DE10081928B4

DE10081928B4 - 6-O-Acetylmorphin (6MAM)-Analoge Verbindungen, welche zur Verwendung in Immuntests geeignet sind, hiergegen gewonnene Antikörper, deren Herstellung sowie Reagentien und Reagenssysteme, die diese umfassen

Info

Publication number: DE10081928B4
Application number: DE10081928T
Authority: DE
Inventors: Gerald F. Carmel Sigler; Riaz Concord Rouhani
Original assignee: Microgenics Corp
Current assignee: Microgenics Corp
Priority date: 1999-06-18
Filing date: 2000-06-16
Publication date: 2006-06-08
Anticipated expiration: 2020-06-17
Also published as: GB2358019B; GB2358019A; WO2000078763A3; US6262265B1; DE10081928T1; AU6404500A; WO2000078763A2; GB0103509D0

Abstract

6-O-Acetylmorphin(6MAM)-analoge Verbindungen mit der folgenden Struktur:

sowie deren Salze,
worin X -O-, -S-, -NH- oder -CH₂- ist, und
worin R ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:

worin K -CH₃, -CF₃, -CHF₂ oder -CH₂F ist;
unter der Voraussetzung, daß, wenn R

ist und K -CH₃ ist, X nicht -O- ist und
Q -L¹-Z ist, wobei L¹ ein Linker ist, der wenigstens ein Kohlenstoffatom enthält;
worin Z ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus den Komponenten
-NH₂,
-COOH,
-SH,

-NH-C(=O)-L²-M,

oder irgendeiner Kombination oder Wiederholung der Komponenten;
wobei L² ein Linker ist, der wenigstens ein Kohlenstoffatom enthält; wobei M ein Halogenid oder Maleinimid ist; und worin J -O-, -S-, -NH- oder -CH₂- ist.

Description

TECHNISCHES GEBIET
Diese Erfindung betrifft im allgemeinen das Gebiet der Bestimmung von Drogenmetaboliten in biologischen Proben. Insbesondere stellt diese ein System aus Analogen, Konjugaten und spezifischen Antikörpern zur Verfügung, welche in Testsystemen zum spezifischen Nachweis oder zur Quantifizierung eines Heroinmißbrauchs verwendet werden können.

HINTERGRUND

Ein Testen auf einen Heroinmißbrauch wird durch die Tatsache kompliziert, daß Heroin einem schnellen Stoffwechsel zu 6-O-Acetylmorphin (ebenfalls bekannt als 6-Monoacetylmorphin, 6MAM) unterliegt. Nach einer intramuskulären Verabreichung von Heroin erscheint 6MAM fast unmittelbar im Urin. Die Spiegel von 6MAM im Urin bleiben für ca. 8 Stunden positiv, wie durch Standardtechniken, wie z.B. GC/MS, nachgewiesen wird (Cone et al., Anal. Toxicol. 15: 1, 1991). Heroin wird dann zu Morphin abgebaut, welches ein Metabolit anderer Opiate, wie z.B. von Codein, ist.

Eine Anzahl von Tests wurde entwickelt, um Opiate in biologischen Proben zu messen. Im allgemeinen waren Immuntests bei der Unterscheidung zwischen 6MAM und verwandten Verbindungen nicht erfolgreich. Andere Opiatmetaboliten, wie z.B. Morphin-4-glucuronid und Morphin-6-glucuronid, können mit Spiegeln vorliegen, die ungefähr vier oder fünf Größenordnungen höher sind als bei 6MAM. Die Forscher mußten auf beschwerlichere und teurere Techniken zurückgreifen, um die Identität eines Opiates in einer unbekannten Probe zu bestimmen.

Solans et al. (J. Pharmaceut. Biomed. Anal. 8: 905, 1990) bestimmten verschiedene Opiate, einschließlich 6MAM, im Urin, indem sie GC-MS verwendeten. Jenkens et al. (J. Anal. Toxicol. 22: 173, 1998) verwendeten GC-MS, um 6MAM in der postmortalen Cerebrospinalflüssigkeit nachzuweisen. Bogusz et al. verwendeten eine chemische Ionisierungs-Massenspektrometrie-Flüssigchromatographie, um 6MAM und andere Morphinmetaboliten in Proben zu bestimmen, die bei einer Autopsie von Opfern einer Überdosis gesammelt wurden. Zuccaro et al. (J. Anal. Toxicol. 21: 268, 1997) beschreiben die gleichzeitige Bestimmung von 6MAM, Morphinglucuroniden und anderen Opiaten durch Flüssigchromatographie-Atmosphärendruck-Ionensprüh-Massenspektrometrie.

Holt et al. (Anal. Chem. 68: 1877, 1996) berichten über einen Biolumineszenztest auf Heroin und seine Metaboliten. Der Test basiert auf Heroinesterase und Morphindehydrogenase, wobei bakterielle Luciferase aus Vibrio harveyi verwendet wird. Heroin, Morphin und Codein werden alle nachgewiesen.

Die internationale Patentschrift WO 93/20079 (Buechler et al.) berichtet von Opiatderivaten und Proteinkonjugaten. In deren synthetischen Verbindungen ist die Gruppe an der 6-O-Position typischerweise H-, CH₃(CO)- oder CH₃CH₂-. Einige der Konjugate werden als Immunogene vorgeschlagen; aber von der Fähigkeit der erhaltenen Antikörper, zwischen Opiaten zu unterscheiden, wird nicht berichtet.

Die europäische Patentanmeldung EP 0 363 041-A1 (Uda et al.) berichtet von monoklonalen Antikörpern gegen Morphin, die unter Verwendung eines N-(4-Brombutyl)-Derivats hergestellt wurden. Es wird von einem Immuntest berichtet, welcher den Antikörper und ein BSA-Normorphin-Konjugat verwendet. Die Kreuzreaktivität zwischen Morphin und jeweils Kokain, Codein, Dihydrocodein, Ethylmorphin, Fentanyl oder Methadon wird als <1,0 % oder besser angegeben, was von dem getesteten Antikörper abhängt.

Das US-Patent 4 064 228 (Gross et al.) berichtet über Antigene und Immuntests auf Morphin und verwandte Verbindungen.

3-Oxybenzomorphan-Derivate werden mit immunogenen Trägern konjugiert, indem eine Verknüpfungsstelle an einer Arylgruppe verwendet wird, und verwendet, um Antikörper zu erzeugen. Von den Tests wird berichtet, daß diese hauptsächlich mit Morphin reagieren, bei einer 11 %-igen Kreuzreaktivität gegenüber Codein und einer 7 %-igen Kreuzreaktivität gegenüber Monoacetylmorphin.

Fogerson et al. (J. Anal. Toxicol. 21: 451, 1997) beschreiben den qualitativen Nachweis von Opiaten, wie z.B. Heroin, 6MAM und Morphin, in Schweiß. Ein Immuntest wurde durchgeführt, indem ein Enzym-Immuntestkit von STC Technologies verwendet wurde. Während der Test bezüglich Morphin standardisiert war, reagierte er ebenfalls mit 6MAM (30 % Kreuzreaktivität), Hydrocodon (143 %) und Codein (588 %). Eine Unterscheidung zwischen den Opiaten war nur unter Verwendung von GC-MS möglich. In ähnlicher Weise wird der Schweißtest von Kintz et al. (Clin. Chem. 43: 736, 1997) ausschließlich mittels GC-MS durchgeführt.

Moeller et al. (Forensic Sci. Int. 70: 125, 1995) berichten über den Nachweis von 6MAM in biologischen Proben mittels GC/MS und einem Radioimmuntest. Der verwendete Radioimmuntest wurde in Form eines Kits von der Diagnostic Products Corporation erhalten. 4 dieses Artikels zeigt die Reaktivität potentiell störender Substanzen im Vergleich zu 6MAM. Auf der Grundlage von 50 % B/Bo-Punkten, beträgt die Kreuzreaktivität mit Heroin ~50 %, mit Morphin ~30 % und mit Morphin-6-glucuronid ~20 %. Reaktivitäten mit Codein werden an dem 50 %-Punkt nicht titriert, aber Codein und andere störende Substanzen sind klar nachweisbar.

Vorzuziehen gegenüber Separationsimmuntests (bei welchen Antikörper verwendet werden, um den Analyten einzufangen) sind Tests vom homogenen Typ, bei welchem Analyt-Antikörper-Komplexe in situ nachgewiesen werden. Ein besonders wirksames homogenes Testsystem ist der Immuntest mit kloniertem Enzymdonor (CEDIA^®), welcher in dem US-Patent Nr. 4 708 929 und in Henderson, Clin. Chem. 32: 1637, 1986 beschrieben wird. In einer bevorzugten Form des CEDIA^®-Tests assoziieren zwei Untereinheiten des Enzyms β-Galactosidase, wobei diese ein nachweisbares Signal liefern, welches quantitativ durch den Analytenspezifischen Antikörper beeinflußt wird, außer bei dem Vorliegen einer Probe, die freien Analyten enthält.

Spezifische Immuntests jeden Typs erfordern die Verfügbarkeit eines Antikörpers, welcher an den interessierenden Analyten, nicht aber an potentiell störende Substanzen bindet. Ein Immuntest auf 6MAM, welcher in der Lage ist, Proben zu unterscheiden, die Codein oder Morphin enthalten, erfordert einen Antikörper mit einer sehr hohen relativen Affinität zu 6MAM.

Die begrenzte Spezifität bei den 6MAM-Tests nach dem derzeitigen Stand der Technik ist auf die beschränkte Spezifität des Antikörpers in dem Test zurückzuführen. Dieses ist wiederum auf die mangelnde Eignung der Immunogene nach dem derzeitigen Stand der Technik zurückzuführen, Antikörper mit einer besseren Fähigkeit, zwischen dem Analyten und potentiell störenden Substanzen zu unterscheiden, zu erzeugen.

OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt ein System für den verbesserten Nachweis von Heroin-Metaboliten in biologischen Proben zur Verfügung. Neue chemische Analoge werden für den Metaboliten 6-O-Acetylmorphin (ebenfalls bekannt als 6-Monoacetylmorphin, 6MAM) zur Verfügung gestellt. Diese Analogen sind stabiler als 6MAM; es wurde jedoch gefunden, daß diese 6MAM im Hinblick auf mehrere wichtige funktionale Parameter nachahmen. Die Hapten-Analogen können verwendet werden, um Immunogene, Enzym- oder Enzymdonor-Konjugate und andere Hapten-Konjugate zu konstruieren.

Die Immunogene erzeugen reproduzierbar Antikörper mit einer ausgezeichneten Fähigkeit, 6MAM in biologischen Proben von Morphin, Codein und anderen potentiell störenden Substanzen zu unterscheiden. Die spezifischen Antikörper und die Hapten-Konjugate können verwendet werden, um 6MAM in biologischen Proben, wie z.B. jenen, die von einer Einzelperson, welche bezüg lich des Mißbrauchs der Substanz in Verdacht steht, erhalten wurden, zu unterscheiden und zu messen. Zusätzliche Ausführungsformen betreffen gewisse Reagenzien, die von dieser Erfindung umfaßt sind, Reagenskombinationen sowie Kits zur Durchführung eines Testverfahrens auf 6MAM in einer biologischen Probe.

In einer Ausführungsform umfaßt die Erfindung 6MAM-analoge Verbindungen mit der folgenden Struktur:

ist und K -CH₃ ist, X nicht -O- ist; und
Q -L¹-Z ist, wobei L¹ ein Linker ist, der wenigstens ein Kohlenstoffatom enthält;
worin Z ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus den Komponenten
-NH₂,
-COOH,
-SH,

-NH-C (=O) -L²-M,

oder irgendeiner Kombination oder Wiederholung der oben erwähnten Komponenten;
wobei L² ein Linker ist, der wenigstens ein Kohlenstoffatom enthält; wobei M ein Halogenid oder Maleinimid ist; und worin J -O-, -S-, -NH- oder -CH₂- ist. Eine bevorzugte X-Gruppe ist -O-. Bevorzugte R-Gruppen umfassen

L¹ und L² werden vorzugsweise unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus C₁-C₂₀-Kohlenwasserstoffketten, die null bis zehn Heteroatome enthalten, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus N, O und S, und welche wenigstens so viele Kohlenstoffatome wie Heteroatome enthalten.

In gewissen Ausführungsformen ist die Verbindung kovalent, entweder direkt oder durch eine Verknüpfungsgruppe, an einer Markierung befestigt, um ein Konjugat zu bilden. Die Befestigung kann irgendwo auf dem Molekül, einschließlich des Normorphinstickstoffs, erfolgen, und diese erfolgt vorzugsweise an der Z-Gruppe der Verbindung. Die Markierung wird vorzugsweise ausgewählt aus einer Komponente, welche ein Radioisotop, eine fluoreszierende Gruppe, eine Fluoreszenz-löschende Gruppe, eine phosphoreszierende Gruppe, eine chemilumineszente Gruppe, eine chromophore Gruppe, eine elektrochemisch aktive Gruppe, eine elektrochemilumineszente Gruppe, eine Gruppe, die beim Binden eine Änderung bei der Fluoreszenz, Phosphoreszenz, Chemilumineszenz oder einer elektrochemischen Eigenschaft erfährt, enthält, einem Peptid, einem Protein, einem Proteinfragment, einem immunogenen Träger, einem Enzym, einem Enzyminhibitor, einem Enzymsubstrat, einem Enzymcofaktor, einer prosthetischen Enzymgruppe, einem Enzymdonor, einem Goldteilchen, einem Antikörper und einer Nukleinsäure. Die Ver bindung kann ebenfalls an einer festen Oberfläche oder einem unlöslichen Feststoffteilchen befestigt werden.

Bei gewissen zusätzlichen Ausführungsformen umfaßt die Erfindung Konjugate der Verbindungen, bei denen die Verbindungen durch eine kovalente Befestigung an einem Protein oder einem Peptid derivatisiert sind. Das Protein oder Peptid kann ein Enzym oder ein Enzymdonor sein, welcher sich mit einem Enzymakzeptor unter Bildung eines aktiven Enzymkomplexes komplementär ergänzt. Ein bevorzugter Enzymdonor ist ED28. In anderen Ausführungsformen kann das Protein oder Peptid immunogen sein. Die Erfindung umfaßt ebenfalls Verfahren zur Herstellung dieser Konjugate, indem die Verbindung mit dem Protein oder Peptid konjugiert wird.

In einer anderen Ausführungsform umfaßt die Erfindung 6MAM-analoge Verbindungen mit der folgenden Struktur:

ist und K -CH₃ ist, X nicht -O- ist; und
Q -L¹-G ist, wobei L¹ ein Linker ist, der wenigstens ein Kohlenstoffatom enthält, und G ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus fluoreszierenden, chemilumineszenten, phosphoreszierenden und chromophoren Verbindungen, einer Fluoreszenz-löschenden Gruppe, einer durch ein Radioisotop markierten Gruppe, einer elektrochemisch aktiven Gruppe, einer elektrochemilumineszenten Gruppe, einer Gruppe, die beim Binden eine Änderung bei der Fluoreszenz, Phosphoreszenz, Chemilumineszenz der einer elektrochemischen Eigenschaft erfährt, Peptiden, Proteinen, Proteinfragmenten, immunogenen Trägern, Enzymen, Enzymdonoren, Enzyminhibitoren, Enzymsubstraten, Enzymcofaktoren, prosthetischen Enzymgruppen, festen Teilchen, Goldteilchen, Antikörpern und Nukleinsäuren.

ist und K -CH₃ ist, X nicht -O- ist;
Q -L¹-Z ist, wobei L¹ ein Linker ist, der wenigstens ein Kohlenstoffatom enthält;
worin Z ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus den Komponenten
-NH₂,
-COOH,
-SH,

-NH-C(=O)-L²-M,

oder irgendeiner Kombination oder Wiederholung der oben erwähnten Komponenten;
wobei L² ein Linker ist, der wenigstens ein Kohlenstoffatom enthält; und
worin J -O-, -S-, -NH- oder -CH₂- ist. In gewissen Ausführungsformen sind diese Verbindungen, entweder direkt oder durch eine Verknüpfungsgruppe, kovalent an einer Markierung be festigt. Die Markierung kann ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus einer Komponente, welche ein Radioisotop, eine fluoreszierende Gruppe, eine Fluoreszenz-löschende Gruppe, eine phosphoreszierende Gruppe, eine chemilumineszente Gruppe, eine chromophore Gruppe, eine elektrochemisch aktive Gruppe, eine elektrochemilumineszente Gruppe, eine Gruppe, die beim Binden eine Änderung bei der Fluoreszenz, Phosphoreszenz, Chemilumineszenz oder einer elektrochemischen Eigenschaft erfährt, enthält, einem Peptid, einem Protein, einem Proteinfragment, einem immunogenen Träger, einem Enzym, einem Enzyminhibitor, einem Enzymsubstrat, einem Enzymcofaktor, einer prosthetischen Enzymgruppe, einem Enzymdonor, einem Goldteilchen, einem Antikörper und einer Nukleinsäure. Die Verbindungen können kovalent an einer festen Oberfläche oder an einem unlöslichen Feststoffteilchen befestigt werden.

Die Erfindung umfaßt ebenfalls ein Verfahren zum Erhalten eines Antikörpers, welcher für 6-O-Acetylmorphin (6MAM) spezifisch ist, welches ein Immunisieren eines Tiers oder ein Inkontaktbringen einer immunkompetenten Zelle oder eines Virus mit einem immunogenen 6MAM-Analog-Konjugat dieser Erfindung umfaßt. Das Tier ist vorzugsweise ein Wirbeltier, noch bevorzugter ein Säugetier. Die Antikörper können in löslicher Form vorliegen oder können durch Befestigung an einer festen Oberfläche, einem festen Träger, einem festen Teilchen oder einem unlöslichen Teilchen unlöslich gemacht werden.

Ebenso umfaßt von der Erfindung sind Reagenziensätze und Reagenziensysteme, die aus einem Antikörper, welcher für 6MAM spezifisch ist, und markierten 6MAM-Analogen oder 6MAM-Analog-Konjugaten bestehen, welche in Kombination verwendet werden können, um einen Immuntest auf 6MAM durchzuführen. Somit umfaßt die Erfindung ebenfalls Reagenzien für einen Immuntest, welche ein Protein- oder Peptid-Konjugat eines 6MAM-Analogen der Erfindung umfassen, wobei das Protein oder Peptid ein Enzym ist, das bei der Bindung des Konjugats an einen Antikörper, welcher für 6MAM spezifisch ist, eine Änderung bei der Enzymaktivität erfährt; oder das Protein oder Peptid ein Enzymdonor ist, wobei die Fähigkeit des Enzymdonors, einen Enzymakzeptor unter Bildung eines aktiven Enzymkomplexes komplementär zu ergänzen, durch die Bindung des Konjugats an einen Antikörper, welcher für 6MAM spezifisch ist, beeinflußt wird.

Weitere Ausführungsformen der Erfindung umfassen Reagenssysteme zur Bestimmung von 6MAM in einer Probe, die einen Antikörper, welcher für 6-O-Acetylmorphin (6MAM) spezifisch ist und eine Kreuzreaktivität mit Morphin, Morphin-3-glucuronid, Morphin-6-glucunorid und Codein aufweist, die jeweils weniger als ca. 10 % beträgt. Besonders bevorzugt ist ein solches Reagenssystem, das einen 6MAM-spezifischen Antikörper aufweist, welches eine Kreuzreaktivität mit Codein von weniger als ca. 1,0 % und eine Kreuzreaktivität mit Morphin von weniger als ca. 0,1 % aufweist. Ein solches Reagenssystem umfasst darüber hinaus markiertes 6MAM oder ein markiertes 6MAM-Analoges.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

1 ist ein chemisches Schema, welches Stoffwechselwege für Opiate zeigt. Heroin wird schnell zu dem Hauptmetaboliten 6-Acetylmorphin (6MAM) umgewandelt, für welchen diese Offenbarung Nachweisverfahren liefert. Potentiell störende Substanzen umfassen die eng verwandten Strukturen Morphin, Codein und deren Glucuronid-Konjugate.

2 ist eine Reihe chemischer Zeichnungen, in welchen die Struktur von 6MAM (obere Struktur) mit beispielhaften Analogen dieser Erfindung verglichen wird.

3 ist eine Reihe chemischer Zeichnungen, welche 6MAM und drei beispielhafte Analoge zeigen, die für eine Protein-Konjugation mit einer Protein-reaktiven Gruppe (Maleinimid), die über eine Verknüpfungsgruppe mit dem Normorphinstickstoff verbunden ist, ausgelegt sind.

Die 4(A) und 4(B) bilden eine dreidimensionale Darstellung in vier Feldern von 6MAM und beispielhaften 6MAM-Analogen dieser Erfindung.

5 ist eine grafische Darstellung in zwei Feldern, welche einen Enzymkomplementationstest für 6MAM betrifft. 6MAM ist über den Normorphinstickstoff mit einem Enzymdonor für β-Galactosidase konjugiert. Ein für 6MAM spezifischer Antikörper wird unter Verwendung eines Dimethylphosphonat-Analogen, das mit KLH konjugiert ist, hervorgerufen. Die Testmischung umfaßt die Probe, welche 6MAM enthält, das Enzymdonor-Konjugat, einen Enzymakzeptor, ein β-Galactosidasesubstrat und einen Antikörper. Ergebnisse für die Antikörper, welche als 3F4 (x) und 8C10 (o) bezeichnet wurden, sind gezeigt. Das obere Feld zeigt die Enzymgeschwindigkeit (mA/min) als eine Funktion der 6MAM-Konzentration in der Probe. Das untere Feld zeigt die prozentuale Modulation.

BESTE ART DER DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung konzentriert sich zum Teil auf die Gestaltung und Produktion von Analogen für den Heroin-Metaboliten 6-Acetylmorphin (6MAM), welche dann verwendet werden können, um Immunogene und Enzymkonjugate herzustellen, die in Immuntests zur Bestimmung von 6MAM nützlich sind. Die Struktur von 6MAM ist nachstehend gezeigt:

1 zeigt die Stoffwechselwege für die Opiate. Heroin wird schnell durch das Enzym Arylesterase zu 6MAM umgewandelt. Das 6MAM wird weiter durch Aliesterase zu Morphin metabolisiert. Andere opioide Drogen, wie z.B. Codein, Pholcodin, Ethylmorphin (werden als ein Antitussivum verschrieben), werden ebenfalls zu Morphin metabolisiert (Pop et al., J. Chromatog. B661: 245, 1994) und die Bestimmung von Morphin allein ist nicht ausreichend, um die Anwendung von Heroin von medizinisch ver schriebenen Opiaten zu unterscheiden. Es wäre vorteilhaft, in der Lage zu sein, 6MAM als einen Beweis des Heroinmißbrauchs unter Verwendung eines Reagenziensystems zu testen, das nicht mit Morphin, Codein oder deren Metaboliten kreuzreagiert. Vorher waren Antikörper, die in der Lage waren, zwischen diesen Verbindungen zu unterscheiden, nicht verfügbar.

Ohne die Erfindung auf irgendeine bestimmte Wirkungstheorie zu beschränken, ist es eine Hypothese dieser Erfindung, daß die Schwierigkeit beim Erhalten von Antikörpern, die für 6MAM hinreichend spezifisch sind, teilweise auf der hydrolytischen und enzymatischen Labilität des 6-Acetylanteils in 6MAM beruht. Diese Erfindung überwindet dieses Problem, indem sie analoge Haptene liefert, bei welchen der 6-Acetylanteil durch chemische Gruppen ersetzt ist, welche die Acetylgruppe in ihrem räumlichen und/oder elektronischen Charakter nachahmen und beträchtlich stabiler sind.

Analoge von 6MAM werden hergestellt, indem der 6-Acetylanteil mit einer Carbamat-, Phosphonat- oder Sulfonatgruppe ersetzt wird. 2 vergleicht die chemische Struktur von 6MAM (obere Struktur) mit den Strukturen von beispielhaften Analogen, welche von dieser Erfindung umfaßt sind.

Die 4(A) und 4(B) sind dreidimensionale Darstellungen der beispielhaften Analogen. Es wird die Hypothese aufgestellt, daß der Raum, welcher durch die 6-Acetylgruppe von MAM (obere Struktur) belegt wird, der Schlüssel ist, um einen Antikörper zu erhalten, welcher in der Lage ist, 6MAM von potentiell störenden Substanzen zu unterscheiden. Bei dem Carbamoylanalogen ist das alpha-Methyl des Acetyls durch den -NH₂-Anteil der Carbamoylgruppe ersetzt. Bei anderen Analogen ist der Carbonylkohlenstoff des Acetyls durch Phosphor oder Schwefel ersetzt. Der Sauerstoff, welcher die Gruppe an der Ringstruktur befestigt, ist bei mehreren Analogen vorhanden, und er ist bei diesen Analogen beständiger gegenüber einer Spaltung als bei 6MAM.

Die Erfindung umfaßt die oben beschriebenen Analogen wie auch deren Derivate, die nicht 6MAM sind. Die Analogen dieser Erfindung können entweder in der gezeigten Form, z.B. als ein interner Standard oder eine kompetitiv bindende Verbindung, in einem Testsystem verwendet werden. Sie können ebenso weiter angepaßt werden. Beispielsweise können sie durch eine kovalente Befestigung an einer festen Oberfläche oder einem unlöslichen Teilchen unlöslich gemacht werden, wie weiterhin in dieser Offenbarung beschrieben wird. Alternativ können sie zur Verwendung in einem Testsystem angepaßt werden, indem, entweder direkt oder durch eine kovalente Verknüpfungsgruppe, kovalent eine Markierung befestigt wird. Geeignete Markierungen umfassen Radioisotope, wie z.B. ¹²⁵I, eine fluoreszierende Gruppe, eine Fluoreszenz-löschende Gruppe, eine phosphoreszierende Gruppe, eine chemilumineszente Gruppe, eine elektrochemisch aktive Gruppe, eine elektrochemilumineszente Gruppe, irgendeine Gruppe, die beim Binden eine Änderung bei der Fluoreszenz, Phorphoreszenz, Chemilumineszenz oder einer elektrochemischen Eigenschaft erfährt, ein Enzym oder einen Enzymdonor, einen Enzyminhibitor, ein Enzymsubstrat, einen Enzymcofaktor und eine prosthetische Enzymgruppe. Die Analogen können zur Verwendung bei Agglutinationsreaktionen an Latexteilchen befestigt werden; die Latexteilchen können lichtundurchlässig sein oder einen Fluorophor oder Farbstoff enthalten. Die Analogen können ebenfalls an kolloidalem Gold befestigt werden. Beispiele dieser Tests werden in den US-Patenten Nr. 5 120 643 und 5 334 538 und in Price und Newman, "Light Scattering Immunoassay", Principles and Practice of Immunoassay (Price und Newman, Herausgeber), New York: Stockton Press, 1991, Seiten 446–481 beschrieben.

Eine Derivatisierung mit Aminomethylfluorescein wird in dem US-Patent Nr. 4 614 823 gelehrt. Enzym und Enzymdonoren werden in den folgenden Testbeschreibungen beschrieben. Die Analogen können ebenfalls als Immunogene ausgelegt werden, indem diese mit einer immunogenen Substanz konjugiert werden, wo für Proteine, wie z.B. das Napfschnecken-Hämocyanin (KLH), ein Beispiel sind.

"Poly(aminosäuren)", "Proteine", "Peptide" und "Polypeptide" sind Begriffe, welche hierin austauschbar verwendet werden, um Polymere von Aminosäuren jeglicher Sequenz zu beschreiben, die typischerweise wenigstens 5 Aminosäuren lang sind und durch Peptidbindungen verknüpft sind. Von besonderem Interesse sind Proteine, die als immunogene Träger verwendet werden können, und Proteine, die zu Testzwecken ein nachweisbares Signal liefern, insbesondere Enzyme und Enzymdonorpolypeptide.

Konjugate zwischen 6MAM-Analogen und jeglichem Typ Protein oder Peptid, wie z.B. einem Enzym, Enzymfragment oder immunogenen Protein, können unter Verwendung irgendeiner geeigneten Verknüpfungschemie hergestellt werden. Der Leser wird im allgemeinen auf Hermanson, G.T., "Bioconjugate Techniques", Academic Press: New York, 1996; und "Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking" von S.S. Wong, CRC Press, 1993 verwiesen.

Es ist bequem, Proteine und andere Substituenten mittels des Stickstoffs in dem Normorphinring zu befestigen. Ein funktionaler Abstandhalter kann eingeführt werden, welcher die Zugänglichkeit zu dem Analogen ermöglicht, wenn es konjugiert ist. Beispiele sind Protein-reaktive Gruppen der Struktur -L¹-Z-,
wobei L¹ ein Linker ist, der wenigstens ein Kohlenstoffatom enthält, und vorzugsweise eine C₁-C₂₀-Kohlenwasserstoffkette ist, die null bis zehn Heteroatome enthält, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus N, O und S, und welche wenigstens so viele Kohlenstoffatome wie Heteroatome enthält;
und Z ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:
-NH₂,
-COOH,
-SH,

-NH-C(=O)-L²-M;

wobei L² ein Linker ist, der wenigstens ein Kohlenstoffatom enthält, und vorzugsweise eine C₁-C₂₀-Kohlenwasserstoffkette ist, die null bis zehn Heteroatome enthält, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus N, O und S, und welche wenigstens so viele Kohlenstoffatome wie Heteroatome enthält; wobei M ein Halogenid oder Maleinimid ist; und worin J S, O oder N ist.

Der Ausdruck "ein Linker, der wenigstens ein Kohlenstoffatom enthält" ist so gemeint, daß er sich auf jegliche generische Verknüpfungsgruppe zwischen zwei anderen Gruppen, z.B. einen Linker zwischen Hapten und Protein oder einen Linker zwischen Hapten und einer funktionalen Gruppe, die zur Befestigung an einem anderen Molekül geeignet ist, bezieht, welche wenigstens ein Kohlenstoffatom enthält. Die Linkergruppe ist vorzugsweise eine C₁-C₂₀-Kohlenwasserstoffkette, die null bis zehn Heteroatome enthält, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus N, O und S, und welche wenigstens so viele Kohlenstoffatome wie Heteroatome enthält. Beispiele für solche generischen Verknüpfungsgruppen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, -O-(CH₂CH₂O)_n-, wobei n eine ganze Zahl zwischen 1 und 10 ist (d.h. ein Polyethylenglykol-Linker); -CH₂CH₂-Phenyl-CH₂CH₂- (in ortho-, meta- oder para-Verknüpfung); -CH₂CH₂-CONH-CH₂CH₂- (d.h. eine Amid-Verknüpfung), -C(=O)-CHS-NH- (d.h. ein Aminosäure-Linker, wobei S eine natürlich oder nicht-natürlich auftretende Aminosäure-Seitenkette ist) oder tatsächlich jegliche geradkettige, verzweigte, cyclische oder eine Kombination geradkettiger, verzweigter oder cyclischer Verknüpfungsgruppen, die als eine kovalente Verknüpfung zwischen den zwei anderen Gruppen dient. Bevorzugte Linker sind C₁-C₂₀-Alkylgruppen.

3 stellt die Strukturen einiger beispielhafter Analoge dieser Erfindung dar, die mit einer Protein-reaktiven Gruppe derivatisiert sind. Der funktionale Linker ist eine Ethylgruppe, und die Protein-reaktive Gruppe ist ein Maleinimid, welche alle an dem Normorphinstickstoff befestigt sind. Diese erlaubt, daß die Acetylgruppe (in dem Fall von 6MAM) oder die Phosphonyl- oder Carbamoylgruppe (in dem Fall der Analogen) an dem anderen Ende des Moleküls für eine Antikörperbindung zugänglich ist.

Ein Verfahren zur Herstellung solcher Verbindungen ist wie folgt. Normorphin wird zuerst an dem Stickstoff alkyliert, um einen funktionalen Abstandhalter einzuführen. Bevorzugte funktionale Abstandhaltergruppen sind Aminoalkyl- oder Carboxyalkylgruppen, wobei die Alkylgruppe (CH₂)_n mit n = 1–20 ist. Die Alkylierung wird typischerweise erreicht, indem Normorphin mit einem N-geschützten Halogenalkylamin oder einer Carboxygeschützten Halogenalkylcarbonsäure umgesetzt wird. Die Halogenid-Abgangsgruppe kann Cl, Br oder I (vorzugsweise Br oder I) sein. Die N-Schutz- oder Carboxylschutzgruppen werden so ausgewählt, daß sie unter Bedingungen entfernt werden können, welche den Normorphinanteil des Moleküls nicht beeinträchtigen. Bevorzugte N-Schutzgruppen sind Urethane, wie z.B. t-Butyloxycarbonyl (BOC) und Benzyloxycarbonyl (Z), welche durch Acidolyse entfernt werden, und die Phthalimido-Schutzgruppe, welche durch Hydrazinolyse entfernt wird. Bevorzugte Carboxyl-Schutzgruppen sind der t-Butylester, welcher durch Acidolyse oder Hydrogenolyse entfernt wird, oder Methyl/Ethylester, welche durch Verseifung entfernt werden. Ein besonders bevorzugtes Alkylierungsreagens ist N-BOC-2-Bromethylamin. Eine Alkylierung wird typischerweise durch eine Reaktion in einem Alkohol oder einem dipolaren, aprotischen Lösungsmittel, wie z.B. Dimethylformamid (DMF) oder Dimethylsulfoxid (DMSO), erreicht. Die Reaktion wird in Gegenwart einer anorganischen Base, wie z.B. Natriumbicarbonat oder Natriumcarbonat, durchgeführt. Alternativ kann ein organisches, tertiäres Amin, wie z.B. Triethylamin oder Diisopropylethylamin, als Base eingesetzt werden. Abhängig von der Reaktivität des Alkylierungsreagenzes und dem eingesetzten Lösungsmittelsystem kann die Reaktion erwärmt werden. In einem bevorzugten Beispiel wird N-BOC-2-Bromethylamin mit Normorphin in DMF mit Natriumbicarbonat als Base und bei einer Temperatur von 25°C bis 100°C, vorzugsweise 50°C bis 70°C, für wenigstens 1 h, vorzugsweise 12–24 h, umgesetzt.

In einem zweiten Schritt wird das phenolische 3-OH von Normorphin selektiv in Gegenwart der freien 6-OH-Gruppe geschützt. Typische Schutzgruppen umfassen Acylester, wie z.B. Acetyl oder Benzoyl. Ether, wie z.B. Benzyl, t-Butyl oder Alkoxymethyl, können ebenfalls verwendet werden. Bevorzugte Schutzgruppen sind Methoxyethoxymethyl (MEM)- oder Methoxymethyl (MOM)-ether, welche unter milden Bedingungen eingeführt werden und leicht durch milde Acidolyse entfernt werden. In einem besonders bevorzugten Beispiel wird das phenolische 3-OH von N-BOC-Aminoalkylnormorphin selektiv mit Methoxyethoxymethylchlorid (MEM-Cl) in einem chlorierten Lösungsmittel, wie z.B. Dichlormethan, in Gegenwart eines tertiären Amins, wie z.B. Diisopropylethylamin, umgesetzt. Die Reaktion wird bei einer Temperatur von 0–30°C für 1–24 h, vorzugsweise 5–25°C für 2–8 h, durchgeführt. Das resultierende Intermediat N-BOC-Aminoalkyl-3-O-MEM-normorphin ist bereit zur Modifikation der 6-OH-Gruppe, um 6-Acetylmorphin-Hapten-Analoge zu erzeugen.

Zur Synthese eines 6-Carbamat-Analogen wird das N-BOC-Aminoalkyl-3-O-MEM-normorphin zuerst mit einem Phosgenäquivalent, Disuccinimidylcarbonat, in einem chlorierten Lösungsmittel, wie z.B. Dichlormethan, welches eine organische Base, wie z.B. Triethylamin, enthält, umgesetzt, um ein gemischtes Succinimidyl-Carbonat als Intermediat zu ergeben. Das gemischte Carbonat wird weiter mit Ammoniak umgesetzt, um das gewünschte 6-Carbamyl-Derivat zu ergeben. Schließlich werden sowohl die MEM-als auch die BOC-Schutzgruppen gleichzeitig durch Acidolyse entfernt, um das Hapten-Analoge, N-Aminoalkyl-6-O-carbamylnormorphin, zu ergeben. Das Hapten-Analoge kann direkt mit Trägerproteinen zum Immunogen oder mit Markierungen über die Aminofunktion, unter Verwendung irgendeines der Verfahren, die auf dem Gebiet der Biokonjugatchemie wohl bekannt sind, konjugiert werden. In einem nicht-beschränkenden Beispiel wird das Amin mit einem Maleinimidoalkyl-N-hydroxysuccinimidester-Linker acyliert, um ein aktiviertes Hapten-Analoges zu erhalten, welches gegenüber Thiolgruppen auf Trägerproteinen, Enzymen, Enzymfragmenten oder anderen Markierungen reaktiv ist.

Zur Synthese eines 6-Phosphonyl-Analogen wird ein Phosphonylhalogenid, vorzugsweise Dimethylphosphonylchlorid, zuerst bei 0–30°C, vorzugsweise 0–5°C, mit einem heterocyclischen Amin, wie z.B. Tetrazol, Triazol oder Imidazol, vorzugsweise Tetrazol, in einem polaren Lösungsmittel, wie z.B. Pyridin oder Collidin, umgesetzt. Das resultierende Phosphonyltetrazolid, -triazolid oder -imidazolid wird dann mit N-BOC-Aminoalkyl-3-O-MEM-normorphin bei 0–30°C umgesetzt, um das 6-phosphonylierte Analoge zu ergeben. Die Schutzgruppen werden durch Acidolyse entfernt, um das N-Aminoalkyl-6-O-phosphonyl-Analoge zu ergeben. Wie bei dem 6-O-Carbamyl-Analogen kann in diesem Stadium eine direkte Konjugation oder eine weitere Verlängerung mit reaktiven Linkern durchgeführt werden.

Analog-Protein-Konjugate werden typischerweise hergestellt, indem das Analoge mit einer Protein-reaktiven Gruppe synthetisiert wird, das modifizierte Analoge mit dem Protein unter Bedingungen inkubiert wird, welche erlauben, daß die Konjugationsreaktion stattfindet, und dann das Konjugat abgetrennt wird. Beispielsweise kann ein Proteinkonjugat hergestellt werden, indem ein Überschuß eines Maleinimid-Addukts mit einem Protein mit freien Thiolgruppen vereinigt wird. Freie Sulfhydrylgruppen können in Form von freien Cysteinresten oder durch ein Reduzieren von Proteindisulfidbindungen durch ein Reagens, wie z.B. Dithiothreitol, zur Verfügung gestellt werden. Alternativ können Thiolgruppen an ein Protein mit freien primären Aminogruppen durch ein Umsetzen mit 2-Iminothiolan (IT) in einem wäßrigen Puffer addiert werden, worauf ein Entfernen von nicht-umgesetztem IT folgt. Eine detaillierte Vorschrift für die Thiolierung des Proteins KLH wird in dem US-Patent Nr. 5 439 798 angegeben.

Zu dem Zweck, spezifische Antikörper gegen 6MAM zu erhalten, wird ein 6MAM-Analog-Protein-Konjugat dieser Erfindung eine Mehrzahl an 6MAM-Analogen umfassen, die kovalent an einen immunogenen Proteinträger gebunden sind, welcher im Hinblick auf seine Fähigkeit ausgewählt wurde, eine allgemeine immunstimulierende Wirkung zu liefern. Verschiedene Proteinträger kön nen eingesetzt werden, einschließlich Serumalbumin, Serumglobulinen, Augenlinsen-Proteinen, Lipoproteinen, Ovalbumin, Thyroxin-bindendem Globulin und synthetischen Polypeptiden. KLH ist besonders bevorzugt.

Der Begriff "Antikörper", wie er in dieser Offenbarung verwendet wird, bezieht sich sowohl auf polyklonale als auch auf monoklonale Antikörper und verwandte Antigen-Erkennungseinheiten. Der Umfang des Begriffs umfaßt bewußt nicht nur intakte Immunglobulinmoleküle, sondern ebenfalls solche Fragmente und Derivate von Immunglobulinmolekülen, welche durch Techniken hergestellt werden können, die im Stand der Technik bekannt sind, und welche die Antikörper-Aktivität eines intakten Immunglobulins beibehalten. In diesem Zusammenhang bezieht sich "Antikörperaktivität" auf die Fähigkeit eines Antikörpers, bevorzugt zu anderen potentiellen Antigenen, über die Antigen-Kombinationsstelle, die innerhalb eines variablen Bereichs eines Immunglobulins lokalisiert ist, an ein spezifisches Antigen zu binden. Fragmente und andere Derivate der Immunglobuline können durch Verfahren der Standardproteinchemie hergestellt werden, wie beispielsweise durch ein Unterwerfen des Antikörpers unter eine Spaltung mit einem proteolytischen Enzym, wie Pepsin, Papain oder Trypsin; und ein Reduzieren der Disulfidbindungen mit solchen Reagenzien wie Dithiothreitol. Gentechnisch produzierte Varianten eines intakten Immunglobulins können erzeugt werden, indem ein Polynukleotid erhalten wird, das den Antikörper codiert, und indem die allgemeinen Verfahren der Molekularbiologie angewendet werden, um codierende Sequenzen zu spleißen oder Mutationen einzuführen, und die Variante translatiert wird. Antikörper, die gentechnisch hergestellte Varianten von besonderem Interesse sind, umfassen chimäre und humanisierte Antikörper, Fab-ähnliche Fragmente, Einzelketten-Fragmente des variablen Bereichs (scFv) und Diabodies.

Für die allgemeinen Techniken, die beim Hervorrufen, Reinigen und Modifizieren von Antikörpern und für die Gestaltung und Ausführung von Immuntests verwendet werden, wird der Leser auf das Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir & C.C. Blackwell, Herausgeber); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., Herausgeber, 1991); David Wild, Herausgeber, The Immunoassay Handbook (Stockton Press, NY, 1994); und R. Masseyeff, W.H. Albert und N.A. Staines, Herausgeber, Methods of Immunological Analysis (Weinheim: VCH Verlagsgesellschaft mbH, 1993) verwiesen.

Die polyklonalen Antikörper dieser Erfindung werden durch Verabreichung des immunogenen 6MAM-Analog-Protein-Konjugats, welches gewöhnlich mit einem Hilfsmittel gemischt ist, an einen tierischen Wirt hervorgerufen. Jeder tierische Wirt, welcher Antikörper produziert, kann verwendet werden. Das Tier ist vorzugsweise ein Wirbeltier, noch bevorzugter ein Säugetier. Das Immunogen wird bequem zur Injektion vorbereitet, indem ein lyophilisiertes Immunogen rehydratisiert wird, um eine Lösung oder Suspension zu bilden. Bevorzugte Hilfsmittel sind Wasser-in-Öl-Immersionen, insbesondere Freund's vollständiges Adjuvans für die Erstverabreichung und Freund's unvollständiges Adjuvans für Verstärkungsdosen. Die Präparation wird typischerweise an einer Vielzahl von Stellen und typischerweise in zwei oder mehr Dosen über einen Zeitraum von wenigstens 4 Wochen verabreicht. Serum wird geerntet und unter Verwendung eines 6MAM-Protein-Konjugats oder eines anderen 6MAM-Analogen in einem Standard-Immuntest oder einer Präzipitationsreaktion auf das Vorliegen eines 6MAM-Antikörpers getestet.

Polyklonale Antiseren werden typischerweise Antikörper enthalten, die nicht mit 6MAM reagieren, und anti-6MAM-Antikörper, die mit anderen Substanzen, einschließlich Morphin, kreuzreaktiv sind. Verfahren zum Reinigen spezifischer Antikörper aus einem polyklonalen Antiserum sind im Stand der Technik bekannt. Ein besonders effektives Verfahren ist eine Affinitätsreinigung unter Verwendung einer Säule, bei der 6MAM an eine feste Phase konjugiert ist. Eine Art der Herstellung einer 6MAM-Säule ist, 6MAM oder ein Analoges dieser Erfindung mit einem Protein, außer dem Protein, das in dem Immunogen verwendet wird, zu konjugieren und dann das Konjugat an einem kommerziell erhältlichen aktivierten Harz, wie beispielsweise CNBr-aktivierter SEPHAROSE^TM, zu befestigen. Der anti-6MAM wird über die Säule geleitet, die Säule wird gewaschen, und der Antikörper wird mit einem milden, denaturierenden Puffer, wie z.B. 0,1 M Glycin, 0,2 M NaCl, pH 2,5, eluiert.

Monoklonale Antikörper dieser Erfindung können durch eine Anzahl unterschiedlicher Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind, hergestellt werden. Für die Hybridomtechnologie wird der Leser im allgemeinen auf Harrow & Lane (1988), die US-Patente Nr. 4 491 632, 4 472 500 und 4 444 887, und Methods in Enzymology, 73B: 3 (1981) verwiesen. Der häufigste Weg, monoklonale Antikörper zu produzieren, ist es, eine Milzzelle oder eine andere Antikörper-produzierende Zelle, die aus einem Tier gewonnen wurde, das wie vorher beschrieben gegen 6MAM immunisiert wurde, zu immortalisieren und zu klonen. Der Klon wird durch ein Verfahren, wie z.B. eine Fusion mit einem nicht-produzierenden Myelom, durch ein Transfizieren mit Epstein Barr-Virus oder ein Transformieren mit oncogener DNA immortalisiert. Die behandelten Zellen werden kloniert und kultiviert, und Klone werden ausgewählt, die den Antikörper mit der gewünschten Spezifität produzieren. Das Testen auf die Spezifität wird mit den Kulturüberständen durch einen Anzahl von Techniken durchgeführt, wobei beispielsweise das immunisierende Antigen als das Nachweisreagens in einem Immuntest verwendet wird. Ein Vorrat des monoklonalen Antikörpers aus dem ausgewählten Klon kann dann aus einem großen Volumen des Kulturüberstands oder aus der Ascitesflüssigkeit von geeignet präparierten Wirtstieren, denen der Klon injiziert wurde, gereinigt werden. Der Antikörper kann als im rohen Überstand oder Ascites auf eine Aktivität hin getestet werden und wird gegebenenfalls unter Verwendung von standardmäßigen biochemischen Präparationstechniken, wie z.B. Ammoniumsulfatfällung, Ionenaustauschchromatographie und Gelfiltrationschromatographie, gereinigt.

Alternative Verfahren zum Erhalten monoklonaler Antikörper beinhalten ein Inkontaktbringen einer immunkompetenten Zelle oder eines viralen Teilchens mit einem Analog-Protein-Komplex dieser Erfindung in vitro. In diesem Zusammenhang bedeutet "immunkompetent", daß die Zelle oder das Teilchen in der Lage ist, einen Antikörper zu exprimieren, der ohne eine weitere genetische Umordnung für das Antigen spezifisch ist und welcher aus einer Zellmischung durch Präsentation des Antigens ausgewählt werden kann. Immunkompetente eukaryotische Zellen können von einem immunisierten Säugetierdonor geerntet werden, oder sie können von einem nicht-immunisierten Donor geerntet werden und in vitro prästimuliert werden, indem diese in Gegenwart des Immunogens und von immunstimulierenden Wachstumsfaktoren kultiviert werden. Zellen der gewünschten Spezifität können ausgewählt werden, indem diese mit dem Immunogen unter Kulturbedingungen in Kontakt gebracht werden, die zu einer Vermehrung der spezifischen Klone, nicht aber der unspezifischen Klone, führen. Ein immunkompetenter Phage kann konstruiert werden, um Segmente der variablen Region des Immunglobulins auf dessen Oberfläche zu exprimieren. Siehe Marks et al., New Engl. J. Med. 335: 730, 1996; WO-Patentanmeldungen 94/13804, 92/01047, 90/02809; und McGuinness et al., Nature Biotechnol. 14: 1149, 1996. Der Phage der gewünschten Spezifität kann beispielsweise über eine Haftung an einem 6MAM-Proteinkomplex, der an einer feste Phase befestigt ist, ausgewählt werden und dann in E. coli amplifiziert werden.

Antikörper, die unter Verwendung irgendeiner der oben erwähnten Techniken erhalten wurden, werden nicht nur auf ihre Fähigkeit hin, mit 6MAM zu reagieren, sondern ebenfalls im Hinblick auf eine geringe Kreuzreaktivität mit potentiell störenden Substanzen gescreent oder gereinigt. Die "Kreuzreaktivität" wird in einem quantitativen Immuntest festgestellt, indem eine Standardkurve erstellt wird, welche bekannte Verdünnungen des Zielanalyten, 6MAM, verwendet. Die Standardkurve wird dann verwendet, um die apparente Konzentration der störenden Substanz zu berechnen, die in verschiedenen bekannten Mengen in Proben vorliegt, die unter einer ähnlichen Bedingung getestet wurden.

Die Kreuzreaktivität ist die apparente Konzentration, geteilt durch die tatsächliche Konzentration, multipliziert mit 100. Der bevorzugte Immuntest zur Feststellung der Kreuzreaktivität ist ein Test vom Typ CEDIA^®, der ein ED28-6MAM-Donorpolypeptid verwendet, welcher im Detail in Beispiel 10 beschrieben wird. Alternativ kann die Kreuzreaktivität in demselben Typ eines Immuntests festgestellt werden, in welchem der Antikörper schließlich verwendet wird.

Es lohnt sich im allgemeinen, Antikörper auf eine Kreuzreaktivität mit anderen pharmazeutischen Verbindungen zu screenen, die Patienten begleitend einnehmen können, insbesondere mit jenen, die im Urin ausgeschieden werden und eine polycyclische Struktur aufweisen, die eine gewisse Ähnlichkeit mit 6MAM hat. Die Werte der Kreuzreaktivität für störende Verbindungen dieser Art betragen im allgemeinen weniger als 10 %, und mit steigender Bevorzugung weniger als 5 %, 1 %, 0,1 % oder 0,01 %. Von speziellem Interesse sind Morphin und Morphin-Metaboliten, wie z.B. Morphin-3-glucuronid und Morphin-6-glucuronid. Ebenso von speziellem Interesse ist Codein und seine Metaboliten, wie z.B. Codein-6-glucuronid. Geringere Kreuzreaktivitäten für diese verwandten Substanzen, entweder allein oder in Kombination, werden zunehmend stärker bevorzugt.

Antikörper gegen 6MAM gemäß dieser Erfindung sind nützlich zum Nachweis von 6MAM und zum Reinigen von 6MAM aus einer Mischung. Eine Reinigung von 6MAM unter Verwendung eines Antikörpers in Immunaffinitätstechniken ist nützlich bei der Isolierung präparativer Mengen von 6MAM aus Verunreinigungen, die durch andere Techniken mitgereinigt werden. Eine Reinigung von 6MAM in Spurenmengen aus klinischen Proben ist wünschenswert, wenn die Proben potentiell eine Substanz enthalten, die nicht 6MAM ist aber die Ablesung bei dem Nachweissystem komplizieren kann. Beispielsweise erfordern die GC/MS-Tests im allgemeinen eine Extraktion des Analyten aus der wäßrigen Probe. Eine gängige Extraktion aus der flüssigen oder festen Phase kann hohe Hintergrundsignale und eine schlechte Nachweisempfindlichkeit ergeben. Eine Analyten-spezifische Immunadsorption verbessert das Ausmaß der Selektion und konzentriert ebenfalls den Analyten in einem kleineren Volumen als der ursprünglichen Probe.

Mögliche Verfahren der Immunaffinitätsreinigung umfassen eine Präzipitation mit einem doppelten Antikörper, eine Präzipitation mit Protein A und die Bildung anderer Typen von Antikörper-Konjugaten. Ein bevorzugtes Verfahren ist die Festphasenadsorption. Der Antikörper wird an irgendeinem geeigneten Harz befestigt, die ursprüngliche Probe wird mit dem Harz in Kontakt gebracht, das Harz wird gewaschen und die Probe wird eluiert. Bevorzugte Harze umfassen: Sepharose^® (Pharmacia), Poros^®-Harze (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis), Actigel Superflow^TM-Harze (Sterogene Bioseparations Inc., Carlsbad CA) und Dynabeads^TM (Dynal Inc., Lake Success, NY).

Ein bevorzugtes Kopplungsverfahren ist wie folgt: Die benötigte Menge an aktivierter Sepharose^® wird gewogen, wobei das gewünschte Kopplungsverhältnis und die Tatsache berücksichtigt werden, daß 1 g gefriergetrocknetes Material zu einem Gelvolumen von 3,5 ml aufquillt. Das Gel wird rekonstituiert und in einem Waschpuffer (1 mM HCl) (3 ml und dann 200 ml pro Gramm) gewaschen, und dann in einem Kopplungspuffer (0,1 M NaHCO₃, 0,5 M NaCl, pH 8,3) (50 ml pro Gramm) gewaschen, wobei ein Buchner-Trichter verwendet wird. Der Antikörper wird in dem Kopplungspuffer gelöst oder ausgetauscht, und 5–10 mg werden pro ml gekoppelt. Der Gelkuchen wird in einen Behälter mit geeigneter Größe überführt, der Antikörper wird zugegeben, und das Volumen wird so eingestellt, daß sich eine 50 %-ige Aufschlämmung ergibt. Die Suspension wird für 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 2 bis 8°C End-über-End gemischt. (Ein Rühren wird vermieden, um ein Scheren der Kügelchen zu verhindern.) Der Anteil des Antikörpers, welcher erfolgreich gekoppelt wurde, wird bestimmt, indem A₂₈₀ vor und nach dem Koppeln gemessen wird. Dann wird ein Blockierpuffer zugegeben (1 M Ethanolamin, pH 8,0, oder 0,2 M Trispuffer, pH 8,0), und die Suspension wird für weitere 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 2 bis 8°C End-über-End gemischt. Das Gel wird in einem Buchner-Trichter mit Kopplungspuffer, einem zweiten Waschpuffer (0,1 M Acetat, 0,5 M NaCl, pH 4,0) und dann Kopplungspuffer (jeweils 100 ml pro Gramm) gewaschen. Das Affinitätsharz kann dann mit präparierter inaktivierter Sepharose^® 4B verdünnt werden, um die gewünschte Bindungskapazität zu ergeben.

Harze dieser Art werden typischerweise unter gekühlten Bedingungen oder in Gegenwart eines Konservierungsmittels, wie z.B. 0,1 % Natriumazid, konserviert. Eine Trennung kann durch Säulenchromatographie oder eine chargenweise Elution durchgeführt werden. Bei einem typischen Trennverfahren werden 10 ml einer Probe, die auf das Vorliegen von 6MAM hin getestet wird (wie z.B. eine Urinprobe von einem menschlichen Patienten), mit 200 μl einer 50 %-igen Aufschlämmung des anti-6MAM-Harzes vereinigt. Die Reaktion und Extraktion kann bequem in einem konischen Probenbehälter mit einem durch eine Kappe abgedeckten 10 ml Vorrat, der am Boden mit einer Fritte und einer zugestopften Spitze ausgerüstet ist, durchgeführt werden. Eine kleine Menge an Puffer kann ebenfalls zu der Probe zugegeben werden, wenn der Antikörper gegenüber einer pH-Änderung zwischen den Proben empfindlich ist. Die Mischung wird dann mit der Kappe abgedeckt, und das Harz wird für ca. 30 bis 120 min auf einem Plattform-Schüttler oder Rotator in Suspension gehalten. Das Harz wird von der Probe getrennt (z.B. durch Filtration oder Zentrifugation) und mit 10 ml phosphatgepufferter Salzlösung und dann zweimal mit Wasser gewaschen. Nach der letzten Wäsche wird das Harz trockengesaugt, indem für 2–5 s ein Vakuum angelegt wird. 1 ml Methanol wird dann zugegeben, das Harz wird für ~2–5 min inkubiert, und das Methanol wird zurückgewonnen. Das Methanoleluat kann dann auf das Vorliegen von 6MAM hin charakterisiert werden, was mit dem Vorliegen von 6MAM in der ursprünglichen Probe korreliert. Eine erfolgreiche Elution kann bestätigt werden, indem parallel Extraktionen mit Proben laufengelassen werden, welche Standardmengen an 6MAM enthalten, oder indem ein interner Standard, wie z.B. eine kreuzreaktive Substanz oder ein stabiler Isotop-markierter interner Standard, in die Probe eingeschlossen wird. 6MAM-Analoge, welche zu diesem Zweck geeignet sind, wurden vorher in dieser Offenbarung beschrieben.

Die Immuntest-Reagenzien und -Reagenssysteme dieser Erfindung können als Grundlage für Immuntestverfahren dienen zum Nachweis von 6MAM in einer interessierenden Probe, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Körperflüssigkeiten von Patienten, die in dem Verdacht stehen, Heroin verabreicht bekommen zu haben, insbesondere Körperflüssigkeiten von Menschen. Geeignete Proben umfassen biologische Proben, die von Patienten entnommen wurden, welche gegebenenfalls verdünnt oder modifiziert wurden, um den Test zu erleichtern, experimentelle Proben, die durch irgendein chemisches oder biologisches Verfahren erzeugt wurden, und Standards, die bekannte Konzentrationen an 6MAM oder anderen Substanzen enthalten, die zur Eichung des Tests verwendet werden.

Flüssige biologische Proben von besonderem Interesse sind Urin, Serum, Plasma und Flüssigkeiten, die während einer Autopsie entnommen werden (wie z.B. Cerebrospinalflüssigkeit). Gewebeproben können für einen Immuntest in ein flüssiges Medium extrahiert werden. Haarproben können ebenfalls getestet werden, indem diese in ein flüssiges Medium extrahiert werden. Beispielsweise kann das Haar in der Luft und in Aceton gewaschen werden, um Öle zu entfernen, getrocknet werden und dann in einer Kugelmühle pulverisiert werden. 20–30 mg pulverisiertes Haar werden dann für ca. 5 h bei 40°C in einem neutralen Puffer inkubiert. Ebenso geeignet sind postmortale Cerebrospinalflüssigkeit oder Glaskörperflüssigkeit. Schweißproben können erhalten werden, indem beispielsweise ein PharmChek-Schweißpflaster (Sudormed, Santa Ana, CA) verwendet wird, welches einen Semi-Okklusivverband umfaßt, der aus einem Cellulose-Löschpapier-Sammelkissen für medizinische Zwecke besteht, das von einer dünnen Schicht Polyurethan und Acrylat-Klebstoffen bedeckt ist. Am Ende der Tragdauer wird das Kissen mit einem geeigneten Puffer, wie z.B. 2,5 ml 0,2 M Acetatpuffer, mit Methanol bei pH 5,0 (25:75), Fogerson et al., J. Anal. Toxicol. 21: 451, 1997, oder mit Acetonitril eluiert.

In den meisten Fällen beinhalten die Tests die Verwendung eines Antikörpers, welcher gegen ein 6MAM-Analog-Protein-Konjugat dieser Erfindung hervorgerufen wurde, oder welcher die charakteristischen Eigenschaften eines solchen Antikörpers, insbesondere eine geringe Kreuzreaktivität mit Morphin oder Codein, aufweist.

Wie in dieser Offenbarung verwendet, bezieht sich ein "6MAM-Analoges" auf eine Verbindung, die in der Lage ist, mit 6MAM um die Bindung an den Antikörper, welcher in dem Test verwendet wird, zu konkurrieren. Nützliche Markierungen zur Verwendung bei den Analogen dieser Erfindung für Immuntesttechniken umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Radioisotope, eine fluoreszierende Gruppe, eine Fluoreszenz-löschende Gruppe, eine phosphoreszierende Gruppe, eine chemilumineszente Gruppe, eine elektrochemisch aktive Gruppe, eine elektrochemi-lumineszente Gruppe, irgendeine Gruppe, die beim Binden eine Änderung bei der Fluoreszenz, Phosphoreszenz, Chemilumineszenz oder einer elektrochemischen Eigenschaft erfährt, ein Enzym, einen Enzymdonor, einen Enzyminhibitor, ein Enzymsubstrat, einen Enzymcofaktor und eine prosthetische Enzymgruppe.

6MAM-spezifische Immuntests, die anti-6MAM-Antikörper dieser Erfindung verwenden, werden mit Hilfe der Spezifität des Antikörpers spezifisch gemacht. Für Tests, die weiterhin Proteinkonjugate einsetzen, wie z.B. in dem Fall, wo ein Hapten (d.h. 6MAM oder ein 6MAM-Analoges) mit einem Enzympolypeptid markiert wird, kann das Hapten durch irgendein geeignetes Verfahren an dem Proteinkonjugat befestigt werden. Bei gewissen bevorzugten Ausführungsformen wird die Chemie, die hierin zur Bildung der immunogenen Proteinkonjugate von 6MAM-Analogen beschrieben wird, ebenfalls verwendet, um das Proteinkonjugat herzustellen, das als ein Testreagens verwendet wird. Auf diese Weise wird der Haptenkern dem Antikörper in ungefähr derselben Orientierung wie während des Immunisierungsereignisses präsentiert, als der Antikörper erzeugt wurde.

Für die Zwecke von Komplementationstests ist der 6MAM-spezifische Antikörper vorzugsweise ein Antikörper, der gegen ein Analog-Protein-Konjugat dieser Erfindung hervorgerufen wurde, oder der die charakteristischen Eigenschaften eines solchen Antikörpers, insbesondere ein geringes Niveau der Kreuzreaktivität mit Morphin, Morphin-3-glucuronid, Morphin-6-glucuronid und Codein aufweist. Außer, daß diese auf eine Kreuzreaktivität hin gescreent wurden, weisen wünschenswerte Antikörper drei andere Merkmale auf. Eines, welches als "Inhibition" bezeichnet wird, bezieht sich darauf, wie gut der Antikörper das Enzymdonor-Konjugat bindet und die Bildung aktiver β-Galactosidase blockiert. Eine ausreichende Inhibition (vorzugsweise wenigstens ca. 70 %) wird benötigt, um ein angemessenes Signal zu liefern. Ein zweites Kriterium ist der Titer des Antikörpers, welcher benötigt wird, um das gewünschte Inhibitionsniveau zu erhalten. Eine Inhibition bei niedrigeren Antikörperniveaus ist bevorzugt. Ein drittes Kriterium, welches als "Modulation" bezeichnet wird, bezieht sich darauf, wie gut der Analyt der Probe in der Lage ist, mit dem Konjugat um die Enzymbindung zu konkurrieren. Die Modulation wird als der Unterschied bei der Enzymgeschwindigkeit zwischen einer Probe, die eine vorgegebene Konzentration des Analyten aufweist, und einer Probe, die kei nen Analyten enthält, geteilt durch die Geschwindigkeit bei der vorgegebenen Konzentration des Analyten, berechnet. Eine bessere Modulation bei der Zielkonzentration für den Entscheidungspunkt positiv/negativ ("der Grenzwert" des Tests), vorzugsweise 10 ng/ml im Fall von 6MAM, korreliert bei Konzentrationen in der Nähe des Grenzwerts mit einer besseren Testempfindlichkeit und -genauigkeit. Es wurden Antikörper erhalten, die diesen Kriterien gut entsprechen, und diese weisen die Bezeichnungen 2G5, 2E1, 13A9, 3F4, 2A11 und 8C10 auf.

Das Enzymdonor-Enzymakzeptor-Paar ist ein Paar von Polypeptiden, welche sich spontan im Reagenspuffer unter Bildung eines aktiven Enzymkomplexes zusammenfügen. Der aktive Enzymkomplex ist in der Lage, ein Substrat enzymatisch in ein Produkt umzuwandeln, das unterschiedlich nachgewiesen wird. Typischerweise hat das Produkt eine andere Farbe als das Substrat und kann in einem Spektrophotometer quantifiziert werden. Das Paar aus Donor und Akzeptor sind typischerweise zwei funktionale Untereinheiten eines gemeinsamen Enzyms. Die Untereinheiten können in dem nativen Enzym nicht-kovalent assoziiert sein oder sie können Defektversionen eines gemeinsamen Polypeptids sein, die einander ergänzen, wenn sie zusammen sind.

Bevorzugte Enzymdonor- und Enzymakzeptorpolypeptide basieren auf dem Enzym β-Galactosidasepolypeptid. Ein "β-Galactosidasepolypeptid" ist ein Polypeptid, das auf der Grundlage seiner Aminosäuresequenz oder der enzymatischen Aktivität dahingehend identifizierbar ist, daß es sich aus einem Enzym mit β-Galactosidaseaktivität entwickelt hat. Die Definition umfaßt nicht nur natürlich auftretende β-Galactosidase, sondern ebenfalls Fragmente, Deletionsmutanten, Fusionsproteine, Mutanten und andere darauf basierende Varianten, welche durch solche Verfahren wie enzymatische Fragmentierung und Gentechnologie mit den relevanten codierenden Sequenzen erhalten wurden. Besondere β-Galactosidasepolypeptide werden in den oben aufgelisteten US-Patentanmeldungen beschrieben, welche sich auf Immuntests mit kloniertem Enzymdonor beziehen.

β-Galactosidase-Enzymakzeptoren werden vorzugsweise durch eine Deletionsmutante des β-Galactosidasegens produziert. EA22, einer der bevorzugten Akzeptoren, weist eine Deletion der Aminosäurereste 13–40 auf. Andere Enzymakzeptorfragmente von β-Galactosidase, welche die natürliche Sequenz enthalten, welche die Aminosäureposition 602 einschließt, können ebenfalls verwendet werden. Andere Beispiele umfassen EA5, EA11, EA14, EA17, EA18, EA20, EA23 und EA24. Das distale Ende des deletierten Segments liegt normalerweise zwischen den Aminosäurepositionen 26 und 54 der β-Galactosidasesequenz. Bei EA22 ist das distale Ende des Deletionssegments die Aminosäure 40.

Ein besonders bevorzugter β-Galactosidase-Enzymdonor ist ED28. ED28 ist ein Peptid mit 90 Aminosäuren, welches die Reste 6–45 von β-Galactosidase enthält, wobei Cysteine an den Positionen 1 und 46 (in Bezug auf die Numerierung des ursprünglichen β-Galactosidasefragments) vorliegen. Die Sequenz von ED28 ist (SEQ ID NO: 1) Met-Asp-Pro-Ser-Gly-Asn-Pro-Tyr-Gly-Ile-Asp-Pro-Thr-Gln-Ser-Ser-Pro-Gly-Asn-Ile-Asp-Pro-Cys-Ala-Ser-Ser-Asn-Ser-Leu-Ala-Val-Val-Leu-Gln-Arg-Arg-Asp-Trp-Glu-Asn-Pro-Gly-Val-Thr-Gln-Leu-Asn-Arg-Leu-Ala-Ala-His-Pro-Pro-Phe-Ala-Ser-Trp-Arg-Asn-Ser-Glu-Glu-Ala-Arg-Thr-Asp-Cys-Pro-Ser-Gln-Gln-Leu-Ala-Gln-Pro-Glu-Trp-Gly-Leu-Glu-Ser-Arg-Ser-Ala-Gly-Met-Pro-Leu-Glu; siehe ebenfalls die Europäische Patentanmeldung Nr. 90 308 937.3 und die US-Patente Nr. 4 708 929, 5 444 161 und 5 763 196. Die zwei Cysteinreste können zur genauen und reproduzierbaren Plazierung von Sulfhydrylreaktiven Addukten von 6MAM oder 6MAM-Analogen verwendet werden, wie vorher beschrieben wurde. Vor der Konjugation mit dem Hapten wird das reduzierende Reagens, welches normalerweise bei der Lagerung von ED28 verwendet wird, durch eine geeignete Entsalzungstechnik, wie z.B. auf einer Pharmacia NAP5^TM-Säule, wie in dem US-Patent Nr. 5 439 798 beschrieben wird, entfernt. Das 6MAM oder das 6MAM-Analoge wird dann mit Maleinimid-Addukten konjugiert, wie an anderer Stelle in dieser Offenbarung beschrieben wird. Eine Anpassung der Verknüpfung kann durchgeführt werden, indem die Enzyminhibition durch einen 6MAM- spezifischen Antikörper überwacht wird. Typische verwendete Linkergruppen sind Maleinimid-Addukte, wobei der Maleinimidstickstoff und der Stickstoff von 6MAM oder von dem 6MAM-Analogen durch -(CH₂CH₂)- verknüpft sind.

Bevorzugte Substrate zur Verwendung in Immuntests, die auf β-Galactosidase basieren, umfassen jene, die in den US-Patenten Nr. 5 032 503, 5 254 677, 5 444 161 und 5 514 560 beschrieben werden. Zu den bevorzugten Substraten gehört Chlorphenolrot-β-D-galactopyranosid. Eine Optimierung anderer Merkmale und der Bedingungen der Tests, welche von dieser Erfindung umfaßt sind, ist eine Sache von Routineversuchen, die ein Durchschnittsfachmann kennt.

Reagenzien und Puffer, die in den Tests dieser Erfindung verwendet werden, können getrennt oder in Kombination in Form von Kits verpackt werden, um den Vertrieb zu erleichtern. Die Reagenzien werden in geeigneten Behältern zur Verfügung gestellt und werden typischerweise in einer Verpackung, zusammen mit schriftlichen Anleitungen, die sich auf die Testverfahren beziehen, zur Verfügung gestellt.

Die Analogen von 6MAM und die spezifischen Antikörper dieser Erfindung können durch Befestigung an einer festen Phase unlöslich gemacht werden. Dieses kann beispielsweise an der Wand eines Gefäßes sein, an einem Feststoffteilchen oder an einem Träger mit großem Molekulargewicht, der in Suspension gehalten werden kann, aber durch physikochemische Mittel wie z.B. durch Zentrifugation oder Mikrofiltration entfernt werden kann. Die Befestigung muß nicht kovalent sein, ist aber zumindest von ausreichender Beständigkeit, um jegliche Trenntechniken (einschließlich Wäschen) auszuhalten, die Teil der Testverfahren sind. Geeignete partikuläre Materialien umfassen Agarose, Polystyrol, Cellulose, Polyacrylamid, Latexteilchen, magnetische Teilchen und fixierte rote Zellen. Geeignete, kommerziell erhältliche Matrizes umfassen Sepharose^® (Pharmacia), Poros^®-Harze (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis), Actigel Su perflow^TM-Harze (Sterogene Bioseparations Inc., Carlsbad CA) und Dynabeads^TM (Dynal Inc., Lake Success, NY). Die Wahl ist nicht kritisch und hängt im allgemeinen von solchen Merkmalen wie Stabilität, Kapazität, Zugänglichkeit des gekoppelten Antikörpers, Flußgeschwindigkeit (oder der Fähigkeit, das Harz in der Reaktionsmischung zu dispergieren) und der Leichtigkeit der Trennung ab.

Geeignete Ansätze zur Befestigung der Substanz auf der festen Oberfläche hängen von dem Wesen des Analogen oder des Antikörpers und der festen Phase ab. Befestigungssysteme umfassen jene, die in der folgenden Tabelle gezeigt sind:

Beispielsweise können Antikörper, die durch Chromatographie über eine Protein A-Affinitätschromatographie gereinigt wurden, wie von dem Hersteller empfohlen an mit Cyanbromid aktivierter Sepharose^® CL-4B (Pharmacia, Piscataway, NJ) befestigt werden. Das Harz wird so präpariert, daß es ungefähr 0,8 mg gebundenen Antikörper pro ml Harzbettvolumen enthält. Das Verfahren kann wie folgt durchgeführt werden: Die benötigte Menge an aktivierter Sepharose^® wird gewogen, wobei berücksichtigt wird, daß 1 g gefriergetrocknetes Material zu einem Gelvolumen von 3,5 ml aufquillt. Das Gel wird rekonstituiert und im Waschpuffer (1 mM HCl) (3 Zyklen einer Harzwäsche, bei 200 ml pro Gramm) gewaschen und dann dreimal mit Kopplungspuffer (0,1 M NaHCO₃, 0,5 M NaCl, pH 8,3 (50 ml pro Gramm) gewaschen, indem ein Buchner-Trichter verwendet wird. Der Antikörper wird in Kopplungspuffer gelöst oder ausgetauscht, und es werden 5–10 mg pro ml gekoppelt. Der Gelkuchen wird in einen Behälter mit geeigneter Größe überführt, der Antikörper wird zugegeben, und das Volumen wird so eingestellt, daß eine 50 %-ige Aufschlämmung erzeugt wird. Die Suspension wird für 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 2 bis 8°C End-über-End gemischt. (Ein Rühren wird vermieden, um ein Scheren der Kügelchen zu verhindern). Der Anteil des Antikörpers, der erfolgreich gekoppelt wurde, kann durch ein Messen von A₂₈₀ vor und nach der Kopplung bestimmt werden. Dann wird Blockierungspuffer zugegeben (1 M Ethanolamin, pH 8,0, oder 0,2 M Trispuffer, pH 8,0), und die Suspension wurde für weitere 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 2 bis 8°C End-über-End gemischt. Das Gel wird in einem Buchner-Trichter mit Kopplungspuffer, einem zweiten Waschpuffer (0,1 M Acetat, 0,5 M NaCl, pH 4,0) und dann Kopplungspuffer (jeweils 100 ml pro Gramm) gewaschen. Nach der letzten Wäsche mit Kopplungspuffer wird das Harz mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, pH 7,4, 0,09 % Natriumazid) in eine 50 %-ige (v/v) Aufschlämmung überführt. Das präparierte Affinitätsharz kann gegebenenfalls mit einer 50 %-igen (v/v) Aufschlämmung inaktivierter Sepharose^® 4B verdünnt werden, um die gewünschte Bindungskapazität zu ergeben.

Natürlich können Antikörper, die zu einer Unlöslichkeit führen sollen, nach anderen Kriterien ausgewählt werden als die, die zu Testzwecken verwendet werden. Eine Modulation ist nicht wichtig, sondern eine hohe Kapazität (oder Affinität), und eine geringe Kreuzreaktivität mit potentiell störenden Substanzen, wie z.B. Morphin und Codein, ist für einen Festphasen antikörper wünschenswert. Ein Antikörper, welcher für 6MAM spezifisch ist und zur Verwendung als ein unlöslich gemachter Antikörper geeignet ist, wurde erhalten und weist die Laborbezeichnung 3F4 auf.

Ein unlöslich gemachtes Antigen kann in Tests für den Antikörper verwendet werden, und ein unlöslich gemachter Antikörper kann in Tests für das Immunogen verwendet werden. Markierungsverfahren und Prinzipien verschiedener Typen von Immuntests wurden vorher in dieser Offenbarung angegeben. Bei einem Festphasentest wird die Testprobe typischerweise mit der festen Phase gemischt, um ein Binden jeglicher Testsubstanz zu erlauben. Dann wird die feste Phase von der Probe und von jeglichem nicht-gebundenem Material abgetrennt, und die feste Phase wird gewaschen. Der nächste Schritt ist es, jegliche Substanz an der festen Phase zu bestimmen, die aus der Probe gebunden hat. Dieses kann durchgeführt werden, indem in die Reaktionsmischung ein markiertes Äquivalent des Analyten oder des Antikörpers, auf welchen getestet wird, eingeschlossen wird und die Menge des Analyten oder Antikörpers durch Kompetition bestimmt wird. Ein solches Verfahren wird in dem US-Patent Nr. 4 551 426 beschrieben. Alternativ kann die feste Phase in einem Sandwichformat verwendet werden, indem das gewaschene Harz mit einem Nachweismittel umgesetzt wird, das in der Lage ist, jegliche Substanz zu bestimmen, die das Harz spezifisch gebunden hat.

Unlöslich gemachtes Antigen und Antikörper können ebenfalls zu Zwecken der Reinigung oder Anreicherung von Substanzen, welche diese binden, als Affinitätsharze verwendet werden. Das Verfahren umfaßt ein Inkubieren des unlöslich gemachten Antigens oder Antikörpers mit dem Ausgangsmaterial unter Bedingungen, welche eine Bindung der Substanz erlauben, ein Entfernen des Ausgangsmaterials, gegebenenfalls ein Waschen der festen Phase und dann ein Gewinnen der gebundenen Substanz. Materialien, die mittels Antigen-Antikörper-Reaktivität binden, können im allgemeinen unter Verwendung organischer Lösungsmittel, Puffer mit hohem oder niedrigem pH (wie z.B. verdünnter Essigsäure oder Glycinpuffer, pH 2,4), hohem Salz (wie z.B. ei ner gepufferten Lösung von 1 M KSCN) oder organischen Lösungsmitteln (wie z.B. Methanol) eluiert werden.

Bei einer Abwandlung hiervon können ein unlöslich gemachtes Antigen oder ein Antikörper verwendet werden, um eine Probe vor einem Testen in einem Testsystem vorzubehandeln. Wenn beispielsweise eine Probe im Test auf 6MAM positiv ist, kann diese mit einer geeigneten Menge des anti-6MAM-Harzes behandelt werden und dann erneut getestet werden. Das Testergebnis wird als positiv bestätigt, wenn das Harz darin erfolgreich ist, den nachweisbaren Analyten aus dem Harz zu entfernen. Eine Weiterentwicklung des Adsorptionsverfahrens zur Durchführung eines bestätigenden Tests wird in der Internationalen Patentanmeldung WO 98126644 beschrieben.

Bei einer anderen Variation wird das Harz nicht verwendet, um den Analyten aus der Probe zu eliminieren, sondern um diese damit anzureichern. Ein bevorzugtes System besteht aus einem Probenextraktionskit aus der ImmunElute^TM-Produktserie von Microgenics. Ein Antikörper gegen 6MAM mit den gewünschten spezifischen Charakteristika wird, wie schon beschrieben, an Agarose gekoppelt. Das Harz wird als eine Suspension von 5 ml (50 Vol/Vol) in einem geeigneten Puffer, welcher 0,1 % Natriumazid als Konservierungsmittel enthält, zur Verfügung gestellt. Der Kit enthält ebenfalls Polyprepsäulen mit jeweils 10 ml, die oben Kappen und an dem Ausfluß am Boden unterhalb der Fritte oder des Filters, welche das Harz an Ort und Stelle halten, entfernbare Stopfen aufweisen.

Eine zusätzliche Erläuterung der Entwicklung und der Verwendung der Reagenzien und Tests gemäß dieser Erfindung wird in dem nachstehenden Abschnitt der Beispiele angegeben. Die Beispiele werden als ein weiterer Leitfaden für den Praktiker mit durchschnittlichem Fachwissen angegeben und sollen in keiner Weise als beschränkend aufgefaßt werden.

Beispiel 1
Herstellung von N-tert-Butyloxycarbonyl-2-bromethylamin
N-BOC-Bromethylamin wurde wie folgt hergestellt: 2-Bromethylaminhydrobromid (6,15 g, 30 mmol) wurde in einer Mischung von jeweils 30 ml Wasser und Dioxan gelöst, und die Lösung wurde in einem Eisbad auf 0–5°C abgeschreckt. Separat wurde eine Lösung von 3,27 g (15 mmol) Di-tert-butyldicarbonat in 35 ml Dioxan hergestellt. Schließlich wurde eine Lösung von 1 N Natriumhydroxid (30 ml) hergestellt. Eine tropfenweise Zugabe des Di-tert-butyldicarbonats und der 1 N Natriumhydroxid-Lösungen zu der gerührten 2-Bromethylaminhydrobromid-Lösung wurde bei 0–5°C begonnen. Die Zugabe von Di-tert-butyldicarbonat fand über 30 min hinweg statt, und die Zugabe von 1 N Natriumhydroxid war nach 15 min abgeschlossen.
Das Eisbad wurde dann entfernt, und die Reaktion wurde für 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach einer gesamten Reaktionszeit von 2,5 h wurde die Mischung mit 100 ml Dichlormethan verdünnt und in einen Scheidetrichter überführt. Die zweiphasige Mischung wurde getrennt, und die obere wäßrige Phase wurde in den Scheidetrichter zurückgegeben und mit 50 ml Dichlormethan gewaschen. Die Phasen wurden getrennt, und die Dichlormethan-Wäsche wurde zu der ursprünglichen Dichlormethan-Phase zugegeben. Der vereinigte Dichlormethan-Extrakt wurde zweimal mit 50 ml 5 % w/v Citronensäure-Lösung gewaschen, worauf zwei Wäschen mit 50 ml 10 % w/v Natriumchlorid-Lösung folgten. Der gewaschene Dichlormethan-Extrakt wurde gesammelt, über 5 g Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Rotationsverdampfer verdampft, wobei sich 3,22 g (95 % Ausbeute) eines klaren flüssigen Produkts ergaben.
¹H-NMR (CDCl₃): 1,47 ppm (9, s, BOC), 3,4–3,6 ppm (4, m + m, CH₂-CH₂), 5,00 ppm (1, br s, NH).
Beispiel 2
N-(N'-BOC-2-Aminoethyl)normorphin
N-(N'-BOC-2-Aminoethyl)normorphin wurde wie folgt hergestellt: Normorphin (202,5 mg, 0,747 mmol) wurde in 5 ml trockenem Dimethylformamid (DMF) gelöst und unter Argon zu einem Rundkolben mit Rückflußkondensator zugegeben. Fein pulverisiertes Natriumbicarbonat (316 mg, 3,76 mMol) wurde zugegeben, und die Suspension wurde unter Rühren auf 54°C erwärmt. In der Zwischenzeit wurde eine Lösung N-BOC-Bromethylamin (0,83 g, 3,69 mmol) in 1 ml trockenem DMF hergestellt, was 1,6 ml Lösung ergab. Ein 400 μl-Aliquot der letzteren Lösung wurde zu der gerührten Normorphin-Lösung zugegeben. Die Temperatur der Reaktion wurde auf 60–62°C erhöht. Nach 2 h und 5 h Reaktionsdauer wurden zusätzliche 400 μl-Aliquots der N-BOC-Bromethylamin-Lösung zu der Reaktion zugegeben. Die Reaktion wurde dann über Nacht bei 60–62°C gerührt. Schließlich wurden die verbleibenden 400 μl der N-BOC-Bromethylamin-Lösung zu der Reaktionsmischung zugegeben, und die Mischung wurde für weitere 3 h bei 60–62°C gerührt (gesamte Reaktionszeit 24 h).
Die Reaktionsmischung wurde auf einem Rotationsverdampfer bei 30°C verdampft, was einen öligen Rückstand ergab. Der Rückstand wurde in einer Mischung von 20 ml Chloroform und 10 ml Wasser gelöst. Die Phasen wurden getrennt, und die obere wäßrige Phase wurde erneut mit 10 ml Chlorform extrahiert. Die Chloroform-Schichten wurden vereinigt und mit 10 ml Wasser gewaschen, worauf 10 ml 10 % w/v Natriumchlorid-Lösung folgten. Die Chloroform-Schicht wurde gesammelt, über 1,6 g Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und auf einem Rotationsverdampfer verdampft, wobei sich 264 mg des rohen Produkts als ein Schaum ergaben. Das rohe Produkt wurde durch Kieselgel-Blitzchromatographie in einer Säule mit 1,5 × 25 cm, die mit Chloroform/Methanol (9/1 v/v) eluiert wurde, gereinigt. Fraktionen, die das Produkt enthielten, wurden durch DSC-Punkttests auf UV-absorbierendes Material lokalisiert, worauf eine DSC in Chloroform/Methanol (9:1) auf UV+-Fraktionen folgte. Reine Fraktionen wurden zusammengefaßt und im Rotationsverdampfer verdampft, wo bei sich 195,4 mg des Produkts als ein gelbbrauner Schaum ergaben (63 % Ausbeute).
¹H-NMR (CDCl₃): 1,5 ppm (s, BOC), 4,2 ppm (1H, m, H6), 4,9 ppm (d, H5), 5,1 ppm (br s, NH), 5,3 ppm (1H, d, H8), 6,5 & 6,65 (2H, d von d, H1 & H2).
Beispiel 3
3-O-Methoxyethoxymethyl-N-(N'-BOC-2-aminoethyl)normorphin
3-O-MEM-N-(N'-BOC-Aminoethyl)normorphin wurde wie folgt hergestellt: N-(N'-BOC-Aminoethyl)normorphin (253,7 mg, 0,61 mmol) wurde in 4 ml Dichlormethan unter Argon gelöst. Die Lösung wurde mit 110 μl (0,63 Mikromol) Diisopropylethylamin behandelt, dann in einem Eisbad auf 0–5°C abgeschreckt. Methoxyethoxymethylchlorid (MEM-Cl), 73 μl (0,64 mmol), wurde dann zugegeben, und die Reaktionsmischung wurde für 1,5 h bei 0–5°C gerührt. Das Eisbad wurde entfernt, und die Reaktion wurde für zusätzliche 2,5 h bei Raumtemperatur gerührt.
Die Reaktionsmischung wurde durch ein Verdünnen mit 10 ml Dichlormethan aufgearbeitet, in einen Scheidetrichter überführt und zweimal mit 10 ml Wasser, gefolgt von 8 ml einer 10 %-igen w/v Natriumchlorid-Lösung, gewaschen. Die Dichlormethan-Lösung wurde über 0,75 g Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und in einem Rotationsverdampfer verdampft, wobei sich das rohe Produkt als ein Öl ergab. Das rohe Produkt wurde durch Kieselgel-Blitzchromatographie in einer Säule mit 1,5 × 26 cm, die mit Chloroform/Methanol (9:1) eluiert wurde, gereinigt. Fraktionen, die das Produkt enthielten, wurden durch DSC-Punkttests auf UV-absorbierendes Material lokalisiert, worauf eine DSC in Chloroform/Methanol (9:1) der UV+-Fraktionen folgte. Reine Fraktionen wurden zusammengefaßt und im Rotationsverdampfer verdampft, wobei sich 211,1 mg des Produkts als ein Gummi ergaben (68 % Ausbeute).
¹H-NMR (CDCl₃): 1,5 ppm (s, BOC CH₃ s), 3,35 ppm (s, MEM CH₃O), 3,5 & 3,8 ppm (ms, MEM O-CH₂-CH₂-O), 5,2 ppm (d, H8), 5,1 & 5,55 ppm (ds, MEM O-CH₂-O), 5,7 ppm (d, H7), 6,5 & 6,8 ppm (d von d, H1 & H2).
Beispiel 4
3-O-MEM-6-O-Carbamoyl-N-(N'-BOC-2-aminoethyl)normorphin
Die Titelverbindung wurde wie folgt hergestellt: 3-O-MEM-N-(N'-BOC-Aminoethyl)normorphin, 23,7 mg (47 Mikromol), wurde unter Argon in 2 ml Dichlormethan gelöst. Disuccinimidylcarbonat (DSC), 36 mg (141 Mikromol), wurde zugegeben, worauf Triethylamin, 20 μl (141 Mikromol), folgte. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur gerührt. Der Fortschritt der Reaktion wurde durch UV auf einer C18-Umkehrphasensäule mit 10 × 0,46 cm (Vydac, 90 Å, pharmazeutisch) überwacht, welche mit einem linearen Gradienten von 20–40 % Acetonitril in 0,1 % v/v TFA/Wasser eluiert wurde (Fluß = 1 ml/min; Steigung = 1 %/min).
Nach 2 h wurden zusätzliche 26 mg (101 Mikromol) DSC und 13 μl (93 Mikromol) Triethylamin zugegeben. Die Reaktion wurde für insgesamt 26 h bei Raumtemperatur fortgesetzt. Nach dieser Zeit war nahezu das gesamte Ausgangsmaterial, welches bei einem k' = 5,9 eluierte, in ein vermutetes 6-O-Succinimidylcarbonat-Zwischenprodukt umgewandelt, welches bei einem k' = 10 eluierte. Zu dieser Zeit wurde 1 ml Dioxan zugegeben, worauf 1 ml 0,5 M Ammoniak in Dioxan folgte. Nach 5 min zeigte eine HPLC eine nahezu vollständige Umwandlung in das 6-O-Carbamat-Produkt, welches bei einem k' = 6,9 eluierte. Die Lösung wurde auf einem Rotationsverdampfer bis zur Trockenheit verdampft, und der Rückstand des rohen Produkts wurde erneut in 2 ml Acetonitril gelöst. Das rohe Produkt wurde in zwei Läufen durch präparative HPLC auf einer C18-HPLC-Säule mit 2,2 × 25 cm (Vydac, 300 Å) in demselben Gradientensystem, wie es bei den analytischen Läufen verwendet wurde, und bei der Fließgeschwindigkeit von 16 ml/min gereinigt. Die Fraktionen des Hauptpeaks aus 2 Läufen wurden zusammengefaßt und lyophilisiert, wobei sich 9,8 mg des Produkts ergaben, welches unmittelbar entschützt wurde (siehe Beispiel 5).
Beispiel 5
6-O-Carbamoyl-N-(2-aminoethyl)normorphinbistrifluoracetat
Die Titelverbindung wurde wie folgt hergestellt: 3-O-MEM-6-O-Carbamoyl-N-(N'-BOC-2-aminoethyl)normorphin, 9,8 mg (17,9 Mikromol), wurde mit 4 ml 50 % v/v Trifluoressigsäure (TFA) in Dichlormethan für 1,5 h bei Raumtemperatur behandelt. Die Reaktion wurde im Rotationsverdampfer verdampft, wobei sich ein Öl ergab. Diethylether wurde zu dem Öl zugegeben, um einen Feststoff zu erhalten. Filtration und Trocknen ergaben 5,3 mg des Produkts.
¹H-NMR (D₂O): 2,1–2,5 ppm (2H, ms, H15), 4,3 ppm (1H, m, H9), 5,1–5,3 ppm (2H, ms, H5 & H6), 5,55 ppm (1H, d, H8), 5,8 ppm (1H, d, H7); 5,65–5,85 (2H, d von d, H1 & H2)); keine BOC- oder MEM-Resonanzen.
Beispiel 6
6-O-Carbamoyl-N-(3-maleimidopropionamidoethyl)normorphin
6-O-Carbamoyl-N-(MPAE)-normorphin wurde wie folgt hergestellt: 6-O-Carbamoyl-N-(2-aminoethyl)normorphinbis-TFA-Salz, 11,7 mg (19,9 Mikromol), wurde in 0,5 ml DMF unter Argon gelöst. Triethylamin, 3,5 μl (25,1 Mikromol), wurde zugegeben, worauf 6,7 mg (25,2 Mikromol) Maleimidopropionsäure-N-hydroxysuccinimidester (MPS) folgten. Die Reaktion wurde durch eine C18-HPLC auf einer Säule mit 0,46 × 10 cm (Vydac, 90 Å, pharmazeutisch) überwacht, wobei ein linearer Gradient von 5–25 % Acetonitril in 0,1 % v/v TFA/Wasser bei 1 ml/min (Steigung = 1 %/min) verwendet wurde. Nach 20 min war nahezu das gesamte Ausgangsmaterial (k' = 1,9) in das Produkt umgewandelt, welches bei k' = 9,4 eluierte. Eine präparative HPLC auf einer C18-HPLC-Säule mit 2,2 × 25 cm (Vydac, 300 Å) in demselben Gradienten, bei einer Flußgeschwindigkeit von 16 ml/min, ergab 4,98 mg gereinigtes Produkt (49 % Ausbeute).
¹H-NMR (D₂O): 2,1–2,5 ppm (2H, ms, H15), 2,55 ppm (2H, t, MPAE CH₂CO), 3,85 ppm (2H, t, MPAE CH₂-N), 4,3 ppm (1H, m, H9), 5,15 ppm (1H, m, H6), 5,25 ppm (1H, d, H5), 5,55 ppm (1H, d, H8), 5,8 ppm (1H, d, H7), 6,7 & 6,8 ppm (2H, d von d, H1 & 2), 6,9 ppm (2H, s, Maleinimid H); Elektrosprüh-MS: erwartetes MG = 508,5; gemessenes MG = 508,5; UV_maX = 286 nm.
Beispiel 7
3-O-MEM-6-O-Dimethylphosphinyl-N-(N'-BOC-2-aminoethyl)-normorphin
Die Titelverbindung wurde wie folgt hergestellt: Dimethylphosphinylchlorid, 28,5 mg (0,253 mmol), wurde in 0,5 ml wasserfreiem Pyridin unter Argon gelöst und in einem Eisbad auf 0–5°C abgeschreckt. Separat wurde 1H-Tetrazol, 23,5 mg (0,336 mmol), in 0,5 ml Pyridin gelöst, und die Lösung wurde zu der abgeschreckten Dimethylphosphinylchlorid-Lösung zugegeben und für 9 min gerührt. Schließlich wurde eine Lösung von 3-O-MEM-6-O-N-(N'-BOC-2-Aminoethyl)normorphin, 59,8 mg (0,118 mmol), in 1 ml Pyridin hergestellt und bei 0–5°C zu der Dimethylphosphinylchlorid/Tetrazol-Mischung zugegeben. Nach einem Rühren für weitere 10 min bei 0–5°C wurde das Eisbad entfernt, und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur gerührt.
Die Reaktion wurde durch eine C18-HPLC auf einer Säule mit 0,46 10 cm (Vydac, 90 Å, pharmazeutisch) in einem linearen Gradienten von 10–60 % Acetonitril in 20 mM Triethylaminacetat (pH 6,0) bei 1,0 ml/min (Steigung = 1 %/min) überwacht. Das Ausgangsmaterial, welches bei einem k' = 9,6 eluierte, wurde in ein Produkt umgewandelt, das bei einem k' = 9,8 eluierte. Die Reaktion war nach 70 min bei Raumtemperatur nahezu vollständig. Nach 2 h wurde die Reaktionsmischung bei 30°C auf einem Rotationsverdampfer verdampft, wobei sich ein Öl ergab. Das Öl wurde erneut in Chloroform, 15 ml, und Wasser, 10 ml, gelöst. Die zweiphasige Lösung wurde getrennt, und die untere Chloroform-Phase wurde mit 10 ml Wasser gewaschen, worauf 10 ml 10 % w/v Natriumchlorid-Lösung folgten. Die Chloroform-Phase wurde über 1 g Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Rotationsverdampfer zu einem rohen Produkt als einem Öl verdampft.
Das rohe Produkt wurde erneut in 250 μl Chloroform gelöst und auf einer präparativen DSC-Platte von 20 × 20 (Whatman PK6F) in Chloroform/Methanol (9:1) als mobile Phase gereinigt.
Die Platte wurde auf 10 cm entwickelt, aus dem DSC-Behälter entfernt und an der Luft getrocknet. Zwei Hauptbanden für das Produkt (R_f 0,40) und das Ausgangsmaterial (R_f 0,55) wurden unter einer UV-Lampe sichtbar gemacht. Die Produktbande wurde aus der Platte ausgeschnitten und auf einem Filter mit 3 × 10 ml mobiler Phase eluiert. Das Eluat wurde im Rotationsverdampfer verdampft, wobei sich 41,3 mg des gereinigten Produkts als ein Öl ergaben (60 % Ausbeute).
¹H-NMR (CDCl₃): 1,5 ppm (9H, s, BOC CH₃ s), 1,55 & 1,70 ppm (6H, d von d, P-CH₃ s), 2,1–2,5 ppm (2H, ms, H15), 3,4 ppm (s, MEM CH₃O), 3,55 & 3,85 (4H, ts, MEM O-CH₂-CH₂-O), 5,25 ppm (2H, d von d, MEM-O-CH₂-O), 5,35 & 5,55 ppm (2H, ds, H7 & H8), 6,5 & 6,85 ppm (2H, ds, H1 & H2).
Beispiel 8
6-O-Dimethylphosphinyl-N-(2-aminoethyl)-normorphinbis-TFA-Salz
Die Titelverbindung wurde wie folgt hergestellt: Das gereinigte 3-O-MEM-6-O-Dimethylphosphonyl-N-(N'-2-BOC-aminoethyl)normorphin, 41,3 mg (71 Mikromol), wurde in 2 ml Dichlormethan gelöst und mit 2 ml TFA behandelt. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur unter Argon für 105 min gerührt, wobei zum Überwachen die HPLC in dem in Beispiel 7 beschriebenen System verwendet wurde. Das gesamte Ausgangsmaterial, welches bei k' = 9,8 eluierte, wurde in ein Produkt umgewandelt, welches bei k' = 3,75 eluierte. Nach 105 min wurde die Reaktionsmischung im Rotationsverdampfer zu einem Öl verdampft. Die Zugabe von Diethylether, 5 ml, ergab einen gummiartigen Feststoff, welcher durch Beschallung in einem Bad zu einem feinen, fast weißen Pulver umgewandelt wurde. Die Suspension wurde im Kühlschrank abgeschreckt, dann filtriert, wobei sich nach Trocknen 41,8 mg des rohen Produkts ergaben.
¹H-NMR (D₂O): 1,70 ppm (6H, "t" = mit d überlappendes d, P-CH₃ s), 2,1–2,5 ppm (2H, ms, H15), 3,5–3,7 ppm (ms, Aminoethyl CH₂ s), 4,4 ppm (1H, m, H9), 5,2 ppm (1H, d, H5), 5,55 & 5,8 ppm (2H, ds, H7 & H8), 6,7 & 6,8 ppm (2H, d von d, H1 & H2), keine MEM- oder BOC-Resonanzen. Eine C18-HPLC auf einer Säule mit 0, 46 ×10 cm in einem linearen Gradienten von 5–25 % Acetonitril in 0,1 % v/v TFA/Wasser, 1,0 ml/min (0,66 % B/min), zeigte einen Hauptpeak bei k' = 3,17 und einen Peak durch Verunreinigungen bei k' = 7,34. Das Produkt wurde durch eine präparative HPLC auf einer C18-Säule mit 2, 2 × 25 cm in dem Gradientensystem von 5–25 %, bei einer Flußgeschwindigkeit von 16 ml/min, gereinigt. Reine Fraktionen wurden gewonnen und lyophilisiert, wobei sich 21,3 mg ergaben. UV_max = 286 nm.
Beispiel 9
6-O-Dimethylphosphinyl-N-(3-maleimidopropionamido)normorphin
Die Titelverbindung wurde wie folgt hergestellt: 6-O-Dimethylphosphinyl-N-(2-aminoethyl)normorphinbis-TFA, 9,8 mg (15,9 Mikromol), wurde in 0,75 ml DMF unter Argon gelöst. Triethylamin, 3,2 μl (23 Mikromol) wurde zugegeben, worauf 3,6 mg (13,5 Mikromol) Maleimidopropionsäure-N-hydroxysuccinimidester (MPS) in 0,25 ml DMF folgten. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur gerührt und durch C18-HPLC in dem in Beispiel 8 beschriebenen Gradientensystem von 5–25 % überwacht. Das Ausgangsmaterial bei k' = 3,28 wurde in ein Produkt bei k' = 7,03 umgewandelt. Nach 60 min wurden zusätzliche 1,6 mg (6 Mikromol) MPS und 1 μl (7,2 Mikromol) Triethylamin zugegeben, um die Reaktion vollständig ablaufen zu lassen. Nach 90 min wurde die Reaktion bis zur Aufarbeitung in einen Gefrierschrank bei –70°C gestellt.
Die Reaktionsmischung wurde aufgearbeitet, indem sie in 9 ml 0,1 % v/v TFA/Wasser verdünnt wurde, filtriert wurde und das Filtrat in zwei Läufen auf einer präparativen C18-HPLC-Säule (2,2 × 25 cm), unter Verwendung des Gradientensystems aus Beispiel 8 von 5–25 %, bei einer Flußgeschwindigkeit von 16 ml/min gereinigt wurde. Reine Fraktionen wurden zusammengefaßt und lyophilisiert, wobei sich eine Gesamtmenge von 6,98 mg ergab.
¹H-NMR (CD₃OD): 1,7 & 1,8 ppm (6H, "t" = mit d überlappendes d, P-CH₃ s), 2,1–2,5 ppm (2H, ms, H15), 2,6 ppm (2H, t, MPS CH₂CO), 3,85 ppm (2H, t, MPS CH₂N), 4,45 ppm (1H, m, H9), 5,2 ppm (1H, d, H5), 5,6 & 5,85 ppm (2H, d von d, H7 & H8), 6,75 & 6,85 ppm (2H, d von d, H1 & H2), 6,9 ppm (2H, s Maleinimid H).
UV_max = 286 nm.
Beispiel 10
Herstellung von Carbamoylanalog-Protein-Konjugaten
Die Konjugation von Normorphin-Carb-MPAE-MPA mit dem Enzymdonor ED28 wurde wie folgt durchgeführt: Eine Lösung von entsalztem ED28 (1 mg) in Phosphatpuffer (833 μl, 100 mM, pH = 7) wurde unter Rühren zu einer Lösung von Normorphin-Carb-MPAE-UPA (380 μg) in DMF (204 μl) zugegeben. Nach einem Stehen bei Raumtemperatur für 100 min wurde TFA in Wasser (1,4 ml, 0,1 % v/v) zugegeben, und die Mischung wurde auf einer vorgepackten PD-10 SEPHADEX G-25-Ionenaustauschersäule (Pharmacia, Inc.), die mit 0,1 % v/v TFA in Wasser voräquilibriert war, entsalzt. TFA in Wasser (1 ml, 0,1 % v/v) wurde zu dem Eluat (3,5 ml) zugegeben, und die Lösung wurde in eine 10 ml-Schleife eingespritzt und durch HPLC gereinigt [C4, 1 × 25 cm, 0 min, 100 % A (0,1 % v/v TFA); 0,1–20 min, 25–45 % B (0,1 % v/v TFA/MeCN); Flußgeschwindigkeit = 4 ml/min; 280 nm]. Die Reinigung lieferte 3,07 ml Eluat. Die Ausbeute betrug 579 μg (51 %), wie durch UV-Extinktion bei 280 nm bestimmt wurde (ε₂₈₀ = 18.900 cm^–1M^–1). Diese Lösung wurde bis zur weiteren Verwendung bei –80°C gelagert.
Die Herstellung des carbamoylanalogen Immunogens (KLH-2-IT-CARB-MPAE-Normorphin) wurde wie folgt durchgeführt: 2-Iminothiolan (2-IT) (1,72 mg) wurde zu KLH (12,5 mg) in Phosphatpuffer (1,25 ml, 83 mM, pH = 7,2, 0,9 M NaCl) unter Rühren zugegeben. Nach 3 h wurde Phosphatpuffer (1,25 ml, 100 mM, pH = 7) zu der Mischung zugegeben, und diese wurde mit einer vorgepackten PD-10 SEPHADEX G-25-Ionenaustauschersäule (Pharmacia, Inc.), welche mit Phosphatpuffer (100 mM, pH = 7) voräquilibriert war, entsalzt, um überschüssiges 2-IT zu entfernen. Das Eluat (3,5 ml) wurde zu Carbamoyl-MPAE-normorphin (3,11 mg) in DMF (2 ml) zugegeben. Nach einem Rühren für 1 h wurde die Mi schung gegen Phosphatpuffer (800 ml, 10 mM, pH = 7, 150 mM NaCl) und DMF (200 ml) dialysiert. Nach 12 Stunden wurde der Puffer ersetzt. Nach weiteren 12 Stunden wurde dieser Puffer durch Phosphatpuffer (2 l, 10 mM, pH = 7, 150 mM NaCl) ersetzt, welcher wiederum nach weiteren 12 Stunden ersetzt wurde. 12 Stunden nach dem letzten Pufferwechsel wurde die Lösung des Im munogens (9 ml) in ein Glasfläschchen überführt und bis zur Verwendung bei –80°C gelagert.
Beispiel 11
Entwicklung von 6MAM-spezifischen monoklonalen Antikörpern
Die Antikörper wurden hergestellt, indem zuerst die Immunogene NM-DMP-MPAE-2IT-KLH oder KLH-2IT-CARB-MPAE-NM oder NM-MMP-MPAE-2IT-KLH Mäusen in einer Serie von Injektionen verabreicht wurden. Den Mäusen wurde nach drei Immunisierungen, und wiederum nach zwei zusätzlichen Immunisierungen, Blut entnommen. Die Seren wurden mit einer Version eines β-Galactosidase-Enzym-Komplementationstests in einer Platte mit 96 Vertiefungen getestet (siehe Beispiel 12). Die Daten waren wie folgt:
Diese Ergebnisse zeigen, daß alle Immunogene gut arbeiteten, so daß sie eine starke und spezifische (außer in dem Fall des MMP-Immunogens) Antwort hervorriefen. Mäuse aus den DMP- oder Carb-Gruppen wurden ausgewählt und vor der Fusion hyperimmunisiert. Das Parentalmyelom, das für alle Fusionen verwendet wurde, war P3X63-Ag8.653, welches über die American Type Culture Collection (ATCC) gekauft wurde. Die erste Fusion erzeugte 71 Klone, welche in dem Enzymkomplementationstest im Stil CEDIA^® mit 96 Vertiefungen stark an das 6MAM-Konjugat banden. 19 dieser Klone wurden auf der Basis einer Modulation mit einem Grenzwert von 1x zurückbehalten. Eine zweite Fusion wurde in ähnlicher Weise durchgeführt, aus welcher 50 anfangs 6MAM-bindende positive Klone identifiziert wurden, von denen 14 zurückbehalten wurden. Kulturüberstände von den zurückbehaltenen Linien wurden wachsen gelassen, um Antikörperproben zur Instrumentenanalyse über CEDIA^® zur Verfügung zu stellen.

Chronologie der Ereignisse für Antikörper, die unter Verwendung von NM-DMP-MPAE-2IT-KLH hervorgerufen wurden:

• Erste Immunisierung	Zeit 0
• Zweite Immunisierung	2 Wochen
• Dritte Immunisierung	4 Wochen
• Den Mäusen Blut entnommen	6 Wochen
• Vierte Immunisierung	35 Wochen
• Seren von der ersten Blutentnahme titriert	64 Wochen
• Fünfte Immunisierung	67 Wochen
• Den Mäusen Blut entnommen	69 Wochen
• Seren von der zweiten Blutentnahme titriert	69 Wochen
• Erste 6MAM-Fusion durchgeführt	89 Wochen
• Erste 6MAM-Fusion gescreent	90 Wochen

Chronologie der Ereignisse für Antikörper, die unter Verwendung von KLH-2IT-CARB-MPAE-NM hervorgerufen wurden:

Erste Immunisierung	Zeit 0
Zweite Immunisierung	2 Wochen
Dritte Immunisierung	5 Wochen
Den Mäusen Blut entnommen	7 Wochen
Vierte Immunisierung	60 Wochen
Seren von der zweiten Blutentnahme titriert	59 Wochen
Fünfte Immunisierung	62 Wochen
Den Mäusen Blut entnommen	63 Wochen
Seren von der ersten Blutentnahme titriert	63 Wochen
Erste 6MAM-Fusion durchgeführt	86 Wochen
Erste 6MAM-Fusion gescreent	87 Wochen

Beispiel 12
β-Galactosidase-Enzymkomplementationstest auf 6MAM
Das Enzymakzeptor-(EA)-Reagens wurde hergestellt, indem ein lyophilisiertes EA-Reagens mit EA-Rekonstitutionspuffer (EARB), welcher den 6-Acetylmorphin-Antikörper enthielt, rekonstituiert wurde. Die verwendeten Bestandteile und Konzentrationen sind nachfolgend aufgelistet.

(*) Konzentration zeigt die Endkonzentration nach der Rekonstitution an.

Das Enzymdonor-(ED)-Reagens wurde als ein flüssiges Reagens mit den nachstehenden Bestandteilen hergestellt.
Beide Reagenzien wiesen einen pH von 6,85 auf.
Das Testprotokoll war wie folgt: Die Probe wurde in eine Reaktionsküvette pipettiert, und das EA-Reagens, welches den Antikörper enthielt, wurde zugegeben. Die Mischung wurde für ungefähr 5 Minuten bei 37°C inkubiert, und das ED-Reagens, welches das Substrat enthielt, wurde anschließend zugegeben. Die Geschwindigkeit der Substrathydrolyse wurde dann photometrisch von 4 bis 5 Minuten nach der ED-Zugabe gemessen. Die folgende Tabelle faßt das Testprotokoll zusammen.
5 zeigt repräsentative Standardkurven, wobei zwei verschiedene Antikörperklone verwendet werden (bezeichnet als 3F4 und 8C10).
Die Kreuzreaktivitäten gegenüber Morphin, Morphin-Metaboliten und Codein wurden für die 3F4- und 8C10-Antikörperklone ausgewertet. Die Ergebnisse sind nachfolgend aufgelistet und zeigen sowohl eine hohe Empfindlichkeit als auch eine hohe Spezifität.
Während die Erfindung zur Veranschaulichung und anhand von Beispielen zu Zwecken der Klarheit und des Verständnisses in gewissem Detail beschrieben wurde, wird es dem Fachmann klar sein, daß gewisse Änderungen und Modifikationen in der Praxis gemacht werden können. Daher sollten die Beschreibung und die Beispiele nicht so ausgelegt werden, daß sie den Umfang der Erfindung, welcher durch die angefügten Ansprüche skizziert wird, beschränken.
Auf alle hierin erwähnten Referenzen, Publikationen und Patente wird hiermit vollinhaltlich Bezug genommen.
SPEZIFITÄT DES MONOACETYLMORPHIN-ANTIKÖRPERS
SPEZIFITÄT DES MONOACETYLMORPHIN-ANTIKÖRPERS

Claims

6-O-Acetylmorphin(6MAM)-analoge Verbindungen mit der folgenden Struktur:
sowie deren Salze, worin X -O-, -S-, -NH- oder -CH₂- ist, und worin R ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:
worin K -CH₃, -CF₃, -CHF₂ oder -CH₂F ist; unter der Voraussetzung, daß, wenn R
ist und K -CH₃ ist, X nicht -O- ist und Q -L¹-Z ist, wobei L¹ ein Linker ist, der wenigstens ein Kohlenstoffatom enthält; worin Z ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus den Komponenten -NH₂, -COOH, -SH,
-NH-C(=O)-L²-M,
oder irgendeiner Kombination oder Wiederholung der Komponenten; wobei L² ein Linker ist, der wenigstens ein Kohlenstoffatom enthält; wobei M ein Halogenid oder Maleinimid ist; und worin J -O-, -S-, -NH- oder -CH₂- ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei X -O- ist, und R ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:
und wobei L¹ und L² unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus C₁-C₂₀-Kohlenwasserstoffketten, die null bis zehn Heteroatome enthalten, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus N, O und S, und welche wenigstens so viele Kohlenstoffatome wie Heteroatome enthalten.
Verbindung nach Anspruch 1, welche durch Befestigung einer Markierung, entweder direkt oder durch eine Verknüpfungsgruppe, kovalent derivatisiert ist.
Verbindung nach Anspruch 3, worin die Markierung ausgewählt ist aus. der Gruppe, bestehend aus einer Komponente, die ein Radioisotop, eine fluoreszierende Gruppe, eine Fluoreszenzlöschende Gruppe, eine phosphoreszierende Gruppe, eine chemilumineszente Gruppe, eine chromophore Gruppe, eine elektrochemisch aktive Gruppe, eine elektrochemilumineszente Gruppe, eine Gruppe, die beim Binden eine Änderung bei der Fluoreszenz, Phosphoreszenz, Chemilumineszenz oder einer elektrochemischen Eigenschaft erfährt, enthält, einem Peptid, einem Protein, einem Proteinfragment, einem immunogenen Träger, einem Enzym, einem Enzyminhibitor, einem Enzymsubstrat, einem Enxymcofaktor, einer prosthetischen Enzymgruppe, einem Enzymdonor, einem Goldteilchen, einem Antikörper und einer Nukleinsäure.
Verbindung nach Anspruch 1, welche durch eine kovalente Befestigung an einer festen Oberfläche oder an einem unlöslichen Feststoffteilchen derivatisiert ist.
6-O-Acetylmorphin(6MAM)-analoge Verbindungen mit der folgenden Struktur:
sowie deren Salze, worin X -O-, -S-, -NH- oder -CH₂- ist, und worin R ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:
worin K -CH₃, -CF₃, -CHF₂ oder -CH₂F ist; unter der Voraussetzung, daß, wenn R
ist und K -CH₃ ist, dann X nicht -O- ist; und Q -L¹-G ist, wobei L¹ ein Linker ist, der wenigstens ein Kohlenstoffatom enthält, und G ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus fluoreszierenden, chemilumineszenten, phosphoreszierenden und chromophoren Verbindungen, einer Fluoreszenz-löschenden Gruppe, einer durch ein Radioisotop markierten Gruppe, einer elektrochemisch aktiven Gruppe, einer elektrochemilumineszenten Gruppe, einer Gruppe, die beim Binden eine Änderung bei der Fluoreszenz, Phosphoreszenz, Chemilumineszenz oder einer elektrochemischen Eigenschaft erfährt, Peptiden, Proteinen, Proteinfragmenten, immunogenen Trägern, Enzymen, Enzymdonoren, Enzyminhibitoren, Enzymsubstraten, Enzymcofaktoren, prosthetischen Enzymgruppen, festen Teilchen, Goldteilchen, Antikörpern und Nukleinsäuren.
6-O-Acetylmorphin(6MAM)-analoge Verbindungen mit der folgenden Struktur:
sowie deren Salze, worin X -O-, -S-, -NH- oder -CH₂- ist, und worin R ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:

worin K -CH₃, -CF₃, -CHF₂ oder -CH₂F ist; unter der Voraussetzung, daß, wenn R
ist und K -CH₃ ist, dann X nicht -O- ist; Q -L¹-Z ist, wobei L¹ ein Linker ist, der wenigstens ein Kohlenstoffatom enthält; worin Z ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus den Komponenten -NH₂, -COOH, -SH,
-NH-C(=O)-L²-M,

irgendeiner Kombination oder Wiederholung der Komponenten; wobei L² ein Linker ist, der wenigstens ein Kohlenstoffatom enthält; und worin J -O-, -S-, -NH- oder -CH₂- ist.
Verbindung nach Anspruch 7, welche durch eine kovalente Befestigung einer Markierung, entweder direkt oder durch eine Verknüpfungsgruppe, derivatisiert ist.
Verbindung nach Anspruch 8, worin die Markierung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer Komponente, welche eine Radioisotop, eine fluoreszierende Gruppe, eine Fluoreszenz-löschende Gruppe, eine phosphoreszierende Gruppe, eine chemilumineszente Gruppe, eine chromophore Gruppe, eine elektrochemisch aktive Gruppe, eine elektrochemilumineszente Gruppe, eine Gruppe, die beim Binden eine Änderung bei der Fluoreszenz, Phosphoreszenz, Chemilumineszenz oder einer elektrochemischen Eigenschaft erfährt, enthält, einem Peptid, einem Protein, einem Proteinfragment, einem immunogenen Träger, einem Enzym, einem Enzyminhibitor, einem Enzymsubstrat, einem Enzymcooder faktor, einer prosthetischen Enzymgruppe, einem Enzymdonor, einem Goldteilchen, einem Antikörper und einer Nukleinsäure.
Verbindung nach Anspruch 7, welche durch eine kovalente Befestigung an einer festen Oberfläche oder an einem unlöslichen Feststoffteilchen derivatisiert ist.
Verbindung nach Anspruch 1, welche durch eine kovalente Befestigung an einem Protein oder Peptid derivatisiert ist.
Verbindung nach Anspruch 11, worin das Protein oder Peptid ein Enzym ist.
Verbindung nach Anspruch 11, worin das Protein oder Peptid ein Enzymdonor ist, welcher sich mit einem Enzymakzeptor unter Bildung eines aktiven Enzymkomplexes komplementär ergänzt.
Verbindung nach Anspruch 13, worin der Enzymdonor ED28 ist.
Verbindung nach Anspruch 11, worin das Protein oder Peptid immunogen ist.
Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 11, welches ein Bereitstellen der Verbindung nach Anspruch 1 und ein Konjugieren der Verbindung mit einem Protein oder Peptid umfaßt.
Verfahren zum Erhalten eines Antikörpers, der für 6-O-Acetylmorphin (6MAM) spezifisch ist, welches ein Immunisieren eines Wirbeltiers oder ein Inkontaktbringen einer immunkompetenten Zelle oder eines Virus mit der Verbindung nach Anspruch 15 umfaßt.
Antikörper, welcher gemäß dem Verfahren nach Anspruch 17 erhalten wurde.
Immuntest-Reagens, welches eine markierte Verbindung gemäß Anspruch 4 umfaßt, worin die Markierung eine fluoreszierende Gruppe, eine phosphoreszierende Gruppe, eine chemilumineszente Gruppe oder eine elektrochemisch aktive Gruppe, eine elektrochemilumineszente Gruppe oder irgendeine Gruppe, die beim Binden an einen Antikörper, der für 6-O-Acetylmorphin (6MAM) spezifisch ist, eine Änderung bei der Fluoreszenz, Phosphoreszenz, Chemilumineszenz oder einer elektrochemischen Eigenschaft erfährt, ist.
Immuntest-Reagens, welches ein Protein- oder Peptid-Konjugat gemäß Anspruch 11 umfaßt, worin entweder: das Protein oder Peptid ein Enzym ist, das beim Binden des Konjugats an einen Antikörper, der für 6MAM spezifisch ist, eine Änderung der Enzymaktivität erfährt oder das Protein oder Peptid ein Enzymdonor ist, wobei die Fähigkeit des Enzymdonors, sich mit einem Enzymakzeptor unter Bildung eines aktiven Enzymkomplexes komplementär zu ergänzen, von der Bindung des Konjugats an einen Antikörper, der für 6MAM spezifisch ist, beeinflußt wird.
Reagenssystem zur Bestimmung von 6-O-Acetylmorphin (6MAM) in einer Probe, welches eine markierte Verbindung gemäß Anspruch 4 und einen Antikörper, der für 6MAM spezifisch ist, umfaßt.
Reagenssystem zur Bestimmung von 6MAM in einer Probe, welches ein Protein- oder Peptid-Konjugat gemäß Anspruch 12 und einen Antikörper, der für 6MAM spezifisch ist, umfaßt.
Reagenssystem zur Bestimmung von 6MAM in einer Probe, welches einen Antikörper gemäß Anspruch 18 und ein markiertes 6MAM oder 6MAM-Analoges umfaßt.
Reagenssystem zur Bestimmung von 6MAM in einer Probe, welches einen Antikörper, welcher für 6-O-Acetylmorphin (6MAM) spezifisch ist und eine Kreuzreaktivität mit Morphin, Morphin-3-glucuronid, Mor phin-6-glucuronid und Codein aufweist, die jeweils weniger als ca. 10,0 % beträgt.
Reagenssystem zur Bestimmung von 6MAM in einer Probe, welches einen Antikörper, welcher eine Kreuzreaktivität mit Codein von weniger als ca. 1,0 % und eine Kreuzreaktivität mit Morphin von weniger als ca. 0,1 % aufweist und ein markiertes 6MAM oder 6MAM-Analoges umfaßt.