 4617-4622 (1989, bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.

In Enterobacteriaceae replizierbare Plasmidvektoren wie z. B. von pACYC184 abgeleitete Kloniervektoren (Bartolome et al.; Gene 102, 75-78 (1991)), pTrc99A (Amann et al.; Gene 69: 301-315 (1988)) beschriebenen wird, oder pSC201-Derivate (Vocke und Bastia, Proceedings of the National Academy of Science USA 80 (21): 6557-6561 (1983)) können verwendet werden. In einem erfindungsgemäßen Verfahren kann man einen mit einem Plasmidvektor transformierten Stamm einsetzen, wobei der Plasmidvektor die für das thrE-Gen coryneformer Bakterien codierende Nucleotidsequenz trägt.

Zusätzlich kann es für die Produktion von L-Threonin mit Stämmen der Familie Enterobacteriaceae vorteilhaft sein neben dem thrE-Gen coryneformer Bakterien ein oder mehrere Enzyme des bekannten Threonin-Biosyntheseweges oder Enzyme des anaplerotischen Stoffwechsels oder Enzyme für die Produktion von reduziertem Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid- Phosphat zu überexprimieren. So können beispielsweise

• - gleichzeitig das für die Aspartatkinase, die Homoserin- Dehydrogenase, die Homoserinkinase und die Threoninsynthase kodierende thrABC-Operon (US-A- 4,278,765), oder
• - gleichzeitig das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende pyc-Gen (DE-A-198 31 609), oder
• - gleichzeitig das für die Phosphoenolpyruvat-Synthase kodierende pps-Gen (Molecular and General Genetics 231: 332 (1992)), oder
• - gleichzeitig das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxylase kodierende ppc-Gen (Gene 31: 279-283 (1984)), oder
• - gleichzeitig die für die Transhydrogenase kodierenden Gene pntA und pntB (European Journal of Biochemistry 158: 647-653 (1986)), oder
• - gleichzeitig das für die Glutamat-Dehydrogenase kodierende gdhA-Gen (Gene 27: 193-199 (1984)), oder
• - gleichzeitig das L-Homoserinresistenz vermittelnde rhtB- Gen (EP-A-0994190)

verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.

Weiterhin kann es für die Produktion von L-Threonin vorteilhaft sein neben der Überexpression des thrE-Gens unerwünschte Nebenreaktionen wie z. B. die Threonin- Dehydrogenase auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982 und Bell und Turner, Biochemical Journal 156, 449-458 (1976)). In dem erfindungsgemäßen Verfahren können Bakterien eingesetzt werden in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung des L-Threonins verringern.

Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können im batch - Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.

Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten. Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.

Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff haltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 25°C bis 45°C und vorzugsweise bei 30°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt bis sich ein Maximum an L- Threonin gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.

Die Analyse von L-Threonin kann durch Anionenaustauschchromatographie mit anschließender Ninhydrin Derivatisierung erfolgen so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174) beschrieben.

Folgender Mikroorganismus wurde bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß Budapester Vertrag hinterlegt:

• - Brevibacterium flavum Stamm DM368-2 pZlthrE als DSM 12840

Das Plasmid pZ1thrE enthält das thrE-Gen von Corynebacterium glutamicum ATCC13032.

Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli sowie alle Techniken zur Restriktion, Klenow- und alkalische Phosphatasebehandlung wurden nach Sambrook et al. (Molecular cloning - A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press) durchgeführt. Die Transformation von Escherichia coli wurde, wenn nicht anders beschrieben, nach Chung et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1989) 86: 2172-2175) durchgeführt.

Die Bebrütungstemperatur bei der Herstellung von E. coli Stämmen und Transformanten war 37°C. Bei dem Genaustauschververfahren nach Hamilton et. al. (Journal of Bacteriology (1989) 171: 4617-4622) wurden Temperaturen von 30°C und 44°C verwendet.

Beispiel 1 Klonierung und Sequenzierung des thrE-Gens von Corynebacterium glutamicum ATCC14752 1. Transposonmutagenese und Mutantenauswahl

Der Stamm Corynebacterium glutamicum ATCC14752ΔilvA wurde einer Mutagenese mit dem Transposon Tn5531 unterworfen, dessen Sequenz unter der Accession-Nummer U53587 in der Nukleotid-Datenbank des National Center for Biotechnology Information (Bethesda, USA) hinterlegt ist. Der Einbau einer Deletion in das ilvA-Gen von Corynebacterium glutamicum ATC14752 wurde mit dem bei Schäfer et al. (Gene (1994) 145: 69-73) beschriebenen System zum Genaustausch durchgeführt. Dazu wurde der von Sahm et al. konstruierte Inaktivierungsvektor pKl9mobsacBΔilvA (Applied and Environmental Microbiology (1999) 65: 1973-1979) zur Deletion verwendet. Zunächst wurde der Methylase-defekte Escherichia coli Stamm SCS110 (Jerpseth und Kretz, STRATEGIES in molecular biology 6, 22, (1993)) der Firma Stratagene (Heidelberg, Deutschland) mit 200 ng des Vektors pK19mobsacBΔilvA transformiert. Transformanten wurden anhand ihrer Kanamycinresistenz auf 50 µg/mL Kanamycin enthaltenden LB-Agarplatten identifiziert. Aus einer der Transformanten wurde das Plasmid pK19mobsacBΔilvA präpariert. Mittels Elektroporation (Haynes et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 61: 329-334) wurden dieses Inaktivierungsplasmid dann in den Stamm Corynebacterium glutamicum ATCC14752 eingebracht. Klone, bei denen der Inaktivierungsvektor im Genom integriert vorlag, wurden anhand ihrer Kanamycinresistenz auf 15 µg/mL Kanamycin enthaltenden LBHIS-Agarplatten identifiziert (Liebl et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 65: 299-304). Um auf die Excision des Vektors zu selektieren, wurden Kanamycin­ resistente Klone auf Saccharose-haltigem LBG-Medium (LB- Medium mit 15 g/L Agar, 2% Glukose und 10% Saccharose) ausplattiert. Dabei wurden Kolonien erhalten, welche den Vektor durch ein zweites Rekombinationsereignis wieder verloren haben (Jäger et al.; Journal of Bacteriology (1992) 174: 5462-5465). Durch Überimpfen auf Minimalmediumplatten (CGXII-Medium mit 15 g/L Agar (Keilhauer et al., Journal of Bacteriology (1993) 175: 5595-5603)) mit und ohne 300 mg/L L-Isoleucin, bzw. mit und ohne 50 µg/mL Kanamycin wurden sechs Klone isoliert, die durch Excision des Vektors Kanamycin sensitiv und Isoleucin auxotroph waren und bei denen nun das unvollständige ilvA- Gen (ΔilvA-Allel) im Genom vorlag. Einer dieser Klone wurde als Stamm ATCC1475ΔilvA bezeichnet und zur Transposonmutagenese eingesetzt.

Aus dem Methylase-defekten E. coli-Stamm GM2929pCGL0040 (E. coli GM2929: Palmer et al., Gene (1994) 143: 1-12) wurde das Plasmid pCGL0040 (Fig. 1) isoliert, welches das zusammengesetzte Transposon Tn5531 enthält (Ankri et al., Journal of Bacteriology (1996) 178: 4412-4419). Der Stamm Corynebacterium glutamicum ATCC14752AilvA wurde mittels Elektroporation (Haynes et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 61: 329-334) mit dem Plasmid pCGL0040 transformiert. Klone, bei denen das Transposon Tn5531 ins Genom integriert war, wurden anhand ihrer Kanamycinresistenz auf 15 µg/mL Kanamycin enthaltenden LBHIS-Agarplatten identifiziert (Liebl et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 65: 299-304). Auf diese Weise wurden 2000 Klone erhalten, welche auf verzögertes Wachstum in Anwesenheit von Threonyl­ threonyl-threonin überprüft wurden. Dazu wurden alle Klone einzeln auf CGXII-Minimalmedium-Agarplatten mit und ohne 2 mM Threonyl-threonyl-threonin übertragen. Das Medium war identisch mit dem bei Keilhauer et al. beschriebenen Medium CGXII (Journal of Bacteriology (1993) 175: 5593-5603), enthielt aber zusätzlich 25 µg/mL Kanamycin, 300 mg/L L- Isoleucin und 15 g/L Agar. Die Zusammensetzung des von Keilhauer et al. beschriebenen Mediums ist in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1

Zusammensetzung des Mediums CGXII

Die Agarplatten wurden bei 30°C inkubiert und das Wachstum nach 12, 18 und 24 Stunden untersucht. Es wurde eine Transposonmutante erhalten, die ohne Threonyl-threonyl­ threonin vergleichbar mit dem Ausgangsstamm Corynebacterium glutamicum ATCC14752ΔilvA wuchs, in Anwesenheit von 2 mM Threonyl-threonyl-threonin aber verzögertes Wachstum zeigte. Diese wurde als ATCC14752ΔilvAthrE: :Tn5531 bezeichnet.

2. Klonierung und Sequenzierung des Insertionsortes von Tn5531 in ATCC14752ΔilvAthrE: :Tn5531

Um den stromaufwärts des Transposons Tn5531 gelegenen Insertionsort in der in Beispiel 1.1 beschriebenen Mutante zu klonieren, wurde zunächst die chromosomale DNA dieses Mutantenstammes wie bei Schwarzer et al. (Bio/Technology (1990) 9: 84-87) beschrieben isoliert und 400 ng davon mit der Restriktionsendonuklease EcoRI geschnitten. Der vollständige Restriktionsansatz wurde in den ebenfalls mit EcoRI linearisierten Vektor pUC18 (Norander et al., Gene (1983) 26: 101-106) der Firma Roche Diagnostics (Mannheim, Deutschland) ligiert. Mit dem gesamten Ligationsansatz wurde der E. coli Stamm DH5αmcr (Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645-4649) mittels Elektroporation transformiert (Dower et al., Nucleic Acid Research (1988) 16: 6127-6145). Transformanten, bei denen auf dem Vektor pUC18 die Insertionsorte des Transposons Tn5531 kloniert vorlagen, wurden anhand ihrer Carbenicillin- und Kanamycinresistenz auf 50 µg/mL Carbenicillin und 25 µg/mL Kanamycin enthaltenden LB-Agarplatten identifiziert. Aus drei der Transformanten wurden die Plasmide präpariert und durch Restriktionsanalyse die Größen der klonierten Inserts bestimmt. Die Nukleotidsequenz des Insertionsortes auf einem der Plasmide mit einem ca. 5,7 kb großen Insert wurde nach der Dideoxy-Kettenabbruchmethode von Sanger et al. bestimmt (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1977) 74: 5463-5467). Hierzu wurden 2,2 kb des Inserts ausgehend von folgendem Oligonukleotid-Primer sequenziert: 5'-CGG GTC TAC ACC GCT AGC CCA GG-3'.

Zur Identifizierung des stromabwärts des Transposons gelegenen Insertionsortes wurde die chromosomale DNA der Mutante mit der Restriktionsendonuklease XbaI geschnitten und in den mit XbaI linearisierten Vektor pUC18 ligiert. Die weitere Klonierung wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Die Nukleotidsequenz des Insertionsortes auf einem der Plasmide mit einem ca. 8,5 kb großen Insert wurde nach der Dideoxy-Kettenabbruchmethode von Sanger et al. bestimmt (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1977) 74: 5463-5467). Hierzu wurden 0,65 kb des Inserts ausgehend von folgendem Oligonukleotid-Primer sequenziert: 5'-CGG TGC CTT ATC CAT TCA GG-3'.

Die erhaltenen Nukleotidsequenzen wurde mit dem Programmpaket Lasergene (Biocomputing Software for Windows, DNASTAR, Madison, USA) analysiert und zusammengefügt. Diese Nukleotidsequenz ist als SEQ ID NO 1 wiedergegeben. Die Analyse ergab die Identifizierung eines offenen Leserasters von 1467 bp Länge. Das entsprechende Gen wurde als thrE-Gen bezeichnet. Das dazugehörige Genprodukt umfasst 489 Aminosäuren und ist als SEQ ID NO 2 wiedergegeben.

Beispiel 2 Klonierung und Sequenzierung des Gens thrE aus Corynebacterium glutamicum ATCC13032

Das Gen thrE wurde in den E. coli Klonierungsvektor pUC18 (Norrander et al., Gene (1983) 26: 101-106, Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) kloniert. Die Klonierung wurde in zwei Schritten durchgeführt. Zunächst wurde durch eine Polymerasekettenreaktion (PCR) das Gen aus Corynebacterium glutamicum ATCC13032 mittels folgender aus SEQ ID NO 1 abgeleiteter Oligonukleotid-Primer amplifiziert.
thrE-forward:
5'-CCC CTT TGA CCT GGT GTT ATT G-3'
thrE-reverse:
5'-CGG CTG CGG TTT CCT CTT-3'

Die PCR-Reaktion wurde in 30 Zyklen in Gegenwart von 200 µM Deoxynukleotid-triphosphaten (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), je 1 µM des entsprechenden Oligonukleotids, 100 ng chromosomaler DNA von Corynebacterium glutamicum ATCC13032, 1/10 Volumen 10-fach Reaktionspuffer und 2,6 Einheiten einer hitzestabilen Taq-/Pwo-DNA-Polymerase-Mischung (Expand High Fidelity PCR System der Firma Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) in einem Thermocycler (PTC-100, MJ Research, Inc., Watertown, USA) unter folgenden Bedingungen durchgeführt: 94°C für 30 Sekunden, 58°C für 30 Sekunden und 72°C für 2 Minuten.

Das amplifizierte etwa 1,9 kb große Fragment wurde dann im folgenden mit Hilfe des SureClone Ligation Kit (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) nach Angaben des Herstellers in die SmaI-Schnittstelle des Vektors pUC18 ligiert. Mit dem gesamten Ligationsansatz wurde der E. coli Stamm DH5αmcr (Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645-4649) transformiert. Transformanten wurden anhand ihrer Carbenicillinresistenz auf 50 µg/mL Carbenicillin enthaltenden LB-Agarplatten identifiziert. Aus 8 der Transformanten wurden die Plasmide präpariert und durch Restriktionsanalyse auf das Vorhandensein des 1,9 kb PCR-Fragments als Insert überprüft. Das so entstandene rekombinante Plasmid wird im folgenden mit pUC18thrE bezeichnet.

Die Nukleotidsequenz des 1,9 kb PCR-Fragments in Plasmid pUClBthrE wurde nach der Dideoxy-Kettenabbruchmethode von Sanger et al. bestimmt (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1977) 74: 5463-5467). Hierzu wurde das vollständige Insert von pUClBthrE mit Hilfe folgender Primer der Firma Roche Diagnostics (Mannheim, Deutschland) sequenziert.
Universalprimer:
5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3'
Reverseprimer:
5'-GGA AAC AGC TAT GAC CAT G-3'

Die Nukleotidsequenz ist als SEQ ID NO 3 wiedergegeben. Die erhaltene Nukleotidsequenz wurde mit dem Programmpaket Lasergene (Biocomputing Software for Windows, DNASTAR, Madison, USA) analysiert. Die Analyse ergab die Identifizierung eines offenen Leserasters von 1467 bp Länge, das als thrE-Gen bezeichnet wurde. Dieses kodiert für ein Polypeptid von 489 Aminosäuren, welches als SEQ ID NO 4 wiedergegeben ist.

Beispiel 3 Expression des Gens thrE in Corynebacterium glutamicum

Das unter Beispiel 2 beschriebene Gen thrE aus Corynebacterium glutamicum ATCC13032 wurde zur Expression in den Vektor pZ1 kloniert (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554). Dazu wurde aus dem Plasmid pUC18thrE mit den Restriktionsenzymen SacI und XbaI ein 1881 bp großes, das Gen thrE enthaltendes DNA- Fragment ausgeschnitten. Die 5'- und 3'-Enden dieses Fragments wurden mit Klenow-Enzym behandelt. Das resultierende DNA-Fragment wurde in den zuvor mit ScaI linearisierten und dephosphorylierten Vektor pZl ligiert. Mit dem gesamten Ligationsansatz wurde der E. coli Stamm DH5αmcr (Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645-4649) transformiert. Transformanten wurden anhand ihrer Kanamycinresistenz auf 50 µg/mL Kanamycin enthaltenden LB-Agarplatten identifiziert. Aus 2 Transformanten wurden die Plasmide präpariert und durch Restriktionsanalyse auf das Vorhandensein des 1881 bp ScaI/XbaI-Fragments als Insert überprüft. Das auf diese Weise entstandene rekombinante Plasmid wurde als pZ1thrE bezeichnet (Fig. 2)

Mittels Elektroporation (Haynes et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 61: 329-334) wurden das Plasmid pZ1thrE in den threoninbildenden Stamm Brevibacterium flavum DM368-2 eingebracht. Der Stamm DM368-2 ist in der EP-B-0 385 940 beschrieben und als DSM5399 hinterlegt. Transformanten wurden anhand ihrer Kanamycinresistenz auf 15 µg/mL Kanamycin enthaltenden LBHIS-Agarplatten identifiziert (Liebl et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 65: 299-304). Auf diese Weise entstanden der Stamm Brevibacterium flavum DM3EB-2 pZ1thrE.

Beispiel 4 Konstruktion des Expressionsplasmids pTrc99AthrE

Das unter Beispiel 2 beschriebene thrE-Gen aus Corynebacterium glutamicum ATCC13032 wurde zur Expression in Escherichia coli in den Vektor pTrc99A kloniert, der von der Firma Pharmacia Biotech (Uppsala, Schweden) bezogen wurde. Dazu wurde das Plasmid pUC18thrE mit dem Enzym SalI gespalten und die überstehenden 3'-Enden mit dem Klenow- Enzym behandelt. Nach der Restriktion mit dem Enzym KpnI wurde der Spaltungsansatz im 0,8%igen Agarosegel aufgetrennt und das 1,9 kbp große thrE-Fragment mit Hilfe des QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Der Vektor pTrc99A wurde mit dem Enzym EcoRI gespalten, die 3'-Enden mit dem Klenow-Enzym behandelt, mit dem Enzym KpnI gespalten und mit dem isolierten thrE-Fragment ligiert. Der Ligationsansatz wurde in den E. coli Stamm DH5α transformiert. Die Selektion pTrc99A tragender Zellen erfolgte auf LB Agar (Lennox, Virology 1: 190 (1955)), der mit 50 µg/ml Ampicillin versetzt war. Die erfolgreiche Klonierung des thrE-Gens konnte nach der Plasmid-DNA-Isolierung und Kontrollspaltung mit XbaI, BamHI, EcoRI, HindIII und SspI nachgewiesen werden. Das Plasmid wurde als pTrc99AthrE (Fig. 3) bezeichnet.

Beispiel 5 Herstellung von L-Threonin mit dem Stamm MG442/pTrc99AthrE

Der L-Threonin produzierende E. coli Stamm MG442 ist in der Patentschrift US-A- 4,278,765 beschrieben und bei der Russischen Nationalsammlung für industrielle Mikroorganismen (VKPM, Moskau, Russland) als CMIM B-1628 hinterlegt.

Der Stamm MG442 wurde mit dem Plasmid pTrc99AthrE transformiert und auf LB Agar mit 50 µg/ml Ampicillin Plasmid tragende Zellen selektioniert. Ausgewählte Einzelkolonien wurden anschließend auf Minimalmedium mit der folgenden Zusammensetzung: 3,5 g/l Na₂HPO₄.2H₂O, 1,5 g/l KH₂PC₄, 1 g/l NH₄Cl, 0,1 g/l MgSO₄.7H₂O, 2 g/l Glucose, 20 g/l Agar, 50 mg/l Ampicillin, weiter vermehrt. Die Bildung von L-Threonin wurde in batch Kulturen von 10 ml, die in 100 ml Erlenmeierkolben enthalten waren, überprüft. Dazu wurde 10 ml Vorkulturmedium der folgenden Zusammensetzung: 2 g/l Hefeextrakt, 10 g/l (NH₄)₂SO₄, 1 g/l KH₂PO₄, 0,5 g/l MgSO₄.7H₂O, 15 g/l CaCO₃, 20 g/l Glucose, 50 mg/l Ampicillin, beimpft und für 16 Stunden bei 37°C und 180 rpm auf einem ESR Inkubator der Firma Kühner AG (Birsfelden, Schweiz) inkubiert. Je 250 µl dieser Vorkultur wurden in 10 ml Produktionsmedium (25 g/l (NH₄)₂SO₄, 2 g/l KH₂PO₄, 1 g/l MgSO₄.7H₂O, 0,03 g/l FeSO₄.7H₂O, 0,018 g/l MnSO₄. 1H₂O, 30 g/l CaCO₃, 20 g/l Glucose) überimpft und für 48 Stunden bei 37°C inkubiert. Zur Induktion der Expression des thrE-Gens wurde in Parallelansätzen 200 mg/l Isopropyl-β-D­ thiogalaktosid (IPTG) hinzugefügt. Nach der Inkubation wurde die optische Dichte (OD) der Kultursuspension mit einem LP2 W-Photometer der Firma Dr. Lange (Berlin, Deutschland) bei einer Messwellenlänge von 660 nm bestimmt.

Anschließend wurde die Konzentration an gebildetem L- Threonin im steril filtrierten Kulturüberstand mit einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenreaktion mit Ninhydrindetektion bestimmt.

In Tabelle 2 ist das Ergebnis des Versuches dargestellt.

Tabelle 2

Beispiel 6 Herstellung von L-Threonin mit dem Stamm B-3996kurΔtdh/pVIC40, pMW218thrE

Der L-Threonin produzierende E. coli Stamm B-3996 ist in US-A- 5,175,107 beschrieben und bei der Russischen Nationalsammlung für industrielle Mikroorganismen (VKPM, Moskau, Russland) hinterlegt.

6.1 Klonierung des thrE-Gens in den Plasmidvektor pMW218

Das unter Beispiel 4 beschriebene Plasmid pTrc99AthrE wurde mit dem Enzym Sspl gespalten, der Spaltungsansatz im 0,8%igen Agarosegel aufgetrennt und das 2,5 kbp große DNA- Fragment, das neben dem thrE-Gen die trc-Promotorregion und die rRNA-Terminator-Region enthält, mit Hilfe des "QIAquick Gel Extraction Kit" (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Das Plasmid pMW218 (Nippon Gene, Toyama, Japan) wurde mit dem Enzym SmaI gespalten und mit dem thrE-Fragment ligiert. Der E. coli Stamm DH5α wurde mit dem Ligationsansatz transformiert und pMW218 tragende Zellen durch Ausplattieren auf LB Agar, der mit 20 µg/ml Kanamycin versetzt ist, selektioniert. Die erfolgreiche Klonierung des thrE-Gens konnte nach Plasmid DNA-Isolierung und Kontrollspaltung mit HindIII und ClaI nachgewiesen werden. Das Plasmid wurde als pMW21BthrE (Fig. 4) bezeichnet.

6.2 Herstellung des Stammes B-3996kurΔtdh/pVIC40, pMW218thrE

Von Stamm B-3996 wurde, nach Kultur im Antibiotika-freien Vollmedium für ungefähr zehn Generationen, ein Derivat isoliert, das das Plasmid pVIC40 nicht mehr enthielt. Der entstandene Stamm ist Streptomycin-sensitiv und wurde als B-3996kur bezeichnet.

Zum Einbau einer Deletion in das tdh-Gen wurde die von Hamilton et al. (Journal of Bacteriology (1989) 171: 4617-9622) beschriebene Methode eingesetzt, die auf der Verwendung des Plasmids pMAK705 mit einem temperatursensitiven Replikon beruht. Das Plasmid pDR121 (Ravnikar und Somerville, Journal of Bacteriology (1987) 169: 4716-4721) enthält ein 3,7 Kilo-Basenpaare (kbp) großes DNA-Fragment aus E. coli, auf dem das tdh-Gen kodiert ist. Zur Erzeugung einer Deletion des tdh- Genbereiches wurde pDR121 mit den Restriktionsenzymen ClaI und EcoRV gespalten und das isolierte 5 kbp große DNA- Fragment nach Behandlung mit dem Klenow-Enzym ligiert. Der Ligationsansatz wurde in den E. coli Stamm DH5α transformiert und Plasmid tragende Zellen auf LB Agar, der mit 50 µg/ml Ampicillin versetzt ist, selektioniert.

Die erfolgreiche Deletion des tdh-Gens konnte nach der Plasmid-DNA Isolierung und Kontrollspaltung mit EcoRI nachgewiesen werden. Das 1,7 kbp große EcoRI-Fragment wurde isoliert und mit dem Plasmid pMAK705, das partiell mit EcoRI verdaut wurde, ligiert. Der Ligationsansatz wurde in DH5α transformiert und Plasmid tragende Zellen auf LB Agar, der mit 20 µg/ml Chloramphenicol versetzt war, selektioniert. Die erfolgreiche Klonierung wurde nach Plasmid-DNA Isolierung und Spaltung mit EcoRI nachgewiesen. Das entstandene pMAK705 Derivat wurde als pDM32 bezeichnet.

Für den Genaustausch wurde B-3996kur mit dem Plasmid pDM32 transformiert. Der Austausch des chromosomalen tdh-Gens gegen das Plasmid-kodierte Deletionskonstrukt erfolgte mit dem von Hamilton et al. beschriebenen Selektionsverfahren und wurde durch Standard-PCR-Methoden (Innis et al. (1990), PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) mit folgenden Oligonukleotid Primern verifiziert:

Der entstandene Stamm wurde auf Kanamycin-Sensitivität getestet und als B-3996kurΔtdh bezeichnet.

B-3996kurΔtdh wurde mit dem aus B-3996 isolierten Plasmid pVIC40 transformiert und auf LB-Agar supplementiert mit 20 µg/ml Streptomycin Plasmid tragende Zellen selektioniert. Eine ausgewählte Einzelkolonie wurde als B- 3996kurΔtdh/pVIC40 bezeichnet und mit dem Plasmid pMW218thrE transformiert. Die Selektion erfolgt auf LB- Agar, der mit 20 µg/ml Streptomycin und mit 50 µg/ml Kanamycin versetzt ist. Der so entstandene Stamm wurde als B-3996kurΔtdh/pVIC40, pMW218thrE bezeichnet.

6.3 Herstellung von L-Threonin

Die Herstellung von L-Threonin durch die Stämme B-3996kurΔtdh/pVIC40 und B-3996kurΔtdh/pVIC40, pMW218thrE wurde wie im Beispiel 5 beschrieben geprüft. Das Minimalmedium, das Vorkulturmedium und das Produktionsmedium wurden für B-3996kurΔtdh/pVIC40 mit 20 µg/ml Streptomycin und für B-3996kurΔtdh/pVIC40, pMW218thrE mit 20 µg/ml Streptomycin und 50 µg/ml Kanamycin supplementiert.

In Tabelle 3 ist das Ergebnis des Versuches zusammengefasst.

Tabelle 3

Folgende Figuren sind beigefügt:

Fig. 1 Karte des das Transposon Tn5531 enthaltenden Plasmids pCGL0040. Das Transposon ist als nicht schraffierter Pfeil gekennzeichnet.

Fig. 2 Karte des das thrE-Gen enthaltenden Plasmids pZ1thrE.

Fig. 3 Karte des das thrE-Gen enthaltenden Plasmids pTrc99AthrE.

Fig. 4 Karte des das thrE-Gen enthaltenden Plasmids pMW218thrE

Längenangaben sind als ca. -Angaben aufzufassen. Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben folgende Bedeutung:
Amp: Ampicillinresistenzgen
Kan: Kanamycinresistenzgen
'amp: 3'-Teil des Ampicillinresistenzgens
oriBR322: Replikationsregion des Plasmides pBR322
lacI: Gen für das Repressorprotein des trc-Promotors
Ptrc: trc-Promotorregion, IPTG-induzierbar
5S: 5S rRNA-Region
rrnBT: rRNA-Terminator-Region

Die Abkürzungen für die Restriktionsenzyme haben folgende Bedeutung
BamHI: Restriktionsendonuklease aus Bacillus amyloliquefaciens
BglII: Restriktionsendonuklease aus Bacillus globigii
ClaI: Restriktionsendonuklease aus Caryphanon latum
EcoRI: Restriktionsendonuklease aus Escherichia coli
EcoRV: Restriktionsendonuklease aus Escherichia coli
HindIII: Restriktionsendonuklease aus Haemophilus influenzae
KpnI: Restriktionsendonuklease aus Klebstella pneumoniae
PstI: Restriktionsendonuklease aus Providencia stuartii
PvuI: Restriktionsendonuklease aus Proteus vulgaris
SacI: Restriktionsendonuklease aus Streptomyces achromogenes
SalI: Restriktionsendonuklease aus Streptomyces albus
SmaI: Restriktionsendonuklease aus Serratia marcescens
XbaI: Restriktionsendonuklease aus Xanthomonas badrii
XhoI: Restriktionsendonuklease aus Xanthomonas holcicola

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (18)

1. Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Threonin dadurch gekennzeichnet, daß man Enterobacteriaceae Bakterien einsetzt, insbesondere solche die bereits L- Threonin produzieren und in denen man die für das thrE-Gen codierende(n) Nukleotidsequenz(en) coryneformer Bakterien verstärkt, insbesondere überexprimiert.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zusätzlich zu den thrE-Genen, weitere Gene verstärkt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae aus der Gattung Escheria und Serratia sind.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismen aus der Gattung Escheria, insbesondere der Art Escheria coli sind.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man gleichzeitig das für die Aspartatkinase, die Homoserin-Dehydrogenase, die Homoserinkinase und die Threoninsynthase kodierende thrABC-Operon verstärkt.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man gleichzeitig das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende pyc-Gen verstärkt.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man gleichzeitig das für die Phosphoenolpyruvat- Synthase kodierende pps-Gen verstärkt.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man gleichzeitig das für die Phosphoenolpyruvat- Carboxylase kodierende ppc-Gen verstärkt.

9. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man gleichzeitig die für die Transhydrogenase kodierenden Gene pntA und pntB verstärkt.

10. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterien einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung des L-Threonins verringern.

11. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen mit einem Plasmidvektor transformierten Stamm einsetzt, und der Plasmidvektor die für das thrE-Gen coryneformer Bakterien codierende Nucleotidsequenz trägt.

12. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man mit dem Plasmid pZ1thrE transformierte Bakterien einsetzt.

13. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Expression des thrE-Gens induziert, insbesondere mit Isopropyl-β-D-thiogalaktosid.

14. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man gleichzeitig das für die Glutamat- Dehydrogenase kodierende gdhA-Gen verstärkt.

15. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man gleichzeitig das Homoserinresistenz vermittelnde rhtB-Gen verstärkt.

16. Verfahren zur Herstellung von L-Threonin, dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Schritte durchführt:

• a) Fermentation von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae in denen zumindest das thrE-Gen coryneformer Bakterien verstärkt (überexprimiert) wird, ggf. in Kombination mit weiteren Genen,
• b) Anreicherung des L-Threonins im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, und
• c) Isolieren des L-Threonins.

17. Plasmid pZ1thrE welches das thrE-Gen von Corynebacterium glutamicum ATCC13032 enthält.

18. Brevibacterium flavum Stamm DM368-2 pZ1thrE als DSM 12840 hinterlegt bei der DSMZ, Braunschweig.