DE10033583A1

DE10033583A1 - Superparamagnetische Perlpolymerisate

Info

Publication number: DE10033583A1
Application number: DE10033583A
Authority: DE
Inventors: Kamelia Karlou-Eyrisch; Wolfgang Podszun; Rainer Neumann
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 2000-07-11
Filing date: 2000-07-11
Publication date: 2002-01-24
Also published as: JP2004502851A; EP1303566A1; US6590094B2; US20020106659A1; US20050014027A1; WO2002004555A1; AU2001281904A1

Abstract

Die Erfindung betrifft vernetzte Perlpolymerisate dotiert mit superparamagnetischen Eisenoxid, ein Verfahren zur Herstellung der Perlpolymerisate, sowie deren Verwendung in der Nucleinsäure Diagnostik.

Description

Die Erfindung betrifft vernetzte Perlpolymerisate dotiert mit superparamagnetischen Eisenoxid, ein Verfahren zur Herstellung der Perlpolymerisate, sowie deren Verwen dung in der Nucleinsäuren Diagnostik.

In jüngster Zeit gewinnt die sogenannte Gen-Diagnostik zunehmend an Bedeutung.

Die Gen-Diagnostik hat Eingang gefunden in die Diagnostik humaner Erkrankungen (u. a. Nachweis von Infektionserregern, Nachweis von Mutationen des Genoms, Entdeckung von zirkulierenden Tumorzellen und Identifizierung von Risikofaktoren für die Prädisposition einer Erkrankung). Aber auch in der Veterinärmedizin, der Umweltanalytik und Nahrungsmitteltestung findet die Gen-Diagnostik mittlerweile ihre Anwendung. Ein weiteres Anwendungsgebiet stellen Untersuchungen an patho logischen-/zytologischen Instituten oder im Rahmen forensischer Fragestellungen dar. Aber auch im Rahmen der Qualitätskontrolle (z. B. Untersuchungen von Blutproben auf Infektionserreger-Freiheit) wird die Gen-Diagnostik mittlerweile eingesetzt und der Gesetzgeber plant, solche Tests per Gesetz in Zukunft anzuordnen. Methoden, die auch bei der Gen-Diagnostik zum Einsatz kommen (wie z. B. Hybridisierungs- oder Amplifikationstechniken wie die PCR, bDNA oder NASBA Technologie) gehören auch bei wissenschaftlichen Grundlagenarbeiten zu den Routineverfahren.

Bei der Gen-Diagnostik ist die Gewinnung von Gen-Proben aus biologischem Material, wie Zellen, Blut, Serum oder Urin ein wichtiger Teilschritt.

In der EP 0 707 077 wird eine Methode zur Isolierung von Nucleinsäuren aus biologischem Material unter Verwendung von löslichem, schwach basischem Poly mer beschrieben. Bei dieser Methode wird in einem sauren pH-Bereich einen Fällungsprodukt aus dem löslichen, schwach basischen Polymer und der Nuclein säure erzeugt, das Fällungsprodukt von den nicht gefällten Bestandteilen des biologischen Materials abgetrennt und gewaschen und die Nucleinsäure aus dem Fällungsprodukt durch Einstellung eines basischen pH-Wertes wieder freigesetzt.

Ein Nachteil der Methode nach EP 0707 077 besteht darin, dass die Handhabung, insbesondere die Abtrennung und Reinigung des Fällungsproduktes schwierig und sehr zeitaufwendig ist. Diese Methode lässt sich auch nicht bzw. nur unter er schwerten Bedingungen mit Hilfe automatisierter Analysegeräte ausführen.

Die US 4339337 und US 5356713 beschreiben Methoden zur Herstellung von magnetischen Beads aus vinylaromatischen Polymer unter Verwendung von magne tischen Partikeln. Diese Perlpolymerisate enthalten allerdings keine funktionellen Gruppen zur Anbindung von Nucleinsäuren. Außerdem zeigen die Beads einen deut lichen Restmagnetismus (Remanenz), wodurch ihre Dispergierbarkeit erschwert wird.

In der WO 8303920 wird eine Methode zur Herstellung von magnetischen Polymer partikeln beschrieben, bei der Polymerpartikel mit Lösungen aus beispielsweise Eisensalz behandelt werden, wobei das Eisen in Form von Eisenhydroxid ausgefällt wird. Bei dieser Methode befindet sich die ausgefällte Eisenverbindung sowohl in den Polymerpartikeln als auch an der Oberfläche der Polymerpartikel. Für einige Anwendungen, beispielsweise für die Amplifikation von Nucleinsäuren durch Taqman-PCR kann die Eisenverbindung an der Oberfläche stören.

Die US 5206159 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von superparamagnetischen Polyacrylamid-Trägern. Allerdings sind diese Träger zur Abtrennung von Nuclein säuren ungeeignet.

Aus der US 5705628 ist eine Methode zur Bindung von DNA an magnetische Micro partikel bekannt. Die magnetischen Mikropartikel haben vorzugsweise eine Teilchen größe von 1 µm und besitzen eine mit Carboxylgruppen beschichtete Oberfläche. Um eine Anbindung der DNA an die Partikel zu erreichen müssen spezielle Salzkon zentration angewendet werden und Polyethylenglycol in definierter Konzentration und mit speziellem Molekulargewicht zugesetzt werden.

Es wurde nun gefunden, dass bestimmte vernetzte Perlpolymerisate, die mit super paramagnetischen Eisenoxid dotiert sind und basische Aminogruppen enthalten, in hervorragender Weise zur direkten und automatisierten Isolierung von Nucleinsäuren geeignet sind.

Gegenstand der Erfindung sind vernetzte Perlpolymerisate dotiert mit superpara magnetischen Eisenoxid und enthaltend basische Aminogruppen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die Perlpolymerisate einpolymerisierte Einheiten aus hydrophilem (Meth)acrylat und Amino(meth)acrylate erhalten.

Unter der Bezeichnung (Meth)acrylat werden die Derivate der Acrylsäure und Meth acrylsäure verstanden.

Hydropile (Meth)acrylate sind solche, deren Homopolymerisate in Wasser bei 25°C zu mehr als 2,5% löslich sind. Beispielhaft seien genannt. 2-Hydroxyethylmeth acrylat, 2-Hydroxypropylmethacrylat, 2-Hydroxyethylacrylat, 2-Hydroxypropyl acrylat, Triethylenglycolmonomethacrylat, Tetraethylenglycolmonomethacrylat, Glycerinmonomethacrylat, Acrylamid, Methacrylamid und N,N-Dimethylacrylamid. Acrylamid ist bevorzugt.

Amino(meth)acrylate im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Derivate der Acrylsäure und Methacrylsäure mit vorzugsweise sekundären und tertiären Amino gruppen. Die Aminogruppen können auch Teil eines cycloaliphatischen oder aroma tischen Rings sein. Geeignete Amino(meth)acrylate sind z. B. N-(3-Amino propyl)methacrylamid, N-(3-Imidazoylpropyl)methacrylamid, N-(2-Imidazoyl ethyl)methacrylamid, N-(3-Aminopropyl)acrylamid, N-(3-Imidazoylpropyl)- acrylamid, N-(2-Imidazoylethyl)acrylamid, N-(1,1-Dimethyl-3-Imidazoylpropyl)- methacrylamid, N-(1,1-Dimethyl-3-Imidazoylpropyl)acrylamid, N-(3-Benzimida zoylpropyl)-methacrylamid und (3-Benzimidazoylpropyl)acrylamid. Bevorzugte Amino(meth)acrylate sind Aminoalkyl(meth)acrylate, wie z. B. N,N-Dimethyl aminoethylmethacrylat, N,N-Dimethylaminopropylmethacrylat, N,N-Dimethyl aminoethylacrylat, und N-tert.-Butylaminopropylmethacrylat. N,N-Dimethylamino ethylmethacrylat und N,N-Dimethylaminopropylmethacrylat sind besonders bevor zugt. Die Aminogruppen können in den erfindungsgemäßen Perlpolymerisaten ganz oder teilweise in protonierter Form, z. B. als Hydrochloride vorliegen.

Als Vernetzer kommen in Frage: Ethylenglycoldimethacrylat, Butandiol dimethacrylat, Hexandioldimethacrylat, Pentaerytritoldimethacrylat, 1,2-Glycerin dimethacrylat, 1,3-Glycerindimethacrylat, Triethylenglycoldimethacrylat, Tetra etylenglycoldimethacrylat, Trimethylolpropantrimethacrylat, Pentaerytritoltrimeth acrylat, Pentaerytritoltetramethacrylat, Ethylenglycoldiacrylat, Butandioldiacrylat, Pentaerytritoldiacrylat, 1,3-Glycerindiacrylat, Triethylenglycoldiacrylat, Trimethylol propantriacrylat, Pentaerytritaltriacrylat, Pentaerytritoltetraacrylat, Allylmethacrylat, Allylacrylat, Diethylenglycoldivinylether und Methylen-N,N'-bisacrylamid. Methylen-N,N'-bisacrylamid ist bevorzugt.

Die Menge an hydrophilem (Meth)acrylat beträgt 30 bis 89 Gew.-%, vorzugsweise 40 bis 75 Gew.-%, die Menge und Amino(meth)acrylate 10 bis 69 Gew.-%, vorzugs weise 20 bis 50 Gew.-% und die Menge an Vernetzer 1 bis 25 Gew.-%, jeweils bezogen auf die Summe aus hydrophilem (Meth)acrylat, Amino(meth)acrylate und Vernetzer.

Der Gehalt an Eisenoxid in den erfindungsgemäßen superparamagnetischen Perl polymerisaten beträgt 2 bis 80 Gew.-%, vorzugsweise 4 bis 50 Gew.-%, besonders bevorzugt 5 bis 35 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht der ungequollenen Perlpoly merisate.

Die erfindungsgemäßen Peripolymerisate sind superparamagnetisch, das heißt sie besitzen eine niedrige Restmagnetisierung (Remanenz) und eine kleine Koerzitiv kraft. Ihre magnetische Sättigung ist hoch, sie werden von einem inhomogenen Magnetfeld stark angezogen. Nach Ausschalten des Magnetfeldes lassen sie sich leicht und vollständig in Wasser oder wässrigen Pufferlösungen dispergieren.

Die Teilchengröße der erfindungsgemäßen superparamagnetischen Perlpolymerisate beträgt 1 bis 200 µm, vorzugsweise 5 bis 100, besonders bevorzugt 10 bis 50 µm. Zur Bestimmung der mittleren Teilchengröße (∅) und der Teilchengrößenverteilung ist die mikroskopische Bildanalyse gut geeignet.

Als Maß für die Breite der Teilchengrößenverteilung der Perlpolymerisate wird das Verhältnis aus dem Mittelwert der Volumenverteilung (D_V) und dem Mittelwert der Anzahlverteilung (D_Z) gebildet. Enge Teilchengrößenverteilungen im Sinne der Erfindung bedeuten D_V/D_Z ≦ 2,5, bevorzugt D_V/D_Z ≦ 2, besonders bevorzugt D_V/D_Z ≦ 1,5. Es wurde gefunden, dass erfindungsgemäße Perlpolymerisate mit enger Teilchengrößenverteilung besonders gut zur Isolierung von Nucleinsäuren geeignet sind und bei Amplifikationsverfahren an der Oberfläche der Perlpolymerisate besonders gut reproduzierbare Ergebnisse liefern.

Die erfindungsgemäßen Peripolymerisate besitzen eine Quellbarkeit in Wasser. Sie besitzen einen Quellungsindex von 1,25 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6 (gemessen bei 25°C). Als Quellungsindex ist der Quotient aus dem Volumen des gequollenen Perlpolymerisates und dem Volumen des nicht gequollenen Perlpolymerisates definiert.

Zur experimentellen Bestimmung des Quellungsindex werden 10 ml getrocknetes, gesiebtes Perlpolymerisat in einem 100 ml-Standzylinder eingewogen. Der Quotient aus dem Volumen der Schüttung (V₀) und der eingewogener Menge (m) ergibt das Schüttvolumen (V_sch). Der Standzylinder wird mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt und 10 bis 20 h bei 25° stehen gelassen. Dabei wurde öfter geschüttelt und darauf geachtet, dass eventuell auftretende Luftblasen entweichen können. Das Volumen der gequollenen Schüttung wird abgelesen und ergibt V₁. Der Quotient aus V₁ und V₀ ist der Quellungsindex.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Her stellung vernetzter Perlpolymerisate, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man ein Monomergemisch aus hydrophilem (Meth)acrylat, Amino(meth)acrylat, Ver netzer und gegebenfalls weiterem Monomer zu Perlen durch umgekehrte Sus pensionspolymerisation polymerisiert und diese anschließend durch eine Nachbe handlung mit Eisensalz-Lösung mit superparamagnetischen Eisenoxid dotiert.

Unter umgekehrter Suspensionspolymerisation im Sinne der Erfindung wird ein Verfahren verstanden, bei dem das Monomergemisch aus hydrophilem (Meth)- acrylat, Amino(meth)acrylat, Vernetzer und gegebenfalls weiterem Monomer mit einem im Monomergemisch löslichen Radikalbildner aktiviert wird und das akti vierte Monomergemisch unter Zusatz eines Dispergierhilfsmittels in einem nicht wässerigem Lösungsmittel zu Tröpfchen emulgiert wird und dann die gebildeten Tröpfchen durch Temperaturerhöhung ausgehärtet werden.

Das hydrophile (Meth)acrylat, das Amino(meth)acrylat und der Vernetzer ent sprechen den oben genannten Verbindungen. Das Amino(meth)acrylat kann dabei in vorteilhafter Weise zumindest teilweise in der Ammoniumform, beispielsweise als Hydrochlorid eingesetzt werden. Als weiteres Monomer kommen in Mengen von bis zu ca. 25 Gew.-% bezogen auf das Gesamtmonomergemisch beispielsweise N- Vinylpyrrolidon, Vinylimidazol, Styrol, alfa-Methylstyrol, Chlormethylstyrol, Acryl nitril, Vinylacetat und Maleinsäureanhydrid in Frage. Es ist günstig, das Monomer gemisch mit Wasser oder Wasser-Alkoholgemischen zu verdünnen. Geeignete Mengen an Verdünnungsmittel sind beispielsweise 10 bis 200 Gew.-%, vorzugsweise 50 bis 150 Gew.-% bezogen auf das Monomergemisch.

Als Radikalbildner sind Azoverbindungen und Peroxiverbindungen geeignet. Bei Verwendung von Wasser als Verdünnungsmittel ist Kaliumperoxodisulfat und Natriumperoxodisulfat, auch in Kombination mit Bisulfit oder Hydrogensulfit, gut geeignet. Weitere bevorzugte Radikalbildner sind die Azoverbindungen, wie 2,2'- Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane]dihydrochlorid und 2,2'-Azobis(2-amidino propan)dihydrochlorid. Der Radikalbildner wird in Mengen von 0,02 bis 2,5 Gew.-%, vorzugsweise von 0,1 bis 1 Gew.-% bezogen auf Gesamtmonomergemisch ver wendet.

Als nicht wässriges Lösungsmittel im Sinne der vorliegenden Erfindung sind in erster Linie Kohlenwasserstoffe und Halogenkohlenwasserstoffe, sowie niedrig vis kose Siliconöle geeignet. Bevorzugt sind lineare, verzweigte und cyclische alipha tische Kohlenwasserstoffe. Beispielhaft sei erwähnt Hexan, Heptan, n-Octan, iso- Octan, iso-Dodecan und Cyclohexan. Natürlich können auch Mischungen aus unter schiedlichen Kohlenwasserstoffe verwendet werden.

Als Dispergierhilfsmittel sind öllösliche Polymerisate mit einem Molekulargewicht von 2000 bis 1 000 000 geeignet. Bevorzugt sind Polymerisate mit einem Anteil von einpolymerisierten Einheiten von C₆- bis C₂₂-Alkyl(meth)acrylaten und/oder Vinyl ester von C₆- bis C₂₂-Carbonsäuren. Beispielhaft seien Polymerisate mit einpoly merisierten Einheiten von Stearylmethacrylat, Laurylmethacrylat und Vinylstearat genannt. Besonders gut geeignet sind Copolymerisate aus C₆- bis C₂₂-Alkyl- (meth)acrylaten bzw. Vinylester von C₆- bis C₂₂-Carbonsäuren und hydrophilen Monomeren. Unter hydrophilen Monomeren werden in diesem Zusammenhang poly merisierbare olefinisch ungesättigte Verbindungen, die ganz oder teilweise (zu mehr als 2,5 Gew.-% bei 20°C) in Wasser löslich sind, verstanden. Als Beispiele seien genannt: Acrylsäure und ihre Alkali- und Ammoniumsalze, Methacrylsäure und ihre Alkali- und Ammoniumsalze, Hydroxyethylmethacrylat, Hydroxyethylacrylat, Diethylenglykolmonoacrylat, Diethylenglykolmonomethacrylat, Triethylenglykol monoacrylat, Triethylenglykolmonomethacrylat, Tetraethylenglykolmonoacrylat, Tetraethylenglykolmonomethacrylat, Glycerinmonoacrylat, Aminoethylmethacrylat, N,N-Dimethylaminoethylmethacrylat, Acrylamid, Methacrylamid, Vinylpyrolidon und Vinylimidazol. Bevorzugt werden Hydroxyethylmethacrylat, Aminoethyl methacrylat, N,N-Dimethylaminoethylmethacrylat, Acrylamid, Methacrylamid, Vinylpyrolidon und Vinylimidazol.

Besonders bevorzugte Dispergierhilfsmittel sind Copolymerisate aus

- 75 bis 99 Gew.-% C₆- bis C₂₂-Alkyl(meth)acrylat und/oder Vinylester von C₆- bis C₂₂-Carbonsäuren und
- 1 bis 25 Gew.-% hydrophiles Monomer aus der Gruppe Hydroxyethylmeth acrylat, Aminoethylmethacrylat, N,N-Dimethylaminoethylmethacrylat, Acryl amid, Methacrylamid, Vinylpyrolidon und Vinylimidazol.

Die Einsatzmenge des Dispergierhilfsmittels beträgt im allgemeinen 0,1 bis 8, vor zugsweise 0,5 bis 5 Gew.-%, bezogen auf das nicht wässrige Lösungsmittel.

Die Rührgeschwindigkeit bei der Polymerisation ist wichtig für die Einstellung der Teilchengröße. Beim erfindungsgemäßen Verfahren nimmt die Größe der erhaltenen Perlpolymerisate mit zunehmender Rührerdrehzahl ab. Die exakte Rührdrehzahl zur Einstellung einer bestimmten vorgegebenen Perlgröße hängt im Einzelfall stark von der Reaktorgröße, der Reaktorgeometrie und der Rührergeometrie ab. Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, die notwendige Rührdrehzahl experimentell zu ermitteln. Für Laborreaktoren mit 0,5 l-Reaktionsvolumen, die mit Gitterrühr ausgestattet sind, werden bei Verwendung von Copolymerisaten aus Methacrylsäure-C₁₃-Ester und Hydroxyethylmethacryl als Dispergierhilfsmittel im allgemeinen Perldurchmesser von 10 bis 25 µm bei Drehzahlen von 800 bis 1000 Upm erreicht.

Die Polymerisationstemperatur richtet sich nach der Zerfallstemperatur des ein gesetzten Initiators und der Siedetemperatur des nicht wässrigen Lösungsmittels. Sie liegt im allgemeinen zwischen 50 bis 150°C, vorzugsweise zwischen 55 und 100°C. Die Polymerisation dauert 0.5 bis einige Stunden (beispielsweise 10 Stunden).

Nach der Polymerisation kann das Polymerisat mit üblichen Methoden, z. B. durch Filtrieren oder Dekantieren, isoliert und gegebenenfalls nach ein oder mehreren Waschvorgängen getrocknet werden. Es ist möglich, das erhaltene Perpolymerisat durch physikalischen Methoden zu fraktionieren, um eine engere Teilchen größenverteilung einzustellen. Geeignete Fraktionierungsmethoden sind beispiels weise Sieben, Sedimentieren und Windsichten.

Die Nachbehandlung zur Dotierung mit superparamagnetischen Eisenoxid erfolgt mit Mischungen aus wässrigen Fe²⁺- und Fe³⁺-salz-Lösungen. Gut geeignet sind die ent sprechende Chloride. Das molare Verhältnis von Fe²⁺ : Fe³⁺ soll dabei 2 : 1 bis 1 : 2 betragen. Dabei ist es möglich von Eisensalzlösungen mit einem anderen Fe²⁺ : Fe³⁺-Verhältnis auszugehen und das optimale Verhältnis von Fe²⁺ : Fe³⁺ durch Verwen dung von Oxidations- bzw. Reduktionsmitteln einzustellen. Beispiele für Oxidations mittel sind Peroxo- und Nitroverbindungen, als Reduktionsmittel ist z. B. Natrium bisulfit geeignet. Die Konzentration der Eisensalzlösungen beträgt im allgemeinen 10 bis 50 Gew.-%, vorzugsweise 20 bis 40 Gew.-%.

Die Eisensalzlösung wird vorzugsweise mit getrocknetem, wasserfreien Perlpoly merisat in Kontakt gebracht. Dabei ist es besonders vorteilhaft, wenn die gesamte Eisensalzlösung in das Perlpolymerisat einquillt und keine überschüssige Eisen salzlösung in den Zwischenräumen der Perlen oder an der Oberfläche der Perlen verbleibt.

Die in das Perlpolymerisat eingequollenen Eisensalze werden durch Zusatz von Basen in die entsprechende Eisenhydroxide überführt. Gut geeignet sind alkalische Lösungen aus Natriumhydroxid, Natriumcarbonat oder Ammoniak. Ammoniak ist bevorzugt, da ein Überschuss leicht durch Abdampfen entfernt werden kann. Gebildete Ammoniumsalze werden durch gründliches Waschen mit Wasser entfernt.

Zur Überführung des Eisenhydroxids in Eisenoxid (Dehydratisierung) wird das Perl polymerisat erhitzt. Die Wärmebehandlung kann dabei in einfacher Weise in wässriger Suspension bei 65 bis 100°C erfolgen. Geeignete Zeiten für die Erhitzung sind 0,5 bis 5 Stunden. Die Umwandlung des Eisenhydroxids in Eisenoxid ist an einen Wechsel der Farbe von hell braun nach dunkelbraun bis schwarz erkennbar. Danach wird das Perlpolymerisat abgetrennt und getrocknet.

Falls gewünscht können die so erhaltenen getrockneten mit superparamagnetischen Eisenoxid dotierten Perlpolymerisate ein weiteres Mal in der oben beschriebenen Weise behandelt werden, wobei der Gehalt an superparamagnetischen Eisenoxid gesteigert wird. Auf diese Weise gelingt es Eisenoxidgehalte von mehr als 50 Gew.-% einzustellen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Isolierung von Nucleinsäuren aus einer Probe, umfassend die nachfolgenden Schritte

A) Vermischen der Probe mit einem Perlpolymerisat bei einem pH-Wert von 7 oder weniger, wobei die Nucleinsäuren adsorbiert werden,
B) Abtrennen des Perlpolymerisates einschließlich der adsorbierten Nuklein säuren unter Anwendung eines Magnetfeldes und
C) Vermischen des Perlpolymerisates mit einer wässrigen Phase mit einem pH-Wert von größer 7, wobei die adsorbierten Nucleinsäuren freigesetzt werden,

welches dadurch gekennzeichnet ist, dass das Perlpolymerisat mit superparamagne tischen Eisenoxid dotiert ist und einpolymerisierte Einheiten aus hydrophilem (Meth)acrylat und Amino(meth)acrylate enthält.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist zur Isolierung und/oder Reinigung von Nuclein säuren unterschiedlicher Herkunft, beispielsweise aus Zellen, Gewebematerialien, Blut oder Infektionserregern geeignet. Vor der Isolierung der Nucleinsäuren wird das zu untersuchende Material durch an sich bekannte Techniken, wie z. B. Aufschluss durch Proteaseverdau aufgeschlossen, wobei eine für die weiteren Schritte A bis C geeignete Probe, ein Lysat, erhalten wird. Gegebenenfalls erfolgt in einem Zwischen schritt nach Verfahrensschritt A) die Lyse des biologischen Materials. Weitere geeignete Aufschlussverfahren sind in DE-A-43 33 805 beschrieben worden.

Es erfolgt das Vermischen der Probe mit dem erfindungsgemäßen Perlpolymerisat bei einem pH-Wert von 7 oder weniger, vorzugsweise im Bereich von 2 bis 6, besonders bevorzugt im Bereich von 2 bis 3 bei Raumtemperatur. Das Abtrennen des Perlpolymerisates erfolgt mit Hilfe eines Magnetfeldes. Der so gewonnene Komplex aus Nucleinsäure und Perlpolymerisat kann nun durch Waschen mit geeigneten Puffern gereinigt werden.

Zur Freisetzung der gebundenen Nucleinsäuren aus dem Komplex erfolgt nun die pH-Einstellung des Komplexes auf pH-Werte oberhalb von 7, vorzugsweise von 8 bis 14, besonders bevorzugt im Bereich 12 bis 14.

Die erfindungsgemäßen Perlpolymerisate liefern höhere Adsorption- und Wiederfrei setzungsraten als die löslichen Polymerisate gemäß EP-A-0 707 077. Die Isolierung lässt sich leichter, d. h. mit weniger Arbeitsschritten und in kürzeren Zeiten durch führen. Die Reinheit der isolierten Nucleinsäuren ist höher, insbesondere enthalten sie weniger inhibierende Nebenprodukte, so dass eine Verstärkung der Nuclein säuren, beispielsweise durch die sogenannte "PCR-Reaktion" und die "RT-PCR" besonders gut gelingt. Auch in Bezug auf Verdau der gewonnenen Nucleinsäuren mittels Restriktionsenzymen ist das erfindungsgemäße Verfahren der in der EP-A-0 707 077 beschriebenen Methode überlegen.

Die erfindungsgemäßen Perlpolymerisate sind auch gut geeignet, um eine Ver stärkung der adsorbierten Nukleinsäuren beispielsweise durch die sogenannte "Taqman-PCR-Reaktion" direkt auf den Perlpolymerisaten (d. h. ohne Teilschritt C) durch zuführen.

Beispiel 1 Herstellung eines erfindungsgemäßen Perlpolymerisates 1a) Herstellung eines Dispergierhilfsmittels

In einem 4 l-Reaktionsgefäß mit Gitterrührer, Gaseinlass- und Gasauslassrohr wurde unter Stickstoffbegasung eine. Lösung aus 1324 g Cyclohexan, 511 g Methacrylsäure- C₁₃-Ester, 57 g Hydroxyethylmethacrylat und 3,8 g Dibenzoylperoxyd innerhalb von 2 h bei 300 Upm auf 78°C erhitzt, 10 h bei dieser Temperatur belassen, anschließend auf 90°C erhitzt und weitere 1,5 h bei dieser Temperatur belassen. Danach wurde auf 25°C abgekühlt. Man erhielt 1835 g einer 30,5 gew.-%igen Lösung eines Disper giermittels. Der Staudinger-Index, gemessen mit Ubbelohde-Viskosimeter bei 25°C, betrug 72,6 ml/g.

1b) Herstellung eines vernetzten Perlpolymerisates

In einem 0,5 Liter-Reaktionsgefäß mit Gitterrührer, Rückflusskühler und Thermo fühler wurden 41,25 g Dispergiermittel-Lösung aus 1a) und 240 g Cyclohexan vorgelegt und gerührt. 9,38 g N,N-Dimethylaminoethylmethacrylat wurde mit 13,3 g Wasser und 5,89 g 37%iger Salzsäure 5 Minuten gerührt und mit 0,6 g 1n NaOH neutralisiert. Anschließend wurde diese Lösung in das Reaktionsgefäß gegeben. Zu dieser Mischung wurden 20,31 g Acrylamid und 1,56 g Methylen-N,N'-bisacryl amid, gelöst in 8 g Methanol, zugegeben. Diese Reaktionsmischung wurde mit 0,063 g Kaliumperoxidisulfat, gelöst in einer Mischung aus 4,25 g Wasser und 2 g Methanol, versetzt und bei 450 Upm 10 Minuten mit Stickstoffgas gespült. Anschließend wurde die Rührgeschwindigkeit auf 1000 Upm gesteigert und die Temperatur innerhalb von 1 Stunde auf 60°C erhöht und 10 Stunden bei dieser Temperatur belassen. Nach dem Abkühlen wurde das entstandene Polymerisat durch Dekantieren von der Reaktionslösung abgetrennt und je dreimal mit Cyclohexan, Wasser und Methanol gereinigt und bei 40°C im Vakuumtrockenschrank getrocknet. Man erhielt 14,7 g getrocknetes Perlpolymerisat mit einer mittleren Teilchengröße von 12 µm und einem Quelllungsindex von 6 bei 25°C in Wasser.

1c) Dotierung des Perlpolymerisates mit Eisenoxid

In einem Rührgefäß mit einem Magnetrührer und Thermometer wurden 3,625 g Eisen(II)chlorid-Tetrahydrat, 1,5 g Eisen (III)Chlorid (wasserfrei) und 0,3 g Natriumbisulfit in 5,75 ml Wasser gelöst.

In einem 100 ml Dreihalskolben wurden 5 g getrocknetes Perlpolymerisat (1b) vorgelegt und extern mit Eis gekühlt und anschließend mit der oben beschriebenen Eisensalzlösung versetzt. Die entstehende Suspension wurde 35 Minuten gerührt und anschließend mit kochendem Wasser extern erwärmt bis aus der Suspension eine feste Mischung entstanden war. Anschließend wurde das Perlpolymerisat in einem anderen 500 ml Kolben mit einer alkalischen Lösung aus 67,5 ml Wasser und 8,5 ml 26%iger Ammoniak-Lösung (pH = 9) 1 Stunde gerührt und mit 250 ml Wasser verdünnt. Nach dem Abdekantieren der Lösung wurde dieser Vorgang mehrfach wiederholt.

Das mit Eisensalzlösung behandelte Perlpolymerisat wurden mit 300 ml Wasser versetzt und unter Luftstrom 30 Minuten gerührt und anschließend auf 72°C erwärmt. Der pH-Wert wurde während des gesamten Vorgangs durch Zugabe von Ammoniaklösung auf 9 eingestellt. Anschließend wurde die Lösung mit 0,155 g Kaliumperoxodisulfat versetzt und weitere 2,5 Stunden bei 72°C erwärmt. Nach dem Abdekantieren der Flüssigkeit wurde der Feststoff fünfmal mit Wasser gewaschen und dabei mit Ultraschall behandelt. Man erhielt 5,1 g schwarzes Perlpolymerisat mit einem Eisengehalt von 6 Gew.-%, welches von einem inhomogenen Magnetfeld stark angezogen wird.

Beispiel 2 Herstellung eines erfindungsgemäßen Perlpolymerisates 2a) Herstellung eines vernetzten Perlpolymerisates

In einem 0,5 Liter-Reaktionsgefäß mit Gitterrührer, Rückflusskühler und Thermo fühler wurden 41 g Dispergierhilfsmittel-Lösung aus 1a) und 240 g Cyclohexan vorgelegt und gerührt. 9,38 g N,N-Dimethylaminoethylmethacrylat wurde mit 13,3 g Wasser und 6 g 37%ige Salzsäure 5 Minuten gerührt. Anschließend wurde diese Lösung in das Reaktionsgefäß gegeben. Zu dieser Mischung wurde 18,75 g Acryl amid und 3,13 g Methylen-N,N'-bisacrylamid, gelöst in 8 g Methanol, zugegeben. Diese Reaktionsmischung wurde mit 0,313 g 2,2'-Azobis(2-amidinopropan)- dihydrochlorid, gelöst in einer Mischung aus 4,25 g Wasser und 2 g Methanol, ver setzt und bei 450 Upm 10 Minuten mit Stickstoffgas gespült. Anschließend wurde die Temperatur innerhalb von 1 Stunde bei 800 Upm auf 60°C erhöht und 10 Stunden bei dieser Temperatur reagieren lassen. Nach dem Abkühlen wurde das entstandene Polymerisat durch dekantieren von der Reaktionslösung abgetrennt und je dreimal mit Cyclohexan, Wasser und Methanol gereinigt und bei 40°C im Vakuumtrockenschrank getrocknet. Man erhielt 15 g getrocknetes Perlpolymerisat mit einer mittleren Teilchengröße von 20 µm und einem Quelllungsindex von 5 bei 25°C in Wasser.

2b) Dotierung des Perlpolymerisates mit Eisenoxid

5 g des Perlpolymerisates aus 2a) wurde wie unter 1d) beschrieben mit Eisenoxid dotiert. Dabei wurde der gesamte Vorgang zweifach durchgeführt. Man erhielt 5,4 g schwarzes Perlpolymerisat mit einem Eisengehalt von 8,3 Gew.-%, welches von einem inhomogenen Magnetfeld stark angezogen wird.

Claims

1. Vernetzte Perlpolymerisate dotiert mit superparamagnetischen Eisenoxid und enthaltend basische Aminogruppen, dadurch gekennzeichnet, dass die Perl polymerisate einpolymerisierte Einheiten aus hydrophilem (Meth)acrylat und Amino(meth)acrylate erhalten.

2. Vernetzte Perlpolymerisate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das hydrophile (Meth)acrylat (Meth)acrylamid ist.

3. Vernetzte Perlpolymerisate nach Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Amino(meth)acrylat ein Aminoalkylmethacrylat ist.

4. Vernetzte Perlpolymerisate nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Perlpolymerisate einpolymerisierte Einheiten aus (Meth)acrylamid und Dialkylaminoalkyl(meth)acrylate und Methylenbis(meth)acrylamid als Ver netzer enthalten.

5. Vernetzte Perlpolymerisate nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Teilchengröße von 5 bis 100 µm besitzen.

6. Vernetzte Perlpolymerisate nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilchengrößenverteilung D_V/D_Z kleiner als 2,5 ist.

7. Verfahren zur Isolierung von Nucleinsäuren unter Verwendung der Perlpoly merisaten gemäß Anspruch 1 bis 6.

8. Verfahren zur Herstellung vernetzter Perlpolymerisate, dadurch gekenn zeichnet, dass man ein Monomergemisch aus hydrophilem (Meth)acrylat, Amino(meth)acrylate, Vernetzer und gegebenfalls weiteren Monomeren zu Perlen durch umgekehrte Suspensionspolymerisation polymerisiert und diese durch eine Nachbehandlung mit Eisensalzlösung mit superparamagnetischen Eisenoxid dotiert.

9. Verfahren zur Herstellung vernetzter Perlpolymerisate nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass Amino(meth)acrylate teilweise oder ganz in Form eines Ammoniumsalzes eingesetzt wird.

10. Verfahren zur Amplifikation von Nucleinsäuren durch PCR, insbesondere Taqman PCR auf der Oberfläche von Partikeln, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel Perlpolymerisate gemäß Anspruch 1 bis 6 sind.