DE10044325A1

DE10044325A1 - Neue MMP-2-Derivate als Inhibitoren des Integrins avbeta3

Info

Publication number: DE10044325A1
Application number: DE10044325A
Authority: DE
Inventors: Alfred Jonczyk; Beate Diefenbach; Ulrich Groth; Gunther Zischinsky
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 2000-09-07
Filing date: 2000-09-07
Publication date: 2002-03-21
Also published as: CA2421283A1; WO2002020566A3; EP1315804A2; WO2002020566A2; JP2004510710A; AU2002212172A1

Abstract

Die Erfindung beschreibt neuartige Verbindungen der Formel I, welche als Liganden des Integrins alpha¶v¶beta¶3¶ biologisch wirksam sind DOLLAR A X-Y-Z DOLLAR A worin DOLLAR A X H, Acyl oder ein Peptidfragment mit 1 bis 20 Aminosäuren, ausgewählt aus der Liste der natürlich vorkommenden Aminosäuren, DOLLAR A Y ein Peptidfragment ausgewählt aus dem Sequenzbereich 466-660 von humanem Pro-MMP-2, DOLLAR A Z OH, NH¶2¶, NHA¶2¶, NA¶2¶ oder ein Peptidfragment mit 1 bis 20 Aminosäuren, DOLLAR A ausgewählt aus der Liste der natürlich vorkommenden Aminosäuren, DOLLAR A A Alkyl mit 1-10 C-Atomen, DOLLAR A Acyl Alkanoyl mit 1-10 C-Atomen, DOLLAR A bedeuten, DOLLAR A wobei die primären Aminogruppen auch mit konventionellen Aminoschutzgruppen versehen sein können, DOLLAR A sowie deren physiologisch unbedenklichen Salze und Solvate.

Description

Die Erfindung betrifft neuartige Verbindungen der Formel I

X-Y-Z I

worin
X H, Acyl oder ein Peptidfragment mit 1 bis 20 Aminosäuren, ausgewählt aus der Liste der natürlich vorkommenden Aminosäuren,
Y ein Peptidfragment ausgewählt aus dem Sequenzbereich 466-660 von humanem Pro-MMP-2,
Z OH, NH₂, NHA, NA₂ oder ein Peptidfragment mit 1 bis 20 Aminosäuren, ausgewählt aus der Liste der natürlich vorkommenden Aminosäuren,
A Alkyl mit 1-10 C-Atomen,
Acyl Alkanoyl mit 1-10 C-Atomen,
bedeuten,
wobei die primären Aminogruppen auch mit konventionellen Amino schutzgruppen versehen sein können,
sowie deren physiologisch unbedenklichen Salze und Solvate.

Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, neue Verbindungen mit wertvol len Eigenschaften aufzufinden, insbesondere solche, die zur Herstellung von Arzneimitteln verwendet werden können.

Es wurde gefunden, daß die Verbindungen der Formel I und ihre Salze bei guter Verträglichkeit sehr wertvolle pharmakologische Eigenschaften besit zen. Vor allem wirken sie als Integrin-Inhibitoren, wobei sie insbesondere die Wechselwirkungen der α_v-Integrin-Rezeptoren mit Liganden, z. B. MMP-2, hemmen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind Liganden insbesondere des Integrins α_vβ₃, die nicht die Sequenz RGD enthalten und aus dem C- terminalen Fragment PEX der Matrix-Metalloproteinase 2 (MMP-2) abgeleitet wurden.

Literaturbekannt ist die Bindung von PEX an das Integrin α_vβ₃.

MMP-2 ist ein Matrix-abbauendes Enzym, das die Zellwanderung in invasiven Prozessen erleichert, wie z. B. bei Tumormetastasierung und Angiogenese.

Es gibt zahlreiche Reviews zu Matrix-Metallo-Proteinasen, wie z. B. Birkedahl-Hansen H. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 4, 197-250 (1993), Borkakoti N. Curr. Opin. Drug Descovery & Development 2, 449-462 (1999), Whittaker M. et al. Chem. Rev. 99, 2735-2776 (1999), Stetler-Stevenson W.G.J. Clin. Invest. 103, 1237-1241 (1999), Siletti S. & Cheresh D.A. Fibrinolysis & Proteolysis 13, 226-238 (1999), Kleiner-DE & Stetler- Stevenson-WG in Cancer-Chemother-Pharmacol. 1999; 43 Suppl: S. 42-51.

MMPs werden als inaktive Proenzyme ("latentes Enzym", "Zymogen") sekretiert, so ist auch enzymatisch inaktives Pro-MMP-2 bekannt: Woessner-JF Jr FASEB-J. 1991 May; 5(8): 2145-54.

Verschiedene Arten der Aktivierung von Pro-MMP-2 zu MMP-2 sind bekannt (autokatalytische, chemische, enzymatische). Die Aktivierung durch Tumorzellen konnte mit Hilfe von Osteopontin, Bone Sialoprotein oder RGD-Peptiden erreicht werden. Hierbei wird die Rolle des C- Terminus von MMP-2 und die Formation des trimeren Komplexes aus MT1-MMP, TIMP-2 und Pro-MMP-2 mitdiskutiert: Teti-A et al. Int-J-Cancer. 1998 Jul 3; 77(1): 82-93.

MMPs ermöglichen Tumorzellinvasion und Metastasierung durch mindestens 3 Mechanismen. Sie beseitigen die physikalische Barriere durch Abbau der ECM, sie modulieren Zelladhäsion, da die Zellen an ECM anhaften müssen, aber Bindungen zur ECM wieder brechen müssen, und sie produzieren andere biologisch aktive Proteinfragmente durch Abbau von Proteinen.

Die Inhibierung von α_vβ₃ durch den Antikörper LM609 induzierte die Aktivierung von Pro-MMP-2 von humanen Rhabdomyosarcomazellen: Kubota-S. et al. Int-J-Cancer. 1997 Jan 6; 70(1): 106-11.

Die Expression von Integrinen moduliert die Expression und Sekretion von MMP-2 und das invasive Verhalten von Tumorzellen, wie von Seftor-RE. et al. in Cancer-Res. 1993 Jul 15; 53(14): 3411-5 beschrieben.

Zur Relevanz von MMPs gibt es unterschiedliche Beiträge. Eine Auswahl zeigt die Bedeutung in der Embryonalentwicklung, Kinoh-H. et al., J-Cell- Sci. 1996 May; 109 (Pt 5): 953-9; bei Zähnen: Heikinheimo-K; Salo-T J- Dent-Res. 1995 May; 74(5): 1226-34; und bei der Entwicklung der Niere: Kanwar-YS; et al. Am-J-Physiol. 1999 Dec; 277(6 Pt 2): F934-47.

Bei invasiven Zellen haben "Invadopodien" und "Lamellipodien" an der Wanderungsfront, die den Kontakt zur darunterliegenden extrazellulären Matrix (ECM) vermitteln, unterschiedliche Expression und Lokalisation von MT1-MMP, MMP-2, und TIMP-2. An den Invadopodien sind Pro-MMP-2 und MT1-MMP für den Abbau der ECM zuständig, da hier MMP- Aktivierung erfolgt. Obwohl Lamellipodien ähnlich aufgebaut sind, erfolgt hier kein ECM-Abau, da sie an der zellulären Peripherie den zirkulierenden Inhibitoren wie TIMP-2 leicht zugänglich sind. Es wurde von Chen-WT et al. in Ann-N-Y-Acad-Sci. 1999 Jun 30; 878: 361-71 gezeigt, daß TIMP-2 mit MMP-2 und MT1-MMP an Lamellipodien aber nicht an Invadopodien kolokalisiert ist. Ähnliches wird von den Autoren Nakahara-H; et al. Proc- Natl-Acad-Sci-U-S-A. 1997 Jul 22; 94(15): 7959-64 berichtet.

MMP-2 kommt in normalen und erkrankten Gelenken des Menschen vor: Chubinskaya-S et al. Lab-Invest. 1999 Dec; 79(12): 1669-77 und wird in der Synovialmembran bei Rheumatoider Arthritis von Konttinen-Y et al. Ann-Rheum-Dis. 1999 Nov; 58(11): 691-7 diskutiert.

Die klinische Relevanz von MMP-2 als prognostischer Marker beim Cervix- Karzinom wurde von Davidson-B et al. in Gynecol-Oncol. 1999 Jun; 73(3): 372-82 aufgezeigt.

MMP-2 und seine Aktivierung spielt eine Rolle bei der Neointimabildung bei Restenose: Wang-H; Keiser-JA J-Vasc-Res. 1998 Jan-Feb; 35(1): 45-54.

MMP-2 moduliert Gliomzellanhaftung und Migration: Deryugina-El; et al. J- Cell-Sci. 1997 Oct; 110 (Pt 19): 2473-82.

Besondere Wirksamkeit zeigen die Verbindungen im Fall der Integrine α_vβ₃ und α_vβ₅. Ganz besonders wirksam sind die Verbindungen als Adhäsionsrezeptor-Antagonisten für den Rezeptor α_vβ₃.

Diese Wirkung kann z. B. nach der Methode nachgewiesen werden, wie sie von B. Diefenbach et al. in Biology of Vitronectins and Their Receptors, Eds. KT Preissner et al., Exerpta Medica, lnterntl. Congress Series 1042, Elsevier Sci. Publishers 1993, p. 149-156 beschrieben wird.

Die Bindung an den Vitronektin-Rezeptor α_vβ₃ wurde für einige erfindungs gemäße Peptide experimentell bewiesen.

B. Felding-Habermann und D. A. Cheresh beschreiben in Curr. Opin. Cell. Biol. 5, 864 (1993) die Bedeutungen der Integrine als Adhäsionsrezep toren für die unterschiedlichsten Phänomene und Krankheitsbilder, speziell in Bezug auf den Rezeptor α_vβ₃.

Die Abhängigkeit der Entstehung von Angiogenese von der Wechsel wirkung zwischen vaskulären Integrinen und extrazellulären Matrix proteinen ist von P.C. Brooks, R.A. Clark und D.A. Cheresh in Science 264, 569-71 (1994) beschrieben.

Die Möglichkeit der Inhibierung dieser Wechselwirkung und damit zum Einleiten von Apoptose (programmierter Zelltod) angiogener vaskulärer Zellen durch ein cyclisches Peptid ist von P.C. Brooks, A.M. Montgomery, M. Rosenfeld, R.A. Reisfeld, T.-Hu, G. Klier und D.A. Cheresh in Cell 79, 1157-64 (1994) beschrieben.

Der experimentelle Nachweis, daß auch die erfindungsgemäßen Verbin dungen die Anheftung von lebenden Zellen auf den entsprechenden Matrixproteinen verhindern und dementsprechend auch die Anheftung von Tumorzellen an Matrixproteine verhindern, kann in einem Zelladhäsions test erbracht werden, der analog der Methode von F. Mitjans et al., J. Cell Science 108, 2825-2838 (1995) durchgeführt wird.

P.C. Brooks et al. beschreiben in J. Clin. Invest. 96, 1815-1822 (1995) α_vβ₃-Antagonisten zur Krebsbekämpfung und zur Behandlung tumor induzierter angiogener Krankheiten.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I können daher als Arzneimittelwirkstoffe insbesondere zur Behandlung von Tumorerkran kungen, Osteoporosen und anderen osteolytischen Erkrankungen sowie zur Unterdrückung der Angiogenese eingesetzt werden.

Verbindungen der Formel I, die die Wechselwirkung von Integrinrezep toren und Liganden, wie z. B. von Fibrinogen an den Fibrinogenrezeptor (Glycoprotein IIb/IIIa) blockieren, verhindern als GPIIb/IIIa-Antagonisten die Ausbreitung von Tumorzellen durch Metastase. Dies wird durch folgende Beobachtungen belegt:
Die Verbreitung von Tumorzellen von einem lokalen Tumor in das vaskuläre System erfolgt durch die Bildung von Mikroaggregaten (Mikro thromben) durch Wechselwirkung der Tumorzellen mit Blutplättchen. Die Tumorzellen sind durch den Schutz im Mikroaggregat abgeschirmt und werden von den Zellen des Immunsystems nicht erkannt.

Die Mikroaggregate können sich an Gefäßwandungen festsetzen, wodurch ein weiteres Eindringen von Tumorzellen in das Gewebe erleichtert wird. Da die Bildung der Mikrothromben durch Fibrinogenbindung an die Fibrino genrezeptoren auf aktivierten Blutplättchen vermittelt wird, können die GPIIb/IIIa-Antagonisten als wirksame Metastase-Hemmer angesehen werden.

Verbindungen der Formel I hemmen neben der Bindung von Fibrinogen, Fibronectin und des Willebrand-Faktors an den Fibrinogenrezeptor der Blutplättchen auch die Bindung weiterer adhäsiver Proteine, wie Vitro nectin, Kollagen und Laminin, an die entsprechenden Rezeptoren auf der Oberfläche verschiedener Zelltypen. Sie verhindern insbesondere die Entstehung von Blutplättchenthromben und können daher zur Behandlung von Thrombosen, Apoplexie, Herzinfarkt, Entzündungen und Arterio sklerose eingesetzt werden.

Die Eigenschaften der Verbindungen können auch nach Methoden nachgewiesen werden, die in der EP-A1-0 462 960 beschrieben sind. Die Hemmung der Fibrinogenbindung an den Fibrinogenrezeptor kann nach der Methode nachgewiesen werden, die in der EP-A1-0 381 033 angegeben ist.

Die thrombozytenaggregationshemmende Wirkung läßt sich in vitro nach der Methode von Born (Nature 4832, 927-929, 1962) nachweisen. Die Hemmung der Knochenresorption durch die erfindungsgemäßen Verbin dungen kann mit Hilfe eines Osteoclasten-Resorptionstests analog WO 95/32710 erfolgen.

Matrix Metalloproteinase 2 (MMP-2, auch Gelatinase A, GelA, 72 kDa type IV Collagenase) ist ein Mitglied der Zink-abhängigen Endoproteasen familie, die als Pro-Enzyme, latente MMPs oder Zymogene sekretiert werden und für den Abbau extrazellulärer Matrixproteine und anderer Proteinen zuständig sind, um Zellwanderung und Invasion zu ermöglichen. Die Balance zwischen Aktivierung aus dem Pro-Enzym und der Inak tivierung durch körpereigene Inhibitoren, wie TIMP-2, oder durch erweiter ten enzymatischen Verdau, reguliert die Aktivität von MMP-2. Die MMPs spielen eine Rolle in physiologischen, wie auch pathologischen Situation en, in der Embryonalentwicklung, bei Entzündungen, Wundheilung, Tumorzellinvasion und Metastasierung. Inhibitoren der enzymatischen Tasche, der Expression auf Zellebene oder der Aktivierung aus dem Pro- Enzym können diagnostische und therapeutische Verwendung bei Mensch und Tier finden.

Das Enzym spaltet verschiedene Typen von Collagen, Elastin, Fibronectin und Laminin. Die Bindung an Collagen erfolgt mittels 3 zu Fibronectin Typ II Modulen homologen Wiederholungseinheiten, die in die katalytische Domäne in der Nähe der active site insertiert sind.

Der C-Terminus von MMP-2 ist in der Literatur als "C-Terminal Domain" CTD (Goldberg et al., Overall et al.) oder PEX (Cheresh et al.) bekannt.

Literatur

Localization of matrix metalloproteinase MMP-2 to the surface of invasive cells by interaction with integrin alpha v beta 3.
Brooks-PC; Stromblad-S; Sanders-LC; von-Schalscha-TL; Aimes-RT; Stetler-Stevenson-WG; Quigley-JP; Cheresh-DA
Cell. 1996 May 31; 85(5): 683-93.
Disruption of angiogenesis by PEX, a noncatalytic metalloproteinase fragment with integrin binding activity. Brooks-PC; Silletti-S. von- Schalscha-TL; Friedlander-M; Cheresh-DA Cell. 1998 Feb 6; 92(3): 391-400.
In US 4,923,818 hat Goldberg die Aminosäuresequenz von Pro-MMP-2 (72 kDa) beschrieben, der Komplex mit TIMP-2 ist von Goldberg in EP 404,750 dokumentiert.
Lösliche Pro-MMP-2 wird an Zelloberflächen gebunden und wird dort durch das membranständige Enzym MT1-MMP durch Proteolyse des Pro- Fragmentes in Position Asn66-Leu67 im ersten Schritt und folgendem MT1-MMP-unabhängigem Selbstverdau an Position Asn109-Tyr110 aktiviert. Diese Aktivierung ist nicht möglich, wenn der C-Terminus von Pro-MMP-2 fehlt. Als Bindungspartner kommen in Frage MT1-MMP, Integrin α_v

β₃

und Fetuin.
In WO 98/12309, Washington University St. Louis, sind bindende Sequenzen von CTD (PEX) an TIMP-2 beschrieben. Es ist erwähnt, daß die Addition eines Überschusses von TIMP-2 (nicht aber TIMP-1) oder rekombinantem CTD (PEX) die Aktivierung von Pro-MMP-2 an der Zelloberfläche unterdrückt.

Gegenstand der Erfindung sind demgemäß Verbindungen der Formel I nach Anspruch 1 und/oder ihrer physiologisch unbedenklichen Salze zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung als Integrin-Inhibitoren. Gegenstand der Erfindung sind insbesondere Verbindungen der Formel I nach Anspruch 1 und/oder ihrer unbedenklichen Salze zur Herstellung eines Arzneimittels zur Bekämpfung von pathologisch angiogenen Erkrankungen, Tumoren, Osteoporose, Entzündungen und Infektionen.

Die Verbindungen der Formel I können als Arzneimittelwirkstoffe in der Human- und Veterinärmedizin eingesetzt werden, zur Prophylaxe und/oder Therapie von Thrombose, myocardialem Infarkt, Arteriosklerose, Entzünd ungen, Apoplexie, Angina pectoris, Tumorerkrankungen, osteolytischen Krankheiten wie Osteoporose, Hypercalcämie, pathologisch angiogenen Krankheiten wie z. B. Entzündungen, ophthalmologischen Krankheiten, diabetischer Retinopathie, makularer Degeneration, Myopia, okularer Histoplasmose, rheumatischer Arthritis, Osteoarthritis, rubeotischem Glaukom, ulcerativer Colitis, Morbus Crohn, Atherosklerose, Psoriasis, Restenose nach Angioplastie, viraler Infektion, bakterieller Infektion, Pilzinfektion, bei akutem Nierenversagen und bei der Wundheilung zur Unterstützung der Heilungsprozesse.

Die Verbindungen der Formel I können als antimikrobiell wirkende Sub stanzen bei Operationen eingesetzt werden, wo Biomaterialien, Implan tate, Katheter oder Herzschrittmacher verwendet werden. Dabei wirken sie antiseptisch. Die Wirksamkeit der antimikrobiellen Aktivität kann durch das von P. Valentin-Weigund et al., in Infection and lmmunity, 2851-2855 (1988) beschriebene Verfahren nachgewiesen werden.

Gegenstand der Erfindung sind auch die Hydrate und Solvate, z. B. Alkoholate, dieser Verbindungen.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel I nach Anspruch 1 sowie ihrer Salze, dadurch gekennzeichnet, daß man
eine Verbindung der Formel I aus einem ihrer funktionellen Derivate durch Behandeln mit einem solvolysierenden, reduzierenden oder hydrogenolysierenden Mittel in Freiheit setzt,
und/oder eine Base oder Säure der Formel I in eines ihrer Salze umwandelt.

Die Verbindungen der Formel I können ein chirale oder mehrere chirale Zentren besitzen und können daher in mehreren stereoisomeren Formen auftreten. Alle diese Formen (z. B. D- und L-Formen) und deren Gemische (z. B. die DL-Formen) sind in der Formel I eingeschlossen.

In die erfindungsgemäßen Verbindungen sind auch sogenannte Prodrug- Derivate eingeschlossen, d. h. mit z. B. Alkyl- oder Acylgruppen, Zuckern oder Oligopeptiden abgewandelte Verbindungen der Formel I, die im Organismus rasch zu den wirksamen erfindungsgemäßen Verbindungen gespalten werden.

Die vor- und nachstehend aufgeführten Abkürzungen stehen für:
Ac Acetyl
BOC tert.-Butoxycarbonyl
CBZ oder Z Benzyloxycarbonyl
DCCl Dicyclohexylcarbodiimid
DMF Dimethylformamid
EDCl N-Ethyl-N,N'-(dimethylaminopropyl)-carbodiimid
Et Ethyl
Fmoc 9-Fluorenylmethoxycarbonyl
HOBt 1-Hydroxybenzotriazol
Me Methyl
Mtr 4-Methoxy-2,3,6-trimethylphenyl-sulfonyl
HONSu N-Hydroxysuccinimid
OBut tert.-Butylester
Oct Octanoyl
OMe Methylester
OEt Ethylester
Pbf 2,2,4,6,7-Pentamethyl-dihydrobenzofuran-5-sulfonyl
Pmc 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl
POA Phenoxyacetyl
TFA Trifluoressigsäure
Trt Trityl(Triphenylmethyl).

Die vor- und nachstehend aufgeführten Abkürzungen von Aminosäure resten stehen für die Reste folgender natürlich vorkommender Aminosäuren:
Ala, A Alanin
Asn, N Asparagin
Asp, D Asparaginsäure
Arg, R Arginin
Cys, C Cystein
Gln, Q Glutamin
Glu, E Glutaminsäure
Gly, G Glycin
His, H Histidin
Ile, I Isoleucin
Leu, L Leucin
Lys, K Lysin
Met, M Methionin
Phe, F Phenylalanin
Pro, P Prolin
Ser, S Serin
Thr, T Threonin
Trp, W Tryptophan
Tyr, Y Tyrosin
Val, V Valin.

Die Sequenz von humanem Pro-MMP-2 (MMP-2), entnommen aus öffentlich zugänglichen Datenbanken (z. B. über www.expasy.ch erhältlich) ist wie folgt:

Hierbei ist der C-terminale, Hemopexin-ähnliche, in der Literatur auch als PEX bekannte Bereich von Position 466-660 dunkel markiert. Die erfindungsgemässen Integrin α_vβ₃ bindenden Peptidsequenzen sind unterstrichen.

Für die gesamte Erfindung gilt, daß sämtliche Reste, die mehrfach auftreten, wie z. B. A, gleich oder verschieden sein können, d. h. unabhängig voneinander sind.

A ist Alkyl und hat 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 C-Atome und steht vorzugsweise für Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sek.-Butyl oder tert.-Butyl, ferner auch für Pentyl, 1-, 2- oder 3-Methylbutyl, 1,1-, 1,2- oder 2,2-Dimethylpropyl, 1-Ethylpropyl, Hexyl, 1-, 2-, 3- oder 4- Methylpentyl, 1,1-, 1,2-, 1,3-, 2,2-, 2,3- oder 3,3-Dimethylbutyl, 1- oder 2-Ethylbutyl, 1-Ethyl-1-methylpropyl, 1-Ethyl-2-methylpropyl, 1,1,2-, 1,2,2- Trimethylpropyi, Heptyl, Octyl, Nonyl oder Decyl, Undecyl. A bedeutet auch durch Halogen substituiertes Alkyl, vorzugsweise CF₃.

Acyl bedeutet Alkanoyl mit 1-10 C-Atomen, vorzugsweise z. B. Formyl, Acetyl, Propionyl oder Butyryl, ferner z. B. Benzoyl.

Aminoschutzgruppe bedeutet vorzugsweise Formyl, Acetyl, Propionyl, Butyryl, Phenylacetyl, Benzoyl, Toluyl, POA, Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, 2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl, BOC, 2-Iodethoxycarbonyl, CBZ ("Carbobenzoxy"), 4-Methoxybenzyloxycarbonyl, FMOC, Mtr oder Benzyl.

Dementsprechend sind Gegenstand der Erfindung insbesondere diejeni gen Verbindungen der Formel I, in denen mindestens einer der genannten Reste eine der vorstehend angegebenen bevorzugten Bedeutungen hat. Einige bevorzugte Gruppen von Verbindungen können durch die folgenden Teilformeln Ia bis Ie ausgedrückt werden, die der Formel I entsprechen und worin die nicht näher bezeichneten Reste die bei der Formel I angegebene Bedeutung haben, worin jedoch
in a) X H, Acyl oder ein Peptidfragment mit 1 bis 20 Aminosäuren,
ausgewählt aus der Peptidsequenz von humanem Pro-MMP-2
bedeutet;
in b) X H, Acyl oder ein Peptidfragment mit 1 bis 20 Aminosäuren,
ausgewählt aus der Peptidsequenz von humanem Pro-MMP-2,
Z OH, NH₂, NHA, NA₂ oder ein Peptidfragment mit 1 bis 20 Aminosäuren,
ausgewählt aus der Peptidsequenz von humanem Pro-MMP-2,
bedeuten;
in c) X H, Acyl oder ein Peptidfragment mit 1 bis 20 Aminosäuren,
ausgewählt aus der Peptidsequenz von humanem Pro-MMP-2,
Y ein Peptidfragment ausgewählt aus dem Sequenz bereich 480-598 von humanem Pro-MMP-2,
Z OH, NH₂ NHA, NA₂ oder ein Peptidfragment mit 1 bis 20 Aminosäuren,
ausgewählt aus der Peptidsequenz von humanem Pro-MMP-2
bedeuten,
in d) X H, Acyl oder ein Peptidfragment mit 1 bis 20 Aminosäuren,
ausgewählt aus der Peptidsequenz von humanem Pro-MMP-2,
Y ein Peptidfragment ausgewählt aus dem Sequenz bereich 489-497 und/oder 570-585 und/oder 588-597 von humanem Pro-MMP-2,
Z OH, NH₂ NHA, NA₂ oder ein Peptidfragment mit 1 bis 20 Aminosäuren,
ausgewählt aus der Peptidsequenz von humanem Pro-MMP-2,
bedeuten,
in e) X H, Acyl oder ein Peptidfragment mit 1 bis 20 Aminosäuren,
ausgewählt aus der Peptidsequenz von humanem Pro-MMP-2,
Y ein Peptidfragment ausgewählt aus dem Sequenz bereich 489-497 und/oder 570-585 und/oder 588-597 von humanem Pro-MMP-2,
Z OH, NH₂, NHA, NA₂ oder Cys
bedeuten,
wobei die primären Aminogruppen auch mit konventionellen Amino schutzgruppen versehen sein können,
sowie deren physiologisch unbedenklichen Salze und Solvate.

Die Peptide der C-terminalen Sequenz von MMP-2 sind als Ber Fragmente mit je 2 Aminosäuren Überlappung auf Papier in einer Fmoc-Strategie synthetisiert worden.

Die Qualität der Synthese wurde mittels eines Auflicht/Fluoreszenzlese gerätes von SLT-Tecan beurteilt und so die Quantität des Fmoc-Signals nach Kupplungsschritten (viel Fluoreszenz) und nach Abspaltungsschritten (keine Fluoreszenz) ausgewertet. Diese peptidbeladenen Papiere wurden mit fluoreszenzmarkiertem Integrin α_vβ₃ inkubiert, gewaschen und mit einem Auflicht/Fluoreszenzlesegerät von SLT-Tecan ausgewertet. Die Peptidsequenzen der positiven "SPOTs" wurden in separaten Synthesen konventionell am Harz hergestellt und dabei mit einem C- terminalen Cystein markiert. Die gereinigten, isolierten Cysteinpeptide wurden in einem kovalenten Bindungstest auf Bindung von biotinyliertem Integrin α_vβ₃ mittels einer antiBiotin/Phosphatase-Reaktion überprüft, dabei wurde die α_vβ₃-bindende, RGD-unabhängige Aktivität bestätigt. Von den aktiven Verbindungen befinden sich 2 Peptide in einer konsekutiven Sequenz, die sich, abgeleitet von der bekannten Röntgen struktur des MMP-2 C-Terminus, an der Oberfläche von PEX befindet.

Die beispielhaft hergestellten erfindungsgemäßen Verbindungen wurden nach Stand der Technik in einem Syntheseautomaten Milligen 9050 an Polystyrol hergestellt. Das Verfahren ist für einen Fachmann anhand von Lehrbuchwissen nachvollziehbar, wie z. B. im Anhang des Novabiochem- Kataloges zu finden. Es wurden Chlor-Trityl(o-Cl)-Anker eingesetzt. Fmoc- geschützte Aminosäuren mit säurelabilem Seitenschutz wurden gekuppelt. Es kamen die seitengeschützten Derivate Fmoc-Ser(But), Thr(But), Tyr(But), His(Trt), Asn(Trt), Gln(Trt), Arg(Pmc) oder Arg(Pbf), Lys(Boc), Asp(OBut), Glu(OBut), Cys(Trt) zum Einsatz. Nach Abspaltung der Fmoc gruppen wird das Peptid mit TFA/Wasser (98 : 2) vom Harz abgespalten, wobei gleichzeitig die Schutzgruppen der Seitenketten mit abgespalten werden.

Die Verbindungen der Formel I und auch die Ausgangsstoffe zu ihrer Her stellung werden im übrigen nach an sich bekannten Methoden hergestellt, wie sie in der Literatur (z. B. in den Standardwerken wie Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Georg-Thieme-Verlag, Stuttgart;) beschrieben sind, und zwar unter Reaktionsbedingungen, die für die ge nannten Umsetzungen bekannt und geeignet sind. Dabei kann man auch von an sich bekannten, hier nicht näher erwähnten Varianten Gebrauch machen.

Die Ausgangsstoffe können, falls erwünscht, auch in situ gebildet werden, so daß man sie aus dem Reaktionsgemisch nicht isoliert, sondern sofort weiter zu den Verbindungen der Formel I umsetzt.

Verbindungen der Formel I können vorzugsweise erhalten werden, indem man Verbindungen der Formel I aus einem ihrer funktionellen Derivate durch Behandeln mit einem solvolysierenden oder hydrogenolysierenden Mittel in Freiheit setzt.

Bevorzugte Ausgangsstoffe für die Solvolyse bzw. Hydrogenolyse sind solche, die sonst der Formel I entsprechen, aber anstelle einer oder mehrerer freier Amino- und/oder Hydroxygruppen entsprechende geschützte Amino- und/oder Hydroxygruppen enthalten, vorzugsweise solche, die anstelle eines H-Atoms, das mit einem N-Atom verbunden ist, eine Aminoschutzgruppe tragen, insbesondere solche, die anstelle einer HN-Gruppe eine R'-N-Gruppe tragen, worin R' eine Aminoschutzgruppe bedeutet, und/oder solche, die anstelle des H-Atoms einer Hydroxygruppe eine Hydroxyschutzgruppe tragen, z. B. solche, die der Formel I entsprechen, jedoch anstelle einer Gruppe -COOH eine Gruppe -COOR" tragen, worin R" eine Hydroxyschutzgruppe bedeutet.

Es können auch mehrere - gleiche oder verschiedene - geschützte Amino- und/oder Hydroxygruppen im Molekül des Ausgangsstoffes vorhanden sein. Falls die vorhandenen Schutzgruppen voneinander verschieden sind, können sie in vielen Fällen selektiv abgespalten werden.

Der Ausdruck "Aminoschutzgruppe" ist allgemein bekannt und bezieht sich auf Gruppen, die geeignet sind, eine Aminogruppe vor chemischen Um setzungen zu schützen (zu blockieren), die aber leicht entfernbar sind, nachdem die gewünschte chemische Reaktion an anderen Stellen des Moleküls durchgeführt worden ist. Typisch für solche Gruppen sind ins besondere unsubstituierte oder substituierte Acyl-, Aryl-, Aralkoxymethyl- oder Aralkylgruppen. Da die Aminoschutzgruppen nach der gewünschten Reaktion (oder Reaktionsfolge) entfernt werden, ist ihre Art und Größe im übrigen nicht kritisch; bevorzugt werden jedoch solche mit 1-20, insbe sondere 1-8 C-Atomen. Der Ausdruck "Acylgruppe" ist im Zusammenhang mit dem vorliegenden Verfahren in weitestem Sinne aufzufassen. Er um schließt von aliphatischen, araliphatischen, aromatischen oder hetero cyclischen Carbonsäuren oder Sulfonsäuren abgeleitete Acylgruppen sowie insbesondere Alkoxycarbonyl-, Aryloxycarbonyl- und vor allem Aralkoxycarbonylgruppen. Beispiele für derartige Acylgruppen sind Formyl oder Alkanoyl wie Acetyl, Propionyl, Butyryl; Aralkanoyl wie Phenylacetyl; Aroyl wie Benzoyl oder Toluyl; Aryloxyalkanoyl wie POA; Alkoxycarbonyl wie Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, 2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl, BOC, 2-Iodethoxycarbonyl; Aralkyloxycarbonyl wie CBZ ("Carbobenzoxy"), 4- Methoxybenzyloxycarbonyl, FMOC; Arylsulfonyl wie Mtr. Bevorzugte Aminoschutzgruppen sind BOC und Mtr, ferner CBZ, Fmoc, Benzyl, Formyl und Acetyl.

Die Abspaltung der Aminoschutzgruppe gelingt - je nach der benutzten Schutzgruppe - z. B. mit starken Säuren, zweckmäßig mit TFA oder Per chlorsäure, aber auch mit anderen starken anorganischen Säuren wie Salzsäure oder Schwefelsäure, starken organischen Carbonsäuren wie Trichloressigsäure oder Sulfonsäuren wie Benzol- oder p-Toluolsulfon säure. Die Anwesenheit eines zusätzlichen inerten Lösungsmittels ist möglich, aber nicht immer erforderlich. Als inerte Lösungsmittel eignen sich vorzugsweise organische, beispielsweise Carbonsäuren wie Essig säure, Ether wie Tetrahydrofuran oder Dioxan, Amide wie DMF, haloge nierte Kohlenwasserstoffe wie Dichlormethan, ferner auch Alkohole wie Methanol, Ethanol oder Isopropanol, sowie Wasser. Ferner kommen Gemische der vorgenannten Lösungsmittel in Frage. TFA wird vorzugs weise im Überschuß ohne Zusatz eines weiteren Lösungsmittels verwen det, Perchlorsäure in Form eines Gemisches aus Essigsäure und 70%iger Perchlorsäure im Verhältnis 9 : 1. Die Reaktionstemperaturen für die Spal tung liegen zweckmäßig zwischen etwa 0 und etwa 50°, vorzugsweise arbeitet man zwischen 15 und 30° (Raumtemperatur).

Die Gruppen BOC, OBut, Pmc, Pbf und Mtr können z. B. bevorzugt mit TFA in Dichlormethan oder mit etwa 3 bis 5n HCl in Dioxan bei 15-30° abgespalten werden, die FMOC-Gruppe mit einer etwa 5- bis 50%igen Lösung von sek. Aminen, wie Dimethylamin, Diethylamin oder Piperidin in DMF bei 15-30°.

Hydrogenolytisch entfernbare Schutzgruppen (z. B. CBZ oder Benzyl) können z. B. durch Behandeln mit Wasserstoff in Gegenwart eines Kata lysators (z. B. eines Edelmetallkatalysators wie Palladium, zweckmäßig auf einem Träger wie Kohle) abgespalten werden. Als Lösungsmittel eignen sich dabei die oben angegebenen, insbesondere z. B. Alkohole wie Methanol oder Ethanol oder Amide wie DMF. Die Hydrogenolyse wird in der Regel bei Temperaturen zwischen etwa 0 und 100° und Drucken zwischen etwa 1 und 200 bar, bevorzugt bei 20-30° und 1-10 bar durch geführt. Eine Hydrogenolyse der CBZ-Gruppe gelingt z. B. gut an 5 bis 10%igem Pd/C in Methanol oder mit Ammoniumformiat (anstelle von Wasserstoff) an Pd/C in Methanol/DMF bei 20-30°.

Als inerte Lösungsmittel eignen sich z. B. Kohlenwasserstoffe wie Hexan, Petrolether, Benzol, Toluol oder Xylol; chlorierte Kohlenwasserstoffe wie Trichlorethylen, 1,2-Dichlorethan, Tetrachlorkohlenstoff, Chloroform oder Dichlormethan; Alkohole wie Methanol, Ethanol, Isopropanol, n-Propanol, n-Butanol oder tert.-Butanol; Ether wie Diethylether, Diisopropylether, Tetrahydrofuran (THF) oder Dioxan; Glykolether wie Ethylenglykolmono methyl- oder -monoethylether (Methylglykol oder Ethylglykol), Ethylen glykoldimethylether (Diglyme); Ketone wie Aceton oder Butanon; Amide wie Acetamid, Dimethylacetamid oder Dimethylformamid (DMF); Nitrile wie Acetonitril; Sulfoxide wie Dimethylsulfoxid (DMSO); Schwefelkohlenstoff; Carbonsäuren wie Ameisensäure oder Essigsäure; Nitroverbindungen wie Nitromethan oder Nitrobenzol; Ester wie Ethylacetat, Wasser oder Gemische der genannten Lösungsmittel.

Weiterhin ist es möglich, einen Ester der Formel I zu verseifen. Zweckmäßig erfolgt dies durch Solvolyse oder Hydrogenolyse, wie oben angegeben, z. B. mit LioH in Methanol, NaOH oder KOH in Dioxan-Wasser bei Temperaturen zwischen 0 und 60°C, vorzugsweise zwischen 10 und 40°C.

Ferner ist es möglich, eine konventionelle Aminoschutzgruppe durch Wasserstoff zu ersetzen, indem die Schutzgruppe, wie oben beschrieben, solvolytisch oder hydrogenolytisch abgespalten wird oder daß man eine durch eine konventionelle Schutzgruppe geschützte Aminogruppe durch Solvolyse oder Hydrogenolyse in Freiheit setzt.

Eine Base der Formel I kann mit einer Säure in das zugehörige Säure additionssalz übergeführt werden, beispielsweise durch Umsetzung äqui valenter Mengen der Base und der Säure in einem inerten Lösungsmittel wie Ethanol und anschließendes Eindampfen. Für diese Umsetzung kommen insbesondere Säuren in Frage, die physiologisch unbedenkliche Salze liefern. So können anorganische Säuren verwendet werden, z. B. Schwefelsäure, Salpetersäure, Halogenwasserstoffsäuren wie Chlor wasserstoffsäure oder Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäuren wie Ortho phosphorsäure, Sulfaminsäure, ferner organische Säuren, insbesondere aliphatische, alicyclische, araliphatische, aromatische oder heterocyclische ein- oder mehrbasige Carbon-, Sulfon- oder Schwefelsäuren, z. B. Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Pivalinsäure, Diethylessigsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Pimelinsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Citronensäure, Gluconsäure, Ascorbinsäure, Nicotinsäure, Isonicotinsäure, Methan- oder Ethansulfon säure, Ethandisulfonsäure, 2-Hydroxyethansulfonsäure, Benzolsulfon säure, p-Toluolsulfonsäure, Naphthalin-mono- und Disulfonsäuren, Lauryl schwefelsäure. Salze mit physiologisch nicht unbedenklichen Säuren, z. B. Pikrate, können zur Isolierung und /oder Aufreinigung der Verbindungen der Formel I verwendet werden.

Andererseits kann eine Säure der Formel I durch Umsetzung mit einer Base in eines ihrer physiologisch unbedenklichen Metall- oder Ammonium salze übergeführt werden. Als Salze kommen dabei insbesondere die Natrium-, Kalium-, Magnesium-, Calcium- und Ammoniumsalze in Betracht, ferner substituierte Ammoniumsalze, z. B. die Dimethyl-, Diethyl- oder Diisopropylammoniumsalze, Monoethanol-, Diethanol- oder Diiso propylammoniumsalze, Cyclohexyl-, Dicyclohexylammoniumsalze, Di benzylethylendiammoniumsalze, weiterhin z. B. Salze mit Arginin oder Lysin.

Die Verbindungen der Formel I enthalten ein oder mehrere chirale Zentren und können daher in racemischer oder in optisch-aktiver Form vorliegen. Erhaltene Racemate können nach an sich bekannten Methoden mecha nisch oder chemisch in die Enantiomeren getrennt werden. Vorzugsweise werden aus dem racemischen Gemisch durch Umsetzung mit einem optisch aktiven Trennmittel Diastereomere gebildet. Als Trennmittel eignen sich z. B. optisch aktive Säuren, wie die D- und L-Formen von Weinsäure, Diacetylweinsäure, Dibenzoylweinsäure, Mandelsäure, Äpfelsäure, Milch säure oder die verschiedenen optisch aktiven Camphersulfonsäuren wie β- Camphersulfonsäure. Vorteilhaft ist auch eine Enantiomerentrennung mit Hilfe einer mit einem optisch aktiven Trennmittel (z. B. Dinitrobenzoyl phenylglycin) gefüllten Säule; als Laufmittel eignet sich z. B. ein Gemisch Hexan/Isopropanol/Acetonitril, z. B. im Volumenverhältnis 82 : 15 : 3.

Natürlich ist es auch möglich, optisch aktive Verbindungen der Formel I nach den oben beschriebenen Methoden zu erhalten, indem man Aus gangsstoffe verwendet, die bereits optisch aktiv sind.

Die Erfindung umfaßt nicht nur die genannten Verbindungen, sondern auch Mischungen und Zubereitungen, welche neben diesen erfindungs gemäßen Verbindungen auch andere pharmakologische Wirkstoffe oder Adjuvantien enthalten, die die primäre pharmakologische Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen in gewünschter Weise beinflussen können. Diese können als Therapeutika, Diagnostika oder als Reagenzien Verwendung finden. Sie können an Mensch oder Tier lokal oder systemisch, oral, intravenös, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan, transdermal, nasal, buccal, oder iontophoretisch gegeben werden, das schließt Formulierungen in Suspensionen, Emulsionen oder Lösungen, Liposomen, Salben, Pasten, bioabbaubaren Polymeren oder als Nanopartikel, Tabletten, Kapseln oder Pillen, Granulate oder Puder, als Aerosol zum Inhalieren, als intranasale Tropfen oder Sprays ein. Auch eine Kombination der neuen Produkte mit anderen Techniken, wie Chirurgie, Bestrahlung, Diagnose, Radiotherapie, photodynamischer Therapie und Gentherapie, sowie mit anderen Medikamenten ist möglich. Solche Medikamente können z. B. aus den Gebieten Herzkreislauf, Zentralnervensystem oder der Onkologie stammen. Es können Tumormittel sein, wie Angiogeneseinhibitoren oder Cytostatika, Chemotherapeutika der Gruppen alkylierende Agenzien, Antibiotika, Antimetaboliten, Biologika und Immunmodulatoren, Hormone und deren Antagonisten, Senfgasderivaten, Alkaloiden und anderen, wobei diese Substanzen niedermolekular und hochmolekular sein können. Es können Lipide, Kohlehydrate oder Proteine sein. Darunter fallen auch Zytokine, Toxine, Fusionsproteine, monoklonale Antikörper und Vaccine.

Gegenstand der Erfindung sind demgemäß Verbindungen der oben und unten sowie in den Ansprüchen definierten Formeln einschließlich ihrer physiologisch unbedenklichen Salze als Arzneimittel, Diagnostika oder Reagenzien.

Insbesondere sind dies Arzneimittel zur Bekämpfung von Erkrankungen, die auf einer Wechselwirkung von Liganden, z. B. von MMP-2 mit dem α_vβ₃ Integrinrezeptor beruhen.

Die Arzneimittel eignen sich zur Bekämpfung von Thrombosen, Herzinfarkt, koronaren Herzerkrankungen, Arteriosklerose, Tumoren, Osteoporose, Fibrosen, Entzündungen, Infektionen, Psoriasis sowie zur Beeinflussung von Wundheilungsprozessen.

Gegenstand sind auch entsprechende pharmazeutische Zubereitungen, welche mindestens ein Arzneimittel der Formel I sowie gegebenenfalls Träger- und/oder Hilfsstoffe enthalten.

Ferner ist Gegenstand der Erfindung die Verwendung der erfindungs gemäßen Verbindungen und/oder ihrer physiologisch unbedenklichen Salze und/oder Solvate zur Herstellung eines Arzneimittels zur Inhibierung des Integrinrezeptors α_vβ₃.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung der erfindungs gemäßen Verbindungen und/oder ihrer physiologisch unbedenklichen Salze und/oder Solvate zur Herstellung eines Arzneimittels zur Bekämpfung von Erkrankungen, die auf einer Wechselwirkung eines Liganden, z. B. der Matrix-Metalloproteinase (MMP-2) mit dem α_vβ₃ Integrinrezeptor beruhen.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung der erfindungs gemäßen Verbindungen und/oder ihrer physiologisch unbedenklichen Salze und/oder Solvate zur Herstellung eines Arzneimittels zur Bekämpfung pathologischer Vorgängen, die durch Angiogenese unterhalten oder propagiert werden.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung der erfindungs gemäßen Verbindungen und/oder ihrer physiologisch unbedenklichen Salze und/oder Solvate zur Herstellung eines Arzneimittels zur Bekämpfung von Thrombosen, Herzinfarkt, koronaren Herzerkrankungen, Arteriosklerose, Tumoren, Osteoporose, Fibrosen, Entzündungen, Infektionen, Psoriasis sowie zur Beeinflussung von Wundheilungs prozessen.

Die erfindungsgemäßen Arzneimittel bzw. sie enthaltende pharma zeutische Zubereitungen können in der Human- oder Veterinärmedizin verwendet werden. Als Trägerstoffe kommen organische oder anor ganische Substanzen in Frage, die sich für die enterale (z. B. orale), paren terale, topische Applikation oder für eine Applikation in Form eines Inhalation-Sprays eignen und mit den neuen Verbindungen nicht reagie ren, beispielsweise Wasser, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Alkylengly kole, Polyethylenglykole, Glycerintriacetat, Gelatine, Kohlehydrate wie Lactose oder Stärke, Magnesiumstearat, Talk, Vaseline. Zur oralen An wendung dienen insbesondere Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Pul ver, Granulate, Sirupe, Säfte oder Tropfen, zur rektalen Anwendung Sup positorien, zur parenteralen Anwendung Lösungen, vorzugsweise ölige oder wässrige Lösungen, ferner Suspensionen, Emulsionen oder Implan tate, für die topische Anwendung Salben, Cremes oder Puder. Die neuen Verbindungen können auch lyophilisiert und die erhaltenen Lyophilisate z. B. zur Herstellung von Injektionspräparaten verwendet werden. Die angegebenen Zubereitungen können sterilisiert sein und/oder Hilfsstoffe wie Gleit-, Konservierungs-, Stabilisierungs- und/oder Netzmittel, Emul gatoren, Salze zur Beeinflussung des osmotischen Druckes, Puffersub stanzen, Farb-, Geschmacks- und /oder mehrere weitere Wirkstoffe ent halten, z. B. ein oder mehrere Vitamine.

Für die Applikation als Inhalationsspray können Sprays verwendet werden, die den Wirkstoff entweder gelöst oder suspendiert in einem Treibgas oder Treibgasgemisch (z. B. CO₂ oder Fluorchlorkohlenwasserstoffen) enthal ten. Zweckmäßig verwendet man den Wirkstoff dabei in mikronisierter Form, wobei ein oder mehrere zusätzliche physiologisch verträgliche Lösungsmittel zugegen sein können, z. B. Ethanol. Inhalationslösungen können mit Hilfe üblicher Inhalatoren verabreicht werden.

Die erfindungsgemäßen Substanzen können in der Regel in Analogie zu anderen bekannten, im Handel befindlichen Präparaten (z. B. beschrieben in der US-A-4 472 305) verabreicht werden, vorzugsweise in Dosierungen zwischen etwa 0,05 und 500 mg, insbesondere zwischen 0,5 und 100 mg pro Dosierungseinheit verabreicht. Die tägliche Dosierung liegt vorzugs weise zwischen etwa 0,01 und 20 mg/kg Körpergewicht. Die spezielle Dosis für jeden Patienten hängt jedoch von den verschiedensten Faktoren ab, beispielsweise von der Wirksamkeit der eingesetzten speziellen Verbindung, vom Alter, Körpergewicht, allgemeinen Gesundheitszustand, Geschlecht, von der Kost, vom Verabreichungszeitpunkt und -weg, von der Ausscheidungsgeschwindigkeit, Arzneistoffkombination und Schwere der jeweiligen Erkrankung, welcher die Therapie gilt. Die parenterale Applikation ist bevorzugt.

Vor- und nachstehend sind alle Temperaturen in °C angegeben. Die HPLC-Analysen (Retentionszeit Rt) erfolgten in dem folgenden System:
Säule 250 × 4 mm Lichrospher 100RP 18 (Merck KGaA) mit einem 50 Minuten Gradienten von 0-80% 2-Propanol in Wasser (mit 0,3% Trifluoressigsäure) bei einem Fluss von 1 ml/min und Detektion bei 215 nm.
Massenspektrometrie (MS): EI (Elektronenstoß-Ionisation) M⁺
FAB (Fast Atom Bombardment) (M+H)⁺

Beispiele Herstellung und Aufreinigung erfindungsgemäßer Peptide

Prinzipiell erfolgt die Herstellung und Aufreinigung mittels Fmoc-Strategie unter Protektion säurelabiler Seitenketten auf säurelabilen Harzen unter Benutzung eines kommerziell erhältlichen "continuous flow" Peptid synthesizers entsprechend den Angaben von Haubner et al. (J. Am. Chem. Soc. 118, 1996, 17703).

Folgende Verbindungen wurden erhalten

Synonym dazu sind die nachstehende Bezeichnungen

KDRFIWRTVC	MMP-2(489-497)-Cys
AAFNWSKNKKTYIFAGC	MMP-2(570-585)-Cys
FWRYNEVKKKC	MMP-2(588-597)-Cys

Weiter wurden folgende Verbindungen erhalten

Einbuchstabencode
Synonym
VKKKMDPGC	MMP-2(594-603)-Cys, M 1005.23
LERGYPKPLTSLGLC	MMP-2(548-561)-Cys, M 1646.94
KPMGPLLVC	MMP-2(502-509)-Cys, M 957.24
IAQIRGC	MMP-2(478-483)-Cys, M 759.94
LKSVKFGSIC	MMP-2(645-653)-Cys, M 1081.34
AGDKFWRYNC	MMP-2(585-593)-Cys, M 1259.42
RGYPKPLTSLC	MMP-2(550-559)-Cys, M 1234.5
PGFPKLIAC	MMP-2(600-607)-Cys, M 945.19
WRTVTPRDC	MMP-2(494-501)-Cys, M 1133.31
AYYLKLENC	MMP-2(635-642)-Cys, M 1116.31

Beispiele für Material und Methoden

Rekombinantes MMP-2 ist von Chemicon erhältlich. Integrin α_vβ₃ kann aus Placenta gereinigt werden, wie von Smith et al. J. Biol. Chem. 263, 18726-18731 (1988) mit den Modifikationen laut F.C. Mitjans et al. J. Cell Sci. 108, 2825-2838 (1995) beschrieben ist. Lösliches α_vβ₃ ist wie in R.J. Mehta et al. Biochem. J. 330, 861-869(1998) beschrieben erhältlich, dort ist auch die Markierung mit Biotin, die Durchführung eines Liganden- Bindungstest und Kompetitionsassays ausgeführt, ein anderes Zitat für die Bindungstests ist S. Kraft et al. J. Biol. Chem. 274, 1979-1985 (1999).

1. Der Rezeptorbindungstest an kovalent gebundenen Peptiden ist analog durchführbar zu: B. Diefenbach et al. in Biology of Vitronectins and Their Receptors; eds. KT Preissner et al. aus Exerpta Medica International Congress Series 1042, Elsevier Science Publishers Amsterdam 1993, p. 149-156.
Beim Rezeptorbindungstest wurde Fluoreszein-markiertes Integrin α_vβ₃ verwendet, das direkt mit dem Cellulose-gebundenen Peptid interagiert. Die Auswertung erfolgte durch Messen der Fluoreszenz.
In einer anderen Variante wurde in Mikrotiterplatten beschichtetes BSA mit sulfo-SMPB aktiviert und die Thiopeptide daran kovalent gebunden. Nach Inkubation mit biotinyliertem α_vβ₃ wurde gebundener Rezeptor mit alkalischer-Phosphatase-gekoppeltem Ziege-anti-Biotin-Antikörper und Farbgebung durch ein Phosphatasesubstrat nachgewiesen.
Die pharmakologischen Daten beweisen die Aktivität der erfindungs gemäßen Verbindungen als Liganden für den Rezeptor α_vβ₃.
2. Bei der Bindung der PEX-Peptide an α_vβ₃ handelt es sich um eine RGD-unabhängige Bindung. Dies wurde in einem weiteren Test nachgewiesen, der analog 1. durchgeführt wurde.
Der Rezeptor wurde mit und ohne das lösliche Peptid cyclo-(Arg-Gly-Asp- D-Phe-N-Me-Val) inkubiert. Während die Bindung des cyclo-RGD-Peptides "cyclo-(RGDfK(mercapto-propionyl))" an α_vβ₃ durch cyclo-(Arg-Gly-Asp-D- Phe-N-Me-Val) inhibiert wurde, war die Bindung des PEX-Peptides AAFNWSKNKKTYIFAGC davon unabhängig.

Die nachfolgenden Beispiele betreffen pharmazeutische Zubereitungen:

Beispiel A Injektionsgläser

Eine Lösung von 100 g Lys-Asp-Arg-Phe-Ile-Trp-Arg-Thr-Val-Cys und 5 g Dinatriumhydrogenphosphat wird in 3 l zweifach destilliertem Wasser mit 2 n Salzsäure auf pH 6,5 eingestellt, steril filtriert, in Injektionsgläser abge füllt, unter sterilen Bedingungen lyophilisiert und steril verschlossen. Jedes Injektionsglas enthält 5 mg Wirkstoff.

Beispiel B Suppositorien

Man schmilzt ein Gemisch von 20 g Lys-Asp-Arg-Phe-Ile-Trp-Arg-Thr-Val- Cys mit 100 g Sojalecithin und 1400 g Kakaobutter, gießt in Formen und läßt erkalten. Jedes Suppositorium enthält 20 mg Wirkstoff.

Beispiel C Lösung

Man bereitet eine Lösung aus 1 g Lys-Asp-Arg-Phe-Ile-Trp-Arg-Thr-Val- Cys, 9,38 g NaH₂PO₄.2 H₂O, 28,48 g Na₂HPO₄.12 H₂O und 0,1 g Benzalkoniumchlorid in 940 ml zweifach destilliertem Wasser. Man stellt auf pH 6,8 ein, füllt auf 1 l auf und sterilisiert durch Bestrahlung. Diese Lösung kann in Form von Augentropfen verwendet werden.

Beispiel D Salbe

Man mischt 500 mg Lys-Asp-Arg-Phe-Ile-Trp-Arg-Thr-Val-Cys mit 99,5 g Vaseline unter aseptischen Bedingungen.

Beispiel E Tabletten

Ein Gemisch von 1 kg Lys-Asp-Arg-Phe-Ile-Trp-Arg-Thr-Val-Cys, 4 kg Lactose, 1,2 kg Kartoffelstärke, 0,2 kg Talk und 0,1 kg Magnesiumstearat wird in üblicher Weise zu Tabletten verpreßt, derart, daß jede Tablette 10 mg Wirkstoff enthält.

Beispiel F Dragees

Analog Beispiel E werden Tabletten gepreßt, die anschließend in üblicher Weise mit einem Überzug aus Saccharose, Kartoffelstärke, Talk, Tragant und Farbstoff überzogen werden.

Beispiel G Kapseln

2 kg Lys-Asp-Arg-Phe-Ile-Trp-Arg-Thr-Val-Cys werden in üblicher Weise in Hartgelatinekapseln gefüllt, so daß jede Kapsel 20 mg des Wirkstoffs enthält.

Beispiel H Ampullen

Eine Lösung von 1 kg Lys-Asp-Arg-Phe-Ile-Trp-Arg-Thr-Val-Cys in 60 l zweifach destilliertem Wasser wird steril filtriert, in Ampullen abgefüllt, unter sterilen Bedingungen lyophilisiert und steril verschlossen. Jede Ampulle enthält 10 mg Wirkstoff.

Beispiel I Inhalations-Spray

Man löst 14 g Lys-Asp-Arg-Phe-Ile-Trp-Arg-Thr-Val-Cys in 10 l isotonischer NaCl-Lösung und füllt die Lösung in handelsübliche Sprühgefäße mit Pump-Mechanismus. Die Lösung kann in Mund oder Nase gesprüht werden. Ein Sprühstoß (etwa 0,1 ml) entspricht einer Dosis von etwa 0,14 mg.

Claims

1. Verbindungen der Formel I
X-Y-Z I
worin
X H, Acyl oder ein Peptidfragment mit 1 bis 20 Aminosäuren, ausgewählt aus der Liste der natürlich vorkommenden Aminosäuren,
Y ein Peptidfragment ausgewählt aus dem Sequenzbereich 466-660 von humanem Pro-MMP-2,
Z OH, NH₂, NHA, NA₂ oder ein Peptidfragment mit 1 bis 20 Aminosäuren, ausgewählt aus der Liste der natürlich vorkommenden Aminosäuren,
A Alkyl mit 1-10 C-Atomen,
Acyl Alkanoyl mit 1-10 C-Atomen,
bedeuten
wobei die primären Aminogruppen auch mit konventionellen Amino schutzgruppen versehen sein können, sowie deren physiologisch unbedenklichen Salze und Solvate.

2. Verbindungen nach Anspruch 1,
worin
X H, Acyl oder ein Peptidfragment mit 1 bis 20 Aminosäuren, ausgewählt aus der Peptidsequenz von humanem Pro-MMP-2
bedeutet,
wobei die primären Aminogruppen auch mit konventionellen Amino schutzgruppen versehen sein können,
sowie deren physiologisch unbedenklichen Salze und Solvate.

3. Verbindungen nach Anspruch 1,
worin
X H, Acyl oder ein Peptidfragment mit 1 bis 20 Aminosäuren, ausgewählt aus der Peptidsequenz von humanem Pro-MMP-2,
Z OH, NH₂, NHA, NA₂ oder ein Peptidfragment mit 1 bis 20 Aminosäuren, ausgewählt aus der Peptidsequenz von humanem Pro-MMP-2
bedeuten,
wobei die primären Aminogruppen auch mit konventionellen Amino schutzgruppen versehen sein können,
sowie deren physiologisch unbedenklichen Salze und Solvate.

4. Verbindungen nach Anspruch 1,
worin
X H, Acyl oder ein Peptidfragment mit 1 bis 20 Aminosäuren, ausgewählt aus der Peptidsequenz von humanem Pro-MMP-2,
Y ein Peptidfragment ausgewählt aus dem Sequenzbereich 480-598 von humanem Pro-MMP-2,
Z OH, NH₂, NHA, NA₂ oder ein Peptidfragment mit 1 bis 20 Aminosäuren, ausgewählt aus der Peptidsequenz von humanem Pro-MMP-2,
bedeuten,
wobei die primären Aminogruppen auch mit konventionellen Amino schutzgruppen versehen sein können,
sowie deren physiologisch unbedenklichen Salze und Solvate.

5. Verbindungen nach Anspruch 1,
worin
X H, Acyl oder ein Peptidfragment mit 1 bis 20 Aminosäuren, ausgewählt aus der Peptidsequenz von humanem Pro-MMP-2,
Y ein Peptidfragment ausgewählt aus dem Sequenzbereich 489-497 und/oder 570-585 und/oder 588-597 von humanem Pro-MMP-2,
Z OH, NH₂, NHA, NA₂ oder ein Peptidfragment mit 1 bis 20 Aminosäuren, ausgewählt aus der Peptidsequenz von humanem Pro-MMP-2,
bedeuten,
wobei die primären Aminogruppen auch mit konventionellen Amino schutzgruppen versehen sein können,
sowie deren physiologisch unbedenklichen Salze und Solvate.

6. Verbindungen nach Anspruch 1,
worin
X H, Acyl oder ein Peptidfragment mit 1 bis 20 Aminosäuren, ausgewählt aus der Peptidsequenz von humanem Pro-MMP-2,
Y ein Peptidfragment ausgewählt aus dem Sequenzbereich 489-497 und/oder 570-585 und/oder 588-597 von humanem Pro-MMP-2,
Z OH, NH₂, NHA, NA₂ oder Cys bedeuten,
wobei die primären Aminogruppen auch mit konventionellen Amino schutzgruppen versehen sein können,
sowie deren physiologisch unbedenklichen Salze und Solvate.

7. Verbindungen nach Anspruch 1

a) Lys-Asp-Arg-Phe-Ile-Trp-Arg-Thr-Val-Cys,
b) Ala-Ala-Phe-Asn-Trp-Ser-Lys-Asn-Lys-Lys-Thr-Tyr-Ile-Phe-Ala- Gly-Cys,
c) Phe-Trp-Arg-Tyr-Asn-Glu-Val-Lys-Lys-Lys-Cys

sowie deren physiologisch unbedenklichen Salze und Solvate.

8. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel I nach Anspruch 1 sowie ihrer Salze, dadurch gekennzeichnet, daß man
eine Verbindung der Formel I aus einem ihrer funktionellen Derivate durch Behandeln mit einem solvolysierenden, reduzierenden oder hydrogenolysierenden Mittel in Freiheit setzt,
und/oder eine Base oder Säure der Formel I in eines ihrer Salze umwandelt.

9. Verbindungen der Formel I gemäß Anspruch 1-6 und die Verbindungen gemäß Anspruch 7 sowie deren physiologisch unbedenklichen Salze und Solvate als Arzneimittel.

10. Arzneimittel nach Anspruch 9 als Inhibitor des Integrinrezeptors α_vβ₃.

11. Arzneimittel nach Anspruch 10 zur Bekämpfung von Erkrankungen, die auf einer Wechselwirkung von Liganden mit dem α_vβ₃ Integrinrezeptor beruhen.

12. Arzneimittel nach Anspruch 11 zur Bekämpfung von Erkrankungen, die auf einer Wechselwirkung der Matrix-Metalloproteinase (MMP-2) mit dem α_vβ₃ Integrinrezeptor beruhen.

13. Arzneimittel nach Anspruch 12 zur Bekämpfung von Thrombosen, Herzinfarkt, koronaren Herzerkrankungen, Arteriosklerose, Tumoren, Osteoporose, Fibrosen, Entzündungen, Infektionen, Psoriasis sowie zur Beeinflussung von Wundheilungsprozessen.

14. Pharmazeutische Zubereitung, enthaltend mindestens ein Arznei mittel gemäß einem der Ansprüche 10 bis 13 sowie gegebenenfalls Träger- und/oder Hilfsstoffe und gegebenenfalls andere Wirkstoffe.

15. Verwendung von Verbindungen gemäß der Ansprüche 1 bis 7 und/oder ihre physiologisch unbedenklichen Salze zur Herstellung eines Arzneimittels zur Inhibierung des Integrinrezeptors α_vβ₃.

16. Verwendung von Verbindungen gemäß der Ansprüche 1 bis 7 und/oder ihre physiologisch unbedenklichen Salze zur Herstellung eines Arzneimittels zur Bekämpfung von Erkrankungen, die auf einer Wechselwirkung von Liganden mit dem V Integrinrezeptor beruhen.

17. Verwendung nach Anspruch 16 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Bekämpfung von Erkrankungen, die auf einer Wechselwirkung der Matrix-Metalloproteinase (MMP-2) mit dem α_vβ₃ Integrinrezeptor beruhen.

18. Verwendung nach Anspruch 16 oder 17 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Bekämpfung pathologischer Vorgängen, die durch Angiogenese unterhalten oder propagiert werden.

19. Verwendung nach Anspruch 18 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Bekämpfung von Thrombosen, Herzinfarkt, koronaren Herzer krankungen, Arteriosklerose, Tumoren, Osteoporose, Fibrosen, Entzündungen, Infektionen, Psoriasis sowie zur Beeinflussung von Wundheilungsprozessen.