DE69023433T2

DE69023433T2 - Für Oligodendrocyten cytotoxischer Faktor.

Info

Publication number: DE69023433T2
Application number: DE69023433T
Authority: DE
Inventors: Avi Cohen; Michal Schwartz
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1989-08-28
Filing date: 1990-08-27
Publication date: 1996-04-04
Anticipated expiration: 2010-08-28
Also published as: AU642897B2; IE903108A1; ZA906853B; PT95123A; AU6137290A; EP0415321B1; NZ235059A; DE69023433D1; EP0415321A1; HUT56117A; ATE130008T1; GR3018534T3; FI904229A0; HU905507D0; IL91459A0; FI904229A7; JPH0411896A; CA2024030A1; KR910004200A; ES2081884T3

Description

FÜR OLIGODENDROCYTEN CYTOTOXISCllER FAKTOR

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Oligodendrocyten hemmenden bzw. für Oligodendrocyten cytotoxischen Faktor, der befähigt ist, eine Verminderung der Zahl von Fortsätze-aufweisenden Oligodendrocyten zu bewirken. Der neue Faktor ist nützlich, um die Regeneration verletzter Nerven des Zentralnervensystems von Säugetieren zu verbessern.
Die Neuronen im Zentralnervensystem (ZNS) der Säugetiere regenerieren durchtrennte Axone nicht spontan, die Fisch- und Amphibien-Neuronen dagegen regenerieren ihre Axone prompt. Die Unfähigkeit des Säuger-ZNS zur Regeneration scheint nicht auf einer Eigenschaft dieser ZNS-Neuronen an sich zu beruhen, denn in vivo können diese Neuronen ein beträchtliches Neuwachstum der Axone in eine periphere Nervenbrücke zustandebringen. In in-vitro-Präparaten wachsen verletzte Säuger-ZNS-Axone nicht an oder in ein Segment eines Säuger-Sehnerven, sie wachsen jedoch an oder in einen Fisch-Sehnerv oder in einen peripheren Nerv eines Säugetieres. Die Unterschiede beruhen somit vermutlich auf der unterschiedlichen Umgebung; die Säuger-ZNS-Umgebung fördert das Wachstum nicht, die Umgebung von peripheren Nerven oder von Fisch-Sehnerven dagegen fördert das Wachstum.
Der Sehnerv eignet sich gut als Modell, um die Rolle von Gliazellen bei der Axon-Regeneration zu untersuchen, denn hier sind keine Neuronen-Zellkörper vorhanden und der Nerv ist für eine Schädigung zugänglich. Zu den zellulären Komponenten des Sehnerven der Ratte zählen Makroglia (Astrocyten und Oligodendrocyten) und Mikroglia (amöboides und verzweigtes Mikroglia). Die Astrocyten werden in zwei Typen eingeteilt, die durch Antigen-Marker unterschieden werden können: die protoplasmatischen oder Typ-1-Astrocyten sind Ran2+, GFAP+ und A&sub2;B&sub5;&submin;, die fibrösen oder Typ-2-Astrocyten sind Ran2-, GFAP+ und A&sub2;B&sub5;&sbplus; (Miller und Raff, 1984; Raff und Miller, 1984) . Die Typ-2- Astrocyten und die Oligodendrocyten haben eine gemeinsame Stammzelle (die O-2A-Stammzelle), die den Phänotyp Ran2-, GFAP- und A&sub2;B&sub5;&sbplus; aufweist. Die Oligodendrocyten/Typ-2-Astrocyten-Familie (die aus der O-2A-Stammzelle hervorgeht) ist auf die Myelinisierung von Axonen spezialisiert: Die Oligodendrocyten erzeugen das Myelin und die Typ-2-Astrocyten tragen zur Struktur der Ranvier-Knoten bei. Die O-2A-Stammzellen können in vitro dazu gebracht werden, sich abhängig vom Kulturmedium entweder zu Oligodendrocyten oder zu Typ-2-Astrocyten zu differenzieren. Die Typ-1-Astrocyten haben eine andere Stammzelle.
Die nicht-neuronalen Zellen tragen zu der ZNS-Umgebung bei und wurden dafür verantwortlich gemacht, daß die ZNS-Regeneration bei Säugetieren versagt. Diese Zellen umfassen Astrocyten, die als Antwort auf eine Läsion hypertrophieren und fibröse Narben bilden, und Oligodendrocyten, die auf das Axon-Wachstum hemmend wirken. Die Astrocyten-Narbe besteht zum größten Teil aus Typ-1-Astrocyten und verhindert vermutlich das Wachstum, indem sie eine physikalische Barriere bildet. Die Zeit, die für die Bildung der Narbe in Amspruch genommen wird, ist lang, deshalb ist es ziemlich unwahrscheinlich, daß eine durch die Narbe erzeugte Barriere das regenerative Wachstum unmittelbar nach dem Trauma verhindern könnte. An Typ-1- Astrocyten im Sehnerven von Ratten wurde gezeigt, daß sie Laminin exprimieren, ein Molekül, das pränatal während der Entwicklung des Sehnerven daran beteiligt ist, den Axon-Auswuchs zu fördern. Typ-1-Astrocyten im Gehirn erwachsener Säugetiere exprimieren normalerweise kein Laminin, mit der Ausnahme, daß nach einer Verletzung des Gehirns eine vorübergehende Expression stattfindet. Im Gegensatz dazu wird Laminin in regenerativen Fisch-Sehnerven kontinuierlich exprimiert. In in-vitro- Präparaten wachsen die Axone in engem Kontakt mit Typ-1- Astrocyten.
Man vermutet nun, daß reife Oligodendrocyten für das Axon-Wachstum nicht-permissiv sind. Wachsende Axone kommen in vitro nicht mit reifen Oligodendrocyten in Kontakt. Während der Entwicklung findet das Axon-Wachstum im Sehnerven größtenteils vor der Geburt statt, bevor sich Oligodendrocyten differenziert haben. Somit scheint es, daß die Axon-Regeneration in Säugetieren, im Gegensatz zum Sehnerven der Fische, dadurch behindert wird, daß reife Oligodendrocyten, die kein Axon- Wachstum zulassen, und reaktive Typ-1-Astrocyten, denen das (die) fördernde(n) Element(e) fehlt (fehlen), vorliegen.
Frühere Arbeiten der Erfinder und anderer Forscher haben gezeigt, daß das ZNS niederer Wirbeltiere, insbesondere regenerierende Fisch-Sehnerven, eine Quelle von Faktoren sind, die das regenerative Axon-Wachstum von verletzten Sehnerven erwachsener Säugetiere fördern können, wenn sie zum geeigneten Zeitpunkt und in geeigneten Mengen auf diese verletzten Sehnerven angewendet werden (Schwarz et al., 1985; Hadani et al., 1984; Lavie et al., 1987, und Cohen et al., 1989).
Robbins et al., 1987, haben berichtet, daß die Stimulierung von Ratten-Astrocyten in vitro zur Erzeugung eines cytotoxischen Faktors führte, der dem Tumornekrosefaktor funktionell ähnlich war. Außerdem haben sie gezeigt, daß der menschliche rekombinante Tumornekrosefaktor eine cytotoxische Aktivität besaß, die gegen Ratten-Oligodendrocyten gerichtet war. Selmaj et al., 1988, haben die Wirkung des rekombinanten menschlichen Tumornekrosefaktors (rHTNF) auf myelinisierte Kulturen von Maus-Rückenmark-Gewebe untersucht. Sie fanden, daß rhTNF eine Oligodendrocyten-Nekrose mit verzögertem Beginn und eine Art Myelin-Dilatation induzierte.
Trotz weltweiter, großer Forschungsanstrengungen wurde bisher noch kein sicheres und wirksames Mittel entwickelt, das eine ZNS-Regeneration bei Säugetieren und insbesondere beim Menschen bewirkt. Ein solches Mittel wäre sehr wünschenswert, insbesondere ein Medikament, das an der Stelle injiziert werden kann, wo die gewünschte Regeneration stattfinden soll, auf diese Weise könnten posttraumatische Paraplegie oder Quadraplegie, Blindheit, Taubheit, mit Operationen einhergehende Axotomie und dergleichen gelindert werden.
Die Erfindung betrifft einen für Oligodendrocyten cytotoxischen Faktor, hier mit OCF bezeichnet, aus niederen Wirbeltieren, die keine Säugetiere sind, der die folgenden Eigenschaften aufweist:
i. er ist selektiv toxisch für Oligodendrocyten, nicht aber für andere Zellen, wie z.B. Typ-1-Astrocyten und Fibroblasten-Zellen;
ii. er verringert die Zahl reifer Oligodendrocyten in den Kulturen von verletzten Nerven von niederen Wirbeltieren und Säugetieren;
iii. er hemmt die Differenzierung von Stammzellen der Oligodendrocyten-Familie zu reifen Oligodendrocyten;
iv. er ist wasserlöslich;
v. er ist hitzeempfindlich, wobei er seine Aktivität bei Erhitzen auf 56ºC verliert;
vi. er ist empfindlich gegenüber Protease, wobei er seine Aktivität bei Spaltung mit Trypsin verliert; und
vii. er liegt in den konditionierten Medien von sich regenerierenden verletzten Nerven von niederen Wirbeltieren, die keine Säugetiere sind, wie z.B. Fischen, vor und kann daraus gereinigt werden, dagegen liegt er weder in den konditionierten Medien von intakten Nerven von niederen Wirbeltieren noch in den konditionierten Medien von verletzten oder intakten Nerven von Säugetieren vor.
Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Isolierung von OCF aus verschiedenen Quellen, z.B. aus sich regenerierenden Fisch-Sehnerven, und seine Reinigung.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung von OCF für die Herstellung von Arzneimitteln, die für die Regeneration von Nerven des ZNS von Säugetieren nützlich sind, und auf diese Weise erhaltene Arzneimittel.
Die Figuren zeigen:
Figur 1 zeigt die Wirkung von Fisch-CM-R auf erwachsene 04-positive Zellen in Kulturen von verletzten Sehnerven erwachsener Ratten. Die Zellen wurden aus den Sehnerven erwachsener Ratten zubereitet, die drei Tage vor der Exzision zerquetscht wurden, sodann wurden sie auf mit Poly-L-Lysin beschichtete Deckgläser in definiertem Medium ausgesät. Die Kulturen wurden 96 Stunden in vitro auf 04-Immunreaktivität gefärbt, wobei ein indirektes Immunfluoreszenz-Verfahren verwendet wurde, das folgendermaßen durchgeführt wurde: Zuerst wurden die Zellen 30 Minuten mit Maus-Anti-04-Antikörpern inkubiert, darauf folgte eine 30-minütige Inkubation mit Fluorescein-konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-IgM. Nach Beendigung der zweiten Inkubation wurden die Zellen gewaschen und 10 Minuten mit kaltem Methanol (-20ºC) fixiert. Feld (a) bzw. Feld (b) zeigt eine fluoreszenz- bzw. phasenkontrastmikroskopische Aufnahme der Kontrollzellen in definiertem Medium ohne Behandlung. Die Felder (c), (e), (f) und (g) zeigen 04-positive Zellen in Kulturen, die 48 Stunden vor der Färbung mit CM-R (12 ug Protein/ml) behandelt wurden. Die Felder (c) und (d) stellen eine fluoreszenz- und eine phasenkontrastmikroskopische Aufnahme der gleichen Zellen dar. Die Aufnahmen wurden in einem einzigen Experiment gemacht, die Ergebnisse dieses Experimentes wurden in zwei weiteren Experimenten reproduziert.
Figur 2 zeigt die Wirkung von CM-R auf die in-vitro-Entwicklung von Galc-positiven Zellen aus den Gehirnen von Ratten einen Tag nach der Geburt. Die Gehirne der neugeborenen Ratten wurden herausgeschnitten und nach dem Verfahren von McCarthy und DeVellis dissoziiert. Nach acht Tagen in vitro wurden die Oligodendrocyten durch Schütteln abgelöst und auf mit Poly-L- Lysin beschichtete Deckgläser ausgesät (10&sup4; Zellen pro Vertiefung einer Mikrotiterplatte). Die Kulturen wurden in vitro nach 24, 48 und 72 Stunden auf Galc-Immunreaktivität gefärbt, wobei die direkte Immunfluoreszenztechnik unter Einsatz von Fluorescein-konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-IgM verwendet wurde. In den Versuchskulturen wurde CM-R (1,2 und 12 ug protein/ml) zu der angegebenen Zeit nach der Aussaat zugegeben (mit Pfeil markiert). In jedem Fall wurde die Gesamtzahl der Galc-positiven Zellen auf den ganzen Deckgläsern gezählt (Zahlen über der Tages-Darstellung). In der Kontrollkultur blieb die Zahl der Galc-positiven Zellen über den ganzen Zeitraum des Experimentes (24 bis 72 Stunden) relativ konstant und betrug etwa 700 bis 850 Zellen. Beachten Sie, daß die Entwicklung reifer Oligodendrocyten in der Kultur in jeder untersuchten Zeitspanne nicht gehemmt wurde, wenn CM-R zur Zeit der Aussaat in einer Konzentration von 1,2 ug Protein/ml zum Kulturmedium zugegeben wurde. Eine deutliche Hemmwirkung (mehr als 50 %) wurde beobachtet, wenn CM-R zur Zeit der Aussaat mit 12 ug Protein/ml zugegeben wurde. Wenn CM-R in vitro 24 Stunden nach der Aussaat zugefügt wurde, zeigte sich nach weiteren 24 Stunden in vitro eine Hemmung der Oligodendrocyten-Reifung von fast 50 %, dieser Effekt schien jedoch nur vorübergehend zu sein. Dieses Experiment wurde zweimal wiederholt, wobei qualitativ die gleichen Ergebnisse erhalten wurden (N.D. - nicht durchgeführt). Figur 2 zeigt außerdem, daß die Hemmwirkung auch dann reproduzierbar war, wenn die Zahl der Galc-positiven Zellen durch ELISA, anstelle von Immunfluoreszenz, bestimmt wurde. Ferner wird in Fig. 2 eine Dosis-Abhängigkeits-Kurve der Hemmaktivität als Funktion der Menge von eingesetzten CM-R gezeigt.
Figur 3 zeigt einen Vergleich zwischen der Wirkung von CM-R und CM-N auf die Entwicklung von Galc-positiven Zellen in Kulturen von Oligodendrocyten aus den Gehirnen neugeborener Ratten. Die Kulturen der Oligodendrocyten wurden wie vorstehend zubereitet und in Platten mit mehreren Vertiefungen (10³ Zellen pro Mikrotiterplatte) ausgesät. Nach 24 Stunden in vitro wurden CM-R oder CM-N in den angegebenen Konzentrationen zugefügt. 48 Stunden später wurden die Zellen untersucht, indem sie zuerst 30 Minuten bei 37ºC mit Galc-Antikörpern und anschließend weitere 30 Minuten bei 37ºC mit Meerrettich- Peroxidase, konjugiert an Ziegen-Anti-Maus-Antikörper (HRP- GαM, Bio-Makor, Israel), inkubiert wurden. Die Menge der gebundenen Antikörper wurde bestimmt, indem die Zellen gewaschen wurden und zu jeder Vertiefung 100 ug Substrat (2,2'-Azinodi(3-ethylbenzthiazolinsulfat) (Sigma) zugefügt wurden. Die Absorption wurde in einem Titertech Multiskan MMC bei 405 nm überwacht, wobei eine Referenzwellenlänge von 630 nm verwendet wurde. Jeder Balken stellt einen Durchschnittswert (± SD) aus drei Vertiefungen dar. Die kleinere eingefügte Abbildung zeigt zum Vergleich die Ergebnisse, die erhalten wurden, wenn man die Zahl der Galc-positiven Zellen pro Deckglas in Kulturen bestimmte, die entweder mit CM-R (12 ug/ml) oder CM-N (12 ug/ml) behandelt wurden, das jeweils nach 24 Stunden in vitro zugefügt wurde, und die 48 Stunden später untersucht wurden.
Figur 4 zeigt einen Vergleich zwischen der Wirkung von PDGF und der von CM-R auf Oligodendrocyten aus den Gehirnen neugeborener Ratten. Die Kulturen der Oligodendrocyten aus den Gehirnen neugeborener Ratten wurden wie in Figur 2 erhalten. In allen Kulturen wurde die gleiche Zahl von Zellen ausgesät. Nach 48 Stunden in vitro wurden die Kulturen entweder auf Galc- oder auf A&sub2;B&sub5;-positive Zellen gefärbt. Bei den behandelten Kulturen wurde zur Zeit der Aussaat entweder PDGF (5 ng/ml, Sigma) oder CM-R (12 ug Protein/ml) zugegeben. Als Kontrolle wurden Kulturen verwendet, die in definiertem Medium gehalten und nicht behandelt wurden. Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen zeigen die mit monoclonalen A&sub2;B&sub5;-Antikörpern der Maus angefärbten Zellen in den Kontrollkulturen (b), in den mit PDGF behandelten Kulturen (a) oder in den mit CM-R behandelten Kulturen (d). Das Balkendiagramm in (c) zeigt die Gesamtzahl der A&sub2;B&sub5;- oder Galc-positiven Zellen in den Deckgläsern bei jeder Behandlung (Balkenabmessung = 10 um).
Figur 5 zeigt die Wirkung einer kombinierten Anwendung von CM-R und PDGF auf die Entwicklung von Galc-positiven Zellen. Die Kulturen der Gehirn-Oligodendrocyten wurden wie in den Figuren 2 und 3 hergestellt. PDGF (5 ng/ml) oder PDGF zusammen mit CM-R (5 ng/ml bzw. 12 ug/ml) wurden zu den Oligodendrocyten aus den Gehirnen neugeborener Ratten 24 Stunden nach der Aussaat zugefügt. Nach der angegebenen darauf folgenden Zeit (24, 48, 96 Stunden) wurden die Kulturen auf Galc-positive Zellen gefärbt. Die Zahlen geben die absolute Zahl der Galc-positiven Zellen pro Deckglas an. Beachten Sie, daß die Zahl der Gal-positiven Zellen verringert war, wenn eine Behandlung mit einer Kombination aus PDGF und CM-R erfolgt war.
Figur 6 zeigt, daß CM-R in gemischten Kulturen aus Astrocyten und Oligodendrocyten von neugeborenen Ratten selektiv die Oligodendrocyten angreift. Gemischte Gliazellen aus den Gehirnen neugeborener Ratten wurden dissoziiert, wie in Figur 2 beschrieben, und unmittelbar danach auf mit Poly-L-Lysin beschichtete Deckgläser ausgesät (10&sup4; Zellen pro Deckglas). Diese Zellen wurden sechs Tage in vitro in mit 5 % FCS angereichertem DMEM gehalten, das alle zwei Tage gewechselt wurde. Am sechsten Tag wurde das Medium gegen definiertes Medium ausgetauscht und entweder mit CM-R (10 ug/ml) oder mit CM-N (10 ug/ml) angereichert. Nach 72 und 96 Stunden in vitro wurden die Zellen mit monoclonalen Maus-Antikörpern gegen Galc und Kaninchen-Anti-GFAP doppelt markiert, anschließend folgte spezifisches Rhodamin-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG&sub3; bzw. Fluorescein-konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen. Die fluoreszenzmikroskopische Aufnahme (a) zeigt Zellen, die mit Anti- GFAP gefärbt wurden und die durch die CM-R-Behandlung nach 72 Stunden in vitro nicht beeinflußt wurden. Die mikroskopische Aufnahme (b) zeigt die Zahl der Galc-positiven Zellen in den Deckgläsern mit der jeweiligen Behandlung bei 72 und 96 Stunden in vitro. Die Ergebnisse stellen den Mittelwert ± SD von zwei Deckgläsern dar. Die mikroskopischen Aufnahmen (c) und (d) sind phasenkontrastmikroskopische Aufnahmen von typischen gemischten Gliazellen aus unbehandelten (d) und mit CM-R behandelten Kulturen (c). Beachten Sie, daß die einzellige Schicht, die durch nicht-CM-R-sensitive Zellen gebildet wird (c), mit GFAP angefärbt wird. Die CM-R-sensitiven Zellen in der Kontrolle verklumpen (d, mit Pfeilen markiert) und werden mit A&sub2;B&sub5; angefärbt (Werte nicht dargestellt). Diese Zellen stellen möglicherweise die O-2A-Stammzellen dar, die durch die Typ-1-Astrocyten, die eine einzellige Schicht bilden, zur Vermehrung stimuliert werden.
Figur 7 zeigt Blut-Makrophagen in den Kulturen von Fisch- Sehnerven. Diese Makrophagen kamen am reichlichsten in Kulturen von Nerven vor, die mehrere Tage vor ihrer Exzision verletzt wurden. Die hier gezeigten Zellen wurden in L-15-Medium gezüchtet, das mit 10 % FCS angereichert war. (A) zeigt einen Makrophagen sieben Tage nach der Plattierung, mit Giesma gefärbt und im Phasenkontrast dargestellt. (B) und (C) sind Zellen fünf Tage nach der Plattierung, (B) ist eine Phasenkontrast-Aufnahme und (C) wurde nach der Fixierung mit 6D2 markiert. Beachtenswert daran ist, daß (C) die mit Myelin beladenen Vakuolen des Makrophagen zeigt. Diese Vakuolen wurden auch mit unspezifischer Esterase positiv angefärbt (Fig. 8). Alle mikroskopischen Aufnahmen haben eine 500-fache Vergrößerung.
Figur 8 zeigt Makrophagen, die für unspezifische Esterase positiv sind. Sehnervenzellen des Goldfisches wurden wie beschrieben gezüchtet. (A), (B) und (C) zeigen Makrophagen, die vermutlich aus dem Blut stammen. Diese kamen in Kulturen von Fisch-Sehnerven, die vor ihrer Dissoziation in Organkultur gehalten wurden, selten vor, sie kamen jedoch reichlich in Kulturen von Fisch-Sehnerven vor, die einige Tage vor ihrer Exzision zerquetscht wurden. Diese Makrophagen zeigten typischerweise eine kreisförmige Gestalt, auch ihre Vesikel waren typischerweise kreisförmig angeordnet. Diese Vesikel waren 6D2-positiv (Fig. 7 B, C), was auf die Myelin-Phagocytose-Aktivität dieser Zellen schließen läßt. Ortsständige Makrophagen sind in (D) bis (G) zu sehen. Hier wurde eine Vielzahl von Formen beobachtet, die von länglichen und Fibroblasten-ähnlichen (F) bis zu mehr runden Formen (D und G) reichten. Die Vesikel dieser Zellen waren gleichmäßig im Cytoplasma verteilt, sie waren auch 6D2-positiv.
Figur 9 zeigt ortsständige Makrophagen in Kulturen von Fisch-Sehnerven, die vor der Dissoziation in Organkultur gehalten wurden. Die Figur zeigt verschiedene Erscheinungsformen der ortsständigen Makrophagen, die von mehr runden - (A) bis (D) - bis zu länglichen, Fibroblasten-ähnlichen Formen (E) reichten. Ein Kontakt zwischen den ortsständigen Makrophagen und den Blutmakrophagen wurde beobachtet, wie in (F) und (G) zu sehen ist. Außerdem wurde ein Kontakt zwischen den Oligodendrocyten und beiden Typen von Makrophagen beobachtet, wie in (H) und (I) zu sehen ist. Dieser Kontakt kann ein Verschlingen von Zellen sein (H) und (I). (A), (C), (E), (F) und (H) sind Phasenkontrastaufnahmen, alle anderen mikroskopischen Aufnahmen sind mit 6D2 markiert. Alle mikroskopischen Aufnahmen haben eine 500-fache Vergrößerung.
Der neue für Oligodendrocyten cytotoxische Faktor (OCF) der Erfindung kann aus sich regenerierenden verletzten Nerven von niederen Wirbeltieren, wie z.B. Fischen, erhalten werden. Er liegt im konditionierten Medium von sich regenerierenden Fisch-Sehnerven vor und kann daraus isoliert und weiter gereinigt werden. Er kann auch aus Makrophagen, die besser verfügbar sind, oder aus beliebigen anderen geeigenten Zellen isoliert werden. Er wird aus dem konditionierten Medium dieser Zellen isoliert und anschließend gereinigt.
Der Begriff "konditioniertes Medium" (CM), der in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, bezieht sich auf ein Medium, das durch sich regenerierende Fisch-Sehnerven konditioniert wird, wobei es hergestellt wird, indem Segmente von Fisch-Sehnerven, die 8 Tage nach dem Zerquetschen entnommen wurden, in einem serumfreien Medium 1,5 bis 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert werden, sodann wird es gewonnen und filtriert. Das erhaltene CM ist frei von Gewebe. Beispiele von serumfreien Medien, die verwendet werden können, sind Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM; 4 Sehnerven pro 300 ul Medium), L-15-Leibowitz-Medium usw.. Wenn ein Vergleich zwischen dem konditionierten Medium von sich regenerierenden Nerven und dem konditionierten Medium von intakten Nerven angestellt wird, wird CM-R für das CM von sich regenerierenden Nerven und CM-N für das CM von intakten Nerven eingesetzt.
Die cytotoxische Aktivität von OCF wird durch seine Fähigkeit bestimmt, die Anzahl reifer Oligodendrocyten in Rattengehirnkulturen zu vermindern. Die Zahl der Oligodendrocyten wird bestimmt, indem gegen Galactocerebrosid (Galc) gerichtete Antikörper verwendet werden, die die reifen Oligodendrocyten markieren. Eine Verminderung der Zahl der Galc-positiven Zellen zeigt eine Verminderung der Zahl der reifen Oligodendrocyten. Der Test wird in den Abschnitten "Experimentelle Verfahren" und "Beispiele" ausführlicher beschrieben.
Die cytotoxische Aktivität von OCF ist für die Oligodendrocyten-Familie spezifisch. Er hemmt somit die Differenzierung von Stammzellen der Oligodendrocyten-Familie zu reifen Oligodendrocyten. Er zeigt keine cytotoxische Wirkung auf andere Zellen, wie z.B. Typ-1-Astrocyten oder Fibroblasten-Zellen.
Es wurde gefunden, daß der OCF im CM von sich regenerierenden verletzten Fisch-Sehnerven vorliegt, nicht aber im CM von unverletzten Fisch-Sehnerven. Auch im CM von verletzten Säuger-Sehnerven liegt er nicht vor. Der OCF, der aus sich regenerierenden verletzten Nerven von Fischen stammt, verringert die Zahl der reifen Oligodendrocyten in Kulturen von Säuger- Nerven, z.B. in Kulturen von Ratten-Nerven.
Der OCF ist wasserlöslich und hitzeempfindlich, wobei er seine Aktivität nach 30 Minuten bei 56ºC verliert. Bei 100ºC verliert der OCF seine Aktivität nach 10 Minuten.
Der OCF ist gegenüber Proteasen empfindlich, wobei er seine Aktivität bei Spaltung mit Trypsin verliert.
Der erfindungsgemäße Faktor kann aus dem CM von sich regenerierenden Fisch-Sehnerven erhalten werden, anschließend wird er durch herkömmliche biochemische Verfahren gereinigt, wie z . B. Ionenaustausch-Chromatographie, Ausschluß-Chromatographie, HPLC usw..
Die Regeneration von ZNS-Axonen aus Fisch-Sehnerven findet in Gegenwart von OCF statt, dies ist ein Faktor, der aus der Umgebung dieser verletzten Nerven stammt. Der OCF hemmt die Reifung von Oligodendrocyten aus ihren Stammzellen und bewirkt eine Verminderung der Zahl der Fortsätze-aufweisenden reifen Oligodendrocyten, wenn er zu einem Säugersystem zugegeben wird. Es wurde gefunden, daß der OCF in Rattenkulturen aktiv ist. Dieser Faktor kann somit einen Weg weisen, um die repressive und nicht-permissive Wirkung reifer Oligodendrocyten auf die Regeneration im ZNS erwachsener Säugetiere zu verhindern. Faktoren, wie der OCF, werden während der Entwicklung nicht benötigt, da die sich entwickelnden Axone mit den vollständig differenzierten Myelin-produzierenden Oligodendrocyten überhaupt nicht in Berührung kommen, von denen man weiß, daß sie eine nicht-permissiven Wirkung auf das Axon-Wachstum ausüben.
Die beobachtete Wirkung der Substanzen, die aus den sich regenerierenden Fisch-Sehnerven stammen, auf die Zahl von gezüchteten Säuger-Oligodendrocyten deutet darauf hin, daß das Axon-Wachstum in verletzten Kaninchen-Sehnerven, die mit CM von sich regenerierenden Fisch-Sehnerven behandelt wurden (Lavie et al., 1987), möglicherweise auf der in-vivo-Wirkung dieser Komponenten, der Modulation der Oligodendrocyten-Population beruht, wobei diese Wirkung zusätzlich zu ihrer Wirkung auf die Eigenschaften der Astrocyten (Cohen und Schwartz, 1989) auftritt. Die beobachtete Hemmwirkung von OCF wird nicht über PDGF oder CNTF vermittelt, die indirekt eine Verminderung der Zahl reifer Oligodendrocyten bewirken (Noble et al., 1988; Lillien et al., 1988). In jüngsten Veröffentlichungen wurde dargestellt, daß aus aktivierten Astrocyten Faktoren, die die Reifung von Oligodendrocyten hemmen können (Rosen et al., 1988), oder der Tumornekrosefaktor (TNF) erhalten werden können (Robbins et al., 1987), und daß TNF eine cytotoxische Wirkung auf myelinisierte Organkulturen von Maus-Rückenmarkgewebe ausübt (Selmaj und Ramie, 1988). Aus diesem Grund wurde die Möglichkeit ins Auge gefaßt, daß die beobachtete Wirkung durch einen Faktor vermittelt wird, der dem TNF funktionell ähnlich ist. Um die Verwandtschaft zwischen dem erfindungsgemäßen OCF und dem TNF zu ermitteln, wurden gegen menschlichen rekombinanten TNF gerichtete Antikörper eingesetzt, wobei gezeigt wurde, daß sie die beobachtete Wirkung von CM-R nicht neutralisieren.
Die Regeneration der Fisch-Sehnerven findet nach einer Verletzung spontan statt. Normale Fisch-Sehnerven können in vitro eine permissive Umgebung für Säuger-ZNS-Neuronen bereitstellen, so daß diese Neuriten ausbilden. Es ist möglich, daß die normalen Fisch-Sehnerven keine Myelin-assoziierten Inhibitoren des Neuronen-Wachstums aufweisen, die in Säugetieren gefunden werden, oder daß sie diese zwar besitzen, jedoch nur in einem niedrigen Spiegel. Sofern die Fische keine oder nur einen niedrigen Spiegel von Inhibitoren des Axon-Wachstums besitzen, könnte man daraus schließen, daß sich die Oligodendrocyten von Fischen und Säugetieren unterscheiden, oder daß der (die) hemmende(n)/cytotoxische(n) Faktor(en) die Expression dieser Myelin-assoziierten Inhibitoren des Axon-Wachstums reguliert (regulieren). Eine solche Möglichkeit paßt zu den niedrigen Spiegeln der hemmenden/cytotoxischen Faktoren, die in den intakten Fisch-Sehnerven gefunden wurden. Das visuelle System der Fische ist insofern ungewöhnlich, als dort während des ganzen Lebens kontinuierlich Zellen zugefügt werden und somit der Sehnerv immer einen bestimmten Anteil wachsender Axone enthält. Aus diesem Grund besteht die Möglichkeit, daß auch im unverletzten Fisch-Sehnerv ein Mechanismus für das Wachstum in einer erwachsenen Umgebung vorliegt, jedoch in viel kleinerem Ausmaß. Man kann annehmen, daß bei den Säugetieren unmittelbar nach der Verletzung die Zugriffsmöglichkeit auf solche Faktoren zur geeigneten Zeit fehlt oder daß sie diese Faktoren überhaupt nicht besitzen.
Die cytotoxische Wirkung, die in den sich regenerierenden Fisch-Sehnerven gefunden wurde, könnte direkt oder indirekt von Makrophagen, aktivierten ortsständigen Mikrogliazellen oder aktivierten Astrocyten abhängen. Wenn die Makrophagen rasch in die verletzten Fisch-Sehnerven einströmen, wie sie es bei den sich regenerierenden peripheren Nerven der Säugetiere tun, könnten sie für die beobachtete gesteigerte Aktivität im CM-R, bezogen auf das CM-N, und für den Beitrag an der Eliminierung der nicht-permissiven reifen Oligodendrocyten verantwortlich sein. Hierdurch würde eine für Wachstum permissive Umgebung entstehen, während die Neuronen noch in einem durch die Verletzung induzierten Wachstumszustand sind.
Es wurde beobachtet, daß in Kulturen von Nerven, die zwei Tage vor ihrer Exzision verletzt wurden, viele Makrophagen, jedoch nur wenige Oligodendrocyten vorlagen. Im Gegensatz dazu wurden in Kulturen von unverletzten Sehnerven, die zwei Tage vor ihrer Dissoziation in Organkultur gehalten wurden, nur wenige Makrophagen, jedoch eine relativ große Zahl an Oligodendrocyten gefunden. Dieses umgekehrte Verhältnis zwischen der Zahl der Oligodendrocyten und der Makrophagen deutet darauf hin, daß die Makrophagen bei der Regulation der Oligodendrocyten-Zahl nach der Verletzung eine Rolle spielen.
Eine Vorgehensweise, um den erfindungsgemäßen Faktor zur Induktion der Regeneration von verletzten Nerven des Säuger- ZNS zu verwenden, besteht darin, ein Präparat des Faktors in das Zielorgan einzupflanzen. Z.B. kann ein längs verlaufendes Implantat des aktiven löslichen Faktors entlang des ganzen Nervs eingesetzt werden, um die Anwendung der verwendeten Substanz zu verbessern, wobei eine Minipumpe eine kontinuierliche Versorgung mit dem Faktor sicherstellt.
Diese Erfindung wird durch die folgenden Experimente und Beispiele erläutert, die den Umfang der Patentansprüche in keiner Weise einschränken sollen.

EXPERIMENTELLE VERFAHREN

a. Quetsch-Verletzung von Fisch-Sehnerven und Herstellung von CM (konditioniertem Medium)

Zur Herstellung von 300 ul CM wurden vier Karpfen (Cyprinus carpio, 800 bis 1200 g) mit 0,05 % Tricainmethansulfonat (Sigma) stark anästhesiert. Die Sehnerven wurden intraorbital zerquetscht und die Tiere in ihren Tank zurückgesetzt. Acht Tage später wurden die Fische erneut anästhesiert, die zerquetschten, sich regenerierenden Nerven wurden herausgeschnitten, in 300 ul serumfreies Medium (DMEM, Gibco) überführt und 1,5 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Medien gewonnen, filtriert und bei -80ºC gelagert. Der Proteingehalt der Medien wurde nach dem Bradford-Verfahren (Bradford, M., 1976) bestimmt.
Die enzymatische Spaltung mit Trypsin wurde folgendermaßen durchgeführt: An Agarose gekoppeltes Trypsin wurde mit PBS äquilibriert und vier Stunden bei 37ºC mit dem CM inkubiert. Die Lösung wurde zentrifugiert (1000 x g, 5 Minuten); am Ende der Inkubation wurde der gewonnene Überstand in vitro in den nachstehend beschriebenen Kulturen getestet. Die CM wurden 10 Minuten bei 100ºC hitzebehandelt.

b. Quetsch-Verletzung des Sehnerven der Ratte

Ratten (250 bis 350 g) wurden mit Rompum (10 mg/kg, intraperitoneal) und Vetalar (50 mg/kg, intraperitoneal) anästhesiert. Eine laterale Kanthotomie wurde unter einem Binokularmikroskop durchgeführt und die Conjunktiva nach Teilung der Bulbus-Retraktionsmuskeln lateral der Cornea eingeschnitten. Der Sehnerv wurde identifiziert und in der Nähe des Augapfels durch stumpfe Austrennung freipräpariert. Die Dura wurde unverletzt gelassen. Der Nerv wurde 1 mm distal des Auges 30 Sekunden lang zerquetscht, wobei eine kalibrierte Kreuz-Quetschzange verwendet wurde. Sodann wurde die Kanthotomie vernäht und das Tier der Genesung überlassen. Zur geeigneten Zeit wurden die Tiere erneut anästhesiert und die Sehnerven herausgeschnitten.

c. Herstellung von Kulturen aus verletzten Sehnerven erwachsener Ratten

Zur Herstellung der Gliazellkulturen wurden in jedem Experiment fünf Sehnerven erwachsener Ratten verwendet. Die Sehnerven wurden wie vorstehend beschrieben zerquetscht, drei Tage später herausgeschnitten, zerkleinert und in Leibowitz L- 15-Medium (Gibco) inkubiert, das 500 E/ml Kollagenase (Sigma) enthielt. Nach 60 Minuten bei 37ºC wurde ein gleiches Volumen Trypsin (30 000 E/ml) für weitere 15 Minuten zugefügt. Die Suspension wurde zentrifugiert (500 x g, 5 Minuten), der Überstand abgenommen und das Gewebe anschließend resuspendiert und in einer Lösung, die 0,25 mM EDTA in Ca²+- und Mg²+-freiem DMEM enthielt, weitere 15 Minuten mit Trypsin (15 000 E/ml) behandelt. Die Spaltung wurde durch Zusatz eines gleichen Volumens einer Lösung von Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor (5000 E/ml, Sigma), Rinderpankreas-DNAse 1 (74 U/ml, Sigma), Rinderserumalbumin (BSA, Fraktion V, 3 mg/ml, Sigma) beendet, anschließend wurde zentrifugiert. Der Überstand wurde durch die Raff-Modifikation (Raff et al., 1983) des definierten Mediums von Bottenstein und Sato (Bottenstein und Sato, 1978) ersetzt und sodann das Gewebe digeriert. 50 ul der resultierenden Zellsuspension wurden auf jedes mit Poly-L- Lysin (PLL, 20 ug/ml) beschichtete Deckglas plattiert (Zellen von einem Sehnerven wurden auf drei Deckgläser ausgesät). Nach 30 Minuten bei 37ºC wurden die angehefteten Zellen gespült und mit 500 ul definiertem Medium versetzt. CM von sich regenerierenden Fisch-Sehnerven (12 ug/ml) wurden 48 Stunden später zu den experimentellen Proben zugegeben. Nach weiteren 48 Stunden wurden die Zellen durch indirekte Immunfluoreszenz- Markierung untersucht.

d. Zellkulturen aus Gehirnen neugeborener Ratten

Die Gliazellen wurden aus der Hirnrinde neugeborener Sprague-Dawley-Ratten präpariert (McCarthy und DeVellis, 1980). Die Zellen wurden zur Analyse gemischter Gliazellkulturen in mit PLL beschichtete Flaschen (85 mm², Nunc) oder auf mit PLL beschichtet Deckgläser (10&sup5; Zellen pro Deckglas) plattiert. Die Zellen wurden in DMEM, angereichert mit 5 % fetalem Rinderserum (FBS, Sigma), gezüchtet, das alle zwei Tage gewechselt wurde.

e. Herstellung von angereicherten Oligodendrocyten-Kulturen

Nach acht Tagen in vitro wurde die Flasche, die gemischte Kulturen von Gliazellen aus Gehirnen neugeborener Ratten enthielt, über Nacht geschüttelt, die nicht angehefteten Zellen wurden mit etwa 10&sup4; Zellen pro Deckglas auf PLL-beschichtete Deckgläser plattiert, sofern nicht anders angegeben. Die Zellen wurden 30 Minuten stehengelassen, damit sie sich anheften konnten, und anschließend mit der Raff-Modifikation des definierten Mediums von Bottenstein und Sato versetzt, um die Entwicklung von Oligodendrocyten anzuregen. Die Zellen wurden zu verschiedenen Zeiten nach der Aussaat behandelt und sodann, üblicherweise nach 48 Stunden, sofern nicht anders angegeben, einer indirekten Immunfluoreszenz-Färbung oder einem ELISA unterworfen.

f. Indirekte Immunfluoreszenz-Markierung

Die folgenden Antikörper wurden zur Immunmarkierung der gezüchteten Zellen eingesetzt monoclonale A&sub2;B&sub5;-Maus-IgM-Antikörper (Hybridom-Überstand, verdünnt 1:1), die reife Typ-2- Astrocyten und perinatale Stammzellen von Oligodendrocyten und Typ-2-Astrocyten (perinatale O-2A-Stammzellen) markieren (Eisenbarth et al., 1979; Raff et al., 1983); monoclonale 04- Maus-IgM-Antikörper (eingeengter Hybridom-Überstand, verdünnt 1:100), die unreife Oligodendrocyten (Sommer und Shachner, 1981) und erwachsene O-2A-Stammzellen (ffrench-Constant und Raff, 1986a) markieren; monoclonale Maus-Anti-Galactocerebrosid(Galc)-Antikörper (Hybridom-Überstand, verdünnt 1:10), die reife Oligodendrocyten markieren (Raff et al., 1978); Kaninchen-Anti-Glia-Fibrillen-saures-Protein (GFAP, vollständige Seren, verdünnt 1:1000), die reife Typ-1- und Typ-2-Astrocyten markieren (Bignami et al., 1972); monoclonale Maus-Antikörper 6D2, die Fisch-Oligodendrocyten markieren (Jeserich und Romen, 1989). Die zweiten Rhodamin- oder Fluorescein-konjugierten Antikörper wurden von verschiedenen Quellen bezogen: Ziegen- Anti-Maus-IgM (verdünnt 1:50, Jackson Immunoresearch Laboratories) ; Ziegen-Anti-Maus-IgG&sub3; (verdünnt 1:50, Serotec) Schwein-Anti-Kaninchen-IgG (verdünnt 1:50, Dakopatts).
Die Immunmarkierung von Oberflächenantigenen (A&sub2;B&sub5;, 04 und Galc) wurde durchgeführt, indem zuerst jeder der erforderlichen Antikörper mit den Zellen in 50 ul Volumen 30 Minuten bei 37ºC inkubiert wurde. Anschließend wurden die Zellen mehrere Male mit Hanks eingestellter Salzlösung, die 2 % hitzeinaktiviertes FBS enthielt, gewaschen und weitere 30 Minuten in den geeigneten Rhodamin- oder Fluorescein-konjugierten zweiten Antikörpern, verdünnt in DMEM, inkubiert. Sodann wurden die Zellen gewaschen und 10 Minuten bei -20ºC in Methanol fixiert. Zur Markierung der intrazellulären Antigene (GFAP) wurden die Zellen zuerst fixiert und dann immunmarkiert. In einigen Experimenten wurden die Kulturen gleichzeitig mit A&sub2;B&sub5;- und Galc- Antikörpern doppelt markiert, worauf Anti-Maus-IgM (Rhodamin) und Anti-Maus-IgG&sub3; (Fluorescein) folgte. In allen Fällen wurden die Deckgläser nach der Immunmarkierung gewaschen, mit einem Tropfen Glycerin, enthaltend 22 mM 1,4-Diazobicyclo(2,2)octain (Sigma) , präpariert, um ein Verblassen zu verhindern, versiegelt und in einem Zeiss-Universal-Mikroskop untersucht, das mit optischen Einrichtungen für Phasenkontrast, Epifluoreszenz (für den Nachweis von Rhodamin und Fluorescein) und Kamera ausgestattet war. In allen Deckgläsern wurde die genaue Zahl der gesamten immunmarkierten Zellen festgestellt.

g. ELISA bei lebenden Zellen

Die mit Oligodendrocyten angereicherten Kulturen wurden wie vorstehend beschrieben hergestellt. Die Zellen wurden in "Multiwell"-Mikrotiterplatten ausgesät (5 x 10³ Zellen pro Vertiefung, Nunc). Nach 24 Stunden in vitro wurden CM, die entweder von sich regenerierenden Nerven oder von inakten Nerven stammten, in den angegebenen Konzentrationen zugegeben. 48 Stunden später wurden die Zellen untersucht, wobei sie 30 Minuten bei 37ºC mit Galc-Antikörpern und anschließend weitere 30 Minuten bei 37ºC mit Meerrettich-Peroxidase, konjugiert an Ziegen-Anti-Maus-Antikörper (BioMakor, Israel), inkubiert wurden. Die Menge der gebundenen Antikörper wurde bestimmt, indem die Zellen gewaschen wurden und sodann zu jeder Vertiefung 100 ul Substrat [2,2-Azino-di(3-ethylbenzthiazolin)sulfat, Sigma], angereichert mit 0,003 % H&sub2;O&sub2;, zugesetzt wurde. Die Absorption wurde in einem Titertech Multiskan MMC bei 405 nm mit einer Referenz-Wellenlänge von 630 nm bestimmt.

h. Unspezifische Esterase-Färbung

Die Zellen wurden gefärbt, wobei das α-Naphthylacetat- Esterase-Verfahren und außerdem das Verfahren der Fluoridhemmung unter Verwendung eines Kits von Sigma eingesetzt wurden. Natriumnitrat (50 ul; 0,1 M) wurde zu 50 ul Echtblau (15 mg/ml in 0,4 M HCl) zugefügt. Dieses Gemisch wurde zwei bis drei Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Sodann wurde es bei 37ºC mit 2 ml entionisiertem Wasser, anschließend mit 250 ul Trizmal 7.6-Puffer-Konzentrat und danach mit 50 ul α-Naphthylacetat-Lösung versetzt. Für die Fluoridhemmung wurden außerdem 50 ul Natriumfluorid (0,2 g/ml) zugefügt. Anschließend wurden die Zellen in einem Citrat-Aceton-Formaldehyd-Fixiermittel (25 ml Citratlösung plus 65 ml Aceton plus 8 ml 37 % Formaldehyd) 30 Sekunden bei Raumtemperatur fixiert. Sodann wurden die Zellen gründlich in Wasser gewaschen und danach 30 Minuten bei 37ºC mit der α-Naphthylacetat-Reaktionslösung inkubiert. Nach gründlichem Waschen wurden die Zellen zwei Minuten mit Hämatoxylin-Lösung gegengefärbt. Anschließend wurden die Deckgläser gewaschen und für die Betrachtung auf Mikroskop-Objektträger mit Glycerin gelegt.

i. Statistische Auswertung

Die Ergebnisse wurden nach dem Friedman-Rang-Test statistisch ausgewertet. In diesem statistischen Test wird jedes Experiment als separater Block behandelt, der signifikante Unterschied der Ergebnisse (Kontrolle gegenüber CM-behandelten Proben) wird gefunden, entsprechend den Anzahl der Blöcke.

BEISPIELE

Beispiel 1

Dieses Beispiel zeigt, daß die durch sich regenerierende Fisch-Sehnerven konditionierten Medien, die den OCF enthalten, eine Verminderung von Fortsätze-aufweisende Oligodendrocyten in Kulturen von dissoziierten verletzten Sehnerven erwachsener Ratten bewirken.
Figur 1a, b zeigt Fortsätze-aufweisende 0,4-positive Zellen in Kulturen, die von Sehnerven erwachsener Ratten hergeleitet wurden, die drei Tage vor ihrer Entnahme verletzt worden waren. In Gegenwart von konditionierten Medien (CM), die von sich regenerierenden Fisch-Sehnerven hergeleitet wurden (CM-R; 12 ug Protein/ml) und die 48 Stunden nach der Aussaat zu diesen Kulturen zugesetzt wurden, war die Zahl der 04-positiven Zellen, die nach 96 Stunden in vitro erschienen (Fig. 1c bis g), viel niedriger als in unbehandelten Kulturen, die im Kontrollmedium gehalten wurden (Fig. 1a, b). Die 04-positiven Zellen, die in den mit CM-R behandelten Kulturen verblieben waren, wiesen nur wenige Fortsätze auf und wurden aus diesem Grund als unreife Oligodendrocyten identifiziert (Fig. 1c bis Die gleichen Ergebnisse wurden erhalten, wenn das gleiche Experiment wiederholt wurde, wobei anstelle von 04-Antikörpern Antikörper verwendet wurden, die gegen reife Oligodendrocyten gerichtet sind, wie z.B. Anti-Galactocerebrosid (Galc). Entsprechend entwickelten sich in Kulturen, die mit dem CM von sich regenerierenden Fisch-Sehnerven (CM-R) behandelt wurden, nur 42 % der Zellen zu reifen Galc-positiven Zellen, bezogen auf die gesamten Galc-positiven Zellen im definierten Medium. Diese Ergebnisse weisen auf das Vorliegen löslicher Faktor(en) in den Medien, die durch sich regenerierende Fisch-Sehnerven konditioniert wurden, hin, wobei diese Faktor(en) cytotoxisch sein können und/oder die Reifung von Oligodendrocyten aus ihren Stammzellen hemmen können.

Beispiel 2

Dieses Beispiel zeigt, daß die durch sich regenerierende Fisch-Sehnerven konditionierten Medien, enthaltend OCF, die Reifung von Galc-positiven Zellen in Oligodendrocyten-Kulturen neugeborener Ratten beeinflussen.
Um die Art dieses hemmenden/cytotoxischen Faktors näher untersuchen zu können und seine mögliche Auswirkung auf die Regeneration klären zu können, haben wir uns zuerst nach einer ausgiebigeren Quelle für Oligodendrocyten umgesehen, hierfür zogen wir die Möglichkeit in Betracht, anstelle der Kulturen von verletzten Sehnerven erwachsener Ratten Kulturen von Gehirnen neugeborener Ratten zu verwenden, da diese eine ausgiebige Quelle und eine homogenere Population von Oligodendrocyten bereitstellen.
Oligodendrocyten aus den Gehirnen neugeborener Ratten und ihre perinatalen Stammzellen wurden in der folgenden Reihe von Experimenten nach dem Verfahren von McCarthy und DeVellis, 1980, erhalten. Die Oligodendrocyten wurden auf mit Poly-L-Lysin beschichtete Deckgläser ausgesät. Die CM von sich regenerierenden Fisch-Sehnerven (CM-R) wurden zu diesen Kulturen, die mit Oligodendrocyten aus den Gehirnen neugeborener Ratten angereichert waren, entweder zur Zeit der Aussaat oder 24 Stunden und 48 Stunden später zugefügt (12 ug/ml). In jedem Fall wurde die gleiche Zahl an Oligodendrocyten ausgesät, wie in den unbehandelten Kontrollkulturen. Wie aus Figur 2 ersichtlich ist, war in allen mit CM behandelten Kulturen 24 Stunden nach der CM-Anwendung die Zahl an Galc-positiven Zellen mit vielen Fortsätzen niedriger (etwa 50 %) als in den entsprechenden unbehandelten Kulturen. Dies zeigt, daß, sofern das CM nur die Reifung der Oligodendrocyten aus ihren Stammzellen beeinflußt, die festgestellte niedrige Zahl von Galcpositiven Zellen, zumindest in den 24 Stunden oder 48 Stunden nach der Aussaat behandelten Kulturen, durch den spontanen Zelltod unter Bedingungen, unter denen die Erneuerung der Zellen aus Stammzellen gehemmt ist, zustande kommen könnte. Alternativ könnte das CM der sich regenerienden Fisch-Sehnerven zusätzlich zu der Wirkung auf die Stammzellen auch die reifen Oligodendrocyten beeinflussen. Außerdem wird in Figur 2 die Abhängigkeit der Hemmwirkung von der Menge des angewendeten CM gezeigt. Hier waren 12 ug Protein pro ml wirksam, 1,2 ug Protein pro ml dagegen waren unwirksam. Wie in Tabelle I dargestellt ist, war die Zahl an Fortsätze-aufweisenden Galc-positiven Zellen 24 Stunden nach der Anwendung von CM-R bereits um 40,3 ± 6,4 niedriger, bezogen auf ihre Zahl in den unbehandelten Kontrollkulturen (Tabelle I). Das Kochen des CM-R oder seine Behandlung mit Trypsin führte zu einer Verminderung ihrer hemmenden/cytotoxischen Wirkung (Tabelle II), dies legt nahe, daß der Faktor Proteinnatur hat. Tabelle I CM-R bewirkt eine Verminderung der Zahl von Rattengehirn-Oligodendrocyten Art der Zellen* Stunden nach der Behandlg.** % der Kontrolle (Mittelw.± SD*** Zahl der Experim. (n) Oligodendrocyten Gemischte Gliazellen * In diesen Experimenten lag die Zahl der gezählten Oligodendrocyten (Galc-positiven Zellen) in den Kontrollkulturen pro Deckglas zwischen 350 und 1700 Zellen. ** CM-R wurde mit 12 ug Protein/ml zugegeben. *** Die prozentuale Hemmung wurde in jedem Experiment errechnet, indem die erhaltene Zahl der Zellen der unbehandelten Kontrollkulturen als 100 % gesetzt wurde. Tabelle II Die hemmende/cytotoxische Wirkung von CM-R auf Oligodendrocyten ist Hitze- und Trypsin-labil Behandlung Zahl von Galc-positiven Zellen (Mittelwert + SEM) Kontrolle CM-R (gekocht) CM-R (Trypsin-behandelt)
In diesem Experiment wurden die Rattengehirn-Oligodendrocyten wie in Figur 2 gezüchtet. 24 Stunden nach der Plattierung wurde CM-R (gekocht oder mit Trypsin behandelt, 20 ug/ml) zugesetzt. 48 Stunden nach dem Zusatz von CM-R wurde die Zahl der Galc-positiven Fortsätze-aufweisenden Zellen bestimmt, indem die immunfluoreszierenden Zellen gezählt wurden. Die Ergebnisse eines Experimentes, das in dreifacher Ausführung durchgeführt wurde, sind dargestellt. Diese Ergebnisse wurden in zwei weiteren Experimenten reproduziert.
* p-Wert = 0,025
** Keine signifikanten Unterschiede zwischen den Kontrollkulturen und den mit gekochtem oder Trypsin-versetztem CM-R behandelten Kulturen wurden beobachtet.

Beispiel 3

Dieses Experiment zeigt, daß die hemmende/cytotoxische Aktivität von OCF mit der Regeneration in den Fisch-Sehnerven assoziiert ist.
Um herauszufinden, ob der Spiegel oder die Aktivität des hemmenden/cytotoxischen Faktors mit der Regeneration der Fisch-Sehnerven in Zusammenhang stehen, haben wir die Wirkung des CM-R mit der Wirkung von Medien verglichen, die durch unverletzte normale Fisch-Sehnerven konditioniert wurden (CM-N). CM-R oder CM-N wurden mit den gleichen Proteinkonzentrationen zu den Oligodendrocyten aus den Gehirnen neugeborener Ratten 24 Stunden nach der Aussaat zugegeben. Die resultierende Wirkung wurde mit Anti-Galc-Antikörpern sichtbar gemacht, wobei die durch indirekte Immunfluoreszenz markierten Galc-positiven Zellen gezählt wurden. In Figur 3 wird die Zahl der Galc-positiven Zellen in mit CM-N behandelten Kulturen mit ihrer Zahl in mit CM-R behandelten Kulturen verglichen. Die Wirkung von CM-N war schwächer, d.h. den unverletzten Nerven fehlte die Hemmaktivität auf die Oligodendrocyten-Reifung.

Beispiel 4

Dieses Experiment zeigt, daß der in CM-R enthaltene OCF nicht die Wirkung von PDGF nachahmt.
Kürzlich wurde gezeigt, daß die Differenzierung von Oligodendrocyten durch den aus Blutplättchen stammenden Wachstumsfaktor (PDGF) reguliert wird (Noble et al., 1988, Raff et al., 1988, und Richardson et al., 1988). Der Zusatz von PDGF zu Kulturen von Oligodendrocyt-Stammzellen verzögert aufgrund seiner Mitogen-Aktivität ihre Differenzierung vorübergehend.
Um einen Einblick in den möglichen Mechanismus zu bekommen, welcher der beobachteten Hemmung zugrunde liegt, zumindest der Hemmung, die die Reifung der Oligodendrocyten aus ihren Stammzellen betrifft, haben wir die Wirkung von CM von sich regenerierenden Fisch-Sehnerven mit der von PDGF verglichen. Der Zusatz von PDGF zu Gehirnkulturen zur Zeit der Aussaat führte in vitro nach 48 Stunden zu einer deutlichen Verminderung der Zahl von Galc-positiven Zellen. Die Wirkung war jedoch, im Vergleich zur Wirkung des CM-R, deutlich schwächer (Fig. 4). Die offensichtlich geringere Zahl von Galc-positiven Zellen, die in den mit PDGF behandelten Kulturen im Vergleich zu unbehandelten Kontrollkulturen beobachtet wurde, war eine Widerspiegelung der Vermehrung ihrer Stammzellen, die mit A&sub2;B&sub5;-Antikörpern angefärbt wurden. Dies wurde aus der gestiegenen Zahl von A&sub2;B&sub5;-positiven Zellen in den mit PDGF behandelten Kulturen deutlich. Wie aus Figur 4 ersichtlich ist, lag in den mit PDGF behandelten Kulturen, wie erwartet, ein Anstieg der Zahl von 0-2A-Stammzellen vor, die mit A&sub2;B&sub5;-Antikörpern angefärbt wurden (Fig. 4a, b, c). Im Gegensatz dazu trat bei den mit CM behandelten Kulturen eine Verminderung der Zahl von A&sub2;B&sub5;-positiven Zellen auf (Fig. 4c, d). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß der CM-R nicht nur erwachsene Oligodendrocyten beeinflußt, sondern auch ihre Stammzellen. Diese Beobachtungen schließen die Möglichkeit aus, daß die festgestellte Wirkung des CM-R auf die Entwicklung von Galc-positiven Zellen aus ihren Stammzellen durch PDGF oder irgendein anderes Mitogen vermittelt wird. Dies wird außerdem durch Figur 5 untermauert, die zeigt, daß der Zusatz von CM-R zusammen mit PDGF zu einer Verminderung von Galc-positiven Zellen führte, die auch bei Anwendung von CM-R alleine zu erwarten war.
Der ciliare neurotrophe-Faktor (CNTF) ist ein anderer Faktor, der, wie kürzlich gezeigt wurde, die O-2A-Zellfamilie beeinflußt, indem er die Differenzierung von Typ-2-Astrocyten induziert und dadurch indirekt eine Verminderung der Zahl reifer Galc-positiver Oligodendrocyten bewirkt (Lillien et al., 1988). Da das CM-R keinen Anstieg der Zahl der mit A&sub2;B&sub5;-Antikörpern angefärbten Zellen bewirkte und somit weder die Stammzellen noch die Typ-2-Astrocyten ansteigen ließ, ist es unwahrscheinlich, daß die Wirkung von CM-R über CNTF vermittelt wird.

Beispiel 5

Dieses Experiment zeigt die Spezifität der hemmenden/cytotoxischen Wirkung des OCF auf die Oligodendrocyten durch Medien, die durch sich regenerierende Fisch-Sehnerven konditioniert wurden.
Um zu untersuchen, ob die hemmende/cytotoxische Wirkung des CM ausschließlich die Oligodendrocyten betrifft, haben wir das CM-R an einer gemischten Population aus Astrocyten und Oligodendrocyten angewendet.
Figur 6 zeigt, daß die beobachtete Hemmwirkung nicht auf einer unspezfischen toxischen Wirkung beruht, sondern daß sie vielmehr für Oligodendrocyten selektiv ist. Kulturen einer gemischten Population von Gliazellen, dissoziiert aus den Gehirnen neugeborener Ratten, wurden entweder mit dem CM von sich regenerierenden Nerven oder mit dem CM von intakten Nerven behandelt (CM-R bzw. CM-N). Solche Bedingungen sind für die Differenzierung von Oligodendrocyten am günstigsten, ausgesät auf die einzellige Schicht, die durch die Astrocyten gebildet wird. Sogar unter diesen Bedingungen wurde die Hemmwirkung des CM-R deutlich, wohingegen das CM-N bei 72 und 96 Stunden in vitro nur eine geringe Hemmwirkung zeigte (Fig. 6b). Im Gegensatz zur Hemmwirkung des regenerativen CM auf Oligodendrocyten wurden die Überlebensrate und die Differenzierung von Nicht- Oligodendrocyten-Zellen, die in diesen gemischten Kulturen vorlagen und die mit dem Glia-Fibrillen-sauren-Protein (einem Marker für Astrocyten) angefärbt wurden, durch das CM-R nicht beeinflußt (Fig. 6a). Die augenscheinliche Dichte der gebildeten einzelligen Schicht der Astrocyten war in behandelten und unbehandelten Kulturen ähnlich (Fig. 6c gegenüber Fig. 6d). Die beobachetete Hemmwirkung des CM-R beruht somit nicht auf einer unspezifischen toxischen Wirkung, sondern ist vielmehr für die Oligodendrocyten-Familie selektiv (Fig. 6).

Beispiel 6

Diese Experimente zeigen, daß die Zahl der Oligodendrocyten und die Zahl der Makrophagen in einem umgekehrten Verhältnis zueinander stehen.
Im ersten Experiment wurden Gemeine Goldfische verwendet. Die konditionierten Medien wurden mit Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, 4 Sehnerven pro 300 ul Medium) hergestellt.
Der Vergleich der Zellkulturen, die nach Dissoziation von in Organkultur gehaltenen Nerven erhalten wurden, mit den Zellkulturen aus den wie üblich zerquetschten Nerven (d.h. OC- 3 und PC-3 in der Ratte und OC-2 und PC-2 im Fisch) könnte zeigen, ob das Verhalten dieser Zellen nach einer Verletzung eine Eigenschaft des Sehnerv selbst ist, oder ob es von einem externen Faktor, wie z.B. den aus dem Blut stammenden Monocyten, beeinflußt wird. Solche externen Faktoren wären in der Organkultur nicht vorhanden, denn hier wird der Sehnerv zum Zeitpunkt der Verletzung entnommen.
In Kulturen von dissoziierten Fisch-Sehnerven, die zwei Tage vor der Dissoziation in Organkultur gehalten wurden (OC- 2-Kulturen), wurde eine relativ hohe Zahl (65 Zellen pro Deckglas) an Oligodendrocyten (6D2-positive Zellen) festgestellt, jedoch wurden nur wenige Makrophagen gezählt. Im Gegensatz dazu entwickelten sich in Kulturen von dissoziierten Sehnerven, die zwei Tage nach ihrer Verletzung entnommen wurden (PC- 2-Kulturen), viele Makrophagen, jedoch nur wenige Oligodendrocyten. Die wenigen Oligodendrocyten, die in den Kulturen von zerquetschten Nerven (PC-2) gefunden wurden, waren viel kleiner und hatten viel kürzere Fortsätze als die Oligodendrocyten in den OC-2-Kulturen. Diese Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt.
Parallel zum Auftreten der Oligodendrocyten in den dissoziierten Zellen der Organkultur-Nerven lagen in diesen Kulturen überhaupt keine Makrophagen oder Makrophagen-ähnlichen Zellen vor. Sogar nach sieben Tagen wurde keine dieser Zellen gefunden (zu diesem Zeitpunkt erreichen diese Zellen in PC-2- Kulturen eine enorme Menge). Tabelle III Die Oligodendrocyten-Zahl in dissoziierten Kulturen von Fisch-Sehnerven, die zwei Tage vor der Entnahme und Dissoziation zerquetscht worden waren (PC-2-Kulturen), und in Kulturen von Fisch-Sehnerven, die zwei Tage vor der Dissoziation als Organkultur gehalten worden waren (OC-2-Kulturen)¹ Zahl der Oligodendrocyten Kultur ¹ In jedem Experiment wurden für die PC-2- und für die OC- 2-Kulturen jeweils die gleiche Anzahl von Fischen ungefähr der gleichen Größe verwendet. Auch wurden die Zellen am Ende auf eine gleiche Zahl von Deckgläsern ausgesät. Auf diese Weise wurden die auf das experimentelle Verfahren beruhenden Schwankungen auf ein Minimum begrenzt. Jedes Experiment wurde in dreifacher Ausführung durchgeführt. Die Gesamtzahl von Oligodendrocyten (6D2-positiven Zellen) auf den Deckgläsern wurde gezählt, wobei die wiedergegebenen Zahlen Durchschnittswerte aus drei Tests darstellen.
Anders als beim Fisch waren bei der Ratte die Zahlen der reifen Oligodendrocyten, die in den Kulturen von verletzten Nerven und in den Kulturen von Organkultur-Nerven festgestellt wurden, ähnlich. In Kulturen von Ratten-Sehnerven, die drei Tage in Organkultur gehalten wurden (CO-3-Kulturen), wurden drei Hauptpopulationen von Zellen gefunden. Ähnlich wie bei den Kulturen von zerquetschten Ratten-Sehnerven (Fig. 3) bestand ein großer Anteil dieser Kulturen aus Fortsätze-aufweisenden Oligodendrocyten, die nach 96 Stunden in Kultur durch Galc markiert wurden und die fast 40 % der gesamten Zellzahl ausmachten. Eine weitere große Zellpopulation (etwa 40 %) glich morphologisch den Makrophagen.
In den folgenden Experimenten wurden Sehnervenzellen des Goldfisches entweder in L-15-Leibowitz-Medium, angereichert mit 1 bis 2 % FCS, oder in L-15-Medium, angereichert mit den gleichen Zusätzen, die in der Raff-Modifikation des def inierten Mediums von Bottenstein und Sato verwendet wurden, plus 1 bis 2 % FCS, gezüchtet. Die Organkultur von Fisch-Sehnerven wurde in L-15-Medium durchgeführt, das mit den gleichen Zusätzen angereichert war, die in der Raff-Modifikation des def inierten Mediums von Bottenstein und Sato verwendet wurden, plus 1 bis 2 % FCS.
Das durch sich regenerierende Goldfisch-Sehnerven konditionierte Medium (CM) wurde ähnlich dem vorstehenden CM-R hergestellt, indem Segmente von Goldf isch-Sehnerven, die acht Tage nach dem Quetschen entfernt wurden, in L-15-Mendium inkubiert wurden (10 Goldfisch-Sehnerven pro 500 ul Medium, drei Stunden bei Raumtemperatur)
Die Makrophagen in den Fischkulturen umfaßten aus dem Blut stammende Makrophagen und ortsständige Makrophagen. Die zwei Typen von Makrophagen konnten durch morphologische Kriterien unterschieden werden: Die Blutmakrophagen zeigten typischerweise eine kreisförmige Gestalt, auch ihre Vesikel waren kreisförmig angeordnet; dagegen wiesen die ortsständigen Makrophagen eine unregelmäßige Gestalt auf, ihre Vesikel waren willkürlich über das ganze Cytoplasma verteilt. Außerdem waren Zellen, die an die aus dem Blut stammenden Makrophagen erinnerten (Fig. 7), in Kulturen von Sehnerven, die mehrere Tage nach einer Quetsch-Verletzung entnommen wurden, besonders reichlich vorhanden, dagegen waren sie in Kulturen von Sehnerven, die nach der Entnahme in Organkultur gehalten wurden, selten. Beide Makrophagen-Typen nahmen aktiv Myelintrümmer durch Phagocytose auf, was durch die 6D2-markierten Vakuolen auf vorher fixierten Zellen deutlich wurde (die Vakuolen wurden weder durch einen beliebigen anderen verwendeten Antikörper noch durch den zweiten Antikörper selbst markiert). Die augenscheinlich aus dem Blut stammenden Makrophagen wuchsen am besten, wenn das Medium mit 10 % FCS angereichert war, nach einer Woche in Kultur wuchsen sie so stark, daß sie im Vergleich zu den anderen Zellen in der Kultur sehr große Dimensionen annahmen (Fig. 7A). Fig. 7C zeigt einen Makrophagen, dessen Vakuolen durch den 6D2-Antikörper stark markiert sind. Diese Makrophagen wurden auch mit unspezifischer Esterase positiv angefärbt (Fig. 8 A bis C).
Die Zellen, die als ortsständige Makrophagen angesehen wurden, traten in vielen Formen auf, sie konnten in zwei Hauptgruppen eingeteilt werden: diejenigen mit einer geraden, Fibroblasten-ähnlichen Gestalt (Fig. 8F und Fig. 9E) und diejenigen, die runder und dicker waren und die manchmal Fortsätze aufwiesen (Fig. 9A bis D). Ein Kontakt zwischen den aus dem Blut stammenden Makrophagen und den ortsständigen Makrophagen (Fig. 9F - G) und zwischen beiden Makrophagen-Typen und den Oligodendrocyten (Fig. 9H - I) wurde festgestellt. Die Art dieses Kontaktes scheint ein Verschlingen von Zellen zu sein, wobei Oligodendrocyten anscheinend von beiden Makrophagen-Typen verschlungen werden. Diese ortsständigen Makrophagen waren auch gegenüber unspezifischer Esterase Positiv (Fig. 8D bis G).
Hinsichtlich des umgekehrten Verhältnisses, in dem die Oligodendrocyten-Zahl und die Makrophagen-Zahl zueinander stehen, und hinsichtlich der Wirkung, die das CM auf Ratten-Oligodendrocyten ausübt, haben wir untersucht, ob die löslichen Substanzen, die aus sich regenerierenden Fisch-Sehnerven stammen (d.h. -CM), für die Oligodendrocyten-Regulation nach der Verletzung verantwortlich sind. Wenn das CM zu Kulturen von dissoziierten Sehnerven zugesetzt wurde, die zwei bis drei Tage in Organkultur gehalten worden waren, nahm die Zahl der Oligodendrocyten ab. Wegen der niedrigen Zahl der Oligodendrocyten pro Deckglas wurde das Experiment mehrere Male wiederholt. Der statistische Test zeigte, daß die Wirkung des CM auf die Zahl der Oligodendrocyten signifikant ist. Diese Ergebnisse werden in Tabelle IV gezeigt. Tabelle IV Die Wirkung von Medium, konditioniert durch sich regenerierende Fisch-Sehnerven (CM), auf die Zahl der Oligodendrocyten in Fisch-Sehnerven-Kulturena Experiment-Nr.b Zahl der Oligodendrocytenc (± SD)d Kontrolle mit CM behandelte
a Die Sehnerven wurden herausgeschnitten und zwei Tage in Organkultur gehalten. Sodann wurden die Sehnerven dissoziiert und plattiert. In diesem Stadium wurde das konditionierte Medium von sich regenerierenden Fisch-Sehnerven (CM) zu den entsprechenden Vertiefungen zugegeben.
b Aufgrund der niedrigen Zellzahl wurde das Experiment mehrere Male wiederholt.
c Jedes Experiment wurde dreifach ausgeführt, davon ist jeweils der Mittelwert angegeben.
d Standardabweichung der drei Werte.
e Das CM wurde zugegeben, so daß eine Endkonzentration von 40 ug/ml erhalten wurde. Der Friedman-Rang-Test, der zur statistischen Auswertung der Ergebnisse verwendet wurde, ergab für den signifikanten Unterschied zwischen der Kontrolle und den mit CM behandelten Deckgläsern einen Wert von p = 0,0001.
Der Friedman-Block-Rang-Test, der zur Auswertung der Ergebnisse verwendet wurde, zeigte, daß der signifikante Unterschied zwischen der Kontrolle (unbehandelt) und den mit CM behandelten Deckgläsern 0,01 % entsprach (p = 0,0001). Wenn zu den Kulturen genauso ein Medium zugegeben wurde, das durch nicht-regenerierende (normale) Goldfisch-Sehnerven (CMN) konditioniert war, zeigte sich keine Wirkung auf die Zahl der Oligodendrocyten, wie in Tabelle V dargestellt. Tabelle V Die Wirkung von Medium, konditioniert durch normale Fisch-Sehnerven (CMN), auf die Zahl der Fisch- Oligodendrocyten im Vergleich zu Medium, konditioniert durch sich regenerierende Fisch-Sehnerven (CM) Zahl der Oligodendrocyten (± SD)b Kontrolle mit CM behandelte mit CMN behandelte
a Das Experiment wurde durchgeführt, wie in Tabelle I beschrieben.
b Standardabweichung von drei Werten.
c Jedes Experiment wurde dreifach ausgeführt, davon ist jeweils der Mittelwert angegeben.
d Das Experiment wurde zweifach ausgeführt. Daher ist keine SD angegeben.
e CM und CMN wurden so zugegeben, daß eine Endkonzentration von 40 ug/ml erhalten wurde.
Beispiel 7 Dieses Experiment zeigt die Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen OCF gegenüber einer Behandlung bei 56ºC Die Bestimmung von Galc-positiven Zellen in Kulturen von Gehirnzellen neugeborener Ratten, angereichert auf Oligodendrocyten, wird mittels ELISA durchgeführt, wie im Abschnitt "Experimentelle Verfahren" beschrieben. Wie aus Tabelle VI ersichtlich ist, tritt bei 56ºC eine Verminderung der Zahl von Galc-positiven Zellen auf, was durch die Abnahme der gemessenen optischen Dichte deutlich wird. Tabelle VI Temperatur-Empfindlichkeit des OCF, der im konditionierten Medium (CM) enthalten ist, bestimmt durch ELISA Durchschnittliche optische Dichte ± SD Konzentrationa Raumtemperatur
a Endkonzentration des CM.
b Die Kultur wird 30 Minuten bei 56ºC erhitzt.
c Das Experiment wird in vier Versuchen durchgeführt, davon ist der Mittelwert angegeben.

Beispiel 8

Dieses Experiment zeigt die Wirkung von konditioniertem Medium von Fisch-Blutmakrophagen auf Oligodendrocyten.
Eine Makrophagen-reiche Kultur wurde folgendermaßen hergestellt. Blut wurde aus Fischen gewonnen und in PBS, enthaltend Heparin, eingebracht und sodann über einen Hypaque-Ficoll-Gradienten geschichtet, der durch Mischen von 70,6 ml 12 % (Gew./Vol.) Ficoll (Sigma) mit 29,4 ml 32,8 % (Gew./Vol.) Natriumdiatriozat (Sigma) erhalten wurde. 10 ml Blut wurden in einem 15-ml-Polystyrol-Röhrchen über 5 ml Hypaque-Ficoll geschichtet. Die Röhrchen wurden 25 Minuten bei 10ºC bei 1000 g zentrifugiert. Die in der Zwischenschicht ("buffer coat") enthaltenen Lymphocyten und Monocyten wurden entfernt und einmal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden gewonnen und auf 20 x 106 Zellen pro ml eingestellt. Nach einer Stunde bei 16ºC wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen, um die nur schwach angehefteten und die nicht angehefteten Zellen zu entfernen. Anschließend wurde das L-15-Medium zu den Zellen zugefügt.
Das durch eine Makrophagen-reiche Kultur konditionierte Medium wurde hergestellt, indem die Zellen acht Stunden in einem serumfreien Medium oder in einem Lipopolysaccharid-enthaltenden Medium inkubiert wurden. Dieses konditionierte Medium wurde zu den Oligodendrocyten-Kulturen zugegeben und die Zahl der Oligodendrocyten durch Zählen von immunfluoreszierenden Galc-positiven Zellen bestimmt, wie im Abschnitt "Experimentelle Verfahren" beschrieben. Im ersten Experiment betrug die Zahl der Galc-positiven Zellen in Gegenwart des konditionierten Mediums der Makrophagen-reichen Kultur 420 im Vergleich zu 839 in der Kontrolle. Im zweiten Experiment lagen 24 Galc-positive Zellen im Vergleich zu 62 in der Kontrolle vor.

Beispiel 9

Arzneimittel

Der für Oligodendrocyten cytotoxische Faktor OCF der Erfindung ist als Wirkstoff in Arzneimitteln nützlich, die zur Regeneration von Nerven des Zentralnervensystems verwendet werden. Vorzugsweise wird er lokal auf das entsprechende Organ verabreicht.
Der OCF wird in einer Menge und Reinheit angewendet, die ausreichend ist, um die Regeneration von ZNS-Axonen in Säugetieren, insbesondere Menschen, zu erleichtern. Der OCF wird in einer beliebigen Art und Weise so verabreicht, daß der Faktor in die Nähe der verletzten Axone gelangt, die regeneriert werden sollen. Vorzugsweise wird der OCF in einem pharmazeutisch verträglichen flüssigen Träger direkt an dieser Stelle injiziert. In einer anderen Ausführungsform kann ein Implantat, das den OCF enthält, operativ eingepflanzt werden. Ein solches Implantat kann aus einem beliebigen Material, z.B. Nitrocellulose, bestehen, das den OCF wie ein Schwamm adsorbiert und ihn an der Stelle der Implantation langsam freisetzt. Der Fachmann wird noch andere Vorrichtungen zur Freisetzung kennen, auch diese sollen im Umfang der Erfindung enthalten sein.
Die OCF-Menge, die einem bestimmten Patienten verabreicht werden soll, hängt von verschiedenen Faktoren ab, wie z.B. der zu behandelnden Verletzung, der Stelle der verletzten Axone, die sich regenerieren sollen, und dem Zustand des Patienten. Typischerweise wird der OCF jedoch in einer Dosis von etwa 100 Einheiten als einzelne Injektion oder als mehrere Injektionen um die verletzte Stelle herum verabreicht, oder man läßt den OCF durch Nitrocellulose oder einen beliebigen anderen adsorbierbaren Träger aufsaugen. Die genauen Dosierungen können errechnet werden.
Der OCF wird vorzugsweise so früh wie möglich nach der Verletzung, die behandelt wird, verabreicht. Er wird somit vorzugsweise eher bei einer akuten Verletzung als bei einer chronischen Verletzung eingesetzt. Die Förderung der Regeneration gemäß der vorliegenden Erfindung wird immer schwieriger, je länger die Degeneration bereits gedauert hat.
Die Verabreichung des OCF alleine zeigt zwar gute Ergebnisse, eine solche Behandlung kann aber auch mit einer beliebigen Begleittherapie kombiniert werden, die seine Wirkung möglicherweise verstärken kann. Z.B. kann die Bestrahlüng der verletzten Stelle mit einem Niederenergie-Laser, vorzugsweise einem He-Ne-Laser (5 Minuten pro Tag, 35 mW) den posttraumatischen Prozess der Degeneration verzögern und dadurch die Narbenbildung aufschieben (Assia et al., Brain Res., 476 (1988), 205-212).
Gemäß der vorliegenden Erfindung können unzählige verschiedene Verletzungen behandelt werden, sie sind dem Fachmann geläufig. Ohne den Umfang der Patentansprüche beschränken zu wollen, können hier Rückenmarkverletzungen, Verletzungen der Sehnerven oder der Hörnerven usw. erwähnt werden. Auch Verletzungen der ZNS-Neuronen, die während Nervenoperationen auftreten oder durch Tumoren verursacht werden, können mit Hilfe der vorliegenden Erfindung behandelt werden.
Der OCF kann für die vorliegende Erfindung zusammen mit einem beliebigen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Excipienten formuliert werden. Der OCF kann als wäßrige Lösung zubereitet werden, z.B. als sterile wäßrige Lösung. Eine Lösung oder ein Pulver, enthaltend OCF, kann mit Hilfe eines Stabilisierungsmittels stabilisiert werden. Das Mittel wird an der Stelle der Verletzung in einer Menge verabreicht, die zur Förderung der Regereration von verletzten Axonen wirksam ist.

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Claims

1. Für Oligodendrocyten cytotoxischer Faktor aus niederen Wirbeltieren, die keine Säugetiere sind, mit den folgenden Eigenschaften:

i. er ist selektiv toxisch für Oligodendrocyten, nicht jedoch für andere Zellen, wie z.B. Typ-1-Astrocyten und Fibroblastenzellen;

ii. er verringert die Zahl der reifen Oligodendrocyten in Kulturen von verletzten Nerven von niederen Wirbeltieren und Säugetieren;

iii. er hemmt die Differenzierung von Stammzellen der Oligodendrocyten-Familie zu reifen Oligodendrocyten;

iv. er ist wasserlöslich;

v. er ist hitzeempfindlich, wobei er seine Aktivität bei Erhitzen auf 56ºC verliert;

vi. er ist empfindlich gegenüber Proteasen, wobei er seine Aktivität bei Spaltung durch Trypsin verliert; und

vii. er liegt in den konditionierten Medien von sich regenerierenden verletzten Nerven von niederen Wirbeltieren, die keine Säugetiere sind, wie z.B. Fischen, vor und kann daraus gereinigt werden, dagegen liegt er weder in den konditionierten Medien von intakten Nerven von niederen Wirbeltieren noch in den konditionierten Medien von verletzten oder intakten Nerven von Säugetieren vor.

2. Arzneimittel, das als Wirkstoff den für Oligodendrocyten cytotoxischen Faktor nach Anspruch 1 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.

3. Arzneimittel nach Anspruch 2 für die Induktion der Regeneration von Nerven von Säugetieren.

4. Arzneimittel nach Anspruch 2 für die Induktion der Regeneration von verletzten Nerven des Zentralnervensystems von Säugetieren.

5. Arzneimittel nach Anspruch 2, wobei das Arzneimittel so beschaffen ist, daß es an der Stelle der Verletzung in Säugetieren verabreicht werden kann.

6. Arzneimittel nach Anspruch 5, wobei die Verabreichung durch eine direkte Injektion an die Stelle der Verletzung in Säugetieren durchgeführt wird.

7. Arzneimittel nach Anspruch 5, wobei ein Implantat, das den OCF enthält, an der Stelle der Verletzung eingepflanzt wird.

8. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 3 bis 7, wobei das Säugetier ein Mensch ist.

9. Verfahren zur Herstellung eines Faktors nach Anspruch 1, umfassend die Auftrennung von konditionierten Medien von sich regenerierenden Nerven von niederen Wirbeltieren, die keine Säugetiere sind, mittels Trennverfahren, vorzugsweise Chromatographie.

10. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels nach einem der Ansprüche 2 bis 8, umfassend die Kombination des für Oligodendrocyten cytotoxischen Faktors nach Anspruch 1 und eines pharmazeutisch verträglichen Trägers.