DE10043481A1

DE10043481A1 - Humaner Antikörper gegen Endoglin (CD105) und seine Verwendung

Info

Publication number: DE10043481A1
Application number: DE10043481A
Authority: DE
Inventors: Roland Kontermann; Daniel Miller; Rolf Mueller
Original assignee: Vectron Therapeutics AG
Current assignee: Vectron Therapeutics AG
Priority date: 2000-09-04
Filing date: 2000-09-04
Publication date: 2002-04-11
Also published as: CA2421202A1; WO2002020614A2; EP1315760A2; WO2002020614A3; US20040053329A1; JP2004508035A

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen humanen Antikörper, der gegen die extrazelluräre Domäne des humanen Endoglin (CD105) Proteins gerichtet ist, sowie seine Verwendung.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen humanen Antikörper, der gegen die ex trazelluläre Domäne des humanen Endoglin (CD105) Proteins gerichtet ist, sowie seine Verwendung.

Die vaskulare Zielsteuerung, d. h. die selektive Erkennung von Zellen oder Struk turen des Gefäßbettes stellt ein relativ neues Konzept in der Medizin dar. Hier durch soll erreicht werden, daß bestimmte diagnostisch bzw. therapeutisch ein setzbare Komponenten gezielt in das Gefäßbett transportiert werden. Anwendun gen findet dieser Ansatz u. a. in der Tumortherapie (Thorpe & Burrows, 1995, Breast Cancer Res. Treat. 36, 237-251). Hierbei wird, z. B. durch Verknüpfung mit einer zytotoxischen Komponente, das Tumorgefäßbett gezielt attackiert und eli miniert. Dies führt zu einer Unterbrechung der Versorgung des Tumorgewebes mit Sauerstoff (Hypoxie) und Nährstoffen. Die Folge ist eine Nekrotisierung des Tumors. Anwendungen findet dieser Ansatz auch in der Gentherapie, z. B. für die zielgerichtete Transduktion von Endothelzellen mit gentherapeutischen Vektoren (z. B. Viren, Liposomen, DNA-Protein-Komplexe) (Wickham et al., 1997, J. Vi rol. 71, 8221-8229).

Voraussetzung für eine vaskulare Zielsteuerung sind Liganden, die spezifische Strukturen im Gefäßbett erkennen. Beispiele hierfür stellen Peptide oder Proteine dar, die an bestimmte Rezeptoren oder andere Oberflächenmoleküle auf den En dothelzellen binden. Solche Rezeptoren sind z. B. die VEGF-Rezeptoren oder die α_v-Integrine (Burrows & Thorpe, 1994, Pharmac. Ther. 64, 155-174). Des weite ren können Antikörperfragmente, die spezifische Strukturen im Gefäßbett erken nen, zum Einsatz kommen. In der Literatur wurden u. a. Antikörper gegen Endo glin (CD105), bei dem es sich um ein Mitglied der TGF-β Familie handelt, be schrieben. Endoglin wird von Zellen des proliferierenden Tumorendothels deut lich überexprimiert (Miller et al., 1998, Int. J. Cancer 81, 568-572). Die beschriebenen Antikörper stammen aus der Maus und führen in der Regel in therapeuti schen Anwendungen im Menschen zur Bildung von humanen anti-Maus Antikör pern (HAMA), die zur Neutralisierung der therapeutischen Antikörper führen. Die Anwendung von Antikörper aus der Maus oder auch anderen Organismen für the rapeutische Zwecke ist deshalb stark limitiert.

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung war es deshalb einen humanen Antikörper gegen Endoglin (CD105) bereitzustellen, der für die Rekrutierung von beispiels weise zytotoxischen Substanzen, Liposomen oder Viren an Tumorendothel geeig net ist.

Überraschend konnte in der vorliegenden Erfindung nun ein humaner Antikörper isoliert werden, der die Infektion humaner Endothelzellen mit einem Adenovirus deutlich verbessert.

Gegenstand der Erfindung ist demnach ein humaner Antikörper, der gegen die extrazelluläre Region des humanen Endoglinproteins (CD105) gerichtet ist. Dieser Antikörper kann durch Bindung an Endoglin-exprimierende Zellen sowohl für diagnostische als auch therapeutische Anwendungen eingesetzt werden. Der Be griff "human" im Sinne der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf Antikörper, deren Aminosäuresequenz eine hohe Homologie zu den konstanten und/oder va riablen Regionen der humanen schweren (V_H und C_H) und/oder leichten Ketten (V_L und C_L) aufweisen und die deshalb im Menschen nicht oder nur im geringen Maße immunogen sind. Eine Homologie liegt dann vor, wenn der erfindungsge mäße humane Antikörper an entsprechenden Position in seiner primär, sekundär oder tertiär Struktur die selben oder ähnliche Aminosäurereste hat. Eine hohe Homologie bedeutet, daß mindestens 70%, vorzugsweise 80%, besonders bevor zugt 90%, insbesondere 95% der Aminosäurereste homolog sind. Aufgrund der geringen Immunogenität besitzt der erfindungsgemäße Antikörper, gerade für therapeutische Anwendungen, gegenüber den bisher beschriebenen murinen Antikörpern deutliche Vorteile, da keine neutralisierenden Antikörper gebildet wer den.

Ein Antikörper im Sinne der vorliegenden Erfindung ist ein Immunglobulin, das natürlichen, teilsynthetischen oder vollsynthetischen Ursprungs sein kann. Bei spiele sind die Immunglobulinisotypen sowie Teile des Antikörpers, wie bei spielsweise die Fab, F(ab¹)₂, "single chain Fv" (scFv), Fv dAb oder Fd- Fragmente, solange sie spezifisch an humanes Endoglin binden. Ein scFv enthält mindestens eine Komponente eines Antikörperdimers (V_L und/oder V_H) auf einem Polypeptid, die für die Bindung an Endoglin nötig ist. Im folgenden werden die Begriffe Polypeptid und Protein synonym für Aminosäureketten von 50 oder mehr Aminosäuren verwendet. Antikörper, die über zwei oder mehrere identische Bin dungsstellen verfügen, haben eine erhöhte funktionelle Affinität (= Bindungsstär ke) und sind deshalb bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen An tikörpers. Antikörper mit erhöhter Affinität zu Endoglin können beispielsweise in Form eines Diabodies (= scFv-Dimer) (Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448), als einzelkettiges mehrfachantigen bindendes Molekül (Brüsselbach et al., 1999, Tumor Targeting 4, 115-123), als Tandern-scFv oder in Fusion mit dimerisierenden Regionen von Immunglobulinen, bzw. dimerisieren den Peptiden und Regionen anderer Proteine vorliegen (Plückthun & Pack, 1997, Immunotechnology 3, 83-105).

Eine bevorzugte Ausführungsform des Antikörpers der vorliegenden Erfindung ist ein Antikörper, der eine oder mehrere Aminosäuredomänen mit einer Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 und/oder SEQ ID Nr. 2 enthält. Eine Aminosäuredomäne im Sinne der vorliegenden Erfindung hat eine Länge zwischen 80 und 150 Ami nosäuren, vorzugsweise zwischen 100 und 120 Aminosäuren und enthält Sequen zen der humanen V_L und/oder V_H-Region. In einer besonders bevorzugten Aus führungsform enthält der Antikörper jeweils eine Aminosäuredomäne gemäß SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2.

Vorzugsweise ist in dem erfindungsgemäßen Antikörper zwischen zwei Ami nosäuredomänen ein Peptidlinker angeordnet. Dieser Peptidlinker hat eine Länge von ca. 12 bis 25 Aminosäuren. Der Peptidlinker dient zur räumlichen Separation der Domänen und erleichtert die Bindung an Endoglin. Für die Separation der Aminosäuredomänen ist insbesondere ein Peptidlinker mit einer Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 3 geeignet.

Um die Herstellung des Antikörpers zu erleichtern, der beispielsweise in einer geeigneten Zelle rekombinant exprimiert wird, enthält der Antikörper in einer bevorzugten Ausführungsform ein oder mehrere Sezernierungssignale. Durch diese Sezernierungssignale wird der erfindungsgemäße Antikörper von der Zelle ins Periplasma ausgeschieden und kann direkt aus dem Kulturmedium der Pro duktionszellinie gewonnen werden. Als Sezernierungssignal ist insbesondere die pe1B Sezernierungssignalsequenz (Lei et al., 1987, J. Bacteriol. 169, 4379-4383) mit einer Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 4 geeignet.

Ein besonders bevorzugter Antikörper enthält eine Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 5. Hierbei ist die pe1B Sezernierungssignalsequenz N-terminal angeordnet, wobei in Richtung des C-Terminus die Aminosäuredömane gemäß SEQ ID Nr. 1, der Pep tidlinker gemäß SEQ ID Nr. 3 und die Aminosäuredömane gemäß SEQ ID Nr. 2 angeordnet sind. Zusätzlich enthält der Antikörper noch eine Hexahistidylsequenz (6 × His-Tag) (Hochuli et al., 1988, Bio/Technol. 6, 1321-1325), die die Reini gung des Antikörpers über beispielsweise eine Ni²⁺-Affinitätssäule erlaubt, sowie ein Peptid, das von dem anti-Myc-Antikörper 9E10 (Munro & Pelham, 1986, Cell 46, 291-300) erkannt wird.

Insbesondere besteht der rekombinante humane Antikörper (Bezeichnung: C4) aus einer variablen schweren (V_H) und einer variablen leichten (V_L) Domäne. Im Antikörper liegen die variablen Domänen in Form eines einzelkettigen Fv- Fragments (single-chain Fv, scFv; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879-5883)) vor (Abb. 1). Hierfür ist die VH-Domäne über ein flexibles 14 Aminosäuren langes Peptid mit der V_L-Domäne verbunden. Für die Expression in Bakterien befindet sich am N-Terminus eine bakterielle Signalsequenz für den Transport in das Periplasma (Lei et al., 1987, supra). Der C-Terminus enthält zu sätzlich kurze Sequenzen für die Reinigung und Detektion. Dies sind eine Hexahi stidyl-Sequenz (Hochuli et al., 1988, supra; Hoffmann & Roeder, 1991, Nucl. Acids Res., 19, 6337-6338) und das Epitop für den anti-Myc Antikörper 9E10 (Munro & Pelham, 1986, supra).

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Antikörper, der eine Variante eines der vorangehend beschriebenen Antikörper darstellt. Eine Variante des Antikörpers ist ein Antikörper, der auf Aminosäureebene eine Homologie von 60%, vorzugsweise 70%, besonders bevorzugt 80%, insbesondere 90% besitzt und spezifisch an die extrazelluläre Domäne von humanen Endoglin bindet. Die Bestimmung der Homologie kann beispielsweise mit einem Programm wie ALIGN, das im Internet zugänglich ist (beispielsweise unter http://www.hgse.bcm.tmc.edu/SearchLaun-cher/) durchgeführt werden. Vorzugs weise sind die Änderung der Aminosäuresequenz sogenannte konservative Ände rungen, wie beispielsweise Asparaginsäure zu Glutaminsäure oder Leucin zu Iso leucin. Die spezifische Bindung kann durch Standardtests, wie beispielsweise ELISA nachgewiesen werden.

Der erfindungsgemäße Antikörper kann auch mit mindestens einem Peptid und/oder einem Protein fusioniert vorliegen. Als Peptid werden Aminosäurese quenzen von weniger als 50 Aminosäuren bezeichnet. Eine Fusion liegt dann vor, wenn die Aminosäuren des Antikörpers über eine Peptidbindung mit dem Peptid und/oder dem Protein verknüpft sind. Vorzugsweise wird das Fusionsprotein zu sammenhängend translatiert und von einer mRNA kodiert. Geeignete Proteine und Peptide sind beispielsweise Enzyme, Wachstumsfaktoren, Hormone, Zytoki ne, Chemokine, virale Hüllproteine, und/oder Antikörper. Die Fusion mit einem Zytokin oder Chemokin erlaubt beispielsweise die Rekrutierung einer für die Zielzelle toxischen Substanz und ermöglicht damit die gezielte Abtötung von beispielsweise Tumorendothelzellen. Die Fusion mit einem viralen Hüllprotein er laubt die Herstellung von rekombinanten Viren, die auf ihrer Oberfläche einen Antikörper tragen, der für Endoglin spezifisch ist und damit die Rekrutierung des jeweiligen rekombinanten Virus zu Endothelzellen. Ein geeignetes Hüllprotein ist beispielsweise das Adenovirus Fiberprotein. Ein ähnliches Ziel kann auch durch die Fusion mit einem zweiten Antikörper, vorzugsweise mit einem scFv-Fragment erreicht werden, wenn dieser spezifisch an ein bestimmtes Virus bindet. Geeignet sind auch Peptide oder Protein, die von viralen Oberflächenmolekülen oder einem Antikörper erkannt werden.

In einer bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Antikörpers intera giert das Protein oder das Peptid mit einem Rezeptor. Geeignete Rezeptoren sind beispielsweise Rezeptoren auf Zellen des Immunsystems, die durch die Interakti on zu Endothelzellen rekrutiert werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Antikörper, der an mindestens eine Komponente gekoppelt ist. Unter Kopplung versteht man die kovalente oder nicht-kovalente Bindung einer Komponente an den Antikörper, wobei der Antikörper und die Komponente nicht zusammen translatiert und nicht von einer mRNA kodiert werden. Eine kovalente Kopplung kann beispielsweise durch Formaldehyd, Glutaraldehyd oder über eine Peptidbindung erfolgen. Eine nicht-kovalente Kopplung wird beispielsweise durch Inkubation eines erfindungs gemäßen Antikörpers, der mit einem Peptid oder Protein fusioniert ist, das spezi fisch an die Knobdomöne des adenoviralen Fiberproteins bindet, mit Adenovirus erhalten. Bevorzugte Komponenten sind Peptide, Proteine, Enzyme, Wachstums faktoren, Hormone, Zytokine, Chemokine, virale Hüllproteine, Kohlenhydrate, Antikörper, Lipide, Isotope, Liposomen, Viren, Virusähnliche Partikel, Nuklein säuren, und/oder Zellen. Die Nukleinsäuren, die an die erfindungsgemäßen Anti körper gekoppelt werden können "nackt" vorliegen oder beispielsweise mit poly- Lysin kondensiert sein.

Die Kopplung der erfindungsgemäßen Antikörper an Liposomen ist eine beson ders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, da Liposomen mit den verschiedensten therapeutisch wirksamen Substanzen beladen werden kön nen. Die erfindungsgemäß Liposomen enthalten bevorzugt mindestens eine anti sense RNA, mindestens ein Chemotherapeutikum, mindestens eine Nukleinsäure kodierend für einen Wirkstoff oder mindestens eine aktive Substanz enthält. Die antisense RNA kann zum Beispiel die Translation von Genen inhibieren, die für die Zellteilung benötigt werden. Chemotherapeutika umfassen Substanzen wie beispielsweise Doxirubicin, cis-Platin oder Taxol. Dem Fachmann sind weitere Chemotherapeutika bekannt, die in der Tumortherapie eingesetzt werden und die von der vorliegenden Erfindung auch umfaßt sind. Ein Wirkstoff, der von einer im Liposomen enthaltenden Nukleinsäure kodiert wird kann zum Beispiel ein Inhi bitor der Zellproliferation sein. Geeignete Proteine sind dem Fachmann bekannt und umfassen Antionkogene, wie beispielsweise p53 oder pRb, sowie Zellzyklu sinhibitoren, wie beispielsweise p21^WAF, p16^INK, p57^INK2, p27^KIP oder GADD45. Des weiteren können die Nukleinsäuren auch für zytostatische oder zytotoxische Proteine, wie zum Beispiel für Perform, Granzym, IL-2, IL-4, IL-12 oder Onco statin M kodieren. Eine aktive Substanz kann jede pharmakologisch wirksame Substanz sein, die beispielsweise zur Therapie von Erkrankungen an denen En dothelzellen beteiligt sind, geeignet ist.

In einer bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Antikörpers intera giert die Komponente mit einem Rezeptor. Geeignete Rezeptoren sind beispiels weise Rezeptoren auf Zellen des Immunsystems, die durch die Interaktion zu En dothelzellen rekrutiert werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Aminosäuresequenz, die eine oder mehrere Aminosäuredomänen mit einer Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 und/oder SEQ ID Nr. 2 enthält. In einer weiteren Ausführungsform der erfin dungsgemäßen Aminosäuresequenz ist jeweils zwischen den Aminosäuredomänen ein Peptidlinker von ca. 12 bis 25 Aminosäuren Länge angeordnet. Die ser Peptidlinker enthält vorzugsweise eine Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 3.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Aminosäuresequenz eine oder mehrere Sezernierungssignalsequenzen. Durch diese Signalsequenzen wird si chergestellt, daß die erfindungsgemäße Aminosäuresequenz bei der Herstellung in einer Wirtszelle von der Wirtszelle in das Wachstumsmedium ausgeschieden wird. In einer Ausführungsform können die Sezernierungssignalsequenzen abge spalten werden. Dieses kann beispielsweise durch das Einfügen von Peptidse quenzen, die von Endopeptidasen erkannt und gespalten werden oder durch das Einfügen von beispielsweise Intein erfolgen. Die Abspaltung der Sezernierungs signalsequenzen kann dann von Vorteil sein, wenn die Sezernierungssignalse quenzen im Menschen immunogen sind und durch die Abspaltung der Sequenzen die Immunogenität des erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz verringert wird. In einer weiteren Ausführungsform ist die Sezernierungssignalsequenz nicht ab spaltbar. Eine bevorzugte Sezernierungssignalsequenz enthält eine Sequenz ge mäß SEQ ID Nr. 4.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Aminosäuresequenz, die eine oder mehrere Sequenzen gemäß SEQ ID Nr. 5. enthält. In dieser Ami nosäuresequenz ist die pe1B Sezernierungssignalsequenz N-terminal angeordnet, wobei in Richtung des C-Terminus die Aminosäuredömane gemäß SEQ ID Nr. 1, der Peptidlinker gemäß SEQ ID Nr. 3 und die Aminosäuredömane gemäß SEQ ID Nr. 2 angeordnet sind. Zusätzlich enthält die Aminosäuresequenz noch eine Hexahistidylsequenz (6 × His-Tag) (Hochuli et al., 1988, Bio/Technol. 6, 1321- 1325), sowie eine Peptidsequenz, die von dem anti-Myc-Antikörper 9E10 (Munro & Pelham, 1986, Cell 46, 291-300) erkannt wird.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Aminosäuresequenz die eine Variante der vorangehend beschriebenen erfindungsgemäßen Aminosäu resequenz darstellt. Eine Variante bedeutet, daß die Aminosäuresequenz eine Homologie von 60%, vorzugsweise 70%, besonders bevorzugt 80%, insbesondere 90% besitzt. Die Bestimmung der Homologie kann beispielsweise mit einem Pro gramm wie ALIGN, das im Internet zugänglich ist (zum Beispiel unter http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/SearchLauncher/) durchgeführt werden. Vorzugs weise sind die Änderung der Aminosäuresequenz sogenannte konservative Ände rungen, wie beispielsweise Asparaginsäure zu Glutaminsäure oder Leucin zu Iso leucin.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure, die für einen erfindungsgemäßen Antikörper und/oder für eine erfindungsgemäße Ami nosäuresequenz kodiert. Es ist bekannt, daß kleine Veränderungen in der Sequenz einer Nukleinsäuren vorhanden sein können, zum Beispiel durch die Degenerie rung des genetischen Codes, oder daß nicht translatierte Sequenzen an das 5' und/oder 3'-Ende der Nukleinsäure angehängt sein können, ohne daß das der ko dierte Antikörper oder die kodierte Aminosäuresequenz wesentlich verändert wird. Diese Erfindung umfaßt deshalb auch sogenannte "Varianten" der vorange hend beschriebenen Nukleinsäuren.

Unter Varianten der Nukleinsäuren sind alle Nukleinsäuresequenzen zu verstehen, die komplementär zu einer Nukleinsäuresequenz sind, die unter stringenten Be dingungen mit der Referenzsequenz hybridisieren und die für Proteine kodieren, die spezifisch an humanes Endoglin binden.

Unter "stringenten Hybridisierungsbedingungen" sind solche Bedingungen zu verstehen, bei denen eine Hybridisierung bei 60°C in 2,5 × SSC-Puffer, gefolgt von mehreren Waschschritten bei 37°C in einer geringeren Pufferkonzentration erfolgt und stabil bleibt.

Um die Einführung der genannten Nukleinsäure und damit die Expression des Polypeptids in einer eu- oder prokaryotischen Zelle durch Transfektion, Transformation oder Infektion zu ermöglichen, kann die Nukleinsäure als Plasmid, als Teil eines viralen, oder nicht viralen Vektors vorliegen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist deshalb ein Vektor, ins besondere ein Expressionsvektor, der eine Nukleinsäure codierend für ein erfin dungsgemäßen Antikörper oder eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz ent hält. Als virale Vektoren eignen sich hierbei besonders Baculoviren, Vakziniavi ren, Adenoviren, adenoassoziierte Viren und Herpesviren. Als nicht virale Vekto ren eignen sich hierbei besonders Virosomen, Liposomen, kationische Lipide, oder poly-Lysin konjugierte DNA.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Zelle, die mit minde stens einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure und/oder mit mindestens einem er findungsgemäßen Vektor transfiziert, transformiert oder infiziert ist. Diese Zelle exprimiert unter dem Fachmann bekannten Bedingungen, die zur Aktivierung der jeweils verwendeten regulierbaren Elemente führen, den erfindungsgemäßen An tikörper oder die erfindungsgemäße Aminosäuresequenz. Der Antikörper oder die Aminosäuresequenz kann dann aus der Zelle isoliert werden oder wird von der Zelle sezerniert. Zur gentechnischen Herstellung und anschließenden Aufreini gung der exprimierten, erfindungsgemäßen Verbindungen eignen sich prokaryoti sche und eukaryotische Zellen, insbesondere Bakterienzellen wie beispielsweise E. coli, Hefezellen wie beispielsweise S. cerevisiae, Insekten Zellen wie bei spielsweise Spodoptera frugiperda Zellen (Sf-9) oder Trichoplusia ni Zellen oder Säugerzellen wie beispielsweise COS-Zellen oder HeLa-Zellen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist deshalb ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Antikörpers oder einer erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz, bei dem mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in einer Zelle exprimiert wird. Wenn der erfindungsgemäße Antikörper oder die erfindungsgemäße Aminosäuresequenz eine abspaltbare Sezernierungssignalse quenz enthält, kann diese in einem weiteren Schritt beispielsweise durch Inkuba tion mit einer geeigneten Endopeptidase oder im Falle von Intein, durch das Zu fügen von Dithiothreitol (DTT) zum Medium, abgespalten werden.

Wenn an den erfindungsgemäße Antikörper oder an die erfindungsgemäße Ami nosäuresequenz eine Komponente gekoppelt werden soll, kann diese Kopplung in einem weiteren Schritt durch Inkubation oder chemische Reaktion mit einer Komponente erfolgen.

Der erfindungsgemäße Antikörper oder die erfindungsgemäße Aminosäure kann als diagnostisches Werkzeug eingesetzt werden. Ein weiterer Gegenstand der vor liegenden Erfindung ist demnach die Verwendung mindestens eines Antikörpers oder einer Aminosäuresequenz zum Nachweis von Endoglin und/oder Endoglin- exprimierenden Zellen oder Zellbestandteilen in vitro und/oder in vivo.

Die Detektion kann direkt durch Fusion oder Kopplung einer nachweisbaren Komponente erfolgen (z. B. mit einem Enzym oder einem Radioisotop) oder indi rekt durch eine markierte Komponente, die den erfindungsgemäßen anti-Endoglin Antikörper erkennt. Bevorzugt verwendete Nachweisverfahren sind ELISA, RIA, Immunfluoresenz, Immunpräzipitation oder Immunscintillation.

Der gegen Endoglin gerichtete erfindungsgemäße Antikörper oder die erfindungs gemäße Aminosäuresequenz kann ferner als Ligand dienen, um gezielt Endoglin- exprimierende Zellen (z. B. Tumorendothelzellen) zu erkennen und zu binden. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach die Verwendung mindestens eines Antikörpers oder einer Aminosäuresequenz zur Bindung an En doglin-exprimierende Zellen.

Durch die Verbindung mit einem zweiten Liganden durch Kopplung oder Fusion kann hierdurch mindestens ein Peptid, mindestens ein Protein oder mindestens eine Komponente zu Endoglin-exprimierenden Zellen rekrutiert werden. Dieser zweite Ligand kann ein weiteres Antikörpermolekül oder -fragment, ein Ligand für einen zellulären Rezeptor, ein Peptid das einen Rezeptor auf Zellen erkennt.

In einer bevorzugten Verwendung wirkt der erfindungsgemäße Antikörper oder die erfindungsgemäße Aminosäuresequenz auf die Endoglin-exprimierende Zelle zytotoxisch. Dieses Effekt wird beispielsweise durch die Rekrutierung von zyto toxischen T-Zellen, die Fusion oder Kopplung mit Zytokinen oder Enzymen, wie beispielsweise "prodrug converting enzymes", erreicht.

In einer weiteren Verwendung der erfindungsgemäße Antikörpers oder der erfin dungsgemäßen Aminosäuresequenz führt die Bindung an die Endoglin- exprimierenden Zelle zur Infektion, Transduktion bzw. Transfektion der Zelle mit einem Virus, einem virusähnlichen Partikel, einem Liposom, und/oder einer Nu kleinsäure.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung minde stens eines Antikörpers, mindestens einer Aminosäuresequenz, mindestens einer Nukleinsäure und/oder mindestens eines Vektors wie vorangehend beschrieben zur Therapie von Erkrankungen an denen Endothelzellen beteiligt sind. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Antikörper, Ami nosäuresequenzen, Nukleinsäure und/oder Vektoren zur Therapie von Erkrankun gen verwendet, die durch die Hyperproliferation von Endoglin-exprimierenden Zellen charakterisiert sind. Hyperproliferation von Endothelzellen wird beispiels weise bei der Neovaskularisierung von Tumorgewebe beobachtet, deshalb ist die Therapie von Tumorerkrankungen eine besonders bevorzugte Verwendung der erfindungsgemäßen Antikörper, Aminosäuresequenzen, Nukleinsäuren und/oder Vektoren.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Arzneimittel oder Diagnostikum, das mindestens einen Antikörper, mindestens eine Aminosäuresequenz, mindestens eine Nukleinsäure, und/oder mindestens einen Vektor wie vor angehend beschrieben und gegebenenfalls geeignete Hilfs- und Zusatzstoffe ent hält. Geeignete Hilfs- und Zusatzstoffe führen beispielsweise zur Verbesserung der Lagerfähigkeit sowie zur Verbesserung der Verträglichkeit oder Erhöhung der Verfügbarkeit des erfindungsgemäßen Arzneimittels oder Diagnostikums und sind dem Fachmann bekannt.

Die folgende Abbildung und die folgenden Beispiele sollen die Erfindung ledig lich näher beschreiben ohne sie zu beschränken.

Abb. 1: Die DNA-Sequenz und davon abgeleitete Proteinsequenz des erfindungs gemäßen anti-Endoglin Antikörperfragments C4 in Form eines scFv-Fragments. Die Signalsequenz, das verbindende Peptid sowie die C-terminalen Sequenzen für Reinigung und Detektion sind unterstrichen. Die einzelnen Nukleotidbereiche haben die folgende Bedeutung:
Nukleotide 1-42: 5' untranslatierte Region
Nukleotide 43-106: DNA kodierend für pelB Signalsequenz (Lei et al., 1987, J. Bacteriol. 169, 4379-4383)
Nukleotide 107-465: DNA kodierend für humane VH-Domäne (semisynthetisch besteht aus Keimbahn V-Gen und synthetischer CDR3- FR4-Region) (Griffiths et al., 1994, EMBO J. 13, 3245- 3260)
Nukleotide 466-505: DNA kodierend für artifizielle Peptidsequenz (Huston et al., 1988)
Nukleotide 506-828: DNA kodierend für humane VL-Domäne (semisynthetisch besteht aus Keimbahn V-Gen und synthetischer CDR3- FR4-Region) (Griffiths et al., 1994, EMBO J. 13, 3245- 3260)
Nukleotide 829-837: DNA kodierend für artifizielle Peptidsequenz
Nukleotide 838-855: DNA kodierend für Hexahistidyl-Sequenz (Hochuli et al., 1988, Bio/Technol. 6, 1321-1325)
Nukleotide 856-864: DNA kodierend für artifizielle Peptidsequenz
Nukleotide 865-897: DNA kodierend für Epitop des anti-Myc-Antikörpers 9E10 (Munro & Pelham, 1986, Cell 46, 291-300)
Nukleotide 898-906: DNA kodierend für artifizielle Peptidsequenz

Beispiele Beispiel 1 Nachweis von Endoglin auf primären Endothelzellen

Das in Abb. 1 dargestellte einzelkettige Fv-Antikörperfragment scFv C4, das durch Phage-Display isoliert wurde (Kontermann 2000, Antibody Engineering, Springer Verlag), das im Expressionsplasmid pHEN2 (MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK) vorlag, wurde nach Induktion der Pro teinexpression durch Zugabe von Isopropyl-β-D-Galaktopyranosid (IPTG) aus periplasmatischen Extrakten von TG1-Bakterien mittels immobilisierter Metallaf finitätschromatographie aufgereinigt. Hierfür wurden pro Liter LB-Medium, das mit 100 µg/ml Ampicillin und 0,1% Glucose versetzt war, 10 ml einer Übernacht kultur von scFv C4 zugegeben und bei 37°C geschüttelt. Beim Erreichen einer OD₆₀₀ von 0.8 wurde 1 mM Endkonzentration IPTG zugegeben und die Bakterien bei Raumtemperatur für 3 Std. geschüttelt. Die Bakterien wurden abzentrifugiert und das Pellet mit Extraktionspuffer (30 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA, 20% Saccharose) resuspendiert. Nach einer Inkubation von 15 min auf Eis wurde MgCl₂ in einer Endkonzentration von 5 mM zugegeben und die Lösung erneut zentrifugiert. Der Überstand wurde gegen IMAC-Ladepuffer dialysiert (50 mM Natriumphosphatpuffer pH 7.5, 500 mM NaCl, 20 mM Imidazol). Das Dialysat wurde auf eine Ni-NTA-beladene Säule (Qiagen), die mit Ladepuffer äquilibriert war, geladen, mit Waschpuffer (50 mM Natriumphosphatpuffer pH 7.5, 500 mM NaCl, 35 mM Imidazol) gewaschen und das gebundene Antikörperfragment anschließend mit Elutionspuffer (50 mM Natriumphosphatpuffer pH 7.5, 500 mM NaCl, 100 mM Imidazol) eluiert.

Das gereinigte Antikörperfragment wurde zum Nachweis von Endoglin ein gesetzt. Die Detektion des gebundenen Antikörperfragments scFv C4 erfolgte hierbei indirekt mit Hilfe monoklonaler Antikörper, die entweder gegen die Hexa histidylsequenz oder gegen das Myc-Epitop gerichtet waren. Endoglin von primä ren humanen Nabelschnurendothelzellen (HUVEC) wurde mittels Immunpräzipa tion unter nichtdenaturierenden Bedingungen nachgewiesen. Hierfür wurden die [³⁵S]-Methionin-markierten Endothelzellen mit Lysepuffer (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% Natriumdesoxycholat, 1% Nonidet P40) für 30 min bei 4°C lysiert. Nach einem Ultrazentrifugationsschritt bei 40 000 Upm für 20 min wurde der Überstand mit 5 µg scFv C4, 5 µg eines negativen Kontroll-scFv oder 5 µl des murinen anti-Endoglin Antikörper SN6h (REF) versetzt und 1 Std. bei 4°C inkubiert. Anschließend erfolgte eine Inkubation mit dem anti-Myc-Antikörper 9E10 (Munro & Pelham, 1986, Cell 46, 291-300) und nachfolgend mit Protein A- Sepharose, jeweils für 30 min bei 4°C. Die Komplexe wurden mehrmals mit Ly sepuffer gewaschen und abschließend in 20 µl SDS-PAGE Ladepuffer resuspen diert. Nach Auftrennung im SDS-Polyakrylamidgel wurde das Gel für 30 min in 30% Methanol und 10% Essigsäure fixiert und anschließend mit Amplifikations lösung versetzt (Amersham-Buchler). Das Gel wurde getrocknet und mit einem Röntgenfilm exponiert.

Es zeigte sich, daß das Antikörperfragment scFv C4 spezifisch eine Bande präzipitierte, die identisch war mit der des murinen anti-Endoglin Antikörpers SN6h, während diese Bande mit dem negativen Kontroll-Antikörper nicht nach zuweisen war. Somit konnte mit scFv C4 spezifisch Endoglin in Extrakten von primären Endothelzellen nachgewiesen werden.

In weiteren Experimenten erfolgte der Nachweis von Endoglin auf Zellen mittels Immunfluoreszenz. Hierfür wurden verschiedene Endothelzellen (HUVEC, HMVEC, HDMEC, HMEC) und Nichtendothelzellen (A549, HEK293) mit scFv C4 mit einer Konzentration von 5-25 µg/ml bzw. mit dem negativen sowie dem positiven Kontrollantikörper für 30 min bei 4°C inkubiert. Anschlie ßend wurden die rekombinanten Antikörper mit dem anti-Myc-Antikörper 9E10 für 30 min bei 4°C inkubiert. Abschließend wurden alle Ansätze mit einem Cy3- markierten anti-Maus Antikörper inkubiert. Der Nachweis der gebundenen Anti körper erfolgte entweder mittels Fluoresenzmikroskopie oder Durchflußzytome trie.

In diesen Experimenten konnte eine spezifische Fluoreszenz von Endoglin- exprimierenden Endothelzellen nachgewiesen werden, während verschiedene En doglin-negative Zellen keine Reaktion zeigten. Dabei zeigte sich eine typische Oberflächenfärbung der Zellen, wie es für ein Membranprotein zu erwarten war.

Beispiel 2 Ein bispezifisches einzelkettiges mehrfachantigenbindendes Molekül für eine zielgerichtete Transduktion von Endothelzellen mit Adenoviren

Die Konstruktion eines bispezifischen einzelkettigen mehrfachantigen bindenden Moleküls (hierbei wird auch Bezug genommen auf die Patentanmel dung DE 198 16 141 und EP 0 952 218), das gegen Endoglin und die Knobdomä ne des Fiberproteins von Adenoviren des Serotyps 5 gerichtet ist, erfolgte auf DNA-Ebene wie folgt. Mittels Polymerasekettenreaktion wurde an das V_L- Fragment von scFv C4 Sequenzen angehängt, die am 5'-Ende für eine BstEII- Restriktionsendonukleaseschnittstelle und einen fünf Aminosäuren langes Ver bindungspeptid und am 3'-Ende acht Aminosäuren des mittleren Verbindungs peptids sowie eine AscI-Restriktionsendonukleaseschnittstelle kodieren. Auf glei che Weise wurde an das V_H-Fragment von scFv C4 Sequenzen angehängt, die am 5'-Ende für sieben Aminosäuren des mittleren Verbindungspeptids sowie eine AscI-Restriktionsendonukleaseschnittstelle und am 3'-Ende für eine SacI- Restriktionsendonukleaseschnittstelle und einen fünf Aminosäuren langes Ver bindungspeptid kodieren. Diese Fragmente wurden in das Plasmid pAB1-scFv S11 kloniert. ScFv S11 bindet an die Knobdomäne des Fiberproteins und neutrali siert durch diese Bindung die Wildtypinfektion. Das resultierende bispezifische einzelkettige mehrfachantigen-bindende Molekül (EDG-Ad) hat die Struktur VHS11-PeptidA-VLC4-PeptidM-VHC4-PeptidB-VLS11. Peptid A und B haben jeweils die Sequenz GGGGS und Peptid M die Sequenz GGGGSGGRASGGGGGS. Das monomere Molekül besitzt ein Molekularge wicht von etwa 58 kDa und besitzt je eine Bindestelle für Endoglin und die Knob domäne. Das bispezifische einzelkettige mehrfachantigenbindende Molekül wurde wie in Beispiel 1 beschrieben aus dem Periplasma von induzierten Bakterien ge reinigt. Bindungsstudien zeigten, daß dieses Molekül voll funktionsfähig war. Es erkannte die Knobdomäne im ELISA und Endoglin-exprimierende HUVEC in der Immunfluoreszenz.

Um die adenovirale Transduktion zu untersuchen wurden 2 × 10³ HUVECs oder 3.5 × 10³ A549-Zellen zwei Tage vor der Infektion mit Viren auf 96- Lochplatten ausplattiert. AdCMVLacZ, das das lacZ-Gen unter der Kontrolle des CMV-Promotors exprimiert, wurden mit dem bispezifischen einzelkettigen mehr fachantigenbindenden Antikörperfragment EDG-Ad für 1 Std. bei 37°C inkubiert und anschließend für 1 Std. zu den Zellen gegeben. Als Kontrolle dienten Viren, die nicht mit dem Antikörperfragment inkubiert wurden. Die Expression der β- Galaktosidase erfolgte mittels X-Gal-Färbung. Hierfür wurden die Zellen nach einem PBS-Waschschritt mit 0.1% Glutaraldehyd fixiert, nochmals mit PBS gewa schen und anschließend mit in 0.8 mg/ml X-Gal, 3 mM K₃Fe(CN)₆, und 3 mM K₄Fe(CN)₆ in PBS bei 37°C inkubiert.

Diese Experimente ergaben, daß Adenoviren alleine nur eine sehr schwache Transduktion bei dem verwendeten Virustiter (8 × 10⁵ pfu) zeigten. Durch Kom plexierung mit EDG-Ad wurde diese jedoch deutlich erhöht. Diese erhöhte, durch EDG-Ad-vermittelte Transduktion war abhängig von der Anwesenheit von Endo glin auf den Zielzellen. So wurden Endoglin-negative Zellen (z. B. A549) nicht verstärkt transduziert. Ferner wurde die EDG-Ad-vermittelte Transduktion von HUVEC durch Präinkubation mit scFv C4 inhibiert. Im Gegensatz dazu hatte die lösliche Knobdomäne, die die Wildtyptransduktion komplett durch Bindung an den primären Rezeptor (Coxsackie-Adenovirus-Rezeptor CAR) inhibiert, keinen Einfluß auf die EDG-Ad-vermittelte Transduktion. Auch die Präinkubation mit einem RGD-Peptid, das die Interaktion der adenoviralen Pentonbasis mit dem sekundären Rezeptor (α_v-Integrin) inhibiert und hierdurch ebenfalls die Wildtyp transduktion verhindert, hatte ebenfalls keinen Einfluß auf die EDG-Ad- vermittelte Transduktion. Somit ist die EDG-Ad-vermittelte Transduktion von Endoglin-exprimierenden Zelten unabhängig von der Anwesenheit der adenovira len Rezeptoren. Die EDG-Ad-vermittelte Transduktion erfolgt vielmehr direkt bzw. indirekt über Endoglin. Die Ergebnisse belegen, daß es möglich ist mit Hilfe eines bispezifischen Moleküls, das gegen Endoglin und ein Virushüllprotein ge richtet ist, Viren gezielt zu Endoglin-exprimierenden Endothelzellen zu rekrutie ren.

Sequenzprotokoll

Claims

1. Humaner Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper gegen die extrazelluläre Domäne des humanen Endoglin (CD105) Proteins gerichtet ist.

2. Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper eine oder mehrere Aminosäuredomänen mit einer Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 und/oder SEQ ID Nr. 2 enthält.

3. Antikörper nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß jeweils zwischen den Aminosäuredomänen ein Peptidlinker von ca. 12 bis 25 Aminosäuren Länge angeordnet ist.

4. Antikörper nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Peptidlinker eine Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 3 enthält.

5. Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein oder mehrere Sezernierungssignale enthält.

6. Antikörper nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Sezernierungs signal eine Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 4 enthält.

7. Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper eine Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 5 enthält.

8. Antikörper nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper eine Variante eines Antikörpers darstellt.

9. Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper mit mindestens einem Peptid oder Protein fusioniert ist.

10. Antikörper nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein oder das Peptid, ein Enzym, ein Wachstumsfaktor, ein Hormon, ein Zytokin, ein Chemokin, ein virales Hüllprotein, und/oder ein Antikörper ist.

11. Antikörper nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein oder das Peptid mit einem Rezeptor interagiert.

12. Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper an mindestens eine Komponente gekoppelt ist.

13. Antikörper nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente ein Peptid, ein Protein, ein Enzym, ein Wachstumsfaktor, ein Hormon, ein Zytokin, ein Chemokin, ein virales Hüllprotein, ein Kohlenhydrat, ein Anti körper, ein Lipid, ein Isotop, ein Liposom, ein Virus, ein virusähnliches Parti kel, eine Nukleinsäure, und/oder eine Zelle ist.

14. Antikörper nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Liposom mindestens eine antisense RNA, mindestens ein Chemotherapeutikum, minde stens eine Nukleinsäure kodierend für einen Wirkstoff oder mindestens eine aktive Substanz enthält.

15. Antikörper nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Kom ponente mit einem Rezeptor interagiert.

16. Aminosäuresequenz, enthaltend eine oder mehrere Aminosäuredomänen mit einer Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 und/oder SEQ ID Nr. 2.

17. Aminosäuresequenz nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß in der Aminosäuresequenz jeweils zwischen den Aminosäuredomänen ein Peptidlin ker von ca. 12 bis 25 Aminosäuren Länge angeordnet ist.

18. Aminosäuresequenz nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Peptidlinker eine Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 3 enthält.

19. Aminosäuresequenz nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekenn zeichnet, daß die Aminosäuresequenz eine oder mehrere Sezernierungssignal sequenzen enthält.

20. Aminosäuresequenz nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Se zernierungssignalsequenz eine Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 4 enthält.

21. Aminosäuresequenz enthaltend eine oder mehrere Sequenzen gemäß SEQ ID Nr. 5.

22. Aminosäuresequenz nach einem der Ansprüche 16 bis 21, dadurch gekenn zeichnet, daß sie eine Variante der Aminosäuresequenz darstellt.

23. Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure für einen Anti körper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 und/oder für eine Aminosäurese quenz gemäß einem der Ansprüche 16 bis 22 kodiert.

24. Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor mindestens eine Nukleinsäu re gemäß Anspruch 23 enthält.

25. Zelte, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle mit mindestens einer Nuklein säure gemäß Anspruch 23 und/oder mindestens einem Vektor gemäß An spruch 24 transfiziert, transformiert und/oder infiziert ist.

26. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 oder einer Aminosäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 16 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 23 in einer Zelle exprimiert wird.

27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß in einem weiteren Schritt mindestens eine Komponente an den Antikörper oder die Aminosäure sequenz gekoppelt wird.

28. Verwendung mindestens eines Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15 oder einer Aminosäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 16 bis 22 zum Nachweis von Endoglin und/oder Endoglin-exprimierenden Zellen oder Zell bestandteilen in vitro und/ oder in vivo.

29. Verwendung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweise mit einem ELISA, einem RIA, einer Immunfluoresenz, einer Immunpräzipita tion oder einer Immunscintillation durchgeführt wird.

30. Verwendung mindestens eines Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15 oder einer Aminosäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 16 bis 22 zur Bindung an Endoglin-exprimierende Zellen.

31. Verwendung nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindung des Antikörpers auf die Endoglin-exprimierende Zelle zytotoxisch wirkt.

32. Verwendung nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindung des Antikörpers zur Infektion, Transduktion bzw. Transfektion der Endoglin- exprimierenden Zellen mit einem Virus, einem virusähnlichen Partikel, einem Liposom, und/oder einer Nukleinsäure führt.

33. Verwendung mindestens eines Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, mindestens einer Aminosäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 16 bis 22, mindestens einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 23 und/oder mindestens eines Vektors gemäß Anspruch 24 und zur Therapie von Erkrankungen.

34. Verwendung nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkrankun gen durch die Hyperproliferation von Endoglin-exprimierenden Zellen cha rakterisiert sind.

35. Verwendung nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkrankun gen Tumorerkrankungen sind.

36. Arzneimittel oder Diagnostikum enthaltend mindestens einen Antikörper ge mäß einem der Ansprüche 1 bis 15, mindestens eine Aminosäuresequenz ge mäß einem der Ansprüche 16 bis 22, mindestens eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 23, und/oder mindestens einen Vektor gemäß Anspruch 24 und ge gebenenfalls geeignete Hilfs- und Zusatzstoffe.