DE10064195A1 - Verwendung einer Zusammensetzung zur Stimulation des Nervenwachstums, zur Inhibition der Narbengewebsbildung und/oder Reduktion eines Sekundärschadens - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Zusammensetzung, enthaltend ein Fusionsprotein und mindestens einen Transporter zur in-vivo-Stimulation des Nervenwachstums, der in-vivo-Inhibition der Narbengewebsbildung und/oder in-vivo-Reduktion eines Sekundärschadens, wobei das Fusionsprotein mindestens eine Bindungsdomäne für den Transporter und mindestens eine Modulationsdomäne zur kovalenten Modifikation von kleinen GTP-bindenden Proteinen enthält und der Transporter die Aufnahme des Fusionsproteins in eine Zielzelle vermittelt.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Zusammensetzung enthaltend ein Fusionsprotein und mindestens einen Transporter zur In-vivo- Stimulation des Nervenwachstums, der In-vivo-Inhibition der Narben­ gewebsbildung und/oder In-vivo-Reduktion eines Sekundärschadens, wobei das Fusionsprotein mindestens eine Bindungsdomäne für den Transporter und mindestens eine Modulationsdomäne zur kovalenten Modifikation von kleinen GTP-bindenden Proteinen enthält, und der Transporter die Aufnahme des Fusionsproteins in eine Zielzelle vermittelt.

Rückenmark und Gehirn bilden bei den Wirbeltiere das zentrale Nervensystem (ZNS). Das Rückmark verläuft in Körperlängsrichtung und wird von dem Wirbelkanal umgeben. Es lässt sich beim Menschen in acht Hals-, zwölf Brust-, fünf Lenden-, fünf Kreuzbein- und ein bis zwei Steißbeinsegmente gliedern. Die zentrale graue Substanz mit ihren seitlichen Ausladungen (Vorder- und Hinterhorn) wird von den Zellkörpern der Nervenzellen und die periphere weiße Substanz durch die markhaltige Nervenfaserbündel gebildet. In der weißen Substanz verlaufen afferente (aufsteigende, sensible) und efferente (absteigende, effektorische) Leitungsbahnen. Die absteigenden Bahnen des Rückenmark werden in die Pyramidenbahnen (willkürliche Bewegungen) und extrapyramidale Bahnen (unwillkürliche Bewegungen; Verteilung des Muskeltonus) unterschieden. Der größte Teil der pyramidalen Fasern verläuft gekreuzt in der Pyramidenseiten­ strangbahn der Gegenseite und zum kleineren Teil ungekreuzt in der Pyramidenvorderstrangbahn zu Vorderhorn- und Hinterhornzellen der verschiedenen Rückenmarkssegmente.

Eine Verletzung des Rückenmarks z. B. infolge eines Unfalls führt zu einer dauer­ haften Unterbrechung der Leitungsfunktion der betroffenen Nervenfasern. Eine Lähmung in Folge eines völligen Ausfalls von mindestens einem Segment bezeichnet man als Querschnittslähmung. Die Folge ist der Verlust der sensiblen (z. B. Temperatur-, Schmerz- oder Druckempfindungen), motorischen (willkür­ liche und unwillkürliche Bewegung) und vegetativen Funktionen (z. B. Blasen- und Darmfunktion) für alle Gebiete unterhalb des betroffenen Segments. Aufgrund der schlechten regenerativen Fähigkeiten der Nervenfasern bleibt die Lähmung der Willkürmotorik und der vollständige Sensibilitätsverlust dauerhaft bestehen.

Es sind aber auch neurologische und neurodegenerative Erkrankungen des peripheren und zentralen Nervensystems bekannt, bei denen Nervenzellen zugrunde gehen. Dies sind z. B. Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson, Multiple Sklerose und ähnliche Erkrankungen, die mit einem Nervenfaserverlust und Entmarkung einhergehen, sowie Amyotrophe Lateral Sklerose und andere Motoneuonenerkrankungen, Ischämie, Schlaganfall, Epilepsie, Morbus Huntington, AIDS Demenz Komplex und Prionen-Erkrankungen.

Ziel der Forschung ist es daher, bei Läsionen des Rückenmarks eine Regeneration der Nervenaxone über die Verletzung hinweg zu bewerkstelligen und bei anderen Krankheiten des peripheren und zentralen Nervensystems, das Nervenwachstum zu stimulieren.. Die Narbenbildung im zentralen Nervensystem der Säugetiere stellt ein enormes Regenerationshemmnis für wachsende Nervenfasern dar. Aus diesem Grund sind die Verlangsamung oder Verhinderung der Narbenbildung sowie die Stimulation des Nervenfaserwachstums wesentliche therapeutische Ziele bei neuroregenerativen Behandlungskonzepten.

Einen Ansatzpunkt bietet die Einflußnahme auf Signaltransduktionswege in Nervenzellen. Es ist bekannt, daß die Aktivierung kleiner GTP-bindender Proteine aus der Familie der Rho-GTPasen (Rho A, B, C) zu einer starken Wachstums­ hemmung von Nervenfasern unter Zellkulturbedingungen führt (Mueller BK, 1999, Annu. Rev. Neurosci. 22: 351-388). Experimentelle Belege sprechen dafür, daß die spezifische Aktivierung von Rho A, B und/oder C im Inneren der Nervenfasern durch potente, außen an der Membran angreifende regenerationshemmende Proteine des adulten Säuger-Gehirns (NOGO, MAG, RGM, Ephrin-A5) einen wesentlichen Mechanismus der Inhibition des Nervenfaserwachstums darstellt (Jin Z und Strittmatter SM, 1997, J. Neurosci. 17: 6256-6263; Lehmann M, Fournier A, Selles-Navarro I, Dergham P, Sebok A, Leclerc N, Tigyi G, McKerracher L, 1999, J. Neurosci. 19: 7537-7547; Wahl S, Barth H, Ciossek T, Aktories K, Mueller BK, 2000, J. Cell. Biol. 149: 263-270). Die Aktivierung von Rho A-C führt bei neu aussprossenden Nervenfasern zum Kollaps des Wachstumskegels, der distalen Spitze des Neuriten, und verhindert dadurch die Ausbildung neuer Nervenbahnen.

Aus dem Stand der Technik ist das bakterielle Exoenzym C3-Transferase als spezifischer Inhibitor von Rho A, B und C bekannt (Aktories K, Schmidt G, Just I, 2000, Biol. Chem. 381: 421-426). Dieses Protein ADP-ribosyliert Rho A-C am Argeninrest 41 und inhibiert dadurch diese Rho-GTPasen (Aktories et al., 2000, supra). Um eine ausreichende Aktivierungsblockade der Rho-GTPasen zu erreichen, müssen über 90% der intrazellulären Rho A-C Proteine ADP-ribosyliert und damit inaktiviert werden. Die C3-Transferase besitzt jedoch eine sehr schlechte Membranpermeabilität und wird daher nur in geringsten Mengen (ca. 1% der Ausgangsmenge) von den Zellen aufgenommen. Für eine Inaktivierung von 90% der intrazellulären Rho A-C Proteine sind folglich sehr hohe C3- Transferasemengen erforderlich. Infolge dessen müßten für pharmazeutische Anwendungen sehr hohe Mengen dieser als Toxine bekannten C3-Transferasen verabreicht werden. Hierdurch können toxische Nebenwirkungen nicht ausgeschlossen werden. Daher ist die pharmakologische Verwendung der C3- Transferase alleine aufgrund ihrer Toxizität nicht geeignet.

Um einen besseren Transport der Wirkstoffkomponente C3-Transferase durch die Plasmamembran der Zellen zu erreichen, wurde ein chimäres Fusionsprotein hergestellt (DE 197 35 105). Zu diesem Zweck wurde das binäre Aktin ADP- ribosylierende C2-Toxin aus Clostridium botulinum verwendet. Das C2-Toxin besteht aus zwei Proteinen, der C2I-Komponente, die enzymatisch aktiv ist, sowie der C2II-Komponente, die die Bindung an die Plasmamembran und eine nachfolgende Translokation vermittelt. Die enzymatische Aktivität des C2I- Proteins ist im C-terminalen Bereich lokalisiert, während die Bindung an C2II über den N-terminalen Bereich erfolgt. Um die C3-Transferase mit Hilfe dieses effizienten Aufnahmemechanismus in die Zellen einzuschleusen, wurde ein chimäres Fusionsprotein aus C3-Transferase (aus Clostridium limosum) und aus dem N-terminalen C2I-Protein hergestellt (Fig. 1). Dieses C3-C2IN-Fusions­ protein gelangt nun mit Hilfe des Bindeproteins C2II ins Innere der Zellen (Barth H, Hofmann C, Olenik C, Just I, Aktories K, 1998, Infect. Immun. 66: 1364- 1369). Der Komplex aus C3-C2IN und C2II wird über Rezeptor-vermittelte Endozytose internalisiert und gelangt in intrazelluläre Vesikel. Aus diesen Vesikeln gelangt das Fusionsprotein C3-C2IN ins Cytosol, kann dort seine Wirkung entfalten und Rho A-C ADP-ribosylieren und dadurch inaktivieren. Dieser binäre Proteinkomplex aus C3-C2IN und C2II verbindet die Wirkeigenschaften der C3-Transferase mit einer um Faktor 100-1000 verbesserten Membranpermeabilität und gewährleistet dadurch eine wesentlich bessere intrazelluläre Verfügbarkeit. Dies ist auch der Grund dafür, daß nur noch geringe Mengen an C3-C2IN nötig sind, um eine 90prozentige Hemmung von Rho A-C zu erreichen. Die Wirksamkeit wurde bisher nur in In-vitro-Experimenten gezeigt (Wahl S, Barth H, Ciossek T, Aktories K, Mueller BK, 2000, J. Cell. Biol. 149: 263-270). In diesen Experimenten mit embryonalen Zellen oder Zelllinien - also proliferationskompetenten Zellen - konnten Neuritenwachstums-stimulierende Effekte nachgewiesen werden (Wahl S, 2000, Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften. Fakultät der Biologie, Eberhard- Karls-Universität Tübingen). Die mit C3-C2IN und C2II behandelten Neuriten waren resistent gegenüber potenten Inhibitoren wie Ephrin-A5 und RGM (Wahl S, 2000, supra).

Bisher ist jedoch keine Verwendung bekannt, mit der es möglich wäre, adulte Nervenzellen - also Zellen mit stark eingeschränkten proliferativen Eigenschaften in vivo dauerhaft zu stimulieren. Die In-vivo-Verwendung von C3 war nur an frisch durchtrennten Nervenzellen möglich und führte nur zu kurzzeitigen Effekten, da C3 von regenerierenden Nervenfasern nicht mehr aufgenommen wird (Lehmann M, Fournier A, Selles-Navarro I, Dergham P, Sebok A, Leclerc N, Tigyi G, McKerracher L, 1999, J. Neurosci. 19: 7537-7547). Deshalb und aufgrund der hohen Dosen die eingesetzt werden müssen, ist dieses System nicht geeignet, motorische oder sensorische Funktionen nach Rückenmarkstrennung wieder herzustellen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher, die Funktion von Nervenfasern nach Verletzung oder infolge von Erkrankungen wieder herzustellen und damit sie ihre Funktionen wieder zurückzuerlangen. Somit soll eine partielle oder totale Regeneration bei Krankheiten oder Verletzungen des peripheren und zentralen Nervensystems erreicht werden.

Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher die Verwendung einer Zusammensetzung enthaltend ein Fusionsprotein und mindestens einen Transporter zur In-vivo-Stimulation des Nervenwachstums, der In-vivo-Inhibition der Narbengewebsbildung und/oder In-vivo-Reduktion eines Sekundärschadens, wobei das Fusionsprotein mindestens eine Bindungsdomäne für den Transporter und mindestens eine Modulationsdomäne zur kovalenten Modifikation von kleinen GTP-bindenden Proteine enthält, und der Transporter die Aufnahme des Fusionsproteins in eine Zielzelle vermittelt.

Unter erfindungsgemäßer Verwendung der Zusammensetzung konnten überraschenderweise nicht nur die Effekte von Myelin-assoziierten Inhibitoren wie NOGO, MAG und CSPG, sondern auch die Effekte potenter anderer Inhibitoren wie z. B. Semaphorin und RGM (Repulsive Guidance Molecule) aufgehoben werden.

Überraschenderweise konnte unter Verwendung des oben beschriebenen Systems nicht nur die Blockade des Neuritenwachstums durch regenerationshemmende Proteine aufgehoben werden, sondern sogar das Nervenfaserwachstum aktiv stimuliert werden.

Weiterhin war überraschend, daß die erfindungsgemäße Verwendung der Zusammensetzung nicht nur die Inaktivierung von Rho A-C, sondern auch auf der Aktivierung von Cdc42 und Rac bewirkte. Die Aktivierung von Rac und Cdc42 in Nervenzellen führt zur Bildung von Finger-artigen Filopodien und Lamellipodien (Häuten zwischen den Filopodien) (Kozma R, Sarner S, Ahmed S, Lim L, 1997, Mol Cell Biol 17: 1201-1211). Filopodien und Lamellipodien sind für das zielgerichtete Wachstum von Nervenfasern notwendig. Aktivatoren von Rho, wie z. B. Myelin-Inhibitoren, RGM oder Ephrin-A5, die außen an der Nervenfaser angreifen, hemmen jedoch die Fortbewegung der Nervenfasern, indem sie ein drastisches Zurückziehen der Nervenfasern auslösen. Die Hemmung von Rho A-C verhindert dies, führt jedoch alleine nicht zum Weiterwachsen der Nervenfasern, denn dafür ist die Aktivierung von Cdc42 und Rac nötig. Somit ist die Kombination von Hemmung der Rho A-C und Aktivierung von Cdc42 und Rac besonders effizient zur Stimulation des Nervenfaserwachstums.

Ebenfalls überraschend war die Beobachtung, daß unter erfindungsgemäßer Verwendung der Zusammensetzung die Bildung von Narbengewebe reduziert war. Es entstand weniger Narbengewebe, welches auch in einer weniger kompakten Weise wuchs, so daß Raum zum Wachstum der Nervenfasern blieb. Die Lakunen- und Hohlraumbildung war stark herabgesetzt und damit die sekundäre Schädigung drastisch reduziert. Hierdurch wurde die Regeneration von Nervenfasern positiv beeinflußt.

Alle Effekte zusammen bewirkten nach Rückenmarksläsion eine Wiederher­ stellung der motorischen, sensorischen und vegetativen Funktionen über die Verletzungsstelle des Rückenmark hinaus. Insbesondere konnte gezeigt werden, daß Ratten nach Läsion des Rückenmarks auf Höhe des achten Thorakalwirbels (TH8) und einmaliger Injektion von C3-C2IN und C2II ihre Hinterbeine wieder bewegen konnten und keine nennenswerten Lähmungserscheinungen übrig behielten. Neben den motorischen wurden auch sensorische und vegetative Funktionen wieder hergestellt. Die Ratten zeigten eine Reaktion auf äußere Reize (z. B. Schmerz) und konnten ihre Blase wieder selbständig leeren (siehe Beispiel 2).

Unter einer In-vivo-Stimulation des Nervenwachstum in Sinne der vorliegenden Erfindung wird eine beschleunigtes und/oder vermehrtes Nervenwachstum verstanden, wobei sich dieses auf das Ausmaß und/oder die Geschwindigkeit des Wachstums beziehen kann. Vorzugsweise wachsen die Nervenfaser mindestens um ca. Faktor 2, bevorzugt um ca. Faktor 3, am meisten bevorzugt um ca. Faktor 4, schneller und/oder weiter. Alternativ ist die Anzahl der wachsenden Fasern mindestens um ca. Faktor 2, bevorzugt um ca. Faktor 3, am meisten bevorzugt um ca. Faktor 4, erhöht. Unter einer In-vivo-Inhibition der Narbengewebsbildung in Sinne der vorliegenden Erfindung wird eine ca. 50prozentige, bevorzugt eine ca. 75prozentige, am meisten bevorzugt eine ca. 90prozentige Reduktion des Narbengewebes und/oder der Lakunen- oder Hohlraumbildung verstanden. Daraus ergibt sich, daß die Inhibition eine völlige oder teilweise Inhibition sein kann. Geeignete Tests zur Quantifizierung der Parameter sind in Beispiel 2 beschrieben. Unter einer In-vivo-Reduktion von Sekundärschäden versteht der Fachmann Schäden, die erst als weitere Folge der anfänglichen Verletzung auftreten. Beispiele hierfür sind eine ischämische Nekrose, die Apoptose von Nervenfasern und anderen Zellen sowie inflammatorische Reaktionen. Unter einer In-vivo-Reduktion eines Sekundärschadens in Sinne der vorliegenden Erfindung wird eine ca. 50prozentige, bevorzugt eine ca. 75prozentige, am meisten bevorzugt eine ca. 90prozentige Reduktion eines Sekundärschadens verstanden.

Unter einem Fusionsprotein versteht man das Expressionsprodukt eines fusionierten Gens. Ein fusioniertes Gen entsteht aus der Verknüpfung zweier oder mehrerer Gene, wobei eine neue Kombination erzeugt wird. In der vorliegenden Erfindung enthält das Fusionsprotein eine Modulationsdomäne und eine Bindungsdomäne.

Ein GTP-bindendes Protein ist ein Protein, das GTP (Guanosintriphosphat) bindet und infolge einer zellulären Signalkaskade zu GDP (Guanosindiphosphat) hydrolysiert. Die Signalinduzierte Hydrolyse des GTP zu GDP bewirkt die Interaktion des GTP-bindenden Proteins mit einem Effektormolekül. Man unterscheidet zwischen heterotrimeren (großen) GTP-bindenden Proteinen und monomeren (kleinen) GTP-bindenden Proteinen. Die heterotrimeren GTP- bindenden Proteinen bestehen aus einer α-, einer β- und einer γ-Untereinheit, wohingegen die monomeren GTP-bindenden Proteine nur aus einer Untereinheit bestehen. Zu der Gruppe der kleinen GTP-bindenden Proteine gehören beispielsweise die Mitglieder der Ras-, Rho-, Rab-, Art-, Sar- und Ran-Familie. Die Rho-GTPasen der Säugetiere können in sechs verschiedene Klassen eingeteilt werden: Rho (RhoA, RhoB, RhoC), Rac (Rac 1, Rac 2, Rac 3, Rho G), Cdc42 (Cdc42Hs, G25K, TC10), Rnd (RhoE/Rnd3, Rnd1/Rho6, Rnd2/Rho7), Rho D und TTF.

Ein GTP-bindendes Protein besitzt eine Guaninnukleotid-Bindungstelle, an der sowohl GTP oder GDP gebunden sein kann. In der GTP-gebundenen Form ist das Protein aktiv, in der GDP-gebundenen Form inaktiv. Der Austausch von GDP und GTP und somit die Aktivierung des GTP-bindenden Moleküls wird durch den in der Signalkaskade dem GTP-bindenden Protein vorgeschalteten Aktivator vermittelt. Die Aktivierung des Effektor, also des dem GTP-bindenden Protein in der Signaltransduktion nachgeschalteten Moleküls, bewirkt die Spaltung des GTP zu GDP und anorganischen Phosphat. Hierdurch wird das GTP-bindende Protein wieder inaktiviert. Die Regulation der Signalkaskade auf Ebene des GTP- bindenden Proteins wird in der Zelle durch mindestens drei weitere Proteine reguliert; GTPase-aktivierende Proteine (GAP) unterstützen die GTP-Hydrolyse, Guaninnukleotidaustausch-Faktoren (GEF) katalysieren den Austausch von GDP zu GTP und GDP-Dissoziationsinhibitoren (GDI) unterdrücken die Dissoziation des GDP vom kleinen GTP-bindenden Protein (siehe hierzu Hall A, 1998, Science 279: 509-514; Mueller BK, 1999, Annu Rev Neurosci 22: 351-388; Luo L, 2000, Nature Review Neurosci 1,3: 173-180)

Bei erfindungsgemäßer Verwendung der Zusammensetzung wird die Aktivität des kleinen GTP-bindenden Proteins geändert. Unter einer Änderung der Aktivität von kleinen GTP-bindenden Proteinen im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man eine Erhöhung oder Erniedrigung der Aktivität. Die Erniedrigung kann zu einer teilweisen oder völligen Hemmung oder Inaktivierung führen. Die Aktivität des kleinen GTP-bindenden Proteins wird mindestens um Faktor 2, bevorzugt um ca. Faktor 3 oder um ca. Faktor 4, am meisten bevorzugt um ca. Faktor 10, erhöht oder erniedrigt. Dem Fachmann sind einschlägige Methoden bekannt, mit der die Aktivität von kleinen GTP-bindenden Proteinen bestimmt werden kann. Beispielsweise könnte in einem Enzymtest die Hydrolyse-Aktivität des kleinen GTP-bindenden Proteins mit GTP als Substrat, das an der γ- Phosphatgruppe markiert ist (z. B. radioaktiv), bestimmt werden (Read PW und Nakamoto RK, 2000, Methods in Enzymology 325: 15; Self AJ und Hall A, 1995, Methods in Enzymology 256: 67).

Die Veränderung der Aktivität durch die Modulationsdomäne kann beispielsweise durch Wechselwirkung mit GAP, GDI GEF oder dem kleinen GTP-bindenden Protein erfolgen. Dabei kann u. a. die Geschwindigkeit der Hydrolyse von GTP zu GDP, die Dissoziation von GDP oder die Bindung von GTP beeinflußt werden. Dies könnte beispielsweise durch kovalente oder nicht-kovalente Modifikation eines der beteiligten Proteine durch die Modulationsdomäne erfolgen. (Bishop AL and Hall A, 2000, Rho GTPases and their effector proteins. Biochem J 348: 241- 255; Hall A, 1999, Signal transduction pathways regulated by the Rho family of small GTPases. Br J Cancer 80 Suppl 1: 25-27; Kjoller L und Hall A, 1999, Signaling to Rho GTPases. Exp Cell res 253: 166-179)

In einer bevorzugten Ausführungsform wird das kleinen GTP-bindenden Molekül, vorzugsweise Rho A-C, durch kovalente Modifikation teilweise oder völlig gehemmt. Vorzugsweise geschieht dies durch ADP-Ribosylierung oder Glykosylierung des kleinen GTP-bindenden Proteins, d. h. ADP-Ribose oder ein Saccharid wird kovalent gebunden. Diese Modifikation führt zu einer veränderten Signaltransduktion auf Ebene des kleinen GTP-bindenden Moleküls.

In einer weiteren Ausführungsform wird die Änderung der Aktivität der kleinen GTP-bindenden Proteine durch nicht-kovalente Modifikation erzielt. Beispiels­ weise könnte ein Molekül an das kleine GTP-bindende Protein angelagert werden, welches z. B. durch Änderung der Konformation des Proteins eine aktive oder inaktive Form stabilisiert. In einer weiteren Ausführungsform könnte aber auch ein Molekül in die Bindungstasche des kleinen GTP-bindenden Proteins eingelagert werden, so daß das GTP nicht mehr gebunden werden kann, und so die Aktivität des kleinen GTP-bindenden Proteins reduziert ist. Beispielsweise kann die Aktivität von RhoGTPasen durch Rho-inhibierende Toxine wie z. B. ExoS (Pseudomonas aeruginosa exoenzyme S), SptP (Salmonella typhimurium protein tyrosine Phosphatase) oder YopE (Yersinia pseudotuberculosis outer protein E) oder durch Rho-aktivierende Toxine wie z. B. SopE (Salmonella typhimurium outer protein E) verändert werden (Lerm M, Schmidt G, Aktories K, 2000, FEMS Microbiology Letters 188: 1-6; Aktories K, Schmidt G, Just I, 2000, Biol Chem 381: 421-426).

In einer weiteren Ausführungsform wird die Modifikation nicht durch die Modulationsdomäne selbst, sondern durch ein in der Signalkaskade dem kleinen GTP-bindenden Protein vor- oder nachgeschalteten Signalmolekül bewirkt. Die Modulationsdomäne würde dann ein solches Signalmolekül aktivieren, welches dann wiederum z. B. das kleine GTP-bindende Protein phosphoryliert (indirekte Modulation). Beispielsweise phosphoryliert die Proteinkinase A (PKA) in Lymphozyten aktives GTP-gebundenes RhoA und induziert über Rho-GDI seine Translokation von der Membran ins Cytosol, dadurch wird die Rho-Aktivierung auf zweierlei Arten beendet. Das Signalmolekül cAMP aktiviert die PKA, diese phosphoryliert RhoA und inhibiert es dadurch, gleichzeitig wird eine Aktivierung von RhoA verhindert, indem es durch Rho-GDI von der Membran ins Cytosol transportiert wird (Mueller BK, 1999, Annu Rev Neurosci 22: 351-388; Lang P, Gespert F, Delespine-Carmagnat M, Stancou R, Pouchelet M, Bertoglio J, 1996, EMBO J 15: 510-519; Laudanna C, Campbell JJ, Butcher EC, 1997, J Biol Chem 272: 24141-24144).

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die GTP-bindenden Proteine Rho A, B oder C kovalent modifiziert. Besonders bevorzugt ist die ADP- Ribosylierung des Asparagin-Restes an Position 41. Damit verbunden ist eine Inaktivierung des kleinen GTP-bindenden Proteins. In einer weiteren Ausführungsfonn wird der Threonin-Rest an Position 35 bzw. 37 eines kleinen GTP-bindenden Proteins der Rho-Familie glykosyliert. Dieses führt ebenfalls zur Inaktivierung des kleinen GTP-bindenden Proteins. Gleichzeitig werden vorzugsweise die kleinen GTP-bindenden Protein Cdc42 und/oder Rac aktiviert. (Dies könnte beispielsweise durch Crosstalk der beiden Signaltransduktionswege erfolgen. Unter Crosstalk versteht der Fachmann die wechselseitige Beeinflussung verschiedener Signaltransduktionswege innerhalb einer Zelle. Im vorliegenden Fall könnte beispielsweise die Inaktivierung des Signalweges, der die GTP- bindenden Proteine Rho A, B oder C beinhaltet, eine Aktivierung des Signalweges unter Beteiligung von Cdc42 und/oder Rac bewirken. (siehe hierzu Mueller BK, 1999, Annu Rev Neurosci 22: 351-388; Wahl S, Barth H, Ciossek T, Aktories K, Mueller BK, 2000, J. Cell. Biol. 149: 263-270; Sander EE, Ten Klooster JP, Van Delft S, Van der Kammen RA, Collard JG, 1999, J Cell Biol 147: 1009-1022).

Vorzugsweise ist die Modulationsdomäne von einem Toxin abgeleitet. Hierbei kann es sich z. B. um bakterielles Toxin handeln. Bakterielle Toxine könnten aus einem Bakterium der Gattung Clostridium, Staphylococcus, Bacillus, Pseudo­ monas, Salmonella oder Yersinia stammen. In einer bevorzugten Ausführungs­ form handelt es sich um die C3-Transferase aus Clostridium botulinum oder eine verwandte Transferase. Unter einer verwandten Transferase versteht man ein Enzym das wie die C3-Transferase die ADP-Ribosylierung von GTP-bindenden Proteinen der Rho-Familie bewirkt.

Einen weiteren Teil des Fusionsproteins bildet die Bindungsdomäne. Sie bewirkt die Bindung an den Transporter. Die Bindung der Bindungsdomäne an den Transporter erfolgt z. B. durch kovalente Bindung, durch elektrostatische Wechselwirkungen, Van-der-Waals-Wechselwirkungen oder Wasserstoff- Brücken-Bindung. In einer Ausführungsform stammt die Bindungsdomäne von einem binären bakteriellen Toxin, insbesondere dem C2-Toxin aus Clostridium botulinum.

Unter einem binären Toxin versteht man ein Toxin, das aus zwei getrennten Proteinen besteht. Die Proteine sind eine Enzym-Komponente und eine Zellbindungs-/Translokationskomponente. Beispiele für binäre Toxine sind das Anthrax-Toxin oder das Toxin aus Clostridium perfringens iota. Das Clostridium perfringens iota Toxin ist ein Mitglied der Familie der binären Aktin ADP- ribosylierenden Toxine. Besonders bevorzugt stammt die Bindungsdomäne von dem C2-Toxin von Clostridium botulinum. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Bindungsdomäne um die N-terminale C2I-Domäne des C2-Toxins von Clostridium botulinum.

Der Transporter vermittelt die Aufnahme des Fusionsproteins in die Zelle. Bei dem Transporter kann es sich beispielsweise um ein Peptid oder Protein handeln. Ein Beispiele für ein solches Protein oder Peptid ist das Antennapedia Peptid, ein 16 Aminosäuren-langes Peptid des Homoeobox-Gens Antennapedia, welches eingesetzt wird, um exogene, hydrophile Komponenten ins Innere lebender Zellen einzuschleusen (Prochiantz A, 1999, Ann NY Acad Sci 886: 172-179; Prochiantz A, 1996, Curr Opin Neurobiol 6: 629-634)

Der Transporter könnte aber auch ein virales Protein oder einen Liganden für eine Zelloberflächenstruktur darstellen oder davon abgeleitet sein. Ein Beispiel für ein virales Transportprotein ist VP22, ein 38 kDA großes Strukturprotein des Herpes Simplex-Virus-1. Diese Protein transloziert (permeiert) die Plasmamembranen von Säugerzellen und kann als Transporter andere Proteine ins Innere der Zellen transferieren (O'Hare P und Elliot G, 1997, Cell 88: 223-233; Phelan A; Elliott G; O'Hare P, 1998, Nat Biotechnol 16: 440-443). Beispiele für Liganden von Oberflächenstrukturen stellen das pflanzliche Toxin Ricin und das bakterielle Shiga Toxin dar (Sandvig K und von Deurs B, 2000, EMBO J 19: 5943-5950).

Beispielsweise könnten aber auch Liposomen die Transporterfunktion erfüllen. Mit Hilfe von liposomalen Transportern können neben Nukleinsäuren auch Proteine in Zellen eingeschleust werden (Rao M und Alving CR, 2000, Adv Drug Delv Res 30: 171-188). Die Aufnahme in die Zelle kann beispielsweise durch die Fusion durch die Zellmembran, durch Durchtritt durch Zellporen, durch erleichterte Diffusion, aktiven Transport mittels Carrier in der Zellmembran oder durch Pinozytose und Phagozytose erfolgen. In einer Ausführungsform wird die Aufnahme des Fusionsproteins über die Bindung des Transporters an eine Struktur an der Zelloberfläche bewirkt. Diese Struktur könnte z. B. ein Rezeptor, ein Kanal oder ein anderes Membranprotein sein. Die Struktur an der Oberfläche bewirkt die Aufnahme der Zusammensetzung oder eines Teils davon in die Zelle. Die Aufnahme des Fusionsproteins könnte z. B. durch Endozytose eines Rezeptor-Protein-Komplexes erfolgen. In der Zelle könnte der Proteinkomplex freigesetzt werden und anschließend die Aktivität des kleinen GTP-bindende Proteins verändern.

Bei dem Transporter kann es sich z. B. um einen Liganden handeln. Liganden sind Moleküle, die spezifisch an bestimmte Rezeptoren binden. Bei diesen Liganden könnte es sich beispielsweise um körpereigene Moleküle wie Hormone, Neurotransmitter wie z. B. Acetylcholin oder um körperfremde Moleküle wie künstlich hergestellte Liganden handeln. Die Liganden können peptidergen, proteinergen oder nicht-proteinergen Ursprungs sein. In einer Ausführungsform könnte der Transporter die variablen Region eines Antikörpers z. B. eines monoklonale Antikörpers darstellen oder mit dieser verbunden sein. Diese Region könnte die spezifische Bindung an Zelloberflächenstrukturen bewirken.

Die Aufnahme in die Zelle könnte aber auch durch Liposomentransporter (Rao M und Alving CR, 2000, Adv Drug Delv Res 30: 171-188) bewirkt werden. Hierbei wäre das Fusionsprotein z. B. in Liposomen eingeschlossen. Die Bindungsdomäne wäre so gestaltet, daß das Fusionsprotein besonders geeignet für den Einschluß in ein Liposom wäre. Das Liposom würde mit der Zellmembran fusionieren und so die Aufnahme des Fusionsproteins in die Zelle bewirken. Dem Fachmann sind geeignete Lipide bekannt, die zur Bildung von Protein-Liposomen-Komplexen verwendet werden können.

Eine weitere Möglichkeit wäre eine Aufnahme des Fusionsproteins durch einen viralen Transporter. Ein Beispiel für ein virales Transportprotein ist - wie bereits erwähnt - VP22 (O'Hare P und Elliot G, 1997, Cell 88: 223-233; Phelan A; Elliott G; O'Hare P, 1998, Nat Biotechnol 16: 440-443).

In einer bevorzugten Ausführungsform stammt der Transporter von einem binären bakteriellen Toxin. Beispiele für binäre Toxine sind das Anthrax-Toxin oder das Toxin aus Clostridium perfringens iota. Das Clostridium perfringens iota Toxin ist ein Mitglied der Familie der binären Aktin-ADP-ribosylierenden Toxine. Besonders bevorzugt stammt der Transporter von dem C2-Toxin von Clostridium botulinum. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Transporterprotein um C2II-Domäne des C2-Toxins von Clostridium botulinum.

Unter neurologischen und neurodegenerativen Erkrankungen des peripheren und zentralen Nervensystems werden beispielsweise Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson, Multiple Sklerose und ähnliche Erkrankungen, die mit einem Nervenfaserverlust und Entmarkung einhergehen, sowie Amyotrophe Lateral Sklerose und andere Motoneuonenerkrankungen, Ischämie, Schlaganfall, Epilepsie, Morbus Huntington, AIDS Demenz Komplex und Prionen- Erkrankungen verstanden.

Die Erfindung wird in den nachfolgenden Figuren und Ausführungsbeispielen näher erläutert, ohne sie darauf einzuschränken.

Beschreibung der Figuren

Fig. 1: Schematische Darstellung des besonders bevorzugten Systems enthaltend ein Fusions- und ein Transporterprotein.
Das Fusionsprotein besteht aus der Modulationsdomäne, die von der C3- Transferase aus C. limosum abgeleitet ist, und der Bindungsdomäne, die von dem N-terminalen Ende des C2I-Untereinheit des C2-Toxins aus C. botulinum stammt. Die C2II-Untereinheit des C2-Toxins aus C. botulinum stellt den Transporter dar.

Fig. 2: Verbesserung der motorischen Funktionen nach C3-C2IN-Gabe.
Die Wiederherstellung der motorischen Funktionen unterschiedlich behandelter Tiere wurde in Abhängigkeit von der Genesungsdauer bestimmt. Die mit C3- C2IN in Gegenwart von C2II behandelten Ratten zeigten gegenüber den Kontrolltieren und Tieren, die lediglich mit C2II behandelt wurden, eine deutlich höhere motorische Genesung. Nach 28 Tagen erreichten die C3-C2JN­ behandelten Tiere auf der BBB-Skala einen Wert von 11,50 (±1,15) im Gegensatz zu den Kontrolltieren und die C2II behandelten Tieren, mit denen Werte von 4,00 (±0,90) und 2,71 (±1,09) erzielt wurden.

Beispiel 1

Die Konstruktion, Expression, Reinigung und Charakterisierung der Proteine erfolgte wie in DE 197 35 105 A1 Beispiele 1 bis 5 beschrieben.

Beispiel 2 Tiere

8-12 Wochen alte, männliche Lewis-Ratten (220-280 g, Charles River, Sulfeld, GER) wurden zufällig auf zwei Gruppen verteilt und das Rückenmark mindestens zur Hälfte durchtrennt. Nach 21 Tagen wurde eine Gruppe mit 10 µg C3-C2IN und eine zweite Gruppe nur mit 10 µg C2II perfundiert. Die Kontrolltiere erhielten entweder 10 µl C2 alleine (ohne C3-Komponente) oder eine Transektion ohne Injektion. Alle Tiere wurden unter kontrollierten Licht- und Temperaturbedingungen gehalten und mit Futter und Wasser zur freien Verfügung ausgestattet. Die Ratten wurden entsprechend den "International Health Guidelines" so wie einem von der Universität Tübingen überprüften Protokoll gehalten.

Rückenmarksläsionen

Die Ratten wurden durch intraperitoniale Injektion von Ketanest (Ketaminhydrochlorid, Parke Davis: 100 mg/kg) und Rompun (Xylazinhydrochlorid, Bayer: 10 mg/kg) betäubt. Um eine Austrocknung der Augen während der Anästhesie zu erreichen, wurden beide Augen mit Oculotect Gel (Retinolpalmitat, CIBA Vision, Novartis, GER) bedeckt. Nach Erreichen einer ausreichenden Anästhesie wurde die Haut über der Wirbelsäule geöffnet, die den Wirbeln anheftenden Muskeln gelöst und zur Freilegung des Rückenmarks eine Bi-Laminektomie auf Höhe des thorakalen Segments TH8 durchgeführt. Nach Öffnung der Dura (äußerste, fibröse Hülle des Rückenmarks) wurde der dorsale Rückenmarksstrang mit einer feinen Iridektomie-Schere durchtrennt, um eine 2/3 Überhemisektion durchzuführen. Die durchtrennten neuralen Strukturen waren sowohl motorischen (gekreuzter Teil der Pyramidenbahn, Teile der extrapyramidalen Bahn) als auch sensorischen (dorsales Rückenmark) Ursprungs. Die Wunde wurde mit steriler Salzlösung gespült und verschlossen. Alle Tiere wurden unter Infrarotlicht gewärmt, bis sie das Bewußtsein wiedererlangten.

Postoperative Behandlung und Gewebspräparation

Alle Ratten erhielten eine postoperative Schmerztherapie durch eine einzelne intraperitoniale Injektion von Rimadyl 2 mg/kg (Carproven, Pfizer, GER) und wurden einer manuellen Blasenentleerung (3 × täglich) unterzogen, bis die spontane Blasenfunktion wiederhergestellt war (gewöhnlich innerhalb von 10-14 Tagen). Vor dem Wiedereintritt der spontanen Blasenfunktion wurden die Ratten 2-3 × täglich gebadet, um Urin-bedingte Wunden zu verhindern. Die Tiere wurden regelmäßig gewogen und bei einem Gewichtsverlust 20% oder mehr getötet. Für immunhistologische Untersuchungen wurden Ratten getötet und intrakardial mit Fixativ (4% Formalin in 0,1 mol/l Phosphatpuffer, pH 7,5), das 20.000 IU/l Heparin enthielt, perfudiert. Rückenmark und Gehirn wurden entfernt und über Nacht bei 4°C nachfixiert. Das fixierte Gewebe wurde in Paraffin eingebettet, Serienschnitte angefertigt und diese auf Silan-beschichteten Objektträgern überführt.

Immunhistochemie

Nach Fixierung mit Formalin und Einbettung in Paraffin wurden rehydrierte 2 µm-Stücke 7 Mal für 5 Minuten in Citratpuffer (2,1 g/l Natriumcitrat, pH 6) gekocht und mit 10% normalem Schweineserum (Biochrom, Berlin, GER) inkubiert, um die nicht-spezifische Bindung von Immunglobulinen zu unterdrücken. Zur Identifizierung bestimmter Zelltypen wurden Antikörper gegen zellspezifische Antigene benutzt. Dies waren beispielsweise GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein, Boehringer Mannheim, GER, 1 : 100) für Astrozyten, MBP (Myelin Basic Protein, Dako, Glostrup, DEN, 1 : 200) für Oligodendrozyten oder Neurofilament (Dako, Glostrup, DEN, 1 : 200) für Neurone. Mikroglia bzw. Makrophagen wurden mit monoklonalen Antikörpern gegen ED1 (Serotec, Oxford, GB, 1 : 100), OX-42 (Serotex, Oxford, BG, 1 : 100) oder ED2 (Serotec, Oxford, BG, 1 : 200) unter Verwendung des ABC-Verfahrens (avidin-biotin­ complex) in Kombination mit alkalinen Phosphatasen-Konjugaten markiert. Zusätzlich wurden monoklonale Antikörper gegen OX-22 (Serotec, Oxford, GB, 1 : 100) zur Identifikation von B-Lymphozyten und W3/13 (Serotec, Oxford, GB, 1 : 100) zur Identifikation von T-Lymphozyten verwendet. OX-6 (Serotec, Oxford, GB, 1 : 100) wurde eingesetzt, um MHC-II-Moleküle zur Charakterisierung der funktionellen Immunkompetenz zu identifizieren. Die Antikörper wurden in den oben angegebenen Lösungen mit 1% TRIS-gepuffertem bovinem Serumalbumin (BSA/TBS) auf die Objektträger gegeben. Die Bindung wurde durch Zugabe eines Biotin-gekoppelten zweiten Antikörper (1 : 400; 30 min.) und eines alkalischen Phosphatase-konjugierten ABC-Komplexes (1 : 400 in BSA/TBS; 30 min.) sichtbar gemacht.

Histologische Färbung auf Myelin und Nuklein

Die seriellen Gewebsschnitte, die zur Immunhistochemie verwendet wurden, wurden mit Luxol Fast-Blue auf Myelin gefärbt. Ausgehend vom Läsionszentrum wurden rostral und kaudal in verschiedenen Abständen (0,6; 1,2; 1,8; 2,4; 3,0 cm) die Gebiete des Gewebes identifiziert, die offensichtlich beschädigt waren oder einen Mangel an Myelin aufwiesen. Die Kerne wurden mit Kresylviolett (0,1%) angefärbt, um intakte und beschädigte Gebiete der grauen Substanz unterscheiden zu können. Die Schnitte zeigten, daß die mit C3-C2IN in Gegenwart von C2II behandelten Ratten weniger Sekundärschäden aufwiesen. Die Lakunenformation und Höhlenbildung war an den so behandelten Tieren gegenüber den Kontrolltieren deutlich reduziert. Gleichzeitig konnten mehr Zellen, weniger Aussparungen und eine erhöhte Neuronensprossung nachgewiesen werden.

Stereotaktische Mikroinjektion

Um exakt definierte Mengen (10 × 1 µl, 10 µg) von C3-C2IN Toxin in den rostalen Stumpf des durchtrennten Rückenmarks injizieren zu können, wurden Mikrokapillaren sowie ein stereotaktischer Apparat benutzt. Um das Rückenmark weiterhin zu stabilisieren, wurde eine Vorrichtung zur Anhebung der Ratte gebaut, die eine Ausdehnung der Atembewegung auf die Wirbelsäule blockierte.

Anterograde Markierung

30 µl (30 µg, 15 µl pro Seite biotinyliertem Biodextran (BDA, 10.000 kDa) wurden mittels Hamilton-Spritze in die motorischen Cortex-Gebiete injiziert. Nach Injektion wurde die Wunde gewaschen und verschlossen. Diese Methode dient der Darstellung von regenerierten axonalen Fasern des Corticospinaltrackts (CST). Das biotinylierte Biodextran wird von den motorischen Kortex-Gebieten in das Rückenmark transportiert. Alle Fasern, die unterhalb der Läsionsstelle biotinyliertes Biodextran enthalten, müssen folglich neu gewachsen sein. Die mit C3-C2IN in Gegenwart von C2II behandelten Ratten zeigten im Vergleich zu den Kontrolltieren ein deutlich erhöhtes Nervenfaserwachstum. Hierbei war sowohl die Anzahl der Fasern als auch die Länge der neugewachsenen Fasern deutlich erhöht. Die neu gewachsenen Fasern waren GAP43⁺ (Nachweis mittels polyklonaler Antikörper) womit sie als neuronale, aussprossende Fasern identifiziert wurden.

Sensorische und lokomotorische Beurteilung

Die Tiere wurden über einen Zeitraum von 1-21 Tagen nach dem Verletzungsereignis in Hinblick auf die Funktionswiederkehr beobachtet und unter Verwendung des "Combined Sensory- Motor Gale-Score" (Gale K, Kerasidis H, Wrathhall JR, 1985, Spinal cord contusion in the rat: behavioural analysis of functional neurologic impairment. Exp Neurol 88: 123-134) unter Einbeziehung der schiefen Ebene (Rivlin AS, Tator CH, 1977, Objective clinical assessment of motor function after experimental spinal cord injury in the rat. J Neurosurg 47: 577-581) und dem "Motor Openfield BBB-Score (Basso D; Beatti MS, Breshnahan JC, 1996, Graded histological and locomotor outcomes after spinal cprd contsuion using the NYU wight-drop device versus transection. Exp Neurol 139: 244-256) beurteilt.

In zwei unabhängigen Experimenten zeigten Ratten, welche C3-C2IN erhalten hatten eine signifikante (p < 0,0001) Verbesserung der sensorischen und motorischen Funktion im Vergleich zu Ratten, die lediglich aktives oder inaktives C2-Transporterprotein erhalten hatten oder Ratten, die der Kontrollgruppe angehörten. Die Verbesserung der sensorischen und motorischen Funktion trat bereits nach dem dritten Tag ein und erreichte ein Maximum 21 Tage nach dem Verletzungsereignis. Vor der Applikation wurde die biologische und funktionelle Aktivität der C3-C2IN-Konstrukte in In-vitro-Versuchen zum Kollaps des Wachstumskegels überprüft. Es wurden Untersuchungen zur motorischen Funktion wie Zehspreizung, Ausrichtung, Aufrichtung, schiefe Ebene und zur sensorischen Funktion wie die Rückzugsreflexe der Hintergliedmaßen als Antwort auf Zug, Schmerz (manuell und Hitze) und Druck sowie Schwimmtests durchgeführt. Ein dritter Versuch wurde als doppelblinde Versuchsanordnung durchgeführt und lieferte identische Ergebnisse.

In einem vierten Experiment wurde die Relevanz der C2-Transporter- Komponente für die funktionelle Wiederkehr analysiert. Die Mikroinjektion von C3-C2IN und inaktivierter C2-Komponente resultierte nicht in einer signifikanten Wiederkehr der Funktion. Diese Ergebnisse belegen, daß das aktive Transporter- Protein C2 zur Regeneration notwendig ist.

Die Verbesserung der motorischen Funktionen von C3-C2IN-behandelten Tieren wurde durch das Erscheinen einer funktionaler Haltung der Hintergliedmaßen (gewöhnlich eine Beugung in der Hüfte, dann den Knien und zuletzt eine Dorsiflektion in den Knöcheln), die ein Maximum (Mittelwert ± SEM) von 12,2 Punkten (± 0,84) in der BBB-Wertung (0-21 Punkte) einschließlich einer Gewichtsunterstützung der Hintergliedmaßen erreichte (Fig. 2). In den meisten Fällen (< 80%) trat die Genesung symmetrisch ein. Die Kontrolltiere erreichten ein Maximum von 4,1 Punkten (± 0,5) in der BBB- Wertung und zeigten keine fortschreitende Verbesserung während des untersuchten Zeitraums. Dies ist im Einklang mit den Ergebnissen anderer Gruppen (Basso et al., 1996; supra). Am 10. Tag nach der Durchtrennung zeigten die C3-C2IN-Tiere eine Verbesserung von bis zu 8-9 Punkten ("sweeping") im Vergleich zu dem ersten Untersuchungszeitpunkt, wogegen die Kontrolltiere unter 3 Punkten lagen. Ausschließlich im ersten Experiment beobachteten wir eine Verbesserung nach 21 Tagen bis zu 8 Punkten (±0,58) auch in den Tieren, die nur C2 erhielten. Im zweiten Experiment konnten wir den Effekt einer alleinigen C2- Gabe bis jetzt nicht bestätigen. Bis zum heutigen Tag war eine signifikante motorische Genesung einschließlich einer Gewichtsunterstützung der Hinterextremitäten auf Ratten beschränkt, die C3-C2IN-Konstrukte erhielten. Keine signifikante motorische Genesung trat bei den Tieren ein, die mit C3-C2IN mit einer inaktiven C2-Transporter-Komponente, nur mit C2-Transporter- Komponente oder ohne Zugabe von irgendwelchen Komponenten (Kontrolltiere) blieben.

Die sensorische Genesung wurde mittels einer senso-motorischen Gale-Wertung quantifiziert. 21 Tage nach Injektion zeigten C3-C2IN behandelte Ratten ein vollständiges Zurückziehen der Hinterextremitäten als Antwort auf alle getesteten Stimuli (Berührung, Mechano-Rezeption, Temperatur) in einer Weise, die vergleichbar ist mit unbehandelten Ratten. C3-C2IN-Tiere erreichten bis zu 95% Genesung in dieser kombinierten Wertung, wogegen C2-Tiere oder Kontrolltiere weniger als 50% Genesung erreichten. Weiterhin wurde ein richtig ausgeprägter Tastsinn in C3-C2IN-Tieren beobachtet, der essentiell für ein spezifisches Ausrichten der Hinterextremitäten ist.

Morphologische Veränderungen charakterisiert durch (i) reduzierte Narbenbildung und (ii) reduzierte sekundäre Schadensphänomene wie Hohlraumbildung, wurden in C3-C2IN behandelten Tieren beobachtet. Die Gewebsneubildung wurde durch immunhistochemische Methoden (spezifische Antikörper, Nukleinfärbung) beschrieben und das die Läsionsstelle überbrückende Gewebe als Gewebe neuronalen Ursprungs (Neurophilament) identifiziert.

Eine durchgeführte Retranssektion oberhalb der ersten Läsionsstelle (Gh7) führte bei den Tieren, die eine über 95%ige Regeneration zeigten, führte erneut zur Lähmung der Hinterläufe. Dies ist darauf zurückzuführen, daß die Regeneration tatsächlich von corticospinalen Fasern oberhalb der ersten Läsionsstelle, die die Läsion überbrückten, bewirkt wurde.

Claims (14)

1. Verwendung einer Zusammensetzung enthaltend mindestens ein Fusions­ protein und mindestens einen Transporter zur In-vivo-Stimulation des Nerven­ wachstums, der In-vivo-Inhibition der Narbengewebsbildung und/oder In- vivo-Reduktion eines Sekundärschadens,
wobei das Fusionsprotein mindestens eine Bindungsdomäne für den Transporter und mindestens eine Modulationsdomäne zur Änderung der Aktivität von kleinen GTP-bindenden Proteinen enthält,
und der Transporter die Aufnahme des Fusionsproteins in eine Zelle vermittelt.

2. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der Transporter an eine Struktur an der Zelloberfläche, insbesondere einen Rezeptor oder ein Oberflächenprotein, bindet.

3. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Transporter ein viraler, liposomaler, ein proteinerger oder peptiderger Transporter ist.

4. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 1-3, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der Transporter von einem binären bakteriellen Toxin, insbesondere von dem C2-Toxin aus Clostridium botulinum, stammt.

5. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 1-4, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Modulationsdomäne das kleine GTP-bindenden Proteine, insbesondere Rho A-C, inaktiviert.

6. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 1-5, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Modulationsdomäne, vorzugsweise durch kovalente Modifi­ kation, am meisten bevorzugt durch ADP-Ribosylierung oder Glykosylierung, das kleine GTP-bindenden Proteine inaktiviert.

7. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 1-4, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Modulationsdomäne das kleine GTP-bindenden Proteine, insbesondere Cdc42 und Rac, aktiviert.

8. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 1-7, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Modulationsdomäne von einem Toxin abgeleitet ist.

9. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 8, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Toxin ein bakterielles Toxin ist, wobei das Bakterium insbesondere aus der Gruppe der Gattungen Clostridium, Staphylococcus, Bacillus, Pseudomonas, Salmonella oder Yersinia ausgewählt ist.

10. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Toxin das C3-Exoenzym aus Clostridium limosum oder eine verwandte Transferase ist.

11. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 1-10, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Bindungsdomäne ganz oder teilweise ein binäres bakterielles Toxin, vorzugsweise das C2-Toxin aus Clostridium botulinum, besonders bevorzugt die C2IN-Domäne enthält.

12. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 1-11 zur Behandlung von Neuronenschäden.

13. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 1-11 zur Behandlung von Verletzungen des Gehirns und des Rückenmarks.

14. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 1-11 zur Behandlung von neurologischen und neurodegenerativen Erkrankungen des zentralen und peripheren Nervensystems.