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DE10047142A1 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung coryneformer Bakterien - Google Patents

Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung coryneformer Bakterien

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Publication number
DE10047142A1
DE10047142A1 DE10047142A DE10047142A DE10047142A1 DE 10047142 A1 DE10047142 A1 DE 10047142A1 DE 10047142 A DE10047142 A DE 10047142A DE 10047142 A DE10047142 A DE 10047142A DE 10047142 A1 DE10047142 A1 DE 10047142A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
pantothenic acid
gene
bacteria
zwa1
plasmid
Prior art date
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Withdrawn
Application number
DE10047142A
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English (en)
Inventor
Nicole Dusch
Georg Thierbach
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Evonik Operations GmbH
Original Assignee
Degussa GmbH
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Publication date
Application filed by Degussa GmbH filed Critical Degussa GmbH
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Priority to EP01965183A priority patent/EP1319083A1/de
Priority to US09/953,260 priority patent/US20020076770A1/en
Priority to US09/965,825 priority patent/US6911329B2/en
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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure durch Fermentation coryneformer Bakterien, bei dem man Bakterien einsetzt, in denen man die für das Zwa1-Genprodukt kodierende Nucleotidsequenz (zwa1-Gen) verstärkt, insbesondere überexprimiert, wobei man folgende Schritte ausführt: DOLLAR A a) Fermentation der D-Pantothensäure produzierenden Bakterien, in denen zumindest das für Zwa1-Genprodukt kodierende Gen verstärkt wird, DOLLAR A b) Anreicherung der D-Pantothensäure im Medium oder in den Zellen der Bakterien und DOLLAR A c) Isolieren der produzierten D-Pantothensäure.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung coryneformer Bakterien, in denen das zwa1-Gen verstärkt ist.
Stand der Technik
Die Pantothensäure stellt ein kommerziell bedeutendes Vitamin dar, das in der Kosmetik, der Humanmedizin, der pharmazeutischen Industrie, der Humanernährung und in der Tierernährung Anwendung findet.
Pantothensäure kann durch chemische Synthese oder biotechnisch durch Fermentation geeigneter Mikroorganismen in geeigneten Nährlösungen hergestellt werden. Bei der chemischen Synthese ist das DL-Pantolacton eine wichtige Zwischenstufe. Es wird in einem mehrstufigen Verfahren aus Formaldehyd, Isobutylaldehyd und Cyanid hergestellt. In weiteren Verfahrensschritten wird das racemische Gemisch aufgetrennt, D-Pantolacton mit β-Alanin kondensiert und so die gewünschte D-Pantothensäure erhalten.
Der Vorteil der fermentativen Herstellung durch Mikroorganismen liegt in der direkten Bildung der gewünschten stereoisomeren D-Form, die frei von L- Pantothensäure ist.
Verschiedene Arten von Bakterien, wie z. B. Escherichia coli, Arthrobacter ureafaciens, Corynebacterium erythrogenes, Brevibacterium ammoniagenes und auch Hefen, wie z. B. Debaromyces castellii, können wie in EP-A 0 493 060 gezeigt, in einer Nährlösung, die Glucose, DL- Pantoinsäure und β-Alanin enthält, D-Pantothensäure produzieren. EP-A 0 493 060 zeigt weiterhin, daß bei Escherichia coli (E. coli) durch Amplifikation von Pantothensäure-Biosynthesegenen aus E. coli, die auf den Plasmiden pFV3 und pFV5 enthalten sind, in einer Nährlösung, die Glucose, DL-Pantoinsäure und β-Alanin enthält, die Bildung von D-Pantothensäure verbessert wird.
EP-A 0 590 857 und US-Patent 5, 518,906 beschreiben von Escherichia coli Stamm IFO3547 abgeleitete Mutanten, wie FV5714, FV525, FV814, FV521, FV221, FV6051 und FV5069, die Resistenzen gegen verschiedene Antimetabolite, wie Salizylsäure, α-Ketobuttersäure, β-Hydroxyasparaginsäure, O-Methylthreonin und α-Ketoisovaleriansäure tragen. Sie produzieren in einer Nährlösung, die Glucose enthält, Pantoinsäure, und in einer Glucose- und β-Alanin-haltigen Nährlösung D-Pantothensäure. In EP-A 0 590 857 und US- Patent 5,518,906 wird weiterhin gezeigt, daß nach Amplifikation der Pantothensäure-Biosynthesegene, die auf dem Plasmid pFV31 enthalten sind, in den oben genannten Stämmen in glucose-haltigen Nährlösungen, die Produktion von D-Pantoinsäure und in einer Nährlösung, die Glucose und β-Alanin enthält, die Produktion von D-Pantothensäure verbessert wird.
Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure mit Hilfe von Corynebacterium glutamicum sind in der Literatur nur ansatzweise bekannt. So berichten Sahm und Eggeling ("Applied and Environmental Microbiology", 65(5), 1973-1979, (1999)) über den Einfluss der Überexpression der Gene panB und panC und Dusch et al. ("Applied and Environmental Microbiology", 65(4), 1530-1539, (1999)) über den Einfluß des Gens panD auf die Bildung der D-Pantothensäure.
Aufgabe der Erfindung
Die Erfinder haben sich die Aufgabe gestellt, neue Grundlagen für verbesserte Verfahren zur fermentativen Herstellung von Pantothensäure mit coryneformen Bakterien bereitzustellen.
Beschreibung der Erfindung
Wenn im Folgenden D-Pantothensäure oder Pantothensäure oder Pantothenat erwähnt werden, sind damit nicht nur die freien Säuren, sondern auch die Salze der D-Pantothensäure wie z. B. das Calcium-, Natrium-, Ammonium- oder Kaliumsalz gemeint.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung von coryneformen Bakterien, in denen mindestens die für das zwa1-Genprodukt kodierende Nucleotidsequenz (zwa1-Gen) verstärkt, insbesondere überexprimiert wird.
Die eingesetzten Stämme produzieren gegebenenfalls bereits vor der Verstärkung des zwa1-Gens D-Pantothensäure.
Bevorzugte Ausführungsformen finden sich in den Ansprüchen.
Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor verwendet oder ein Gen verwendet, das für ein entsprechendes Enzym (Protein) mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können D-Pantothensäure aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es handelt sich um Vertreter coryneformer Bakterien, insbesondere der Gattung Corynebacterium. Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum) zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu produzieren.
Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium glutamicum, sind beispielsweise die bekannten Wildtypstämme:
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte, D-Pantothensäure produzierende Mutanten, wie beispielsweise:
Corynebacterium glutamicum ATCC13032ΔilvA/pEC7panBC und
Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pND-D2.
Es wurde gefunden, daß coryneforme Bakterien nach Überexpression des für das zwa1-Genprodukt kodierenden zwa1-Gens in verbesserter Weise Pantothensäure produzieren.
Die Nukleotidsequenz des zwa1-Gens ist in der SEQ ID No 1 und die sich daraus ergebende Aminosäuresequenz des Enzymproteins in SEQ ID No 2 dargestellt.
Das in der SEQ ID No 1 beschriebene zwa1-Gen kann erfindungsgemäß verwendet werden. Weiterhin können Allele des zwa1-Gens verwendet werden, die sich aus der Degeneriertheit des genetischen Codes oder durch funktionsneutrale Sinnmutationen ("sense mutations") ergeben.
Zur Erzielung einer Verstärkung (z. B. Überexpression) erhöht man z. B. die Kopienzahl der entsprechenden Gene oder mutiert die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression im Verlaufe der fermentativen Pantothensäure-Bildung zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte liegen dabei entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vor oder sind im Chromosom integriert und amplifiziert. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammen­ setzung und Kulturführung erreicht werden.
Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al. ("Bio/Technology", 5, 137-146 (1987)), bei Guerrero et al. ("Gene", 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga ("Bio/Technology", 6, 428-430 (1988)), bei Eikmanns et al. ("Gene", 102, 93-98 (1991)), in EP 0 472 869, im US Patent 4,601,893, bei Schwarzer und Pühler ("Bio/Technology", 9, 84-87 (1991), bei Remscheid et al. ("Applied and Environmental Microbiology", 60, 126-132 (1994)), bei LaBarre et al. ("Journal of Bacteriology", 175, 1001-1007 (1993)), in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Malumbres et al. ("Gene", 134, 15-24 (1993)), in der japanischen Offenlegungsschrift JP-A-10-229891, bei Jensen und Hammer ("Biotechnology and Bioengineering", 58, 191-195 (1998)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.
Beispielhaft wurde das zwa1-Gen mit Hilfe von Plasmiden überexprimiert.
Als Plasmide eignen sich solche, die in coryneformen Bakterien repliziert werden. Zahlreiche bekannte Plasmidvektoren, wie z. B. pZ1 (Menkel et al., "Applied and Environmental Microbiology", (1989), 64: 549-554), pEKEx1 (Eikmanns et al., "Gene", 102: 93-98 (1991)), oder pHS2-1 (Sonnen et al., "Gene", 107: 69-74 (1991)) beruhen auf den kryptischen Plasmiden pHM1519, pBL1 oder pGA1. Andere Plasmidvektoren, wie z. B. solche, die auf pCG4 (US-A 4,489,160), oder pNG2 (Serwold-Davis et al., "FEMS Microbiology Letters", 66, 119-124 (1990)), oder pAG1 (US-A 5,158,891) beruhen, können in gleicher Weise verwendet werden.
Ein Beispiel für einen replikativen Plasmidvektor ist der in der Fig. 2 dargestellte Plasmidvektor pEC- T18mob2zwa1exp.
Weiterhin eignen sich solche Plasmidvektoren, mit Hilfe derer man das Verfahren der Genamplifikation durch Integration in das Chromosom anwenden kann, so wie es beispielsweise von Remscheid et al. ("Applied and Environmental Microbiology", 60, 126-132 (1994)) zur Duplikation bzw. Amplifikation des hom-thrB-Operons beschrieben wurde. Bei dieser Methode wird das vollständige Gen in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann.
Als Vektoren kommen bespielsweise pSUP301 (Simon et al., "Bio/Technology", 1, 784-791 (1983)), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al., "Gene", 145, 69-73 (1994)), pGEM-T (Promega corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). "Journal of Biological Chemistry", 269: 32678-84; US-A 5,487,993), pCR®Blunt (Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., "Journal of Molecular Biology", 234: 534-541 (1993)) oder pEM1 (Schrumpf et al. 1991, "Journal of Bacteriology", 173: 4510-4516) in Frage. Der Plasmidvektor, der das zu amplifizierende Gen enthält, wird anschließend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al. ("Applied and Environmental Microbiology", 60, 756-759 (1994)) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al. ("Applied Microbiology and Biotechnology", 29, 356-362 (1988)), Dunican und Shivnan ("Bio/Technology", 7, 1067-107C (1989)) und Tauch et al. ("FEMS Microbiological Letters", 123, 343-347 (1994)) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines "cross over"- Ereignisses enthält der resultierende Stamm mindestens zwei Kopien des betreffenden Gens.
Ein Beispiel für einen Integrationsvektor ist das in der Fig. 1 dargestellte Integrationsplasmid pCR2.1zwa1exp.
Zusätzlich kann es für die Produktion von Pantothensäure vorteilhaft sein, neben dem zwa1-Gen ein oder mehrere weitere, für Enzyme des Pantothensäure-Biosyntheseweges oder des Keto-Isovaleriansäure-Biosyntheseweges codierende Gene, wie z. B.:
  • - das für die Ketopantoat-Hydroxymethyltransferase kodierende panB-Gen (Sahm et al., "Applied and Environmental Microbiology", 65, 1973-1979 (1999)) oder
  • - das für die Pantothenat-Synthetase kodierende panC-Gen (Sahm et al., "Applied and Environmental Microbiology", 65, 1973-1979 (1999)) oder
  • - das für die Dihydroxysäure-Dehydratase kodierende ilvD- Gen
zu verstärken, insbesondere zu überexprimieren.
Weiterhin kann es für die Produktion von Pantothensäure vorteilhaft sein, neben der Überexpression des zwa1-Gens unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).
Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch(Zulaufverfahren)- oder repeated fed batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Pantothensäure-Produktion kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel ("Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik" (Gustav Fischer- Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas ("Bioreaktoren und periphere Einrichtungen" (Vieweg-Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Mikroorganismen genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedenener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.
Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate, wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose; Öle und Fette, wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett; Fettsäuren, wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure; Alkohole, wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren, wie z. B. Essigsäure, verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Stickstoffquelle können organische, stickstoffhaltige Verbindungen, wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Phosphorquelle können Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium­ haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten, wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe, wie Aminosäuren und Vitamine, zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden.
Dem Kulturmedium können überdies zur zusätzlichen Steigerung der Pantothensäure-Produktion Vorstufen der Pantothensäure, wie Aspartat, β-Alanin, Ketoisovalerat, Ketopantoinsäure oder Pantoinsäure, und gegebenenfalls deren Salze zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak oder saure Verbindungen, wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure, in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie z. B. Fettsäurepolyglykolester, eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, z. B. Antibiotika, hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff- haltige Gasmischungen, wie z. B. Luft, in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum an Pantothensäure gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Die Konzentration an gebildeter Pantothensäure kann mit bekannten chemischen (Velisek, "Chromatographic Science", 60, 515-560 (1992)) oder mikrobiologischen Verfahren, wie z. B. dem Lactobacillus-plantarum-Test (DIFCO MANUAL, 10th Edition, S. 1100-1102; Michigan, USA) bestimmt werden.
Folgender Mikroorganismus wurde am 19. Oktober 1999 als Reinkultur bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß Budapester Vertrag hinterlegt:
  • - Escherichia coli Top10F'/pCR2.1zwa1exp als DSM13115.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Zu diesem Zweck wurden Versuche mit dem Isoleucin- bedürftigen Stamm ATCC13032ΔilvA und dem Plasmid pND-D2 durchgeführt. Eine Reinkultur des Stammes ATCC13032ΔilvA ist am 21. Oktober 1998 als DSM12455 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen in Braunschweig (Deutschland) gemäss Budapester Vertrag hinterlegt worden. Das panD-Gen-haltige Plasmid pND-D2 ist bei Dusch et al. ("Applied and Environmental Microbiology", 65(4), 1530-1539 (1999)) beschrieben und in Form einer Reinkultur des Stammes Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pND-D2 am 05. Oktober 1998 als DSM12438 ebenfalls bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen in Braunschweig (Deutschland) gemäss Budapester Vertrag hinterlegt worden.
Beispiel 1 Herstellung einer genomischen Cosmid-Genbank aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
Chromosomale DNA aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 wurde wie bei Tauch et al. (1995, "Plasmid", 33: 168-179) beschrieben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Code no. 27-0913-02) partiell gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Code no. 1758250) dephosphoryliert. Die DNA des Cosmid-Vektors SuperCos1 (Wahl et al. (1987) "Proceedings of the National Academy of Sciences", USA, 84: 2160-2164), bezogen von der Firma Stratagene (La Jolla, USA, Produktbeschreibung SuperCos1 Cosmid Vektor Kit, Code no. 251301) wurde mit dem Restriktionsenzym XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung XbaI, Code no. 27-0948-02) gespalten und ebenfalls mit shrimp alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. Anschließend wurde die Cosmid-DNA mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Code no. 27-0868- 04) gespalten.
Die auf diese Weise behandelte Cosmid-DNA wurde mit der behandelten ATCC 13032-DNA gemischt und der Ansatz mit T4- DNA-Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Code no. 27-0870-04) behandelt. Das Ligationsgemisch wurde anschließend mit Hilfe des Gigapack II XL Packing-Extracts (Stratagene, La Jolla, USA, Produktbeschreibung Gigapack II XL Packing- Extract, Code no. 200217) in Phagen verpackt. Zur Infektion des E.-coli-Stammes NM554 (Raleigh et al. 1988, "Nucleic Acid Research", 16: 1563-1575) wurden die Zellen in 10 mM MgSO4 aufgenommen und mit einem Aliquot der Phagensuspension vermischt. Infektion und Titerung der Cosmidbank wurden wie bei Sambrook et al. (1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei die Zellen auf LB-Agar (Lennox, 1955, "Virology", 1: 190) mit 100 µg/ml Ampicillin ausplattiert wurden. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C wurden rekombinante Einzelklone selektioniert.
Beispiel 2 Isolierung und Sequenzierung des zwa1-Gens
Die Cosmid-DNA einer Einzelkolonie wurde mit dem Qiaprep Spin Miniprep-Kit (Product No. 27106, Qiagen, Hilden, Germany) nach Herstellerangaben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Product No. 27- 0913-02) partiell gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit shrimp alkalischer Phosphatase (Rache Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Product No. 1758250) dephosphoryliert. Nach gelelektrophoretischer Auftrennung erfolgte die Isolierung der Cosmidfragmente im Größenbereich von 1500 bis 2000 Basenpaaren mit dem QiaExII Gel Extraction-Kit (Product No. 20021, Qiagen, Hilden, Germany).
Die DNA des Sequenziervektors pZero-1, bezogen von der Firma Invitrogen (Groningen, Niederlande, Produktbeschreibung Zero Background Cloning-Kit, Product No. K2500-01) wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Product No. 27-0868-04) gespalten. Die Ligation der Cosmidfragmente in den Sequenziervektor pzero-1 wurde wie von Sambrook et al. (1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei das DNA- Gemisch mit T4-Ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) über Nacht inkubiert wurde. Dieses Ligationsgemisch wurde anschließend in den E.-coli-Stamm DH5αMCR (Grant, 1990, "Proceedings of the National Academy of Sciences", U.S.A., 87: 4645-4649) elektroporiert (Tauch et al. 1994, "FEMS Microbiol Letters", 123: 343-7) und auf LB- Agar (Lennox, 1955, "Virology", 1: 190) mit 50 µg/ml Zeocin ausplattiert.
Die Plasmidpräparation der rekombinanten Klone erfolgte mit dem Biorobot 9600 (Product No. 900200, Qiagen, Hilden, Deutschland). Die Sequenzierung erfolgte nach der Dideoxy- Kettenabbruch-Methode von Sanger et al. (1977, "Proceedings of the National Academy of Sciences", USA, 74: 5463-5467) mit Modifikationen nach Zimmermann et al. (1990, "Nucleic Acids Research", 18: 1067). Es wurde der "RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit" von PE Applied Biosystems (Product No. 403044, Weiterstadt, Deutschland) verwendet. Die gelelektrophoretische Auftrennung und Analyse der Sequenzierreaktion erfolgte in einem "Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid"-Gel (29 : 1) (Product No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Germany) mit dem "ABI Prism 377"- Sequenziergerät von PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Deutschland).
Die erhaltenen Roh-Sequenzdaten wurden anschließend unter Anwendung des Staden-Programpakets (1986, "Nucleic Acids Research", 14: 217-231) Version 97-0 prozessiert. Die Einzelsequenzen der pZero1-Derivate wurden zu einem zusammenhängenden Contig assembliert. Die computergestützte Kodierbereichsanalyse wurden mit dem Programm XNIP (Staden, 1986, "Nucleic Acids Research", 14: 217-231) angefertigt.
Die erhaltene Nukleotidsequenz des zwa1-Gens ist in SEQ ID NO 1 dargelegt. Die Analyse der Nukleotidsequenz ergab ein offenes Leseraster von 597 Basenpaaren, welches als zwa1- Gen bezeichnet wurde. Das zwa1-Gen kodiert für ein Polypeptid von 199 Aminosäuren, welches in SEQ ID NO 2 dargelegt ist.
Beispiel 3 Herstellung eines Integrationsvektors zur Überexpression des zwa1-Gens
Aus dem Stamm ATCC 13032 wurde nach der Methode von Eikmanns et al. ("Microbiology", 140: 1817-1828 (1994)) chromosomale DNA isoliert. Aufgrund der aus Beispiel 2 für C. glutamicum bekannten Sequenz des zwa1-Gens wurden die folgenden Oligonukleotide für die Polymerase-Kettenreaktion ausgewählt:
zwa1-d1:
5' TCA CA CCG ATG ATT CAG GC 3'
zwa1-d2:
5' AGA TTT AGC CGA CGA AAG CG 3'.
Die dargestellten Primer wurden von der Firma MWG Biotech (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert und nach der Standard-PCR-Methode von Innis et al. ("PCR protocols. A guide to methods and applications", 1990, Academic Press) mit Pwo-Polymerase der Firma Boehringer die PCR-Reaktion durchgeführt. Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion wurde ein ca. 1,0 kb großes DNA-Fragment isoliert, welches das zwa1-Gen trägt.
Das amplifizierte DNA-Fragment wurde mit dem TOPO TA Cloning-Kit der Firma Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA; Katalog Nummer K4500-01) in den Vektor pCR2.1-TOPO (Mead at al. (1991) "Bio/Technology", 9: 657-663) ligiert. Anschließend wurde der E.-coli-Stamm Top10F' mit dem Ligationsansatz (Hanahan, In: "DNA cloning. A practical approach". Vol.I. IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA) elektroporiert. Die Selektion von Plasmid-tragenden Zellen erfolgte durch Ausplattieren des Transformationsansatzes auf LB Agar (Sambrook et al., "Molecular cloning: a laboratory manual". 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.), der mit 25 mg/l Kanamycin supplementiert worden war. Plasmid-DNA wurde aus einer Transformante mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep-Kit der Firma Qiagen isoliert und durch Restriktion mit dem Restriktionsenzym EcoRI und anschließender Agarosegel- Elektrophorese (0,8%) überprüft. Das Plasmid wurde pCR2.1zwa1exp genannt und ist in Fig. 1 dargestellt.
Beispiel 4 Herstellung eines replikativen Plasmids zur Expression des zwa1-Gens 4.1. Herstellung des Shuttle-Vektors pEC-T18mob2
Nach dem Stand der Technik wurde der E.-coli-C.- glutamicum-Shuttle-Vektor pEC-T18mob2 konstruiert. Der Vektor enthält die Replikationsregion rep des Plasmids pGA1 einschließlich des Replikationseffectors per (US-A- 5,175,108; Nesvera et al., "Journal of Bacteriology", 179, 1525-1532 (1997)), das Tetracyclinresistenz-vermittelnde tetA(Z)-Gen des Plasmids pAG1 (US-A-5,158,891; Genbank- Eintrag beim National Center for Biotechnology-Information (NCBI, Bethesda, MD, USA) mit der Accession Number AF121000), die Replikationsregion oriV des Plasmids pMB1 (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium an Quantitative Biology 43, 77-90 (1979)), das lacZα-Genfragment einschließlich des lac-Promotors und einer Mehrfachklonierschnittstelle ("multiple cloning site", mcs) (Norrander et al. "Gene", 26, 101-106 (1983)) und die mob- Region des Plasmids RP4 (Simon et al., (1983) "Bio/Technology", 1: 784-791).
Der konstruierte Vektor wurde in den E.-coli-Stamm DH5α (Hanahan, In: "DNA Cloning. A Practical Approach", Vol. I, IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA) transformiert. Die Selektion von Plasmid-tragenden Zellen erfolgte durch Ausplattieren des Transformationsansatzes auf LB-Agar (Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.), der mit 5 mg/l Tetracyclin supplementiert worden war. Plasmid-DNA wurde aus einer Transformante mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep-Kit der Firma Qiagen isoliert und durch Restriktion mit dem Restriktionsenzym EcoRI und HindIII anschließender Agarosegel-Elektrophorese (0,8%) überprüft. Das Plasmid wurde pEC-T18mob2 genannt und ist in Fig. 3 dargestellt.
Eine Reinkultur des Stammes DH5α/pEC-T18mob2 wurde am 20. Januar 2000 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) als DSM 12344 gemäß Budapester Vertrag hinterlegt.
4.2. Klonierung von zwa1 in den Shuttle-Vektor pEC-T18mob2
Als Vektor wurde der in Beispiel 4.1. beschriebene E.-coli- C.-glutamicum-Shuttle-Vektor pEC-T18mob2 verwendet. DNA dieses Plasmids wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI vollständig gespalten und anschließend mit shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Product No. 1758250) dephosphoryliert. Für das Insert wurde DNA des Plasmids pCR2.1zwa1exp nach der üblichen Methode aus einer Transformante isoliert, mit der Restriktionsendonuklease EcoRI verdaut und in den gespaltenen Vektor pEC-T18mob2 ligiert. Nach der Ligation wurde der Ansatz in den Stamm E. coli DH5αmcr elektroporiert. Die Selektion erfolgte auf LB-Agarplatten mit 5 µg/ml Tetracyclin. Plasmid-DNA aus einer so erhaltenen Transformante wurde isoliert, mit der Restriktionsendonuklease EcoRI gespalten, und die Fragmente wurden anschließend durch Agarose-Gelelektrophorese überprüft. Das so konstruierte Plasmid wurde als pEC- T18mob2zwa1exp bezeichnet und ist in Fig. 2 dargestellt.
Beispiel 5 Herstellung des Stammes ATCC13032ΔilvA/pND-D2, pEC- T18mob2zwa1exp
Nach Elektroporation (Tauch et.al., 1994, "FEMS Microbiological Letters", 123: 343-347) des Plasmids pND-D2 in den C.-glutamicum-Stamm ATCC13032ΔilvA und anschließender Selektion auf LB-Agar (Lennox, 1955, "Virology", 1: 190-206), der mit 25 µg/ml Kanamycin supplementiert worden war, wurde der Stamm ATCC13032ΔilvA/pND-D2 erhalten.
Nach Elektroporation des Plasmids pEC-T18mob2zwa1exp (Beispiel 4) in den C.-glutamicum-Stamm ATCC13032ΔilvA/pND- D2 und anschließender Selektion auf LB-Agar, der mit 25 µg/ml Kanamycin und 10 µg/ml Tetracyclin supplementiert worden war, wurde der Stamm ATCC13032ΔilvA/pND-D2, pEC- T18mob2zwa1exp erhalten.
Beispiel 6 Herstellung von Pantothensäure
Die Bildung von Pantothenat durch die C.-glutamicum-Stämme ATCC13032ΔilvA/pND-D2 und ATC13032ΔilvA/pND-D2, pEC- T18mob2zwa1exp wurde in Medium CGXII (Keilhauer et al., 1993, "Journal of Bacteriology", 175: 5595-5603; Tabelle 1) geprüft, das mit 25 µg/ml Kanamycin, 2 mM Isoleucin und im Falle des Stammes ATCC13032ΔilvA/pND-D2, pEC-T18mob2zwa1exp mit zusätzlich 10 µg/ml Tetracyclin supplementiert worden war.
Dieses Medium wird im Folgenden als C.-glutamicum- Testmedium bezeichnet. Je 50 ml frisch angesetztes C.- glutamicum-Testmedium wurden aus einer 16 Stunden alten Vorkultur des gleichen Mediums dergestalt angeimpft, daß die optische Dichte der Kultursuspension (o. D.580) bei Inkubationsbeginn 0,1 betrug. Die Kulturen wurden bei 30°C und 130 U/min bebrütet. Nach 5-stündiger Inkubation wurde IPTG (Isopropyl β-D-thiogalactosid) in einer Endkonzentration von 1 mM hinzugefügt. Nach 24-stündiger Inkubation wurde die optische Dichte (o. D.580) der Kultur bestimmt und anschließend die Zellen durch 10-minütige Zentrifugation bei 5000 g entfernt und der Überstand sterilfiltriert.
Zur Bestimmung der optischen Dichte wurde ein Novaspec-II- Photometer der Firma Pharmacia (Freiburg, Deutschland) bei einer Messwellenlänge von 580 nm eingesetzt.
Die Quantifizierung des D-Pantothenats im Kulturüberstand erfolgte mittels Lactobacillus plantarum ATCC 8014 nach Angaben des Handbuchs der Firma DIFCO (DIFCO MANUAL, 10th Edition, S. 1100-1102; Michigan, USA). Für die Kalibrierung wurde das Hemicalciumsalz von Pantothenat der Firma Sigma (Deisenhofen, Deutschland) verwendet.
Das Ergebnis ist in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 1
Tabelle 2
Folgende Abbildungen sind beigefügt:
Fig. 1: Karte des Plasmids pCR2.1zwa1exp;
Fig. 2: Karte des Plasmids pEC-T18mob2zwa1exp;
Fig. 3: Karte des Plasmids pEC-T18mob2.
Bei der Angabe der Basenpaarzahlen handelt es sich um Näherungswerte, die im Rahmen der Reproduzierbarkeit von Messungen erhalten werden.
Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben folgende Bedeutung. Tet Resistenzgen für Tetracyclin
KmR Resistenzgen für Kanamycin
ApR Resistenzgen für Ampicillin
ColE1 ori Replikationsursprung ColE1
oriV Plasmidkodierter Replikationsursprung von E. coli
f1 ori Replikationsursprung des Phagen f1
RP4mob mob-Region zur Mobilisierung des Plasmids
rep Plasmidkodierter Replikationsursprung aus C. glutamicum Plasmid pGA1
per Gen zur Kontrolle der Kopienzahl aus pGA1
lacZ-alpha lacZα-Genfragment (N-Terminus) des β-Galactosidase-Gens
'lacZ-alpha 3'Ende des lacZα-Genfragments
lacZ-alpha' 5'Ende des lacZα-Genfragments
zwa1 zwa1-Gen aus C. glutamicum ATCC13032
BamHI Schnittstelle des Restriktionsenzyms BamHI
EcoRI Schnittstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
HindIII Schnittstelle des Restriktionsenzyms HindIII
KpnI Schnittstelle des Restriktionsenzyms KpnI
PstI Schnittstelle des Restriktionsenzyms PstI
PvuI Schnittstelle des Restriktionsenzyms PvuI
SalI Schnittstelle des Restriktionsenzyms SalI
SacI Schnittstelle des Restriktionsenzyms SacI
SmaI Schnittstelle des Restriktionsenzyms SmaI
SphI Schnittstelle des Restriktionsenzyms SphI
XbaI Schnittstelle des Restriktionsenzyms XbaI
XhoI Schnittstelle des Restriktionsenzyms XhoI
SEQUENZPROTOKOLL

Claims (13)

1. Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure durch Fermentation coryneformer Bakterien, dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterien einsetzt, in denen man die für die zwa1-Genprodukt kodierende Nucleotidsequenz (zwa1) verstärkt, insbesondere überexprimiert.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterien einsetzt, in denen man zusätzlich ein oder mehrere weitere(s) Gen(e) des Biosyntheseweges der D-Pantothensäure verstärkt.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterien einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung der D-Pantothensäure verringern.
4. Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man einen mit einem Plasmidvektor transformierten Stamm einsetzt und der Plasmidvektor die für die zwa1-Genprodukt kodierende Nucleotidsequenz trägt.
5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man mit dem Plasmid pCR2.1zwa1exp, dargestellt in Fig. 1, transformierte Bakterien einsetzt.
6. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man mit dem Plasmid pEC-T18mob2zwa1exp, dargestellt in Fig. 2, transformierte Bakterien einsetzt.
7. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man gleichzeitig das für die Ketopantoat- Hydroxymethyltransferase kodierende panB-Gen verstärkt.
8. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man gleichzeitig das für die Pantothenat- Synthetase kodierende panC-Gen verstärkt.
9. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man gleichzeitig das für die Dihydroxysäure- Dehydratase kodierende ilvD-Gen verstärkt.
10. Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die genannten Gene in coryneformen Bakterien verstärkt, die bereits D-Pantothensäure produzieren.
11. Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Schritte durchführt:
  • a) Fermentation der D-Pantothensäure produzierenden Bakterien, in denen zumindest das für das zwa1-Genprodukt kodierende Gen verstärkt wird;
  • b) Anreicherung der D-Pantothensäure im Medium oder in den Zellen der Bakterien und
  • c) Isolieren der produzierten D-Pantothensäure.
12. Coryneforme Bakterien, in denen die für das zwa1- Genprodukt kodierenden Nucleotidsequenzen (zwa1-Gen) verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.
13. Escherichia coli Top10F'/pCR2.1zwa1exp, hinterlegt unter der Nummer DSM13115 bei der DSMZ, Braunschweig, Deutschland.
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