DE69129113T2 - Stimulierung der stroma- und vorläuferzellen im knochenmark - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung auf dem Gebiet der Zellbiologie und Medizin betrifft die Verwendung von Fibroblasten-Wachstumsfaktoren und insbesondere von basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktoren zur Stimulierung von Knochenmarkzellen in vitro und in vivo.
Knochenmarkzellen: Züchtung und Stimulierung
• Gewebekulturtechniken wurden entwickelt, die den Langzeiterhalt von hämatopoetischen Zellen in vitro erlauben (Dexter, T.M., Acta Haemat. 62: 299-305 (1979)). Eine wichtige Komponente dieses Kultursystems ist die vorherige Bildung einer Schicht in dem Kulturgefäß aus vom Knochenmark stammenden adhärenten Stromazellen. Die Stromaschicht besteht aus Endothelzellen, Fibroblasten, Adipocyten und Makrophagen (Weiss, L., J. Morphol. 117:467-538 (1965); Lichtman, M.A., Exp. Hematol. 9: 391-410 (1981)). Unterschiedliche Kulturbedingungen erlauben die selektive Proliferation von Zellen der B-Lymphocyten-Zellinie (Whitlock, C.A. et al., J Immunol. Methods, 67:353-369 (1984) oder der myeloiden Zellinie (Dexter et al., J Cell. Physiol. 91:335-344 (1977)) in von Stromazellen abhängigen Langzeitkulturen. Es wurde gezeigt, daß bestimmte Cytokine, wie IL1 und IFN-gamma, die Produktion verschiedener Faktoren durch adhärente Zellen erhöhen, die die Zellproliferation oder Differenzierung fördern können (Zucali, JR. et al., J. Clin. Invest. 77:1857-1863 (1986); Philip, R. et al., Nature 323:86-89 (1986)). Wenig ist über die Wirkungen anderer Lymphokine auf Knochenmarkstromazellen bekannt, teilweise weil es schwierig war, große Mengen dieser Zellen zu erhalten.
• Die hämatopoetischen Stannnzellen sind eine Klasse von Zellen, die hauptsächlich auf das Knochenmark beschränkt sind und die funktionell durch die Eigenschaften einer ausgedehnten Selbsterneuerung und die Fähigkeit zur Reitung in eine oder mehrere differenzierte Form(en) von Blutzellen, wie Granulocyten, Monocyten/Makrophagen, Lymphocyten, Erythrocyten und Megakaryocyten (aus denen sich Blutplättchen entwickeln) definiert wurden. In vitro scheinen Stammzellen eine begrenzte proliferative Kapazität zu besitzen und können sich nicht unbegrenzt teilen.
• Die hämatopoetischen Zellen scheinen eine ihnen eigene Unfähigkeit zur nichtstimulierten Zellteilung zu besitzen. Die Granulocyten-Makrophagenkoloniestimulierenden Faktoren (GM-CSF, G-CSF, M-CSF) sind spezifische Glycoproteine, die die Produktion, Differenzierung und Funktion von zwei verwandten Leukocytenpopulationen im Blut, den Granulocyten und den Monocyten/Makrophagen, regulieren.
• Die Knochenmarktransplantation ist eine in zunehmendem Maße übliche Form der Therapie bei einer Reihe von Erkrankungen, an denen eine Dysfunktion der hämatopoetischen Zellen beteiligt ist (beispielsweise aplastische Anämie), oder die Behandlungen unter irreversibler Schädigung der hämatopoetischen Zellen umfassen (beispielsweise Chemotherapie und Radiotherapie von Krebs). Infolge klinischer Probleme im Zusammenhang mit einer unvollkommenen Übereinstimmung von Spendern und Empfängern ist eine autologe Knochenmarktransplantation, bei der der Patient als sein eigener Spender dient, sofern möglich, bevorzugt.
• Die autologe Knochenmarktransplantation ist mit der Entfernung von weniger als 5% des Gesamtgehalts des Empfängerknochenmarks verbunden, das gefroren gelagert wird und zum geeigneten Zeitpunkt reinfundiert wird. Mauch et al. (Blood 74:872-825 (1989)) fanden beim Studium von Tiertransplantatmodellen eine Abnahme des Gehalts der Stannnzellen und der Fähigkeit zur Selbsterneuerung des Knochenmarks bei Transplantatempfängern, die proportional zur Dosis der transplantierten Knochenmarkzellen war. Diese Abnahme (die sich in den Leukocytenzahlen des peripheren Bluts oder im Zellmuster des Knochenmarks nicht widerspiegelt) wurde nach emer anfänglichen Erholung des Knochenmarks beobachtet und veränderte sich nach der Transplantation im Verlauf der Zeit nicht, was einen permanenten Verlust der Selbsterneuerungskapazität des Knochenmarks anzeigt.
• Knochenmarkdepression (eine Depression der Erzeugung von Leukocyten, insbesondere Granulocyten oder Neutrophilen) ist eine häufige und ernsthalte Komplikation der Krebstherapie, weil die meisten Chemotherapeutika keine Spezifität für maligne Zellen besitzen und Knochenmarkstammzellen und andere unreife Blutzellen, die proliferieren müssen, gegenüber einer Schädigung durch Chemotherapeutika und Bestrahlung besonders empfindlich sind. Eine Hauptursache für behandlungsbezogene Todesfälle bei Krebspatienten ist eine Infektion, die eine Funktion sowohl der Dauer als auch der Schwere der Neutropenie ist. Die Verwendung der autologen Knochenmarktransplantation erlaubte eine intensivere und somit effektivere Chemo- und Radiotherapie bei einer Vielzahl von Neoplasmen. Jedoch sind die Morbidität und die Mortalität während der fast dreiwöchigen Periode hoch, die dafür benötigt wird, daß autologes Knochenmark erfolgreich einwachsen und eine hämatopoetische Rekonstitution beginnen kann.
• Die Knochenmarkdepression kann auch nach der Verabreichung von Antibiotika, Antidepressiva, nichtsteroidalen entzündungshemmenden Arzneimitteln, antiviralen Mitteln oder nach der Behandlung von Schilddrüsenerkrankungen auftreten. Die Knochenmarkdepression ist auch eine Begleiterscheinung einer Vielzahl von immunsuppressiven Störungen, wie AIDS.
• Brandt et al., (New. Eng. J. Med. 318:869-876 (1988)) beschreiben die Verwendung des rekombinanten menschlichen Granulocyten-Makrophagen-Koloniestimulierenden Faktors (GM-CSF) für die hämatopoetische Rekonstitution nach einer hochdosierten Chemotherapie und autologen Knochenmarktransplantation und fanden eine beschleunigte Erholung des Knochenmarks über einen Bereich von tolerierbaren GM-CSF-Dosen.
Fibroblasten-Wachstumsfaktoren
• Viele Peptide mit potenten stimulatorischen Wirkungen auf die Proliferation entweder der Epithel- oder Mesenchymzellen wurden identifiziert. Wegen ihrer regulatorischen Wirkung auf das Gewebswachstum wurden diese Peptide gemeinsam als "Wachstumsfaktoren" bezeichnet. Leider wurden die meisten Wachstumsfaktoren nach der biologischen Aktivität benannt, auf die während ihrer ursprünglichen Identifikation und Isolierung getestet wurde. Jedoch wird nun offensichtlich, daß viele Wachstumsfaktoren ein viel größeres Wirkungsspektrum besitzen, als die biologische Aktivität, nach der sie ursprunglich benannt wurden, und die meisten gelten nun als multifunktionell. Ferner zeigte sich, daß viele Faktoren mit verschiedenen Namen nach der Reinigung eine einzelne Moleküleinheit sind.
• Basischer und saurer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF und aFGF) sind Peptide mit einem offensichtlichen Molekulargewicht (Mr) von etwa 16 bis 25 Kilodalton, die als potente Mitogene und Differenzierungsfaktoren für eine große Vielzahl von Zellen wirken, die vom embryonalen Mesoderm und Neuroectoderm abgeleitet sind. Der basische FGF (pl 9,6) wurde zuerst durch seine Fähigkeit, Proliferation und Phänotypische Transformation von Mausfibroblasten (BALB/c-3T3-Zellen) zu induzieren, identifiziert (Gospodarowicz D., Nature 249:123-127 (1974)). bFGF ist multifunktionell; er kann die Proliferation stimulieren und Differenzierung induzieren oder verzögern. Der basische FGF stimuliert auch andere wichtige Prozesse bei der Zellfunktion, obwohl die Mechanismen der verschiedenen FGF-Wirkungen noch geklärt werden müssen (Rifkin, DB. et al., 3. Cell Biology 109:1-6 (1989)).
• Der basische FGF wurde aus den meisten vom Mesoderm oder Neuroektoderm stammenden normalen oder malignen Geweben oder Zellen gereinigt, die eine gemeinsame Eigenschatt teilen: Starkes angiogenes Potential, d.h. eine Fähigkeit, neue Blutgefäße zu bilden. Strukturstudien zeigten, daß bFGF ein einkettiges Peptid aus 155 Aminosäuren ist, das auch in einer verkürzten Form ohne die ersten 15 N-terminalen Aminosäuren vorkommen kann. Verkurzter bFGF ist genauso wirksam wie nativer bFGF bezüglich der Bindung an die Zelloberflächenrezeptoren und in biologischen Tests, was anzeigt, daß die N-terminale Region von bFGF für die Bindung oder Bioaktivität nicht notwendig ist. In Abhängigkeit von dem Ausgangsgewebe wird entweder die intakte oder die verkürzte Form von bFGF gefünden. Es ist nicht bekannt, ob die verkürzte Form gleichzeitig mit dem ganzen Molekül in den Geweben vorkommt, oder ob sie ein Artefakt der proteolytischen Spaltung während des Extraktions- und Isolierungsverfahrens ist.
• Obwohl menschliche bFGF-cDNA und genomische Clone ein 17,8-kDa- Genprodukt von 155 Aminosäuren vorhersagen, enthält das aus menschlicher Plazenta isolierte bFGF-Protein zwei zusätzliche Aminosäuren N-terminal zu dem vorhergesagten Initiator-Methionin. Es wurde gefünden, daß die menschliche Zellinie SK-HEP-1 4 molekulare Formen von bFGF exprimiert (17,8, 22,5, 23,1 und 24,2 kDa). Die Translation des 17,8-kDa-bFGF-Proteins beginnt an dem kürzlich vorhergesagten Methionincodon (AUG-Codon), wohingegen die Translation der 22,5-, 23,1- und 24,2- kDa-Proteine bei unüblichen Codons beginnt, die keine AUG-Codons sind. Die Formen mit höherem Molekulargewicht sind colineare N-terminale Extensionen des etwa 18- kDa großen bFGF. (Vgl. beispielsweise Florkiewicz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3978-3981(1989)).
• Viele Organe, die bFGF enthalten, sind stark mit Blutgefäßen durchsetzt. Vaskuläre Endothelzellen exprimieren das bFGF-Gen und synthetisieren bioaktiven bFGF. bFGF wird auch in einer großen Vielzahl normaler diploider Zellen (die alle gegenüber bFGF in vitro empfindlich sind) und in verschiedenen von diesen Zellen stammenden Tumoren exprimiert.
• Zelltypen, die auf bFGF antworten, tragen hochspezifische FGF-Rezeptoren auf der Zelloberfläche. Weder bFGF noch aFGF bindet an Rezeptoren für andere Wachstumsfaktoren, und andere Wachstumsfaktoren binden nicht an den FGF-Rezeptor. Untersuchungen zur Vernetzung von bFGF oder aFGF mit ihren Rezeptoren (auf BHK- 21-Zellen) zeigten, daß beide Faktoren mit den gleichen zwei Membrankomponenten mit einem Mr von 145 und 125 kD wechseiwirken, die sich offensichtlich nur durch ihren Glycosylierungsgrad unterscheiden.
• Die Wechselwirkung von bFGF mit einer Zelle führt zu einer erhöhten Membranfluidität und Fältelung, die mit raschen Veränderungen in der dynamischen Struktur des Actincytoskeletts einhergehen. Basischer FGF stimuliert auch die Synthese von verschiedenen spezifischen Proteinen, insbesondere sezernierten Proteinen. Von einem dieser sezernierten Proteine, dem "sezernierten Hauptprotein", wurde jüngst gezeigt, daß es ein thiolabhängiges Kathepsin ist. FGF stimuliert auch die Synthese und Freisetzung eines Glycoproteins mit dem ursprünglichen Namen "Mitogen-reguliertes Protein", das ein Mitglied der Prolactin/Wachstumshormon-Familie ist und mit Proliferin identisch ist.
• Basischer FGF kann als "Kompetenz"-Faktor für normale diploide Zellen wirken, wobei eine kurze Exposition eine "Botschaft" zur Zellteilung auslöst. Der Verlauf durch den Zellzyklus wird weiter durch Plasmabestandteile einschließlich Transferrin und Lipoproteine hoher Dichte vermittelt.
• Der basische FGF besitzt sowohl akute als auch Langzeitwirkungen auf die Morphologie und das Wachstumsmuster antwortender Zellen. bFGF erhöht die migratorische Aktivität und verursacht ein "verwandeltes" Aussehen korifluenter Kulturen von 3T3-Zellen infolge einer reduzierten Zell-Substrat-Adhäsion, Wachstum in kreuzweisem Muster und erhöhte Membranfaltelung. Basischer FGF kann auch das Wachstum von nicht-verwandelten Zellen in Weichagar induzieren und kann die Wirkung des verwandelnden Wachstumsfaktors β (TGFβ) verstärken. Basischer FGF ist ein wirksames Mitogen für vom Mesoderm stammenden Zellen, der die Zellproliferation mit halbmaximaler und maximaler Wirkung in Konzentrationen von 1,5 bzw. 10 pM auslöst. Basischer FGF ist sowohl für Zellen, die in extrem geringen Dichten ausgebracht sind (beispielsweise unter Clonierungsbedingungen) als auch für Kulturen mit geringer Dichte mitogen und verringert stark die durchschnittliche Zellverdoppelungszeit. Dies ist in erster Linie eine Folge einer Verkürzung der G1-Phase des Zellzyklus.
• Basischer FGF stabilisiert die Phänotypische Expression gezüchteter Zellen. Diese Eigenschaft ist besonders interessant, da sie eine Langzeitzüchtung von Zelltypen ermöglicht hat, die ansonsten ihren normalen Phänotyp in Kultur bei wiederholter Passage in niedriger Dichte verlieren wurden. Diese biologische Wirkung von bFGF wurde ausführlich an von großen Blutgefäßen oder der Hornhaut stammenden Endothelzellen untersucht, die doniert und in Gegenwart von bFGF weitergeführt wurden, und welchen dann für verschiedene Zeitintervalle der Faktor entzogen wurde. Basischer FGF kann die Invasion von Kapillarendothelzellen in eine dreidimensionale Collagenmatrix und ihre eigene Organisation unter Bildung charakteristischer Tubuh, die den Blutkapillaren ähneln, induzieren. Gleichzeitig stimuliert bFGF die Endothelzellen zur Produktion eines uroktnaseartigen Plasminogen-Aktivators, einer Protease, die an der Antwort zur Gefäßneubildung beteiligt ist. So kann bFGF Prozesse stimulieren, die für die Angiogenese in vivo charakteristisch sind, einschließlich der endothelialen Zellmigration, Invasion und Produktion des Plasminogen-Aktivators.
• Basischer FGF wirkt auch als Differenzierungsfaktor für verschiedene Zellen einschließlich Chondrocyten, Schafpräadipocyten, Fibroblasten, Astrocyten und Oligodendrocyten; die bFGF-Behandlung neuraler Zellen induziert sowohl eine Neuritensprossung als auch die Ornithindercarboxylase-Aktivität. Nicht alle Wirkungen von bFGF auf die Zeildifferenzierung wirken stimulierend. Beispielsweise kann bFGF die Differenzierung und Fusion normaler diploider Myoblasten verzögern. In einigen etablierten Myoblasten-Zeliinien können bFGF und aFGF die Expression der Creatin- Phosphokinase erniedrigen.
• FGF verzögert auch signifikant die endgültige Seneszenz gezüchteter Zellen, wie beispielsweise von Granulosazellen, Nebennierenrindenzellen, Linsenepithelzellen und vaskulären Endothelzellen. Hält man diese Zellen in Abwesenheit von bFGF, so besitzen sie eine begrenzte Lebensspanne, wohingegen sie in dessen Gegenwart für mehr als 200 Generationen proliferieren können. In der Entwicklung fördert bFGF die Regeneration von Gliedern bei niedrigen Vertebraten und kann eine Rolle bei der frühen Entwicklung des Nervensystems spielen. Basischer FGF fördert sowohl das Überleben als auch die Differenzierung von Nervenzellen, die entweder vom Hippocampus oder dem Cortex stammen. FGF kann auch ausgeprägte Wirkungen auf die Proliferation und Differenzierung von Astrocyten und Oligodendrocyten besitzen, indem er ihre Eigenschaften als Gliazellen während der normalen Entwicklung oder nach einem spezifischen pathogenen Ereignis beeinflußt.
• Basischer FGF unterscheidet sich von anderen Wachstumsfaktoren, wie dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), dem von Plättchen stammenden Wachstumsfaktor (PDGF) oder dem TGFβ durch seine Fähigkeit, die Proliferation aller Zelltypen, die an der Wundheilung beteiligt sind, in vitro sowie in vivo zu stimulieren. Diese Zelltypen umfassen die Kapillarendothelzellen, die vaskulären glatten Muskelzellen, Fibroblasten, Chondrocyten und Myoblasten. Basischer FGF erhöht auch die Bildung von Granulationsgewebe in vivo, die synthetische Funktion von Fibroblasten und Myoblasten, die Rate der Reepithelialisierung abgelöster Epidermis und die Chondrossifizierung. Basischer FGF wirkt als potenter angiogenetischer Faktor in vivo und ist das hauptsächliche angiogenetische Mittel in gesunden vaskularisierten Geweben, wie Corpus luteum, Nebenniere, Niere und Netzhaut.
• Infolge der weiten Verbreitung von bFGF und seines breiten Bereichs von Zielzellen wurden dem als bFGF bekannten Molekül mindestens 23 verschiedene Namen gegeben (leukämischer Wachstumsfaktor (Thymus), Makrophagen-Wachstumsfaktor, von embryonaler Niere stammender Angiogenese-Faktor 2, Prostata-Wachstumsfaktor, Astroglia-Wachstumsfaktor 2, endothelialer Wachstumsfaktor, Tumorangiogenesefaktor, Hepatom-Wachstumsfaktor, Chondrosarcom-Wachstumsfaktor, von Knorpel stammender Wachstumsfaktor 1, von Augen stammender Wachstumsfaktor 1, Heparinbindende Wachstumsfaktoren Klasse II, myogener Wachstumsfaktor, gereinigter menschlicher Plazentafaktor, vom Uterus stammender Wachstumsfaktor, von embryonalem Carcinom stammender Wachstumsfaktor, menschlicher Hirnanhangsdrüsen-Wachstumsfaktor, von der Hirnanhangsdrüse stammender Chondroycten-Wachstumsfaktor, Adipocyten-Wachstumsfaktor, Prostata-Osteoblasten- Wachstumsfaktor, von Brustkrebs stammender Wachstumsfaktor, Glia- Wachstumsfaktor und vom Gehirn stammender neurotroper Faktor).
• Der basische FGF ist unter den Wachstumsfaktoren bezüglich seiner intrazellulären Lokalisation und dem Fehlen einer Signalsequenz, die allgemein zur Sekretion benötigt wird, einzigartig, was zu Fragen führt, wie und wann bFGF freigesetzt wird.
• FGF wurde zur Behandlung von ischämischen Herzerkrahkungen verwendet (U.S. Patente Nr. 4 296 100 und 4 378 347 von Franco), wobei gefunden wurde, daß er den Blutfluß im Herzen für längere Zeitspannen nach dem Myokardinfarkt erhöht.
• Nevo et al. U.S. Patent Nr. 4 642 120) beschreiben die Verwendung von FGF zur Reparatur von Defekten von Knorpel und Knochen.
• Senoo et al. Europäische Patentveröffentlichung EP 281 822) beschreiben ein Mutein von bFGF, das zur Beschleunigung des Zellwachstums in vitro verwendet werden kann und das als Wundheilungsförderer für Verbrennungen und als therapeutischer Wirkstoff bei Thrombosen verwendet werden kann.
• Arakawa et al. Europäische Patentveröffentlichung EP 320 148) beschreiben rekombinante bFGF-Analoga, die mindestens eine der biologischen Eigenschaften von Säuger-bFGF-Faktor besitzen. Der bFGF scheint die Vaskularisation, die Reepithelialisierung und die Wundreparatur zu induzieren.
• Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die vorstehend genannten Nachteile des Standes der Technik zu überwinden.
• Der vorliegenden Erfindung liegt weiterhin die Aufgabe zugrunde, eine große Anzahl von Vorläuferzellen zur Verwendung bei der Knochenmark-Transplantation durch Stimulieren der Proliferation von hämatopoetischen Vorläuferzellen mit einem Fibroblasten-Wachstumsfaktor, bevorzugt dem basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), oder einem funktionellen Derivat davon, zu züchten.
• Es ist weiterhin eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, hämatopoetische Vorläuferzellen in vitro mit einer für die Proliferation wirksamen Menge eines FGF oder eines funktionellen Derivats davon für eine Zeitspanne zu behandeln, die ausreicht, die Proliferation der hämatopoetischen Vorläuferzellen zu erlauben, um ihre Anzahl für eine effektivere Knochenmark-Transplantation zu erhöhen.
• Es ist weiterhin eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Etablierung des Knochenmark-Transplantats und die Rekonstitution von hämatopoetischen Prozessen zu beschleunigen. Dies wird durch bFGF oder ein funktionelles Derivat davon allein oder in Kombination mit einem oder mehreren Kolonie-stimulierenden Faktoren erreicht, die an einen Empfanger eines Knochenmark-Transplantats verabreicht werden.
• Diese Kombinationstherapie ist zur Regulierung der Blutzellproduktion und zur Behandlung von Krankheitszuständen, die durch hämatopoetische Dysfunktion (wie aplastische Anämie oder Neuropenie) oder Hyperplasie (wie verschiedene Leukämieformen) hervorgerufen werden, besonders nützlich.
• Es ist weiterhin eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, bestinnnte aplastische oder dysplastische Knochenmarkzustande zu behandeln, indem endogene Cytokine unter Verwendung von bFGF oder eines funktionellen Derivats davon stimuliert werden.
• Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Konzentration an Vorläuferzellen in einem Knochenmarkspender vor der Transplantation zu erhöhen, um die Effektivität des transplantierten Knochenmarks zu erhöhen, indem bFGF oder ein funktionelles Derivat davon verabreicht wird.
• Die Zugabe sehr kleiner Mengen (im Bereich von Nanogramm/ml) an FGF zu Kulturen hämatopoetischer Vorläuferzellen erhöht die Proliferationsrate dieser Zellen sowie die am Ende erhaltene Zelldichte stark. Diese Technik ist daher zur Bereitstellung großer Mengen an menschlichen Knochenmark-Stromazellen nützlich, die verwendet werden können, um Kulturen an hämatopoetischen Zellen für Therapie- und Forschungszwecke aufrechtzuerhalten.
• So betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Fibroblasten- Wachstumsfaktors oder eines funktionellen Derivats davon zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Stimulierung der Proliferation hämatopoetischer Vorläuferzellen in vivo oder in vitro.
• Sie betrifft auch ein Verfahren zur Proliferation in vitro-gezüchteter hämatopoetischer Vorläuferzellen, wobei man die hämatopoetischen Vorläuferzellen für eine Zeit, die ausreichend ist, die Proliferation hämatopoetischer Vorläuferzellen zu erlauben, in einem Kulturmedium züchtet, das eine für die Proliferation wirksame Menge eines Fibroblasten-Wachstumsfaktors oder eines funktionellen Derivats davon enthält.
• Die vorliegende Erfindung umfaßt weiter ein Arzneimittel zur Beschleunigung der Verankerung von transplantierten hämatopoetischen Knochenmarkzellen in einem Säuger oder zur Behandlung eines Säugers, der eine Krankheit aufweist, die mit der Dysplasie oder Aplasie einer Knochenmarkzellinie assoziiert ist, das eine Kombination eines Fibroblasten-Wachstumsfaktors oder eines funktionellen Derivats davon und mindestens eines Kolonie-stimulierenden Faktors umfaßt.
• Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines Fibroblasten- Wachstumsfaktors oder eines funktionellen Derivats davon zur Herstellung eines Arzneimittels zur Stimulierung der in-vivo-Proliferation hämatopoetischer Vorläuferzellen im Knochenmark eines voraussichtlichen Knochenmarkspenders, der ein Sauger ist, wobei das Arzneimittel zur Verabreichung zu einem Zeitpunkt vor der Knochenmarkentnahme geeignet ist, oder eines Arzneimittels zur Behandlung eines Säugers mit einer Krankheit, die mit der Dysplasie oder Aplasie einer Knochenmarkzellinie assoziiert ist.
• Die Figur list ein Satz von Mikrophotographien, die die Wirkung von bFGF auf die Morphologie von Knochenmark-(KM)-Stromazellen zeigen. Phasenkonstante Mikrophotographien von Stromakulturen bei verschiedenen Dichten in Abwesenheit (a) und (c) und in Gegenwart (b) und (d) von 20 ng/ml bFGF. Maßstabsbalken = 50 um.
• Die Figur 2 ist eine graphische Darstellung, die die Wirkung verschiedener Konzentrationen von bFGF auf das Wachstum von Knochenmarkstromazellen zeigt. Knochenmarkstromazellen, die 3mal einer Passage unterzogen worden waren, wurden in Stromamedium in einer Konzentration von 3 x 10&sup4; Zellen pro 35 mm Kulturgefäß in Abwesenheit ( ) oder Gegenwart von bFGF in einer Konzentration von 20 (O), 2 ( ) oder 0,2 (Δ) ng/ml bFGF ausgebracht. Duplikat-Schalen wurden entnommen, und die Zellzahlen wurden zu den angegebenen Zeiten bestimmt.
• Die Figur 3 ist eine graphische Darstellung, die die Wirkung von BFG auf das Wachstum von Knochenmarkstromazellen in verschiedenen Medien zeigt. Knochenmarkstromazellen, die zweimal einer Passage unterzogen worden waren, wurden in Konzentrationen von 6 x 10&sup4; Zellen pro 35 mm Schale in Stromamedium ( -), Stromamedium mit 20 ng/mi bFGF (Δ-Δ), RPMI-1640 (mit 10% FCS) ( -- ) oder RPMI-1640 (mit 10% FCS) + 20 ng/ml bFGF (o--o) ausgebracht. Duplikat-Schalen wurden entnommen und die Zellzahlen wurden zu den angegebenen Zeiten bestimmt.
• Die Figur 4 ist eine graphische Darstellung, die die Verstärkung der Wirkungen von bFGF auf das Stromazellwachstum durch Heparin zeigt. Knochenmarkstromazellen, die zweimal einer Passage unterzogen worden waren, wurden in einer Konzentration von 6 x 10&sup4; Zellen pro 35 mm Schale in Stromamedium allein ( -), Stromamedlum mit 2 ng/ml bFGF (o--o), 20 ng/m bFGF (Δ-Δ), 2 ng/ml bFGF und 20 ug/ml Heparin ( -- ) und 20 ug/ml Heparin allein ( -- ) ausgebracht. Duplikat-Schalen wurden entnommen, und die Zellzahlen wurden zu den angegebenen Zeiten bestimmt
• Die Figur 5 ist eine graphische Darstellung, die die Reversibilität der Wirkungen von bFGF auf das Zellwachstum zeigt. Knochenmarkstromazellen, die viermal einer Passage unterzogen worden waren, wurden verwendet. bFGF in einer Konzentration von 20 ng/ml wurde einigen Kulturen zugesetzt, die zweimal in Gegenwart von bFGF für eine Zeitspanne von 5 Wochen einer Passage unterzogen wurden. Diese Kulturen wurden dann mit Trypsin behandelt und in einer Konzentration von 3 x 10&sup4; Zellen pro 35 mm Schale entweder in fortgesetzter Gegenwart von 20 ng/ml bFGF (Δ-Δ) oder nach seiner Entfernung vor der Trypsinbehandlung ( -- ) ausgebracht. Begleitkulturen, die viermal ohne bFGF einer Passage unterzogen worden waren, wurden in der gleichen Dichte ausgebracht ( -). Duplikat-Schalen wurden entnommen, und die Zellzahlen wurden zu den angegebenen Zeiten bestimmt.
• Die Figur 6 ist eine graphische Darstellung, die die Wirkungen einer kurzen Exposition gegen bFGF auf das Knochenmarkstroma-Zellwachstum zeigt. Knochenmarkstromazellen, die zweimal einer Passage unterzogen worden waren, wurden in einer Konzentration von 6 x 10&sup4; Zellen pro 35 mm Schale ausgebracht. Das Medium allein (( -)) oder Medium mit 20 ng/m bFGF wurde den Sätzen von Kulturschalen 4 h (o--o), 24 h ( --) oder kontinuierlich (Δ-Δ) zugesetzt. Nach der Entfernung des bFGF-enthaltenden Mediums wurden die Kulturen dreimal mit 2 ml Stromamedium gewaschen, und das Stromamedium allein wurde dann diesen Schalen zugesetzt. Duplikat-Schalen wurden entnommen, und die Zellzahlen wurden zu den angegebenen Zeiten bestimmt.
• Die Figur 7 ist ein Balkendiagrannn, das die Dichte von in Gegenwart von bFGF gezüchteten Zellen gegenüber Kontrollzellen vergleicht. Knochenmarkstromazellen wurden in einer Konzentration von 2 x 10&sup7; Buffy-coat-Zellen/75 cm² Kolben in Abwesenheit und Gegenwart von 20 ng/ml bFGF ausgebracht. In 10- bis 12tägigen Intervallen wurde die Zellzahl bei jedem Satz von Kolben bestimmt, und die Zellen wurden in einer Konzentration von 1,3 x 10&sup6;/75 cm² Kolben einer Passage unterzogen.
• Die Figur 8 ist ein Balkendiagramm, das die Verstärkung der Erzeugung von hämatopoetischen Vorläuferzellen durch bFGF zeigt. Menschliche Knochenmarkzellen wurden in einer Konzentration von 2 x 10&sup7; Buffy-coat-Zellen/75 cm² Kolben in Abwesenheit und Gegenwart von 20, 2, 1 und 0,2 ng/ml bFGF ausgebracht. Eine adhärente Stromazellschicht, die Foci von hämatopoetischen Vorläuferzellen enthielt, wurde etabliert. Die Zahl der in das Kulturmedium freigesetzten Zellen wurde bestimmt.
• Die Figur 9 ist eine graphische Darstellung, die die Freisetzung von Granulocyten in das Kulturmedium unter dem Einfluß von bFGF zeigt. Menschliches Knochenmark wurde in einer Konzentration von 2 x 10&sup7; Buffy-coat-Zellen/75 cm² Kolben in Abwesenheit und Gegenwart von 20, 2, 1 und 0,2 ng/ml bFGF ausgebracht. Zu verschiedenen Intervallen wurden die Zellen im Überstand geerntet, und Objektträger mit diesen Zellen wurden hergestellt. Eine Differentialzellzählung identifizierte den Prozentsatz der verschiedenen Zelltypen, die in den Proben vorhanden waren.
• Die Figur 10 ist ein Satz von Balkendiagrammen, die die konzentrationsabhängige Stimulierung von Antworten von Vorläuferzellen auf CSFs durch bFGF zeigen. Menschliches Knochenmark wurde in einer Konzentration von 2 x 10&sup7; Buffy-coat-Zeflen/75 cm² Kolben in Abwesenheit und Gegenwart von 20, 2, 1 und 0,2 ng/ml bFGF ausgebracht. In verschiedenen Intervallen wurden die Zellen im Überstand geerntet und in Weichagar in Abwesenheit oder Gegenwart von einem von mehreren CSFs (GM-CSF, G-CSF und 5637-CM) ausgebracht, die das Wachstum von Zellen myeloiden Ursprungs stimulieren.
• Die Figur 11 ist eine graphische Darstellung, die zeigt, daß bei niedrigen Konzentrationen von bFGF die Vorläuferzeilpopulation im Medium zunimmt. Menschliches Knochenmark wurde in einer Konzentration von 2 x 10&sup7; Buffy-coat- Zellen/75 cm² Kolben in Abwesenheit und Gegenwart von 20, 2, 1 und 0,2 ng/ml bFGF ausgebracht. In wöchentlichen Intervallen wurden die Zellen im Überstand geerntet und in Weichagar in Gegenwart von GM-CSF ausgebracht, und die Kolonien wurden nach 14 Tagen gezählt. Ähnliche Ergebnisse wurden nach 7tägiger Kultur und mit G-CSF oder 5637-CM erhalten.
• Die Figur 12 ist ein Balkendiagrannn, das die Etablierung einer adhärenten Stromazellschicht, die Foci von hämatopoetischen Vorläuferzellen enthält, in Gegenwart von bFGF zeigt. Menschliche Knochenmarkzellen wurden in einer Konzentration von 2 x 10&sup7; Buffy-coat-Zellen/75 cm² Kolben in Abwesenheit und Gegenwart von 20, 2, 1 und 0,2 ng/ml bFGF ausgebracht. Eine adhärente Stromazellschicht, die Foci von hämatopoetischen Vorläuferzellen enthält, wurde etabliert.
• Die Erfinder haben gefünden, daß bFGF, ein Wachstumsfaktor mit vielen Aktivitäten, wie vorstehend beschrieben, das Wachstum von Knochenmarkstromakulturen stimulieren kann, die hämatopoetisches Zellwachstum und - differenzierung fördern können. Ferner haben die Erfinder gefunden, daß die Myelopoese in Knochenmarkkultur durch bFGF stimuliert wird. Ferner verstärkt bFGF die Wirkungen der Kolonie-stimulierenden Faktoren.
• Der Ausdruck "Hämatopoese" soll die Produktion von zellullären Elementen des Bluts umfassen und umfaßt Myelopoese, Lymphopoese und Erythropoese.
• Der Ausdruck "hämatopoetische Vorläuferzellen" bezeichnet eine Zelle in jeder der Blutzellinien (myeloid, erythroid, lymphoid, megakaryocytoid), die ein Vorläufer der reifen Blutzelle ist. Der hier verwendete Ausdruck soll sehr frühe Vorläuferzellen einschließen, wie pluripotente Stanimzellen, die sich sowohl selbst erneuern als sich auch zu allen Linien entwickeln können, sowie determinierte Stammzellen, die eine begrenztere Selbsterneuerungskapazität als pluripotente Stammzellen haben und auf eine spezielle Zellinie festgelegt sind. Insbesondere sind myeloide Vorläuferzellen, die als abgestammt von den determinierten Stammzellen der myeloiden Linie gelten, Zielzellen der erfindungsgemäßen Verfahren. Im allgemeinen ist bei Säugern die Gegenwart und proliferative Aktivität von hämatopoetischen Vorläuferzellen auf das Knochenmark beschränkt. Jedoch ist in dem Ausmaß, in dem extramedulläre Hämatopoese vorkommt, diese auch Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
• Basischer FGF stimuliert das Wachstum von Knochenmarkstromazellen und beschleunigt stark die Bildung einer primären Stromazellschicht nach Züchtung von frisch entnommenen Knochenmarkzellen. In Gegenwart von bFGF erreichen Stromazellen hohe Dichten, verlieren ihre Kontakthemmung und wachsen in vielschichtigen Lagen. Der Ausdruck "Stromazelle" bezeichnet eine heterogene Population von im Knochenmark vorhandenen Zellen, die in Kultur in Form einer adhärenten Schicht wächst. Stromazellen umfassen vom Knochenmark stammende Zellen, die als Adipocyten, Präadipocyten, Fibroblasten, Fibroblasten-koloniebildende Einheiten (CFU-F), retikuläre Zellen und Makrophagen bezeichnet werden. Clonierte Stromazellinien gelten auch als Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Der Stand der Technik über Knochenmarkstromazellen ist von Dorshkind (Ann. Rev. Immunol. 8:111- 137 (1990)) zusammengefaßt, worauf hiermit Bezug genommen wird.
• Heparansulfat ist bekanntlich eine Komponente der extrazellulären Matrix, die die Hämatopoese beeinflußt. Es wurde gezeigt, daß Wachstumsfaktoren, wie koloniestimulierende Faktoren, an Heparin binden und als möglicher Mechanismus dienen, über den Stromazellen die Hämatopoese beeinflussen können Roberts R. etal., Nature 332:376-378 (1988)).
• Heparin verstärkt stark die stimulatorische Wirkung niedriger Konzentrationen von bFGF (Saksela, O. et al., J. Cell Biol. 107:743-751(1988); Ulrich, S. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 137:1205-1213 (1986); vgl. nachstehendes Beispiel). Zusätzlich zu Heparin fällt die Verwendung eines Heparinfragments oder eines synthetischen Heparinersatzstoffes unter den Umfang der vorliegenden Erfindung.
• Heparinpraparate sind nicht einheitlich und heterogen in der Zusammensetzung, Molekülgröße, Struktur, Position der Substituenten (N-Sulfat, O-Sulfat und Glucuronsäure) und Sequenz (Goldgaber, et al. , Science 235:877 (1987); Tanzi et al., Science 235:881(1987); Robakis, N.K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4190 (1987). Diese Heterogenität gilt als verantwortlich für die verschiedenen beobachteten Wirkungen.
• Heparin kann modifiziert werden, oder Heparinfragmente können nach auf dem Fachgebiet bekannten Methoden synthetisiert werden (Choay, J. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 116:492 (1983), van Boeckel, C.A.A. et al., Tetrahedron Lett. 29:803 (1988), auf beide Druckschriften wird hiermit Bezug genommen).
• Bevorzugte Heparinfragmente umfassen ein Hexasaccharid- oder Pentasaccharidfragment. Bevorzugte synthetische Heparin-Ersatzstoffe umfassen Cyclodextrine aus 6 oder 8 Glucopyranoseeinheiten, wie beispielsweise β-Cyclodextrintetradecasulfat.
• Cyclodextrine sind natürlicherweise vorkommende cyclische nichtreduzierende wasserlösliche Oligosaccharide, die aus 6 bis 8 Glucopyranoseeinheiten bestehen (Bender, M.L. et al., Cyclodextrin Chemistry, Springer Verlag Berlin, (1978); Saenger, W., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 91:344 (1980): Saenger, W., in: Indusion Compounds (Atwood, J.L. et al., Hrsg.), Academic Press, New York, 1984, Bd. 2, Seiten 232-259).
• Erfindunsgemäß ist bFGF zur Verabreichung an Patienten, um die Hämatopoese zu stimulieren (beispielsweise bei Knochenmarktransplantat-Empfängern) oder um die Anzahl der Vorläuferzellen zu erhöhen (beispielsweise bei Knochenmarkspendern).
• bFGF kann zur Verabreichung auf jedem Weg, der den beabsichtigten Zweck erreicht, dienen. Beispielsweise kann die Verabreichung auf verschiedenen parenteralen Wegen, wie subcutan, intravenös, intradermal, intramuskulär, intraperitoneal, intranasal, transdermal oder buccal, erfolgen. Alternativ oder gleichzeitig kann die Verabreichung auf oralem Weg erfolgen. Die parenterale Verabreichung kann durch Bolusinjektion oder durch allmähliche Pertusion im Verlauf der Zeit erfolgen.
• Es ist selbstverständlich, daß die Dosierung von bFGF oder zusätzlichen Faktoren, wie CSFs (siehe nachstehend), für die In vivo- oder In vitro- Verabreichung, von dem Alter, Geschlecht, der Gesundheit und dem Gewicht des Empfängers, der Art der Begleitbehandlung, sofern durchgeführt, der Häufigkeit der Behandlung und der Natur der gewunschten Wirkung abhängt. Die Bereiche der nachstehend angegebenen effektiven Dosen sollen die Erfinder nicht beschränken und sind bevorzugte Dosisbereiche. Jedoch wird die am meisten bevorzugte Dosierung dem individuellen Patienten angepaßt, wie einem Fachmann klar ist und von ihm bestimmt werden kann.
• Präparate für die parenterale Verabreichung umfassen sterile wäßrige oder nichtwäßrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen, die Hilfsmittel oder Excipienten enthalten können, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Arzneimittel, wie Tabletten und Kapseln, können auch nach Routineverfahren hergestellt werden.
• Bei Verwendung zur Förderung des Wachstums von Knochenmark entweder in Knochenmarkspendern oder in -empfängern wird bFGF zur Verabreichung in einer effektiven Menge, bevorzugt im Bereich von etwa 0,1 ug/kg Körpergewicht bis etwa 20 mg/kg Körpergewicht, verwendet.
• Bei in vitro-Verwendung zur Förderung des Wachstums von Knochenmarkstromazellen oder Vorläuferzellen wird bFGF bevorzugt dem Medium zugesetzt, wobei eine Endkonzentration von etwa 0,01 bis 10 ug/l erhalten wird.
• Basischer FGF wird auch verwendet, um die Produktion von Granulocyten nach Chemotherapie gegen maligne Erkrankungen zu verstärken. Bevorzugt dient bFGF zur Verabreichung in einer Dosis von etwa 0,1 ug bis etwa 20 ug/kg Körpergewicht, um einen Patienten vor Infektionen als Ergebnis der Wirkungen der Knochenmarkdepression der Chemotherapie oder vor den anderen Ursachen der Knochenmarkdepression, die auf dem Fachgebiet bekannt sind und vorstehend diskutiert wurden, zu schützen.
• Um die Produktion von Knochenmarkzellen zu verstärken und dadurch die hämatopoetische Rekonstitution eines Patienten, der sich einer Knochenmark- Transplantation unterzieht, zu fördern, dient bFGF oder ein funktionelles Derivat davon (nachstehend definiert) zur Verabreichung in Dosen bevorzugt im Bereich von etwa 0,1 ug/kg Körpergewicht bis etwa 20 mg/kg Körpergewicht jedes Mittels. bFGF dient bevorzugt zur Verabreichung bis zu einer Woche, bevor der Patient das Knochenmark erhält, wodurch das "therapeutische Fenster" vor dem Anwachsen des Transplantats signifikant verkurzt wird.
• bFGF oder ein funktionelles Derivat davon in Kombination mit einem oder mit mehreren koloniestimulierenden Faktoren, bevorzugt in Dosierungen im Bereich von etwa 0,1 ug/kg Körpergewicht bis zu etwa 20 mg/kg Körpergewicht jedes Mittels dient zur Verabreichung an einen Patienten, der sich einer Knochenmarktransplantation unterzieht zur Erhöhung der Produktion der Knochenmarkzellen. Das Gemisch aus bFGF und CSF dient bevorzugt zur Verabreichung bis zu einer Woche, bevor der Patient das Knochenmarktransplantat erhält, wodurch das "therapeutische Fenster" vor dem Anwachsen des Transplantats signifikant verkürzt wird, währenddessen das Knochenmark des Empfängers gehemmt und der Empfänger besonders infektionsanfällig ist.
• Der hier verwendete Ausdruck "Kolonie-stimulierender Faktor" (CSF) bezeichnet einen beliebigen CSF und verwandte Cytokine und Lytuphokine, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, und die Schritte der Hämatopoese stunulieren. Solche Faktoren umfassen ohne Beschränkung darauf GM-CSF, G-CSF, M-CSF, IL-3, IL-4 und IL-6. Bezüglich einer Diskussion der CSFs und ihrer Rolle in der Hämatopoese vergleiche Nienhuis, A., New Eng. J. Med 318-916-918 (1988); Brandt etal. (a.a.O.), Cosman, D., Immunol. Today 9:97-98 (1988); und Dorshkind (a.a.O.).
• Die erfindungsgemäßen Methoden betreffen die Verwendung von einem oder von mehr als einem CSF in Kombination mit bFGF. Ein Fachmann auf dem Gebiet kann leicht in Abhängigkeit von der oder den speziell erwünschten Wirkung(en) bestimmen, welcher CSF oder welche Kombination an CSFs verwendet wird.
• Erfindungsgemäß erhält ein Knochenmarkspender eine wirksame Menge an bFGF oder eines funktionellen Derivats davon, bevorzugt von etwa 0,1 ug/kg Körpergewicht bis zu etwa 20 mg/kg Körpergewicht. Diese Behandlung wird zu einem Zeitpunkt vor dem Erhalt des Knochenmarks begonnen, die ausreicht, daß die Vorläuferzellzahl in dem Knochenmark zunimmt. Ein bevorzugter Zeitpunkt für die Behandlung ist eine Zeitspanne bis zu 2 Wochen vor dem Erhalt des Knochenmarks. Durch Erhöhen der Produktion von Vorläuferzellen im Knochenmark des Spenders soll diese Behandlung die Effizienz des Knochenmarktransplantats erhöhen.
• Wenn ein geeigneter Knochenmarkspender nicht verfiugbar ist, werden die patienteneigenen Knochenmarkzellen in Gegenwart von bFGF oder eines funktionellen Derivats davon gezüchtet, um Stromazell-"Feeder"zellschichten für die anschließende Erzeugung von primitivem Vorläufer-(Stannn)-Zellen zur Verwendung zur Implantation in den Patienten zu erzeugen. Verfahren zur Züchtung von Stromazellen sind in Dexter, T.M. et al., Long-Term Bone Marrow Culture, Hrsg. Wright, D.B. et al., Liss, New York, S. 441 (1984) und Dorshkind, K et al J. Immunol. Meth. 89:37-47 (1986) beschrieben, worauf hiermit Bezug genommen wird. bFGF kann Stromazellkulturen, wie in dem nachstehenden Beispiel beschrieben, zugesetzt werden. Alternativ kann bFGF oder ein funktionelles Derivat davon direkt Kulturen aus Gesamt-Knochenmark zugesetzt werden, um die Anzahl der Vorläuferzellen in einer Population, die für die Transplantation verwendet werden soll, zu erhöhen.
• Übermäßige bFGF-Produktion im Knochenmark kann an der Ätiologie der Myelofibrose verbunden sein. Antikörper gegen bFGF oder Antagonisten gegen den FGF-Rezeptor können zur Behandlung von Myelofibrose-Patienten oder Patienten mit einer verwandten Erkrankung nützlich sein. Suramin kann auch zur Behandlung von Myelofibrose nützlich sein. Diese Verbindung bindet viele Wachstumsfaktoren, einschließlich bFGF, und wurde jüngst zur Behandlung von Krebspatienten verwendet (Rocha, R.V. et al., Cancer Cells 2: 105-115 (1990)).
• Der bevorzugte tierische Patient gemäß der Erfindung ist ein Säuger. Unter dem Ausdruck "Säuger" ist ein Individuum der Klasse Mammalia gemeint. Die Erfindung ist besonders nützlich zur Behandlung von Menschen, obwohl sie auch für veterinärmedizinische Behandlungen beabsichtigt ist.
• Zusätzlich zu bFGF soll die vorliegende Erfindung andere Fibroblasten- Wachstumsfaktoren und funktionelle Derivate davon mit ähnlicher Bioaktivität für alle hier beschriebenen Verwendungen umfassen. Umfaßt werden alle aktiven Formen von FGF, die von dem FGF-Transkript abgeleitet sind, alle Muteine mit FGF-Aktivität und alle Moleküle, die mit dem FGF-Rezeptor wechselwirken können. Andere auf dem Fachgebiet bekannte FGF umfassen sauren FGF, das hst/K-fgf-Genprodukt, FGF-5 und int-2 (vgl. Rifkin, D.B. et al., a.a.O.).
• Erfindungsgemäß umfaßt werden auch alternative Molekülformen von bFGF, wie solche mit Molekulargewichten von 17,8, 22,5, 23,1 und 24,2 kDa. Die Translation des 17,8-kDa-bFGF-Proteins beginnt an dem kürzlich vorhergesagten Methionin(AUG)-Codon, wohingegen die Translation des 22,5-, 23,1- und 24,2-kDa-Proteins bei ungewöhnlichen Nicht-AUG-Codons beginnen. Die Formen mit höherem Molekulargewicht sind colineare N-terminale Extensionen des 18 kDa-bFGF (Florkiewicz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3978-3981(1989), worauf hiermit Bezug genommen wird).
• Als Alternativen zu rekombinantem oder gereinigtem intaktem bFGF können funktionelle Derivate des bFGF-Moleküls verwendet werden. Vergleiche beispielsweise Arakawa et al., Europäische Patentveröffentlichung EP 320 148, worin rekombinante bFGF-Analoga, die einen Teil oder die Gesamtheit der Primärstrukturkonformationen und der biologischen Eigenschaften von menschlichem bFGF besitzen, beschrieben sind. In diesen Analoga ist mindestens einer der Cysteinreste des natürlich vorkommenden basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt.
• Eine weitere Form von bFGF, die erfindungsgemäß verwendet werden kann, ist in Senoo etal., Europäische Patentveröffentlichung EP 281 822) offenbart. Das offenbarte Mutein umfaßt modifizierte mikrobiologisch produzierte bioaktive Proteine, die die gleichen Aktivitäten wie die natürlich vorkommende Verbindung besitzen, aber keine intermolekularen Brücken und intramolekularen Bindungen über Cysteinreste oder andere Reste bilden können, was zur Bildung einer unerwünschten Tertiärstruktur führt (z.B. Konformationen, die die Proteinaktivität erniedrigen).
• "Funktionelles Derivat" bezeichnet ein "Fragment", eine "Variante", ein "Analogon" oder ein "chemisches Derivat" von FGF, bevorzugt bFGF, wobei die Ausdrücke nachstehend definiert werden. Ein funktionelles Derivat behält mindestens einen Teil der Funktion des bFGF, die dessen erfindungsgemäße Verwendung erlaubt.
• Ein bFGF-"Fragment" bezeichnet jede Untergruppe des Moleküls, d.h. ein kürzeres Peptid.
• Eine "Variante" von bFGF bezeichnet ein Molekül, das entweder dem ganzen Peptid oder einem Fragment davon im wesentlichen ännlich ist. Peptidvarianten können zweckdienlicherweise durch direkte chemische Synthese der Peptidvariante unter Verwendung auf dem Fachgebiet gut bekannter Methoden hergestellt werden.
• Alternativ können Aminosäuresequenzvarianten des Peptids durch Mutationen in der DNA, die das synthetisierte Peptid codiert, hergestellt werden. Solche Varianten umfassen beispielsweise Deletionen oder Insertionen oder Substitutionen von Resten in der Aminosäuresequenz. Jede Kombination aus Deletion, Insertion und Substitution kann auch hergestellt werden, um zu dem Endprodukt zu gelangen, vorausgesetzt, das Endprodukt besitzt die gewünschte Aktivität. Natürlich dürfen die Mutationen, die in der DNA, die die Peptidvariante codiert, vorgenommen werden, das Leseraster nicht ändern und erzeugen bevorzugt keine komplementären Regionen, die eine mRNA-Sekundärstruktur ergeben könnten (siehe Europäische Patentveröffentlichungs-Nr. EP 75 444).
• Auf der genetischen Ebene werden diese Varianten üblicherweise durch ortsspezifische Mutagenese (wie beispielsweise von Adelman et al., DNA 2:183 (1983) ausgeführt) von Nucleotiden in der DNA, die das Peptidmolekül codiert, hergestellt, wodurch die DNA, die die Variante codiert, erzeugt wird und anschließend die DNA in der rekombinanten Zellkultur exprimiert wird. Die Varianten zeigen typischerweise die gleiche qualitative biologische Aktivität wie das Nicht-Varianten-Peptid.
• Ein "Analogon" von bFGF bezeichnet ein nicht-natürliches Molekül, das im wesentlichen entweder zu dem ganzen Molekül oder einem Fragment davon ähnlich ist.
• Ein "chemisches Derivat" von bFGF enthält zusätzliche chemische Einheiten, die normalerweise nicht Teil des Peptids sind. Covalente Modifikationen des Peptids fallen unter den Schutzumfang der Erfindung. Solche Modifikationen können in das Molekül eingeführt werden, indem Ziel-Aminosäurereste des Peptids mit einem organischen Derivatisierungsmittel umgesetzt werden, das mit ausgewählten Seitenketten oder terminalen Resten umgesetzt werden.
• Cysteinylreste werden am häufigsten mit α-Halogenacetaten (und entsprechenden Aminen), wie Chloressigsäure oder Chloracetamid, umgesetzt, wodurch Carboxymethyl- oder Carboxyamidomethylderivate erhalten werden. Cysteinylreste werden auch durch Umsetzung mit Bromtrifluoraceton, α-Brom-β-(5-imidazoyl)propionsäure, Chloracetylphosphat, N-Alkylmaleimiden, 3-Nitro-2-pyridyldisulfid, Methyl-2-pyridyldisulfid, p-Chlormercuribenzoat, 2-Chlormercuri-4-nitrophenol oder Chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol derivatisiert.
• Histidylreste werden durch Umsetzung mit Diethylpyrocarbonat bei einem pH-Wert von 5,5 bis 7,0 derivatisiert, weil dieses Mittel für die Histidylseitenkette relativ spezifisch ist. Parabromphenacylbromid ist ebenfalls nützlich. Die Reaktion wird bevorzugt in 0,1 M Natriumkakodylat bei einem pH-Wert von 6,0 durchgeführt.
• Lysinyl- und aminoterminale Reste werden mit Bernsteinsäureanhydrid oder anderen Carbonsäureanhydriden umgesetzt. Die Derivatisierung mit diesen Mitteln besitzt die Wirkung, daß die Ladung der Lysinylreste umgekehrt wird. Andere geeignete Reagenzien zur Derivatisierung von α-Amino-enthaltenden Resten umfassen Imidoester, wie Methylpicolinimidat, Pyridoxalphosphat, Pyridoxal, Chlorborhydrid, Trinitrobenzolsulfonsäure, O-Methylisoharnstoff, 2,4-Pentandion und die Transaminasekatalysierte Reaktion mit Glyoxylat.
• Arginylreste werden durch Umsetzung mit einem oder mehreren herkömmlichen Reagenzien modifiziert, darunter Phenylglyoxal, 2,3-Butandion, 1,2- Cyclohexandion und Ninhydrin. Zur Derivatisierung von Argininresten muß die Umsetzung unter alkalischen Bedingungen wegen des hohen pKa-Werts der Guanidinfunktion durchgeführt werden. Ferner können diese Reagenzien mit den Gruppen von Lysin sowie mit der Arginin-ε-aminogruppe reagieren.
• Die spezifische Modifikation der Tyrosylreste per se wurde ausführlich untersucht, wobei besonderes Interesse an der Einführung spektraler Marker in die Tyrosylreste durch Umsetzung mit aromatischen Diazoniumverbindungen oder Tetranitromethan bestand. Am häufigsten werden N-Acetylimidazol und Tetranitromethan zur Bildung von O-Acetyltyrosylspezies bzw. 3-Nitroderivaten verwendet.
• Carboxylseitengruppen (Aspartyl- oder Glutamylgruppen) werden selektiv durch Umsetzung mit Carbodiimiden (R'-N-C-N-R'), wie 1-Cyclohexyl-3-(2- morpholinyl-(4-ethyl)carbodiimid oder 1-Ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl)carbodiimid modifiziert. Ferner werden Aspartyl- und Glutamylreste in Asparaginyl und Glutaminylreste durch Umsetzung mit Ammoniumionen umgewandelt.
• Glutaminyl- und Asparaginylreste werden häufig zu den entsprechenden Glutamyl- und Aspartylreste desamidiert. Alternativ werden diese Reste unter leicht sauren Bedingungen desamidiert. Beide Formen dieser Reste fallen unter den Umfang dieser Erfindung.
• Die Derivatisierung mit biftinktionellen Mitteln ist zur Vernetzung des Peptids an eine wasserunlösliche Trägermatrix oder an andere makromolekülare Träger nützlich. Üblicherweise verwendete Vernetzungsmittel umfassen z.B. 1,1-Bis-(diazoacetyl)-2- phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, beispielsweise Ester mit 4- Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester einschließlich Disuccinimidylester, wie 3,3'-Dithiobis-(succinimidylpropionat), und bifunktionelle Maleimide, wie Bis-N-maleimido-1,8-octan. Derivatisierungsmittel, wie Methyl-3-[p-azidophenyl)dithio]propioimidat ergeben photoaktivierbare Intermediate, die Vernetzungen in Gegenwart von Licht ergeben können. Alternativ werden reaktive wasserunlösliche Matrizen, wie Bromcyan-aktivierte Kohlenhydrate und die reaktiven Substrate, die in den U.S. Patenten Nr. 3 969 287, 3 691 016, 4 195 128, 4 247 642, 4 229 537 und 4 330 440 beschrieben sind, zur Proteinimmobilisierung verwendet.
• Andere Modifikationen umfassen die Hydroxylierung von Prolin und Lysin, die Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl- oder Threonylresten, die Methylierung von α-Aminogruppen von Lysin, Arginin und Histidin-Seitenketten (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, Seiten 79-86 (1983)), die Acetylierung von N-terminalem Amin und in einigen Fällen die Amidierung von C-terminalen Carboxylgruppen.
• Derartig derivatisierte Einheiten können die Löslichkeit, Absorption, biologische Halbwertszeit und dergleichen verbessern. Die Einheiten können alternativ irgendwelche unerwunschten Nebenwirkungen des Proteins und dergleichen beseitigen oder abschwächen. Einheiten, die solche Effekte vermitteln konnen, sind beispielsweise in Reinington's Pharmaceutical Sciences, 16. Aufl., Mack Publishing Co., Easton, PA (1980) beschrieben.
• Das folgende Beispiel dient der Erläuterung, soll aber die Erfindung nicht beschränken.
BEISPIEL LANGZEITZÜCHTUNG VON MENSCHLICHEN KNOCHENMARKSTROMAZELLEN IN GEGENWART VON bFGF
• Die Wirkung von bFGF auf menschliche Knochenmakstromazellen wurde als Mittel zur Überwindung der Schwierigkeit, eine ausreichende Anzahl solcher Zellen zu erhalten, untersucht.
A. MATERIAL UND METHODEN
• Rekombinanter menschliche bFGF wurde von Synergen Inc. (Boulder, CO) bezogen. Trypsin, Heparin oder Hydrocortison wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) bezogen. Das minimale essentielle α-Medium (αMEM) wurde von Flow Laboratories (McLean, VA) erhalten. Fötales Kälberserum wurde von Armour Pharmaceutical Co. (Kankakee, IL) erhalten, und Pferdeserum von GIBCO (Grand Island, NY).
• Menschliche Knochenmarkstromazellen wurden von gesunden freiwilligen Erwachsenen nach Einwilligung erhalten. Buffy-coat-Zellen wurden in einer Konzentration von 3 x 10&sup6;/ml in "Stromamedium" ausgebracht, das aus αMEM mit 12,5% fötalem Kälberserum, 12,5% Pferdeserum, 10&supmin;&sup6;M Hydrocortison, 10&sup4;M 2- Mercaptoethanol, 1,6 mM Glutamin und Antibiotika bestand. Eine Schicht von adhärenten Zellen wurde innerhalb von 2 - 3 Wochen erhalten. Nichtadhärente Zellen wurden durch ausgiebiges Waschen entfernt, und die adhärente Zellschicht wurde einer Passage unterzogen, indem sie zuerst mit 0,25% Trypsin mit 0,02% EDTA behandelt wurde, um die Zellen abzulösen. bFGF wurde in den angegebenen Konzentrationen zugesetzt. Frisches "Stromamedium" wurde in 48stündigen Intervallen beim Test der Wirkungen von bFGF auf das Wachstum von Knochenmarkstromazellen zugesetzt.
B. ERGEBNISSE 1. Morphologie
• Die Wirkungen von bFGF auf die Morphologie von Knochenmarkstromazellen in Kultur waren bemerkenswert, wie in Figur 1 gezeigt ist. Die verlängerte Fibroblasten-Morphologie der Stromazellen wurde durch bFGF so verändert, daß die Zellen eine kompaktere Morphologie hatten (Figuren 1a und 1b). bFGF veränderte auch das Aussehen der konfluenten Zellkulturen. In Gegenwart von bFGF wachsen die Zellen bis zu einer hohen Dichte in mehreren Schichten, während ihre Gegenstücke, die in Abwesenheit von bFGF gehalten wurden, bei einer niedrigen Zelldichte kontaktgehemmt wurden (Figuren 1c und 1d).
2. Wachstum
• Die Zugabe von bFGF erhöhte die Dichte der primären Stromazellschicht. Primäre Knochenmark-Buffy-coat-Zellen wurden in "Stromamedium" in einer Konzentration von 3 x 10&sup6; Zellen/ml pro 35 mm-Schale in Gegenwart von 0, 0,2, 2 oder 20 ng/ml bFGF ausgebracht, und die Zellzahl bei Duplikat-Schalen wurde 15 Tage später bestimmt. Wie in Tabelle 1 gezeigt, wurde eine Sfache Erhöhung der Zelldichte festgestellt, wenn die Zellen in Gegenwart von 20 ng/ml bFGF gezüchtet wurden; 0,2 ng bFGF/ml verdoppelte in etwa die Zelldichte. Tabelle 1 Wirkung von bFGF auf das Wachstum von primären Knochenmarkstromazellen
• Primäre Knochenmark-Bufiy-coat-Zellen wurden in Stromamedium in einer Konzentration von 3 x 10&sup6; Zellen pro 35 mm-Petrischale in Abwesenheit oder Gegenwart der angegebenen Konzentration an bFGF ausgebracht. Die Zellzahlen wurden bei den Duplikat-Schalen nach 15 Tagen bestimmt.
• Die kontinuierliche Züchtung von Stromazellen in Gegenwart von bFGF verzögerte ihre Seneszenz beträchtlich. Die Stromazellen hatten ein eingeschränktes proliferatives Potential und alterten nach etwa 2 Generationen, wohingegen kontinuierlich in Gegenwart von bFGF gezüchtete Zellen bis zu etwa 26 Generationen überlebten, wie in Tabelle 2 gezeigt ist. Tabelle 2 Wirkung von bFGF auf die Seneszenz von Knochenmarkstromazellen
• Das Knochenmark wurden 6 gesunden Freiwilligen entnommen und in Abwesenheit und kontinuierlicher Gegenwart von 20 ng/ml bFGF gezüchtet. In 10- bis 13tägigen Intervallen wurden die einzelligen Schichten mit Trypsin entfernt, und 1,3 x 10&sup6; Zellen wurden zu 75 cm²-Kolben gegeben. Dieses Verfahren wurde fortgesetzt, bis das Zellwachstum aufhörte.
• a - Nicht bestimmt.
• Die stimulatorischen Wirkungen auf das Wachstum wurden auch festgestellt, wenn Stromazellschichten, die in Kultur einer Passage unterzogen worden waren, anschließend bFGF ausgesetzt wurden. Die Figur 2 erläutert die Wirkung variierender Konzentrationen von bFGF auf Stromazellen, die 3mal vor dessen Zugabe einer Passage unterzogen worden waren. Mit 20 ng/ml bFGF 9 Tage behandelte Schalen enthielten 10mal mehr Zellen, als in unbehandelten Kulturen gefünden wurden. Niedrige Konzentrationen an bFGF (0,2 ng/ml) verstärkten ebenfalls signifikant das Zellwachstum.
• Die Stromazellen hatten ein sehr begrenztes proliferatives Potential bei Züchtung in RPMI-1640-Medium, das mit 10% fötalem Kälberserum supplementiert war, wie in Figur 3 gezeigt ist. Die Zugabe von bFGF in einer Konzentration von 20 ng/ml zu diesem Medium verstärkte das proliferative Potential der Stromazellen stark. Beispielsweise wurde nach 9tägiger Kultur mit bFGF eine 12fache Zunahme der Zellzahl festgestellt. In Gegenwart von 20 ng/ml bFGF gezüchtete Zellen wuchsen schneller als solche in "Stromamedium" ohne bFGF. Jedoch erreichten in RPMI-1640 + bFGF gezüchtete Zellen keine so hohe Enddichte wie in "Stromamedium" + bFGF gezüchtete Zellen.
• Heparin verstärkte die Wachstumsstimulation durch bFGF. Die Wachstumsrate von m Gegenwart von 2 ng/ml bFGF und 20 ug/ml Heparin gezuchteten Zellen war wesentlich größer als die Wachstumsrate von in Gegenwart von bFGF allein gellichteten Zellen und war etwas größer als die Wachstumsrate von in Gegenwart von 20 ng/ml bFGF gezüchteten Zellen, wie in Figur 4 gezeigt ist. Heparin allein hat in einer Konzentration von 20 ug/ml nur eine geringe Wirkung auf das Zellwachstum.
• Die Wirkungen von bFGF auf das Stromazellwachstum waren vollkommen reversibel. Zellen, die in Gegenwart von 20 ng/ml bFGF für 2 Passagen über 5 Wochen gezüchtet wurden, hatten die gleiche Wachstumsrate wie unbehandelte Zellen, wenn bFGF vor der Trypsinbehandlung und der Passage der einzelligen Schicht entfernt wurde, wie in Figur 5 gezeigt ist. Im Gegensatz dazu wurden signifikante stimulatorische Wirkungen auf das Wachstum festgestellt, wenn bFGF Stromazellen für kurze Zeitspannen zugesetzt wurde.
• Selbst eine kurze Exposition gegen bFGF stimuliert das Zellwachstum (Figur 6). Eine 3fache Zunahme der Zellzahl wurde festgestellt, wenn bFGF den Zellen 24 H vor der Entnahme und dem Ersatz durch reguläres Stromamedium zugesetzt wurde.
• Die Zellkulturen in Gegenwart von bFGF erreichten eine viel höhere Dichte als die Zellen im Kontrollmedium (Figur 7). Auch konnten die Zellkulturen in Gegenwart von bFGF sehr viel öfter vor dem Auftreten der Seneszenz einer Passage unterworfen werden. Diese trat nach etwa 26 Generationen, verglichen mit etwa 2 Generationen für ohne bFGF gezüchtete Zellen auf Basischer FGF kann daher zur Erzeugung einer großen Anzahl von menschlichen Knochenmarkstromazellen verwendet werden, was vorher nicht möglich war.
• Es ist jedoch festzustellen, daß bFGF die Anzahl der in das Kulturmedium freigesetzten hämatopoetischen Zellen erhöhte Figur 8). Basischer FGF stimuliert daher unter diesen Bedingungen signifikant die Erzeugung von hämatopoetischen Vorläuferzellen zusammen mit einer Stromazelischicht.
• Die Zugabe von niedrigen Konzentrationen von bFGF zu Zellkulturen führte zu einem erhöhten Prozentsatz an in das Medium abgeschiedenen Granulocyten (Figur 9). Dieser Versuch zeigt, daß bFGF die Produktion von Zellen der Myeloidlinie erhöht. Die erhöhte Produktion von Granulocyten nach Knochenmarktransplantation oder Chemotherapie gegen maligne Erkrankungen wurde den Patienten vor Infektionen schützen.
• bFGF stimulierte in allen getesteten Konzentrationen die Erzeugung von Vorläuferzellen, die auf CSFs in vitro antworten können Figuren 10 und 11). GM- CSF, G-CSF und 5637-konditioniertes Medium (CM) stimulieren alle das Wachstum von Myeloid-Vorläuferzellen. GM-CSF wirkt auf primitivere Vorläuferzellen als G-CSF, und 5637-CM enthalt ein Gemisch aus verschiedenen Cytokinen. Die in dem Medium der mit bFGF gezüchteten Zellen vorhandenen Vorläuferzellen waren daher myeloiden Ursprungs.
• Die Gegenwart von bFGF in Kultur erhjhte die Anzahl der Vorläuferzellen enthaltenden Foci in der Stromazellschicht (Figur 12). bFGF förderte die Entwicklung von Foci von Vorläuferzellen in der adhärenten Stromaschicht und erhöhte die Hämatopoese zusammen mit der Stromazellschicht.
C. Diskussion
• Es wurde früher gezeigt, daß basischer FGF ein potentes Mitogen für viele vom Mesoderm stammende Zellen ist und die Seneszenz in bestimmten gezüchteten Zellen verzögert Gospodarowicz et al., in vitro 14:85-118 (1978); Gospodarowicz et al., in Ford R.J. und Maizel A.L. (Hrsg.), Mediators in Cell Growth and Differentiation, Raven Press, New York, 1985, Seiten 109-134; Gospodarowicz etal., Endocr. Rev. 8:95-114 (1987)).
• Die Erfinder haben gezeigt, daß in Konzentrationen von nur 0,2 ng/ml bFGF ein potentes Mitogen für Knochenmarkstromazellen ist. bFGF erhöht auch die Enddichte, die von Knochenmark-Stromazellkulturen erhalten wird, was zu Zellen führt, die dichte mehrschichtige Schichten bilden und eine transformierte Morphologie besitzen. Diese Wirkungen sind vollständig reversibel. Nach Exposition gegen bFGF für verlängerte Zeitspannen kehrt die Zellwachstumsrate zu einer, die der unbehandelter Zellen vergleichbar ist, zurück, sobald bFGF aus dem Medium entfernt und die Zellen mit Trypsin behandelt und einer Passage unterworfen wurden.
• Es wurde gezeigt, daß bFGF an Heparansulfate, die in Zellmatrizen vorhanden sind, bindet, und daß die Wechselwirkung mit Heparin und Heparansulfat bFGF vor proteolytischem Abbau schützt (Sommer, A. et al., J. Cell. Physiol. 138:215- 220 (1989); Saksela et al., J. Cell. Biol. 107:743-751 (1988)). Die Matrixbindung von bFGF kann ein Reservoir des Wachstumsfaktors und eine kontinuierliche Quelle für den Liganden für spezifische Hochaffinitätsrezeptoren auf den Zelloberflächen bereitstellen Moscatelli, D., J. Cell. Biol. 107:753-759 (1988); Flaumenhaft, R. et al., J. Cell. Physiol. 140:75-81 (1989). Es wurde hier gezeigt, daß eine signifikante Stimulierung des Wachstums auf eine vorübergehende (4 H) Exposition von Stromazellen gegenüber bFGF folgt. Heparin verstärkt die wachstumsstimulierende Wirkung von bFGF, was wahrscheinlich darauf zurückzuführen ist, daß Heparin bFGF vor proteolytischem Abbau schützt.
• Knochenmarkstromazellen sind eine wesentliche Komponente des hämatopoetischen Systems und sind bekanntlich eine Quelle für die koloniestimulierenden Faktoren, die für Wachstum und Differenzierung hämatopoetischer Stammzellen notwendig sind. Basischer bFGF wurde aus Präparaten von Rinderknochenmatrix isoliert (Hauschka, S.V. et al., J. Biol. Chem. 261:12665- 12674 (1986)), und er kann ein wichtiger Faktor sein, der für die Funktion und Proliferation des Stromazellkomponente des hämatopoetischen Systems benötigt wird.
• Die Tatsache, daß bFGF bei Zugabe zu Stromamedium das Wachstum großer Zahlen von menschlichen Stromafibroblasten in vitro erlaubt, liefert eine leichter verfügbare Quelle für diese Fibroblasten zur Untersuchung ihrer Antwort auf eine Vielzahl von Cytokinen, die für die Knochenmarkphysiologie relevant sind.
• Nachdem die vorliegende Erfindung nun vollständig beschrieben wurde, ist einem Fachmann klar, daß sie innerhalb eines weiten Bereichs von äquivalenten Parametern, Konzentrationen und Konditionen ohne vom Gehalt und Schutzumfang der Erfindung abzuweichen und ohne unnötiges Experimentieren durchgeführt werden kann.
• Während diese Erfindung im Zusammenhang mit spezifischen Ausführungsformen davon beschrieben wurde, ist klar, daß sie weiter modifiziert werden kann. Diese Anwendung soll alle Variationen, Verwendungen oder Anpassungen der Erfindung umfassen, die im allgemeinen den Grundsätzen der Erfindung folgen und soll solche Abweichungen von der vorliegenden Offenbarung umfassen, die in die bekannte oder übliche Praxis auf dem Gebiet, auf das sich die Erfindung bezieht, fallen, und die auf wesentliche, vorstehend dargelegte Merkmale im Rahmen der beigefügten Patentansprüche angewendet werden können.

Claims (28)

1. Verwendung eines Fibroblasten-Wachstumsfaktors oder eines funktionellen Derivats davon zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Stimulierung der Proliferation hämatopoetischer Vorläuferzellen in vivo oder in vitro.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Fibroblasten- Wachstumsfaktor basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor, saurer Fibroblasten-Wachstumsfaktor, das hst/K-fgf-Genprodukt, FGF-5 oder int-2 ist.

3. Verwendung nach Anspruch 2, wobei der Fibroblasten- Wachstumsfaktor basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor oder ein funktionelles Derivat davon ist.

4. Verwendung nach Anspruch 3, wobei der basische Fibroblasten-Wachstumsfaktor die 17,5 Kilodalton-Form, die 22,5 Kilodalton-Form, die 23,1 Kilodalton-Form oder die 24,2 Kilodalton-Form dieses Fibroblasten-Wachstumsfaktors ist.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Zusammensetzung ein Arzneimittel ist.

6. Verfahren zur Vermehrung in vitro gezüchteter hämatopoetischer Vorläuferzellen, wobei man die hämatopoetischen Vorläuferzellen fur eine Zeit, die ausreichend ist, um die Vermehrung hämatopoetischer Vorläuferzellen zu erlauben, in einem Kulturmedium züchtet, das eine für die Proliferation wirksame Menge eines Fibroblasten-Wachstumsfaktors oder eines funktionellen Derivats davon enthält.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Fibroblasten-Wachstumsfaktor basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor, saurer Fibroblasten-Wachstumsfaktor, das hst/K-fgf-Genprodukt, FGF-5 oder int-2 ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Fibroblasten-Wachstumsfaktor basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor oder ein funktionelles Derivat davon ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der basische Fibroblasten-Wachstumsfaktor die 17,5 Kilodalton-Form, die 22,5 Kilodalton-Form, die 23,1 Kilodalton-Form oder die 24,2 Kilodalton-Form dieses Fibroblasten-Wachstumsfaktors ist.

10. Arzneimittel zur Beschleunigung der Verankerung von transplantierten hämatopoetischen Knochenmarkszellen in einem Säuger oder zur Behandlung eines Säugers, der eine Krankheit aufweist, die mit der Dysplasie oder Aplasie einer Knochenmarkszellinie assoziiert ist, das eine Kombination eines Fibroblasten-Wachstumsfaktors oder eines funktionellen Derivats davon und mindestens eines Kolonie-stimulierenden Faktors umfaßt.

11. Arzneimittel zur Stimulierung der in vivo-Proliferation hämatopoetischer Vorläuferzellen im Knochenmark eines potentiellen Knochenmarkspenders, der ein Säuger ist, das eine Kombination eines Fibroblasten-Wachstumsfaktors oder eines funktionellen Derivats davon und einer wirksamen Menge Heparin oder eines Heparinanalogs umfaßt, und zur Verabreichung zu einem Zeitpunkt vor Knochenmarksentnahme geeignet ist.

12. Arzneimittel nach Anspruch 10 oder 11, wobei der Fibroblasten-Wachstumefaktor basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor, saurer Fibroblasten-Wachstumsfaktor, das hst/K-fgf-Genprodukt, FGF-5 oder int-2 ist.

13. Arzneimittel nach Anspruch 12, wobei der Fibroblasten- Wachstums faktor basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor oder ein funktionelles Derivat davon ist.

14. Arzneimittel nach Anspruch 13, wobei der basische Fibroblasten-Wachstumsfaktor die 17,5 Kilodalton-Form, die 22,5 Kilodalton-Form, die 23,1 Kilodalton-Form oder die 24,2 Kilodalton-Form dieses Fibroblasten-Wachstumsfaktors ist.

15. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 10 oder 12 bis 14, wobei der Kolonie-stimulierende Faktor GM-CSF, G-CSF, M- CSF, Interleukin-3, Interleukin-4 oder Interleukin-6 ist.

16. Verwendung eines Fibroblasten-Wachstumsfaktors oder eines funktionellen Derivats davon zur Herstellung eines Arzneimittels zur Stimulierung der in vivo-Proliferation hämatopoetischer Vorläuferzellen im Knochenmark eines potentiellen Knochenmarkspenders, der ein Säuger ist, das zur Verabreichung zu einem Zeitpunkt vor Knochenmarksentnahme geeignet ist.

17. Verwendung nach Anspruch 16, wobei der Fibroblasten- Wachstumsfaktor basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor, saurer Fibroblasten-Wachstumsfaktor, das hst/K-fgf-Genprodukt, FGF-5 oder int-2 ist.

18. Verwendung nach Anspruch 17, wobei der Fibroblasten- Wachstumsfaktor basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor oder ein funktionelles Derivat davon ist.

19. Verwendung nach Anspruch 18, wobei der basische Fibroblasten-Wachstumsfaktor die 17,5 Kilodalton-Form, die 22,5 Kilodalton-Form, die 23,1 Kilodalton-Form oder die 124,2 Kilodalton-Form dieses Fibroblasten-Wachstumsfaktors ist.

20. Verwendung eines Fibroblasten-Wachstumsfaktors oder eines funktionellen Derivats davon zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Säugers, der eine Krankheit aufweist, die mit der Dysplasie oder Aplasie einer Knochenmarkszellinie assoziiert ist.

21. Verwendung nach Anspruch 20, wobei der Fibroblasten- Wachstumsfaktor basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor, saurer Fibroblasten-Wachstumsfaktor, das hst/K-fgf-Genprodukt, FGF-5 oder int-2 ist.

22. Verwendung nach Anspruch 21, wobei der Fibroblasten- Wachstumsfaktor basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor oder ein funktionelles Derivat davon ist.

23. Verwendung nach Anspruch 22, wobei der basische Fibroblasten-Wachstumsfaktor die 17,5 Kilodalton-Form, die 22,5 Kilodalton-Form, die 23,1 Kilodalton-Form oder die 24, 2 Kilodalton-Form dieses Fibroblasten-Wachstumsfaktors ist.

24. Verwendung nach einem der Ansprüche 20 bis 23, wobei das Arzneimittel in Kombination mit dem Fibroblasten-Wachstumsfaktor oder einem Derivat davon mindestens einen Kolonie-stimulierenden Faktor umfaßt.

25. Verwendung nach Anspruch 24, wobei der Kolonie-stimulierende Faktor GM-CSF, G-CSF, M-CSF, Interleukin-3, Interleukin-4 oder Interleukin-6 ist.

26. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 10 bis 15, wobei die Zellen menschliche Zellen sind.

27. Verfahren oder Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und 16 bis 24, wobei die Zellen menschliche Zellen sind.

28. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 10 bis 15 zur Verabreichung bei menschlichen Patienten.