DE10033245A1 - Verwendungen des Hitzeschockproteins gp96 - Google Patents

Abstract

gp96-Moleküle werden zum Markieren und/oder Aktivieren von Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) verwendet. Ferner wird ein Verfahren zum aktivieren von APCs in vitro und in vivo beschrieben

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verwendungen des Hitze­ schockproteins gp96.

Es ist seit längerem bekannt, daß das Hitzeschockprotein gp96 eine tumorspezifische Immunantwort vermitteln kann, sofern es aus dem Tumor isoliert wurde, gegen den die Antwort gerichtet werden soll. Beispielsweise wird in einer Maus ein bekannter Tumor induziert, dieser Tumor entnommen und gp96 aus dem Tumor isoliert. Wird die­ ses gp96 nun im Rahmen einer Immuntherapie einer Maus, die eben­ falls vom gleichen Tumor befallen ist, gespritzt, so zeigt sich, daß der Tumor abgestoßen wird. Im Rahmen einer Immunisierung dage­ gen wird der Maus gp96 gespritzt und daraufhin der Tumor implan­ tiert bzw. induziert. Es zeigt sich daß der Tumor nicht wachsen kann. gp96 aus Nicht-Tumorgewebe kann diese Immunantwort nicht vermitteln.

Die Tumorspezifität beruht demnach nicht auf gp96 selbst, sondern auf kleinen Peptiden (Antigenen), die an gp96 assoziiert sind. Diese Peptide stellen für das Immunsystem die Informationen dar, die es braucht, um den Tumor zu erkennen. In der heutigen Modell­ vorstellung wird gp96 von sog. antigenpräsentierenden Zellen (APCs) aufgenommen, innerhalb der APC wird das an gp96-gebundene Peptid auf sog. MHC Klasse I-Moleküle übertragen und diese auf der Oberfläche im Kontext dieser MHC Klasse I-Moleküle präsentiert. Diese Präsentation ermöglicht die spezifische Erkennung des Pep­ tids von T-Zellen, die aktiviert werden und darauf hin im Ideal­ fall in der Lage sind, den Tumor zu erkennen und zu vernichten.

gp96 dient demnach als Antigen-Carrier. Mittlerweile ist eine ähn­ liche Funktion auch für andere Hitzeschockproteine wie hsp70, hsp90, hsp110 und grp170 gezeigt. Da die Immunisierung mit gp96 auch bei Einsatz extrem geringer Mengen erfolgreich funktioniert, ist in der Literatur bereits spekuliert worden, daß APCs spezifi­ sche Rezeptoren besitzen, die gp96 und andere Hitzeschockproteine auf der Oberfläche binden und endozytieren.

In diesem Zusammenhang konnten Singh-Jasuja et al., J. Exp. Med., 2000, 191: 1965-1974 zeigen, daß gp96 auf der Oberfläche von APCs an einen oder mehrere noch unbekannte Rezeptoren bindet und diese rezeptorvermittelte Aufnahme essentiell für die Präsentation von gp96-assozierten Peptiden auf MHC Klasse I-Molekülen und damit für die Aktivierung von T-Zellen ist.

Aus dieser Veröffentlichung ist es bekannt, daß gp96 an einen oder mehrere noch unbekannte Rezeptoren auf menschlichen und Maus-APCs bindet. Wichtig ist hier insbesondere, daß sog. dendritische Zel­ len (DCs), denen die größten Fähigkeiten als APC nachgesagt wer­ den, gp96 gut binden. Die Bindung von gp96 an Zellen kann nur gemessen werden, wenn das Protein in irgendeiner Form markiert ist, z. B. radioaktiv, enzymatisch oder mit einem fluoreszierenden Farb­ stoff. Im letzteren Fall kann gp96-FITC verwendet werden, also gp96, das mit dem Fluoreszenzfarbstoff FITC (Fluoresceinisothiocyanat) markiert wurde.

Vor diesem Hintergrund liegt der vorliegenden Erfindung die Aufga­ be zu Grunde, zumindest eine neue Verwendung für gp96 bereitzu­ stellen.

Zur Lösung dieser Aufgabe wird erfindungsgemäß von einer von den Erfindern der vorliegenden Anmeldung neu entdeckten Funktion von gp96 Gebrauch gemacht. gp96 kann nach Erkenntnis der Erfinder näm­ lich nicht nur als Antigen-Carrier fungieren, es ist überraschen­ der Weise auch in der Lage, APCs, insbesondere dendritische Zellen (DCs) zu aktivieren, so daß diese ihrerseits noch besser in der Lage sind, T-Zellen zu aktivieren. Bei der Aufnahme von gp96 durch DCs laufen nach Erkenntnis der Erfinder nämlich zwei Vorgänge si­ multan ab: zum einen wird auf diese Weise effektiv gp96- assoziertes Antigen für die Präsentation aufgenommen, zum anderen wird die DC aber auch selbst aktiviert, worauf sie noch besser präsentieren kann.

Man unterscheidet zwischen der ruhenden, unreifen DC, die in der Antigenaufnahme spezialisiert ist und der aktivierten, reifen DC, die in der Antigenpräsentierung spezialisiert ist. DCs können durch verschiedene Reagenzien aktiviert werden, z. B. durch bakte­ rielle Bestandteile wie Lipopolysaccharid (LPS). Solche Bestand­ teile verursachen in Säugern Fieber, weshalb sie auch als Pyrogene bezeichnet werden. Andere Aktivatoren sind z. B. Cytokine wie TNF- alpha, das im allgemeinen heute in der Forschung zur Aktivierung von DCs verwendet wird. Vor kurzem ist gezeigt worden, daß die Hitzeschockproteine hsp60 und hsp70 ebenfalls die Aktivierung von DCs vermitteln.

Nach Erkenntnis der Erfinder aktiviert gp96 humane und Maus-DCs. Dies zeigt sich anhand von Markermolekülen, die bei Aktivierung von DCs auf der Oberfläche hochreguliert werden: CD86 (B7.2), MHC Klasse II und (nur bei humanen DCs) CD83. Außerdem sekretieren DCs nach Aktivierung mit gp96 Cytokine (Fig. 2b), die wichtige immun­ regulatorische Funktionen haben. Besonders das Cytokin IL-12 nimmt eine immer wichtigere Bedeutung ein. Von Bedeutung ist auch der Beweis, daß die Aktivierung nicht auf Kontamination von Pyrogenen beruht, z. B. LPS. Die Aktivierung erfolgt nicht bei Denaturierung des gp96 durch Kochen, während LPS sich durch Kochen nicht denatu­ rieren läßt.

Die Konsequenz der Aktivierung von DCs mit gp96 besteht darin, daß aktivierte DCs als einzige Zellen des Immunsystems in der Lage sind, T-Zellen zu aktivieren.

Eine entscheidende Erkenntnis ist darin zu sehen, daß ruhende DCs gp96 hervorragend binden, nicht aber entweder durch gp96 selbst oder LPS aktivierte DCs, was darauf hindeutet, daß der Rezeptor für gp96 auf DCs nach ihrer Aktivierung herrunterreguliert wird. Die Messung der Bindung erfolgt z. B. durch fluoreszenzmarkiertes gp96, also gp96-FITC. Somit kann gp96-FITC als Detektionsreagenz verwendet werden. Die Bindung bzw. Nichtbindung zeigt den Aktivie­ rungsstatus der DCs an.

Erfindungsgemäß werden gp96-Moleküle zum Markieren und/oder Akti­ vieren von Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) verwendet, wobei die APC vorzugsweise ausgewählt sind aus der Gruppe: Dendritische Zellen (DC), Monozyten, Makrophagen, B-Zellen und peritoneale Ex­ sudat-Zellen.

Dabei können die gp96-Moleküle als Marker für die Aktivierung und/oder die Reifung und/oder den Differenzierungsstatus der APC, insbesondere von DC, und/oder für unreife DC verwendet werden.

Es ist ferner bevorzugt, wenn die gp96-Moleküle markiert, vorzugs­ weise fluoreszenzmarkiert, weiter vorzugsweise FITC-markiert sind.

Weiter ist es bevorzugt, wenn die gp96-Moleküle aus primären nicht-menschlichen Säugerzellen, vorzugsweise aus Mauszellen, oder aus humanen bzw. murinen Zellinien gewonnen werden.

Hier ist von Vorteil, daß gp96-Moleküle zum einen in beliebiger Menge und zum anderen so hergestellt werden können, daß sie nicht oder mit ganz speziellen Antigenen assoziiert sind, die z. B. in genetisch veränderten Mäusen oder anderen Säugetieren exprimiert werden.

Dabei ist es bevorzugt, wenn die gp96-Moleküle zum Aktivieren der Reifung von APCs, insbesondere DCs verwendet werden.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum in vivo oder in vitro Aktivieren von APCs, insbesondere DCs, bei dem gp96- Moleküle, vorzugsweise so wie oben beschrieben verwendet werden. Die gp96-Moleküle können dabei z. B. subkutan oder intradermal in­ jiziert werden.

In diesem Zusammenhang ist es bevorzugt, wenn die APCs ex-vivo mit Antigenen geladen werden, die vorzugsweise ausgewählt sind aus der Gruppe: Tumor-assoziierte, Tumor-spezifische, autoimmunassoziier­ te, virale und bakterielle Antigene.

Dabei ist es weiter bevorzugt, wenn die APCs in vitro mit gp96- Molekülen alleine oder zusammen mit anderen Faktoren wie TNF-alpha behandelt werden.

Die Erfindung betrifft ferner nach dem neuen Verfahren hergestell­ te APCs sowie deren Verwendung zur Induzierung einer Immunantwort gegen die Antigene, mit denen sie ex vivo beladen wurden.

Schließlich betrifft die Erfindung die Verwendung von gp96- Molekülen zur Induzierung einer Toleranz und/oder einer TH2-Typ- Antwort und/oder einer TH1-Typ-Antwort gegen Antigene, vorzugswei­ se gegen Antigene, die ausgewählt sind aus der Gruppe: Tumor­ assoziierte, Tumor-spezifische, autoimmunassoziierte, virale und bakterielle Antigene.

Es ist bevorzugt, wenn nicht aktivierte APCs mit stark exprimier­ ten gp96-Rezeptor verwendet werden, der vorzugsweise über markier­ te, vorzugsweise fluoreszenzmarkierte gp96-Moleküle detektiert wird, und derartige APCs in diesem nicht aktivierten Zustand durch Substanzen wie bspw. Cytocahlsin D arretiert werden.

Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der neuen APCs im Rahmen einer Tumortherapie und/oder -prävention, eine therapeuti­ sche Zusammensetzung mit diesen APCs und einem therapeutisch ak­ zeptierbaren Träger, sowie ein Kit mit erfindungsgemäß zu verwen­ denden gp96-Molekülen und den erforderlichen Reagenzien.

In dieser Weiterbildung wird gp96 also nicht als Antigen-Carrier benutzt, sondern lediglich als Aktivator von APCs, insbesondere DCs. Die APCs können dann mit dem gewünschten Antigen ex vivo be­ laden und dem Patienten zur Therapie wieder gespritzt werden.

Wird gp96-FITC als Detektionsmittel eingesetzt, um den Aktivie­ rungs- bzw. Differenzierungszustand von antigenpräsentierenden Zellen zu ermitteln, lassen diese APCs sich entsprechend ihrer Bindung von gp96-FITC und damit entsprechend ihres Expressions­ levels des gp96-Rezeptors in verschiedene Kategorien unterteilen, die bei der Tumortherapie relevant sind.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur in vitro Präpara­ tion von DCs aus aus dem Blut isolierten Monozyten und/oder aus dem Knochenmark präparierten Stammzellen, bei dem die Monozyten und/oder Stammzellen mit gp96-Molekülen allein oder in Kombination mit Wachstumsfaktoren wie bspw. GM-CSF behandelt werden.

Die Erfinder haben nämlich erkannt, daß gp96-Moleküle in der Lage sind, derartige Vorläuferzellen zu DCs zu differenzieren.

Zusammenfassend induzieren Peptide, die mit dem Hitzeschockprotein gp96 assoziiert sind, eine spezifische T-Zellantwort gegen die Zellen, aus welchen gp96 isoliert wird. Es ist bereits bekannt, daß gp96 an einen noch unbekannten Rezeptor bindet, welcher auf dendritischen Zellen (DCs) vorhanden ist, und daß eine rezeptor­ vermittelte Aufnahme für eine Kreuzpräsentation gp96-assoziierter Peptide durch DCs notwendig ist. Die gegenwärtigen Erfinder haben nun gezeigt, daß gp96 die Reifung der DCs vermittelt, wie durch eine Hochregulierung von MHC Klasse II- und CD86-Molekülen, Sekre­ tion der Cytokine IL-12 und TNF-alpha und eine erhöhte T- Zellstimulationsfähigkeit bestimmt wurde. Erhitztes und daher de­ naturiertes gp96 ist nicht in der Lage, eine DC-Reifung und Cyto­ kinsekretion zu induzieren. Weiterhin sind reife DCs nicht mehr in der Lage, gp96-Moleküle zu binden. Daher wird der gp96-Rezeptor auf reifen DCs herrunterreguliert, was nahelegt, daß sich dieser Rezeptor ähnlich verhält wie andere Rezeptoren, die an der Anti­ genaufnahme beteiligt sind, wie der Scavenger-Rezeptor CD36, der Mannose-Rezeptor oder die Integrine αv β3 und αv β5.

Insgesamt ist gp96 ein überkreuz primender Antigen-Carrier und überraschenderweise ein direkter Aktivator dendritischer Zellen.

Dendritische Zellen sind sehr effektive Aktivatoren der T-Zellen. Unreife DCs sind Experten für die Antigenaufnahme, wogegen reife DCs auf die T-Zellaktivierung spezialisiert sind, die höchstwahr­ scheinlich durch eine erhöhte Expression von MHC- und co­ stimulatorischen Molekülen wie CD86 verursacht wird. Die DC- Reifung kann durch mehrere Stimuli einschließlich LPS, Bakterien und Viren, CpG-Oligonukleotide und Signalmoleküle wie CD40L indu­ ziert werden.

Insbesondere die Fähigkeit, exogene Antigene durch einen Prozeß zu präsentieren, welcher "Kreuzpräsentation" genannt wird, ist ein Schlüsselmerkmal der DCs. Diese exogenen Antigene umfassen Protei­ ne, Bakterien und apoptotische Zellen. Zusätzlich wurde vor kurzem gezeigt, daß auch Peptide, die von Hitzeschockproteinen (HSPs) be­ gleitet werden, wie gp96, durch APCs in Verbindung mit MHC Klasse I-Molekülen für CTLs präsentiert werden können. Die Präsentation erfordert die Aufnahme von gp96 über einen oder mehrere bisher nicht identifizierte Rezeptoren, die von DCs exprimiert werden.

Hitzeschockproteine wie HSP60 und HSP70 induzieren ebenfalls die Aktivierung von Monozyten und die Sekretion der entzündungsför­ dernden Cytokine TNF-alpha und IL-12 über eine Wechselwirkung mit CD14-Molekülen. So können HSPs nicht nur als ein Vehikel für antigene Peptide, welche durch T-Zellen erkannt werden, sondern eben­ falls wie postuliert als ein Gefahrensignal für das angeborene Im­ munsystem dienen, wenn sie von gestreßten Zellen freigesetzt wer­ den. In Übereinstimmung hiermit steht der Befund, daß eine erhöhte HSP70-Expression in Tumorzellen, welche durch einen nicht apopto­ tischen Zelltod oder durch Transfektion induziert wurde, zu einer erhöhten Tumorimmunogenität über einen T-Zell-vermittelten Weg führte.

Unter allen analysierten HSPs hat das ER-interne Hitzeschockpro­ tein gp96 die am besten dokumentierte Geschichte in Bezug auf die Induktion spezifischer CTL-Antworten und Tumore. Diese Merkmale wurden der Tatsache zugeschrieben, daß gp96 mit Peptiden assozi­ iert ist, die von intrazellulären Proteinen abgeleitet sind, wel­ che nach einer rezeptorvermittelten Endozytose von gp96 effizient auf MHC Klasse I-Molekülen auf DCs präsentiert werden. Eine nichtspezifische Phagozytose führte nicht zu einer CTL- Aktivierung. Jedoch wurde vor kurzem gezeigt, daß zur Aktivierung von CTLs aus ihren nativen Vorläufern immunogene Peptide durch DCs präsentiert werden müssen, welche ihr volles Potential co­ stimmulatorischer Moleküle zeigen.

In Anbetracht des Obigen haben die gegenwärtigen Erfinder die Wir­ kung von gp96 auf die DC-Reifung und die T-Zellaktivierung gete­ stet und konnten überraschend zeigen, daß mit gp96 behandelte un­ reife DCs TNF-alpha und IL-12 sekretieren und sich in den reifen Phänotyp umwandeln, wobei sie in dem Fall von humanen DCs erhöhte Spiegel von CD86-, MHC Klasse II- und CD83-Molekülen exprimieren. Diese Änderung beim Phänotyp hat funktionale Konsequenzen, welche durch die Zunahme bei der Aktivierung von allogenen T-Zellen sichtbar gemacht werden. Interessanterweise verlieren die DCs nach der Reifung ihre Fähigkeit, exogenes gp96 zu binden. Diese Beobachtung ist in guter Übereinstimmung mit den verringerten Fähig­ keiten von reifen DCs, Antigen aufzunehmen.

Beispiele von Ergebnissen sind wie folgt in den Figuren gezeigt:

Fig. 1: gp96 aktiviert humane dendritische Zellen.

Humane dendritische Zellen wurden in vitro aus CD14+-pBMCs nach 7 Tagen mit GM-CSF und IL-4 präpariert und für 24 h mit gp96, hitze­ behandeltem gp96, LPS oder hitzebehandeltem LPS inkubiert. A: CD86-Expressionslevels von DCs, die mit gp96/LPS behandelt wurden (ausgefülltes Histogramm), oder von nicht behandelten DCs (in grau; die schwarze Linie stellt einen isotypen Kontrollantikörper dar, welcher für alle Behandlungen dieselbe Fluoreszenzintensität zeigte). B zeigt den Prozentsatz von hoch CD86- (wie in A durch den Markierungsbalken angegeben) und von Aktivierungsmarker CD83- exprimierenden DCs nach Behandlung mit den verschiedenen Effektor­ molekülen. Fehlerbalken geben die Standardabweichung an. Die Er­ gebnisse repräsentieren drei unabhängige Experimente.

Fig. 2: gp96 aktiviert dendritische Mauszellen.

Dendritische Mauszellen wurden aus Knochenmark von C57BL/6- oder BALB/c-Mäusen nach 7 Tagen mit GM-CSF präpariert. A: Die Behand­ lung mit 30 und 100 µg/ml gp96 und 2 µg/ml LPS und hitzebehandel­ tem LPS führte nach 24 h zu einer Hochregulierung von CD86 (gemessen durch FACS-Doppelfärbung mit CD11c- und CD86- Antikörpern), während hitzebehandeltes gp96 die DCs nicht akti­ vierte. B: Überstände aus dem obigen Experiment wurden durch ELISA auf den Gehalt der Cytokine IL-12 und TNF-alpha hin analysiert (was ähnliche Ergebnisse wie in A zeigte). Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung von jeweils drei Versuchen. Die Ergebnisse repräsentieren wenigstens drei unabhängige Experimente.

Fig. 3: Dendritische humane und Mauszellen, die durch gp96 akti­ viert wurden, sind in der Lage, eine starke Vermehrung von allore­ aktiven T-Zellen zu induzieren.

Humane DCs wurden präpariert und für 24 h wie oben beschrieben mit 30 µg/ml gp96, hitzebehandeltem gp96 oder 2 µg/ml LPS behandelt. Nach einem gründlichen Waschen wurden diese vorbehandelten DCs mit 1 × 10E5 PBMCs eines anderen Spenders für 4 Tage in anderen Stiu­ mulator/Responder-Verhältnissen inkubiert (gezeigt ist das Ver­ hältnis 1 : 30). Die Vermehrung der T-Zellen wurde durch Zugabe von 1 µCi 3H-Thymidin für 16 h getestet. Fehlerbalken geben die Stan­ dardabweichung von jeweils drei Versuchen an. Die Ergebnisse re­ präsentieren zwei unabhängige Experimente. Ähnliche Ergebnisse wurden für BALB/c-Maus-DCs erhalten, die eine Vermehrung von C57BL/6 T-Zellen induzierten (Daten nicht gezeigt).

Fig. 4: Aktivierte DCs regulieren den gp96-Rezeptor herunter.

Aus Knochenmark stammende DCs aus C57BL/6-Mäusen zeigen eine hete­ rogene Population aktivierter (hoch CD86-positiv auf FL-2) und nicht aktivierter (gering CD86-positiv) CD11c-positiver DCs. OVA- FITC als Kontrollprotein band überhaupt nicht, während gp96-FITC nur an nicht aktivierte DCs band (untere Felder). Die oberen Fel­ der zeigen die CD11c-Expression der DC-Präparation und die Bindung von gp96-FITC. Die Werte geben Prozentsätze der gesamten Zellen in dem bestimmten Quadranten an. Die Ergebnisse repräsentieren drei verschiedene Experimente.

Beispiel 1 Materialien & Methoden Erzeugung dendritischer Zellen

Das Medium, welches durchgehend verwendet wurde, war Iscove's Mo­ difiziertes Dulbecco-Medium (IMDM, BioWhittaker, Verviers, Belgi­ en), das mit 2 mM L-Glutamin (GibcoBRL Life Technologies, Paisley, UK), 100 IU/ml Penicillin/Streptomycin (Gibco), 10% FCS (PAA, Linz, Österreich) und Cytokinen wie unten angegeben ergänzt war. Unreife Maus-DCs wurden aus Knochenmark von C57BL/6- oder BALB/c- Mäusen gemäß Inaba et al., J. Exp. Med. 1992, 176: 1693-1702 er­ zeugt. Kurz gesagt wurden Knochenmarkzellen mit 150 U/ml GM-CSF (PeproTech, London, UK) für 6-8 Tage inkubiert, wobei das Medium alle zwei Tage erneuert wurde. Ungefähr 90-100% aller Zellen in dem FACS(r)-Fenster, das für Monozyten verwendet wird, waren DCs, wie durch Durchflußzytometrie mit Antikörpern bestimmt wurde (die von Pharmingen, San Diego, CA, erhalten wurden): diese waren CD11c-, CD86- und MHC Klasse II-positiv und CD14-negativ. Humane unreife dendritische Zellen wurden gemäß Bender et al., J. Immu­ nol. Methods 1996, 196: 121-135 aus PBMCs präpariert.

Kurz gesagt wurden CD14+-Monozyten durch ein Anhaften für 1 h an Kulturschalen und gründliches Waschen gereinigt; die Monozyten wurden für 6-8 Tage mit 1000 IU/ml IL-4 und 800 IU/ml GM-CSF inku­ biert, wobei die Cytokine alle drei Tage erneuert wurden. Die Zel­ len, welche auf diese Weise erzeugt wurden, zeigten bis zum Tag 12 eine große Anzahl von Dendriten und waren nur leicht adhärent. Sie exprimierten CD1a, wenig CD14, CD86, HLA-DR und sehr wenig CD83 auf ihrer Oberfläche, wie durch Antikörper (Pharmingen) bestimmt wurde.

Stimulation von dendritischen Zellen

Maus- und humane DCs wurden durch Zugabe von 30 bis 100 µg/ml gp96 oder 2 µg/ml LPS (aus Salmonella typhimurium, Sigma Chemicals, St. Louis, MO) für 24 h stimuliert. In einigen Fällen wurden gp96 oder LPS bei 95°C für wenigstens 20 min vorbehandelt. Gp96 (freundlicherweise von Immatics Biotechnologies, Tübingen, zur Verfügung gestellt) wurde aus einer Mycoplasma-freien IGELa2- Mauszellinie wie in Arnold et al., J. Exp. Med. 1995, 182: 885-889 beschrieben gereinigt. FPLC-Fraktionen, welche den Fraktionen, die gemäß Western-Blot kein gp96 enthielten, vorausgingen und folgten, werden als "flankierende Fraktionen" bezeichnet (zur Verfügung ge­ stellt von Immatics Biotechnologies, Tübingen). Endotoxin, das in den gp96-Präparationen vorliegen könnte, wurde durch ein Limulus- Amöbozytenlysat-Kit (QCL-1000, BioWhittaker) gemäß den Richtlinien getestet, die von der US Food and Drug Administration (FDA) veröf­ fentlicht wurden. Der Endotoxingehalt, der in allen Fällen be­ stimmt wurde, lag bei oder unterhalb von 0,05 EU/µg gp96. Zum Nachweis von möglichen Mycoplasma-Verunreinigungen der IGELa2- Zellinie und der gp96-FPLC-Fraktionen wurde das "Mycoplasma Plus"- Kit von Stratagene, La Jolla, CA, verwendet.

Cytokinnachweis

Maus IL-12 (p40) und TNF-alpha wurden in Kulturüberständen unter Verwendung von Standard-Sandwich-ELISA-Protokollen gemessen. Anti­ körper und rekombinante Standards beider Cytokine wurden von Phar­ mingen erhalten. Der Einfang-Antikörper wurde an die ELISA-Platte (MaxiSorb™ Nunc, Roskilde, Dänemark) gebunden, der biotinylierte Nachweisantikörper wurde von Streptavidin-konjugierter Meerret­ tichperoxidase erkannt und durch ein ABTS-Substrat (Sigma), das bei 415 nm emittierte, nachgewiesen.

Stimulation alloreaktiver T-Zellen

Humane oder BALB/c-DCs wurden in einer Platte mit 96 Vertiefungen wie oben beschrieben stimuliert, gründlich gewaschen und mit PBL aus einem anderen Spender bzw. C57BL/6-Milzzellen für 4 Tage bei verschiedenen Responder/Stimulator-Verhältnissen inkubiert. Am Tag 4 wurde 1 µCi 3H-Thymidin pro Vertiefung zugegeben, die Zellen wurden nach weiteren 16 h geerntet und das eingebaute 3H-Thymidin wurde nachgewiesen, indem ein Wallac 1450-MicroBetacounter verwen­ det wurde.

FACS-Analyse

Eine Anfärbung der Zelloberfläche wurde durchgeführt, indem Anti­ körper wie oben beschrieben, Ovalbumin-FITC oder gp96-FITC (freundlicherweise von Immatics Biotechnologies, Tübingen, zur Verfügung gestellt) verwendet wurden, welche mit den Zellen für 30 min auf Eis in IMDM, das 10% FCS enthielt, inkubiert wurden. Tote Zellen wurden durch PI-Färbung ausgeschlossen. Alle FACS(r)- Analysen wurden auf einem FACSCalibur(r) (Becton Dickinson, Moun­ tain View, CA) durchgeführt, wobei eine Cell Quest Software ver­ wendet wurde.

Beispiel 2 Gp96 induziert die Reifung humaner DCs

Um die Wirkung von gp96 auf phänotypische Veränderungen der DCs zu untersuchen, wurden unreife DCs durch Inkubation humaner PBMCs für 7 Tage mit GM-CSF und IL-4 erzeugt. Für weitere 24 h wurden gp96 oder LPS als eine positive Kontrolle zu den Kulturen zugegeben. Wie in Fig. 1 gezeigt ist, induzierte gp96 wie auch LPS eine Rei­ fung der DCs, welche nun erhöhte Levels an CD83 und CD86 auf ihrer Oberfläche zeigten. Eine Denaturierung von gp96 durch Wärme zerstörte dessen Fähigkeit, DCs zu aktivieren, wogegen LPS durch die­ se Behandlung nicht betroffen wurde. Diese letzteren Beobachtungen sind ein starkes Argument für eine gp96-vermittelte DC- Aktivierung, die keine Folge einer Endotoxinkontamination, sondern das Ergebnis der Bindung von nativem gp96 an seinen Rezeptor ist. Dieses wurde weiterhin durch den Befund gestützt, daß die gp96- flankierenden Fraktionen aus der FPLG-Reinigung (denen gp96 fehl­ te) keine DC-Reifung induzierten und daß sich normales Medium und gp96 in ihrem Endotoxingehalt nicht unterschieden, wie durch den Limulus-Amöbozyten-Testkit gemessen wurde (Daten nicht gezeigt). Zusätzlich wurde gp96 aus einer Zelline gereinigt, die nicht mit Mycoplasma infiziert war. Es ist wichtig, dieses festzustellen, da vor kurzem gezeigt wurde, daß der Überstand von Mycoplasma- infizierten Zellen in der Lage ist, eine DC-Reifung zu induzieren. BSA und Concanavalin A, welche als Kontrollproteine in ähnlichen Mengen wie gp96 zugegeben wurden, aktivierten die DCs nicht (Daten nicht gezeigt).

Beispiel 3 Gp96 induziert die Reifung von Maus-DCs

Eine vergleichbare gp96-vermittelte Aktivierung wurde ebenfalls erhalten, indem aus Knochenmark von Mäusen stammende DCs verwendet wurden. Eine Inkubation unreifer DCs mit gp96 bei verschiedenen Konzentrationen induzierte eine hitzelabile Reifung von DCs, wie durch eine erhöhte Expression von CD86-Molekülen (Fig. 2A) und MHC Klasse II-Molekülen (Daten nicht gezeigt) sichtbar gemacht wurde. Zusätzlich zu der Expression von Reifungsmarkern auf der Zelloberfläche induziert gp96 ebenfalls die Sekretion der entzün­ dungsfördernden Cytokine IL-12 und TNF-alpha (Fig. 2B). Wiederum ist die Wirkung wärmeempfindlich und beruht nicht auf Endotoxin­ verunreinigungen, die in unseren gp96-Präparationen möglicherweise vorhanden sind.

Beispiel 4 Gp96-aktivierte DCs induzieren eine starke T- Zellvermehrung

Um zu erforschen, ob die gp96-vermittelte DC-Reifung funktionale Konsequenzen hat, wurden DCs, die durch gp96 oder LPS reifen ge­ lassen wurden, für 4 Tage mit allogenen PBMCs inkubiert, und die Zellvermehrung wurde durch Inkubation mit 3H-Thymidin bestimmt. Wie in Fig. 3 gezeigt ist, induzierten DCs, die entweder nach LPS- oder gp96-Aktivierung für 24 h einen reifen Phänotyp zeigten, 3fach besser die T-Zellvermehrung als unreife DCs, die nur mit Me­ dium inkubiert wurden. Wie schon vorher beobachtet wurde, ist die gp96-vermittelte Wirkung wärmeempfindlich, da DCs, die mit erhitz­ tem gp96 inkubiert wurden, keine erhöhte T- Zellstimulationsfähigkeit zeigten. Eine vergleichbare T- Zellvermehrung wurde beobachtet, indem Maus-DCs und allogene Milz­ zellen verwendet wurden (Daten nicht gezeigt).

Beispiel 5 Reife DCs exprimieren verringerte Spiegel des gp96- Rezeptors

Die Reifung von DCs induziert eine Hochregulierung von MHC Klasse II-, CD83- und CD86-Molekülen, was zu einer erhöhten T-Zellvermeh­ rung führt. Zusätzlich sind die DCs, wenn sie einmal aktiviert sind, nicht in der Lage, weiterhin gp96-vermittelte Stimuli zu empfangen. Wie in Fig. 4 gezeigt ist, binden alle CD11c-positiven Maus-DCs gp96, nicht aber Ovalbumin. Jedoch sind nur unreife DCs, die niedrige Levels an CD86 exprimieren, in der Lage, gp96 zu bin­ den. Da gp96 mit Peptiden aus der Zelle, aus welcher es isoliert wurde, komplexiert ist, und DCs in der Lage sind, diese Peptide auf MHC Klasse I-Molekülen überkreuz zu präsentieren, kann nicht mehr erwartet werden, daß reife DCs in der Lage sind, gp96- assoziierte Peptide für T-Zellen zu präsentieren.

Beispiel 6 Schlußfolgerung

Die obigen Experimente zeigen, daß das ER-interne Hitzeschockpro­ tein gp96 in der Lage ist, die Reifung von Maus- und humanen DCs zu induzieren. Diese Beobachtung ist besonders bemerkenswert im Lichte der früheren Befunde, wo für gp96 gezeigt wurde, daß es spezifisch an DCs bindet, was zu einer auf die MHC Klasse I be­ schränkten Kreuzpräsentation gp96-assoziierter Peptide führte. Der Befund des Herunterregulierens des gp96-Rezeptors auf der Oberflä­ che reifer DCs erlaubt außerdem die ersten Spekulationen über die Natur des gp96-Rezeptors, der auf DCs exprimiert wird. Mögliche Kandidaten sind endozytische Rezeptoren wie der Scavenger-Rezeptor CD36 oder die Integrine αvβ3 und αvβ5, von welchen allesamt ge­ zeigt wurde, daß diese bei der DC-Reifung herrunterreguliert wer­ den.

Die Erfindung liefert den ersten Beweis, daß gp96 nicht nur ein Peptid-Carrier ist, welcher die assoziierten Peptide zu professio­ nellen APCs dirigiert, sondern ebenfalls ein direkter Aktivator der DCs, welche bei der T-Zellaktivierung eine Umwandlung zu dem reifen Phänotyp hocheffizient induziert. Gp96 könnte daher als ein Gefahrensignal wirken, wenn es aus nekrotischen oder gestreßten Zellen freigesetzt wird, welche sowohl unspezifische als auch spe­ zifische Stimuli an das Immunsystem abgeben.

Wenn sie einmal aktiviert sind, verlieren die DCs die Fähigkeit, neue gp96-assoziierte Peptide aufzunehmen, und gewinnen die Fähig­ keit, effizient mit T-Zellen zu kommunizieren, welche für die prä­ sentierten MHC/Peptid-Komplexe spezifisch sind. Diese Situation ähnelt stark derjenigen, die anfangs für die Präsentation von lös­ lichen Antigenen auf MHC Klasse II-Molekülen beobachtet wurde, wo beschrieben wurde, daß DCs in einem Zustand der Antigenpräsentation "arretiert" sind und bei der Aktivierung der T-Zellen hocheffi­ zient sind.

Dieses neue Merkmal von gp96 liefert eine zusätzliche, bisher un­ bekannte Erklärung für dessen hohe Immunogenität und wird es er­ lauben, seine Anwendung bei der Induktion spezifischer Immunant­ worten in vivo zu verbessern.

Claims (20)

1. Verwendung von gp96-Molekülen zum Markieren und/oder Aktivie­ ren von Antigen-präsentierenden Zellen (APCs).

2. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die APC ausgewählt sind aus der Gruppe: Dendritische Zellen (DC), Monozyten, Makrophagen, B-Zellen und peritoneale Exsudat- Zellen.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die gp96-Moleküle als Marker für die Aktivierung und/oder die Reifung und/oder den Differenzierungsstatus der APC, ins­ besondere von DC, und/oder für unreife DC verwendet werden.

4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die gp96-Moleküle markiert, vorzugsweise fluo­ reszenzmarkiert, weiter vorzugsweise FITC-markiert sind.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die gp96-Moleküle aus humanen und anderen Säu­ gerzellinien sowie aus Insekten-Zellinien sowie aus primären, nicht-menschlichen Säugerzellen, vorzugsweise aus Mauszellen gewonnen werden.

6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die gp96-Moleküle zum Aktivieren der Reifung von APCs, insbesondere DCs verwendet werden.

7. Verfahren zum Aktivieren von APCs in vitro, insbesondere DCs, bei dem gp96-Moleküle, vorzugsweise wie in einem der Ansprü­ che 1 bis 6 verwendet werden.

8. Verfahren zum Aktivieren von APCs in vivo, z. B. durch subku­ tane oder intradermale Injektion von gp96-Molekülen.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß die APCs ex-vivo mit Antigenen beladen werden.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Antigene ausgewählt sind aus der Gruppe: Tumor-assoziierte, Tumor-spezifische, autoimmunassoziierte, virale und bakteri­ elle Antigene.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die APCs in vitro mit gp96-Molekülen allein oder zusammen mit anderen Faktoren wie beispielsweise TMF- alpha behandelt werden.

12. APCs, hergestellt nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11.

13. Verwendung der APCs aus Anspruch 12 zur Induzierung einer Im­ munantwort gegen die Antigene.

14. Verwendung von gp96-Molekülen zur Induzierung einer Toleranz und/oder einer TH2-Typ-Antwort und/oder einer TH1-Typ-Antwort gegen Antigene, vorzugsweise gegen Antigene, die ausgewählt sind aus der Gruppe: Tumor-assoziierte, Tumor-spezifische, autoimmunassoziierte, virale und bakterielle Antigene.

15. Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß nicht aktivierte APCs mit stark exprimiertem gp96-Rezeptor verwendet und anschließend mit Hilfe fixierender Substanzen wie bspw. Cytocahlasin D in diesem nicht aktivierten Zustand arretiert werden.

16. Verwendung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der gp96-Rezeptor über markierte, vorzugsweise fluoreszenzmar­ kierte gp96-Moleküle detektiert wird.

17. Verwendung der APCs aus Anspruch 11 im Rahmen einer Tumorthe­ rapie und/oder -prävention.

18. Therapeutische Zusammensetzung mit APCs nach Anspruch 11 und einem therapeutisch verträglichen Träger.

19. Kit mit wie in den Ansprüchen 1 bis 6 zu verwendenden gp96- Molekülen und den erforderlichen Reagenzien.

20. Verfahren zur in vitro Präparation von DCs aus aus dem Blut isolierten Monozyten und/oder aus dem Knochenmark präparier­ ten Stammzellen, bei dem die Monozyten und/oder Stammzellen mit gp96-Molekülen allein oder in Kombination mit Wachstums­ faktoren wie bspw. GM-CSF behandelt werden.