DE10050540A1 - Verfahren zur flächigen Anregung von Strahlungsemission in einer Ebene - Google Patents

Abstract

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur flächigen Anregung von Strahlungsemission, bei der mehrere gepulste Laserstrahlen mit einer Fokussierungseinrichtung in ein Objekt fokussiert werden und in ihren Fokalvolumina durch nichtlineare Effekte Strahlungsemission anregen. Dabei sind die Fokalvolumina so eng benachbart angeordnet, dass jeder Punkt der zu untersuchenden Fläche im Anregungsvolumen mindestens einer der Strahlen liegt. Zur Vermeidung von Interferenzen zwischen den einzelnen Strahlen, durchlaufen die Strahlen das Objekt mit einer geringen Zeitverzögerung.

Description

Verfahren zur flächigen Anregung von Strahlungsemission in einer Ebene eines dreidimensionalen Objekts, umfassend eine Quelle für mehrere gepulste Laserstrahlen und einer Fokussicherungseinrichtung.

Stand der Technik

Lichtmikroskopie ist auch heute noch, obwohl es mit der Elektronenmikroskopie oder Nahfeldtechniken Verfahren mit besserer Ortsauflösung gibt, eine wichtige Untersuchungsmethode in Biologie und Medizin. Dies liegt an einigen wesentlichen Vorteilen, die diese Technik gegenüber anderen hat:

• - man kann lebende Objekte untersuchen,
• - es können Untersuchungen im Volumen und nicht nur an der Oberfläche dreidimensionaler Objekte durchgeführt werden,
• - durch den gezielten Einsatz von Farbstoffmarkierungen (z. B. Fusionsproteine [1]) und spektroskopischer Techniken bei der Detektion (z. B. FRET Nachweis [2], Lebensdauermessung [3]) wird eine hohe Selektivität erreicht,
• - die Sensitivität ist durch hoch empfindliche Detektoren sehr groß (bis hin zum Nachweis einzelner Moleküle)

Insbesondere die Techniken, bei denen das Objekt zur Emission von Strahlung angeregt wird, haben die beiden zuletzt genannten Eigenschaften. Die emittierte Strahlung kann u. a. Fluoreszenz, Raman- oder Rayleigh-Streuung, CARS oder frequenzvervielfachtes Beleuchtungslicht sein.

Die verschiedenen bekannten Lichtmikroskopietechniken bei denen das Objekt zur Emission von Strahung angeregt wird, werden im folgenden kurz beschrieben, um das der Erfindung zugrunde liegende Problem zu schildern.

Fluoreszenzmikroskopie

Hier wird das Objekt in seinem ganzen Volumen von Licht, das Substanzen, die natürlicherweise im Objekt vorkommen oder mit denen das Objekt angefärbt wurde, zur Fluoreszenz anregt, durchstrahlt. Die emittierte Fluoreszenz wird von einem Objektiv aufgenommen und abgebildet. Das Problem bei dieser Art der Mikroskopie ist, dass im ganzen Volumen des Objekts Fluoreszenzlicht angeregt und emittiert wird, dass aber nur eine dünne Ebene des Objekts scharf abgebildet wird. Die Fluoreszenz, die aus den anderen Teilen des Objekts emittiert wird, verteilt sich diffus über das Bild. Dies hat zur Folge, dass die Bilder nur geringen Kontrast haben bzw. feine Strukturen durch die diffuse Überstrahlung nicht zu erkennen sind.

Nur sehr dünne Objekte (in der Regel in Scheiben geschnitten) können hoch auflösend untersucht werden. Ein weiterer Nachteil ist, dass das gesamte Objekt mit Licht bestrahlt und auch durch das Licht geschädigt bzw. ausgebleicht wird. (siehe auch [])

Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie []

Hier wird die Fluoreszenz von einem Laserstrahl, der in das Objekt fokussiert wird, angeregt. Die Fluoreszenz wird von einem Objektiv aufgenommen und auf eine Lochblende abgebildet, hinter der sich der Lichtdetektor befindet. Die Lochblende ist dabei so angeordnet, dass nur der Teil des Fluoreszenzlichtes, der im Fokus des Lasertrahls erzeugt wird, die Lochblende passieren kann. Die übrige Fluoreszenz wird von der Lochblende aufgefangen. Durch diese Anordnung wird erreicht, dass nur Fluoreszenz aus einem dreidimensional eng begrenzten Volumen (nämlich dem Fokus) aufgenommen wird. Wird der Fokus in einer Ebene rasterartig durch das Objekt bewegt und dabei das jeweilige Signal gemessen, kann die abgerasterte Ebene mit hoher Auflösung untersucht werden. Neben dem Nachteil, dass auch hier ein großer Teil des Objekts zur Fluoreszenz angeregt und ausgebleicht wird, bzw. durch das Laserlicht geschädigt wird, liegt ein weiterer Nachteil dieser Technik darin, dass zur Aufnahme eines Bildes der Laserstrahl nacheinander auf alle Punkte der abzubildenen Ebene gelenkt werden muß. Dies führt dazu, dass zur Aufnahme eines Bildes eine erhebliche Zeit benötigt wird, die die Geschwindigkeit der Prozesse, die mit einem solchen Mikroskop noch untersucht werden können, limitiert.

Nichtlineare Laser-Scanning-Mikroskopie

Hier wird, ähnlich wie bei einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop, ein Laserstrahl in das Objekt fokussiert. Die Anregung der Emission erfolgt hier allerdings durch einen nichtlinearen optischen Prozess. Durch die Nichtlinearität der Anregung wird die Strahlungsemission auf das Fokalvolumen des Laserstrahles begrenzt. Eine weitere Einschränkung der Emission durch eine Lochblende o. ä. ist nicht nötig. Auch dieser Mikroskoptyp muß allerdings zur Erzeugung eines Bildes alle Punkte nacheinander aufnehmen, was mit den oben genannten Nachteilen verbunden ist.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, hochaufgelöste flächige Bilder aus dem Volumen dreidimensionaler Objekte mit hoher Bildaufnahmegeschwindigkeit zu erzeugen.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, dass mehrere, gepulste Laserstrahlen mittels der Fokussierungseinrichtung in das zu untersuchende Objekt fokussiert werden, und dass die Foki der Laserstrahlen nebeneinander in einer Ebene angeordnet sind, und dass die Laserstrahlen in den Volumina der Foki das Objekt durch nichtlineare Effekte zur Emission von Strahlung anregen, und dass jeder Punkt der zu untersuchenden Fläche im Anregungsvolumen mindestens einer der Laserstrahlen liegt, und dass die Laserstrahlen das Objekt mit einer Zeitverzögerung, die verhindert, dass die Strahlen im Objekt interferieren, durchlaufen.

Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls eine Anordnung zur insbesondere flächigen Anregung von Strahlungsemission in der Ebene eines dreidimensionalen Objekts mit Mitteln zur Erzeugung anderer gepulster Laserstrahlen und einer Fokussiereinrichtung, wobei vor der Fokussiereinrichtung eine Strahlteilereinrichtung zur Vervielfachung des Laserstrahls vorgesehen ist.

Weitere vorteilhafte Merkmale sind den Unteransprüchen zu entnehmen. Hieraus wird deutlich, dass viele Laserstrahlen in das Objekt fokussiert werden, wobei jeweils jeder der Strahlen in seinem Fokusvolumen das Objekt durch einen nichtlinearen optischen Prozess zur Emission von Strahlung anregen kann und die Abstände der Foki so klein sind, dass sich die Anregungsvolumina überlappen. Damit es nicht zur Vergrößerung der Anregungsvolumina der einzelnen Strahlen gegenüber dem Anregungs­ volumen nur eines Strahles kommt, durchlaufen die Strahlen das Objekt mit einer Zeitverzögerung, die verhindert, dass die einzelnen Strahlen im Objekt miteinander interferieren.

Die Zeitverzögerung zwischen den Strahlen bewirkt also, dass jeder Strahl das Objekt unabhängig von allen anderen Strahlen durchläuft und auch unabhängig von allen anderen Strahlen in seinem Fokusvolumen die Strahlungsemission anregt. Sind die Zeitverzögerungen sehr klein (z. B. 1 ps) können alle Strahlen das Objekt innerhalb der Zeit, die für die Emission der angeregten Strahlung charakteristisch ist (z. B. 1 ns für Fluoreszenz) durchlaufen. Man erhält also eine quasisimultane Anregung der Emission.

Jeder der Strahlen regt die Emission in einem dreidimensional begrenzten Volumen an. Durch die eng benachbarte, überlappende Anordnung der Anregungsvolumina in einer Ebene, kann die Emission in der kompletten Ebene angeregt werden.

Durch diese Art der Beleuchtung werden zweidimensionale Schnittbilder dreidimensional ausgedehnter Objekte gewonnen, ohne dass dazu die Laserstrahlen gerastert werden müssen. Durch schrittweises Verfahren der Ebene in Richtung ihrer Normalen, kann die dreidimensionale Struktur eines Objekts aufgenommen werden.

Es wird die gleiche Ortsauflösung erreicht wie bei gerasterter Beleuchtung mit einem Strahl.

Die Bildrate, die erreicht werden kann, ist durch die Wiederholrate der Laserpulse gegeben und kann bedeutend höher sein als bei Rastersystemen (MHz gegenüber einigen Hz). Dies stellt einen wesentlichen technischen Fortschritt dar, weil die Bildrate die maximale Geschwindigkeit der Prozesse, die noch beobachtet werden können, angibt.

Anhand der Zeichnungen wird die Erfindung beispielhaft näher erläutert.

Fig. 1 zeigt mehrere fokussierte Laserstrahlen und deren Anregungsvolumina;

Fig. 2 zeigt die Fokussierung mehrerer Laserstrahlen in das Objekt;

Fig. 3 zeigt schematisch das zeitliche Aufeinanderfolgen der Laserstrahlen;

Fig. 4 zeigt eine erste Variante zur Teilung des Laserstrahls;

Fig. 5 zeigt eine weitere Variante Izsur Teilung des Laserstrahls.

Fig. 1 zeigt mehrere fokussierte Laserstrahlen (1) und deren Anregungsvolumina (2). Die Anregung ist durch nichtlineare Prozesse auf die Fokalregion der Laserstrahlen begrenzt. Die Foki der Laserstrahlen liegen so nah aneinander, dass sich die Anregungsvolumina überlappen. Dadurch wird erreicht, dass ein zusammenhängender Teil der Fokalebene, in der sich die Anregungsvolumina befinden angeregt wird.

Fig. 2 zeigt die Fokussierung mehrerer Laserstrahlen (1) in das Objekt (4), wobei die Fokuspunkte und somit die Anregungsvolumina (2) eng benachbart sind. Dies wird erreicht indem die Winkel der Laserstrahlen vor der Fokussierungseinrichtung (3) klein gewählt werden.

Fig. 3 zeigt schematisch das zeitliche Aufeinanderfolgen der Laserstrahlen, die das Objekt alte zu unterschiedlichen Zeiten durchlaufen. Der zeitliche Verlauf der Laserpulse (6) ist an die Strahlachsen (5) der Laser gezeichnet, um zu verdeutlichen, dass sich die Laserpulse zu einem festen Zeitpunkt an verschiedenen Positionen auf den Strahlachsen befinden und somit auch in der Probe zeitlich nicht überlappen können.

Fig. 4 zeigt als Beispiel eine Möglichkeit für eine Realisierung des Verfahrens durch Teilung eines intensiven Laserstrahls. Der Laserstrahl (1) wird durch eine Serie teilreflektierender Strahlteilerspiegel (7a-7d) gelenkt. Die Reflexionsgrade der Strahlteiler sind so eingestellt, dass die reflektierten Teilstrahlen (8a-8d) identische Intensität besitzen. Dies erfordert unterschiedliche Reflexionsgrade der Strahlteiler, wobei der letzte der Strahlteiler (7d) ein hochreflektierender Spiegel ist. Die Teilstrahlen (8a-8d) werden auf eine Serie weiterer teilreflektierender Strahlteilerspiegel (9a-9d) gelenkt, die ihrerseits die Teilstrahlen in die endgültigen Teilstrahlen (10) zerlegen. Die Strahlteiler (7a-7d, 9a-9d) sind so angeordnet, dass die Winkel zwischen den Teilstrahlen so klein sind, dass sich die Foki der Teilstrahlen im Objekt (4) hinter der Fokussierungseinrichtung (3) überlappen und eine rechteckige Fläche in der Fokalebene vollständig ausgeleuchtet wird. Durch die Anordnung, bei der jeder der Teilstrahlen einen unterschiedlichen geometrischen Weg zurücklegt kann gewährleistet werden, dass gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren alle Teilstrahlen die Fokalebene zu unterschiedlichen Zeitpunkten durchtreten. Die Anzahl der Strahlteiler bestimmt die Größe der Fläche im Objekt, die quasi simultan angeregt wird.

Fig. 5 zeigt als Beispiel eine weitere Möglichkeit für eine Realisierung des Verfahrens durch Teilung eines intensiven Laserstrahls. Die Teilung des Laserstrahl erfolgt in der Strahlteileranordnung gemäß Patent 199 04 592.5-42. Aus dieser Literaturstelle ist bekannt, den Strahl zunächst an einer Strahlteilerplatte (10) in zwei Teilstrahlen gleicher Intensität zu zerlegen, die dann wiederum mittels der Spiegel (11, 12) auf die gleiche Strahlteilerplatte gelenkt werden, wobei jeder der Strahlen wiederum zerlegt wird, so dass vier Strahlen gleicher Intensität entstehen. Dieser Prozess wird wiederholt, bis genügend Teilstrahlen erzeugt sind. Die Einstellung der Spiegel ist so gewählt, dass sich die Strahlen in der Eintrittsebene des Objektives (17) überlappen. Die Foki der Teilstrahlen in der Probe liegen dann in einer Reihe. Eine weitere, um 90° gedrehte identische Anordnung von Strahlteilerplatte und Spiegeln erlaubt die weitere Teilung der Teilstrahlen, so dass eine flächige, insbesondere quadratische Anordnung von Foki in der Probe ensteht. Das heißt, dass durch eine vielfache Teilung des Laserstrahles eine entsprechend der Anzahl des geteilten Laserstrahles vergrößerte Fläche in der Probe ausgeleuchtet wird. Durch die Drehung der zweiten Strahlteilereinrichtung relativ zur ersten Strahlteilereinrichtung wird die zweite Dimension der Anregung, und damit eine flächige Anordnung von Foki ermöglicht. Die Strahlen müssen im Strahlteiler nebeneinander verlaufen, um eine Trennung zu ermöglichen. Die Anforderung des Überlappens benachbarter Foki erfordert bei einer Fokusgröße im Bereich von 0,5 µm und einem Objektiv mit einer Vergrößerung von 63 einen Winkel der Strahlen von etwa 0.01°. Bei einem typischen Strahldurchmesser von 3 mm muß dann der Strahl etwa 20 Meter von dem Strahlteiler zum Objektiv zurücklegen. Dies macht die Anordnung anfällig für Störungen, insbesondere in Form von Erschütterungen. Reduziert man allerdings den Strahldurchmesser vor dem Strahlteiler mittels eines telezentrischen Teleskopes 15 und weitet ihn vor dem Objektiv durch das Teleskop 16 wieder auf und verkleinert hierbei den Winkel zwischen den Strahlen, so kann der Strahlweg zum Objektiv 17 so stark reduziert werden, dass der Aufbau kompakt und robust wird. Die Reduzierung und Aufweitung des Strahldurchmessers um einen Faktor N vermindert den nötigen Strahlweg vom Mikroskop zum Objektiv um den Faktor 1/N². Dieser Faktor kommt wie folgt zustande: Die Reduzierung des Strahldurchmessers ermöglicht die Reduzierung des Abstandes der Strahlen im Strahlteiler, also einen kleineren Strahlteiler. Dieser kann dann näher an das Objekt gebracht werden.

Die Winkel der Strahlen zueinander sind von dem zweiten Teleskop um den Faktor N größer als der Sollwinkel im Objektiv. Dadurch kann der Strahlteiler zusätzlich an einem weiteren Faktor 1/N näher an das Objektiv angebracht werden. Am oben angeführten Beispiel bewirkt eine Reduzierung des Strahldurchmessers um den Faktor 4, also eine Reduzierung des Abstandes zum Objektiv von 20 Meter auf 1,25 Meter. Da die Apertur des Objektives für einen idealen Fokus voll ausgeleuchtet werden muß ist eine stärkere Aufweitung der Strahlen vor dem Objektiv in der Regel nötig, die zu einer weiteren Reduzierung des Strahlweges führt.

Bezugszeichenliste

1

Laserstrahl

2

Anregungsvolumen

3

Fokussierungseinrichtung

4

Objekt

5

Mittenlinie eines Laserstrahls

6

Zeitlicher Verlauf der Pulsintensität eines Laserstrahls

Claims (17)

1. Verfahren zur flächigen Anregung von Strahlungsemission in einer Ebene eines dreidimensionalen Objekts bestehend aus einer Quelle für mehrere, gepulste Laserstrahlen, einer Fokussierungseinrichtung dadurch gekennzeichnet, dass
mehrere, gepulste Laserstrahlen mittels der Fokussierungseinrichtung in das zu untersuchende Objekt fokussiert werden, und dass die Foki der Laserstrahlen nebeneinander in einer Ebene angeordnet sind, und dass die Laserstrahlen in den Volumina der Foki das Objekt durch nichtlineare Effekte zur Emission von Strahlung anregen, und
dass jeder Punkt der zu untersuchenden Fläche im Anregungsvolumen mindestens einer der Laserstrahlen liegt,
und dass die Laserstrahlen das Objekt mit einer Zeitverzögerung, die verhindert, dass die Strahlen im Objekt interferieren, durchlaufen.

2. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die emittierte Strahlung bildgebend, z. B. durch eine Kamera, registriert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass der zeitliche Verlauf der emittierten Strahlung registriert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die Laserstrahlen durch mehrere Laser erzeugt werden.

5. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die Laserstrahlen durch Aufteilung eines Laserstrahles erzeugt werden.

6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 5 dadurch gekennzeichnet, dass der oder die Laserstrahlen vor dem Strahlteiler durch ein Teleskop im Durchmesser verkleinerbar sind.

7. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die Winkel zwischen den Laserstrahlen vor der Fokussierungseinrichtung durch ein Teleskop verkleinert werden.

8. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die emittierte Strahlung Fluoreszenzlicht ist.

9. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die emittierte Strahlung durch Frequenzvervielfachung oder -mischung aus den Laserstrahlen im Objekt erzeugt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die emittierte Strahlung durch CARS (Coherent Anti-Stokes Raman Scattering) im Objekt erzeugt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die emittierte Strahlung durch stimulierte Raman-Streuung im Objekt erzeugt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die Fläche, die durch die Laserstrahlen beleuchtet wird, auf verschiedene Bereiche des Objekts gelenkt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die Fläche, die durch die Laserstrahlen beleuchtet wird, senkrecht zur Ebene durch das Objekt bewegt wird, um das Objekt dreidimensional zu untersuchen.

14. Anordnung zur insbesondere flächigen Anregung von Strahlungsemission in der Ebene eines dreidimensionalen Objekts mit Mitteln zur Erzeugung mehrerer gepulster Laserstrahlen und einer Fokussiereinrichtung gekennzeichnet, durch eine vor der Fokussiereinrichtung angeordnete Strahlteilereinrichtung zur Vervielfachung des Laserstrahles.

15. Anordnung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass vor der Strahlteilervorrichtung Mittel zur Reduzierung des Durchmessers des Laserstrahls vorgesehen sind.

16. Anordnung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass vor der Fokussiereinrichtung Mittel zur Vergrößerung des Durchmessers des Laserstrahls vorgesehen sind.

17. Anordnung nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zur Reduzierung und Vergrößerung des Durchmessers des Laserstrahles ein Teleskop ist.