DE10027040A1

DE10027040A1 - Verfahren zur Herstellung von DNA-Arrays

Info

Publication number: DE10027040A1
Application number: DE10027040A
Authority: DE
Inventors: Achim Fischer
Original assignee: BASF Lynx Bioscience AG
Current assignee: Sygnis Pharma AG
Priority date: 2000-06-02
Filing date: 2000-06-02
Publication date: 2001-12-06
Also published as: WO2001092568A3; AU2001272448A1; WO2001092568A2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Nukleinsäureanalytik, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: DOLLAR A a) Primermoleküle, die mindestens ein Primerpaar bilden, werden auf einer Oberfläche immobilisiert; DOLLAR A b) ein aus mindestens zwei verschiedenen Nukleinsäuremolekülen bestehendes Nukleinsäuregemisch wird mit der Oberfläche aus a) in Kontakt gebracht; DOLLAR A c) die immobilisierten Primermoleküle werden komplementär zum Gegenstrang unter Bildung sekundärer Nukleinsäuren verlängert; DOLLAR A d) die nicht durch die Immobilisierung in Schritt a) an die Oberfläche gebundenen Nukleinsäuremoleküle werden von der Oberfläche entfernt; DOLLAR A e) die sekundären Nukleinsäuren werden amplifiziert, wobei tertiäre Nukleinsäuren erhalten werden; DOLLAR A f) die tertiären Nukleinsäuren werden mit einer Sonde oder einem Gemisch aus mehreren Sonden in Kontakt gebracht; DOLLAR A g) die tertiären Nukleinsäuren und/oder Sonden, die sich an Orten, an denen ein differentielles Hybridisierungsereignis lokalisiert ist, befinden, werden von den anderen Nukleinsäuren und/oder Sonden, die sich an Orten, an denen kein differentielles Hybridisierungsereignis lokalisiert ist, befinden, getrennt.

Description

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich um eine Methode zur Her stellung sowie Verwendung von DNA-Microarrays, vorrangig auf dem Gebiet der Genexpressionsanalyse sowie der Genomanalyse. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Apparatur zur Analyse und photochemischen Prozessierung besagter Microarrays.

Aus dem Stand der Technik sind Verfahren zur Herstellung von DNA-Arrays be kannt. Beispielsweise beschreiben Maier et al. die Herstellung von Membranfil tern mit einer hohen Dichte an cDNA-Klonen (J. Biotechnol. 1994 June 30; 35(2-3): 191-203). Schena et al. (Science 1995 Oct 20; 270(5235): 467-70) beschreiben die Herstellung von cDNA-Microarrays, bei denen bekannte cDNAs auf einem mikroskopischen Objektträger abgelegt und zur Hybridisierung mit aus zu unter suchenden biologischen Proben stammenden, fluoreszenzmarkierten Sonden ein gesetzt werden. Ein alternatives Verfahren zur Microarray-Herstellung, welches auf dem Aufbau von Oligonukleotiden an Oberflächen über Photolithographie basiert, wird von McGall et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996 Nov 26; 93(24): 13555-60) beschrieben.

Einer der großen Nachteile bei der Herstellung von DNA-Arrays nach dem Stand der Technik ist jedoch die Tatsache, daß die auf die Trägeroberfläche aufzubrin genden DNA-Sequenzen zuvor bekannt sein müssen. Dies gilt sowohl für photo lithographisch hergestellte Oligonukleotid-Arrays wie auch für "gedottete" Arrays (separate Ablage jeder einzelnen DNA-Spezies), für die eine normalisierte und charakterisierte Bank von DNA-Klonen vorhanden sein muß. Die Charakterisie rung (insbesondere Sequenzüberprüfung der abzulegenden Klone) solcher Banken bedeutet einen enormen Aufwand, der zu hohen Kosten führt und eine deutliche Inflexibilität des Verfahrens nach sich zieht. Insbesondere schließt sich die An wendung konventioneller Array-Technik nach dem Stand der Technik für mole kular nicht sehr gut charakterisierte Organismen aus. Dies folgt aus der sehr ho hen Zahl an Genen vielzelliger eukaryontischer Organismen (schätzungsweise 100 000 verschiedene Gene in Säugern), der extremen Größe vieler eukaryonti scher Genome (ca. 10⁹ Basenpaare im Humangenom; ca. 10¹⁰ Basenpaare im Ge nom mancher agronomisch bedeutender Nutzpflanzen) sowie der sehr unter schiedlichen Expressionsstärke und Expressionslokalisation der einzelnen Gene. Das Zusammenspiel der genannten Faktoren führt dazu, daß eine auch nur annä hernd vollständige Information über die Sequenz der Transkripte eines Organis mus (und damit Zugang zu jedem einzelnen Transkript) mit den heute zur Verfü gung stehenden Mitteln kaum erhältlich ist. Lediglich im Falle einiger weniger, besonders intensiv untersuchter Organismen (insbesondere Mensch, Maus, Cae norhabditis elegans, Drosophila melanogaster, und Arabidopsis thaliana) ist in absehbarer Zeit mit einer weitgehenden Kenntnis der verschiedenen mRNA- Moleküle zu rechnen. Dabei ist aber auch der nächste Schritt, geeignete Nuklein säuremoleküle zu erzeugen und geordnet in hybridisierungsfähiger Form auf einer Oberfläche abzulegen, mit extrem hohem Aufwand verbunden, wenn nicht ledig lich eine kleine Auswahl (beispielsweise einige hundert bis einige tausend) ver schiedener Nukleinsäurespezies in Form eines Arrays angeordnet werden soll.

Die bekannten Verfahren zur Erzeugung von DNA-Arrays weisen also folgende Nachteile auf:

- sehr hoher Aufwand
- hoher Zeitbedarf
- Kenntnis der jeweiligen mRNA-Moleküle wird vorausgesetzt
- Arrays erfassen meist nur kleine Ausschnitte der Gesamtheit der mRNA.

Daher bestand die Aufgabe in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung sowie Anwendung von DNA-Arrays, welches die vorgenannten Nachteile des Standes der Technik überwindet.

Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Nukleinsäureanalytik, gekenn hnet durch die folgenden Schritte

a) Primermoleküle, die mindestens ein Primerpaar bilden, werden auf einer Oberfläche immobilisiert;
b) Ein aus mindestens zwei verschiedenen Nukleinsäuremolekülen bestehen des Nukleinsäuregemisch wird so mit der Oberfläche aus a) in Kontakt gebracht, daß Hybridisierung zwischen Primermolekülen und Nukleinsäu remolekülen stattfinden kann;
c) Die immobilisierten Primermoleküle werden komplementär zum Ge genstrang unter Bildung sekundärer Nukleinsäuren verlängert;
d) Die nicht durch die Immobilisierung in Schritt a) an die Oberfläche ge bundenen Nukleinsäuremoleküle werden von der Oberfläche entfernt;
e) Die sekundären Nukleinsäuren werden amplifiziert, wobei tertiäre Nu kleinsäuren erhalten werden;
f) Die tertiären Nukleinsäuren werden mit einer Sonde oder einem Gemisch aus mehreren Sonden so in Kontakt gebracht, daß Hybridisierung zwi schen den tertiären Nukleinsäuren und der Sonde oder den Sonden statt finden kann;
g) Die tertiären Nukleinsäuren und/oder Sonden, die sich an Orten, an denen ein differentielles Hybridisierungsereignis lokalisiert ist, befinden, werden von den anderen Nukleinsäuren und/oder Sonden, die sich an Orten, an denen kein differentielles Hybridisierungsereignis lokalisiert ist, befinden, getrennt.

Primermoleküle sind einzelsträngige Nukleinsäuremoleküle einer Länge von etwa 10 bis etwa 50 Nukleotidbausteinen und mehr. Es handelt sich um DNA- Moleküle, RNA-Moleküle oder deren Analoga, die zur Hybridisierung mit einer zumindest über einen Teilbereich komplementären Nukleinsäure bestimmt sind und als Hybrid mit der Nukleinsäure ein Substrat für eine Doppelstrang spezifische Polymerase darstellen. Bei der Polymerase handelt es sich vorzugs weise um DNA-Polymerase I, T7-DNA-Polymerase, das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, um Polymerasen, die bei der PCR Anwendung finden, oder auch um eine Reverse Transkriptase.

Ein Primerpaar besteht aus zwei Sorten von Primermolekülen, die an Bereiche einer Nukleinsäure, der Matrize (engl. template), nach Maßgabe der bekannten Polymerasekettenreaktion (PCR) in gegensinniger Orientierung binden, die die zu amplifizierende Zielsequenz der Nukleinsäure flankieren. Bei diesen Bereichen handelt es sich bevorzugt um Sequenzabschnitte, die bei den Nukleinsäuremole külen des Nukleinsäuregemisches identisch sind. Zum Beispiel kann es sich bei dem Nukleinsäuregemisch um eine Plasmid-Bibliothek handeln. Die Primer wür den dann bevorzugt in dem Bereich der sogenannten Multiple Cloning Site (MCS) binden, und zwar einmal oberhalb und einmal unterhalb der Klonierungsstelle. Ferner könnten die Primer an die Sequenzabschnitte binden, die den Linkern ent sprechen, die, wie unten beschrieben, beidseitig an Restriktionsfragmente ligiert wurden. Das erfindungsgemäße Verfahren wird bevorzugt mit nur einem Primer paar durchgeführt etwa wie das in der US-A 5 641 658 beschriebene Verfahren, in dem auch nur ein Primerpaar eingesetzt wird. Erfindungsgemäß bevorzugt binden die Primer des Primerpaars oder der Primerpaare an Sequenzbereiche, die bei allen oder bei fast allen Nukleinsäuren des Nukleinsäuregemischs im wesentlichen identisch sind. Denkbar, obschon aus bekannten Gründen nicht bevorzugt, ist es im übrigen auch, mit lediglich einer einzigen Sorte von Primermolekülen zu ar beiten.

Bevorzugt besitzt mindestens einer der Primer eines Primerpaars eine Gruppe, welche eine durch Einwirkung elektromagnetischer Strahlung (beispielsweise im UV-Bereich) photochemisch spaltbare Bindung aufweist. Diese Gruppe ist so mit dem Primermolekül zu verbinden, daß das auf einer Oberfläche immoblisierte Primermolekül durch elektromagnetische Strahlung, also photolytisch von der Oberfläche entfernt werden kann.

Bei der photolytisch spaltbaren Gruppe handelt es sich bevorzugt um eine Gruppe der allgemeinen Formel II

Hierbei ist X oder Y mit dem Oberfläche verbunden oder verbindbar, während der jeweils andere Rest mit der 5'-OH-Gruppe des 5'-terminalen Ribosylrestes oder mit einer an den 5'-terminalen Ribosylrest gebundenen Base verbunden ist. n und m sind natürliche Zahlen von 1 bis 30.

Ferner beschreiben Venkatesan und Greenberg (J. Org. Chem. 61 (1996), 525-529) die Synthese photolytisch spaltbarer Verbindungsmoleküle (engl. linker) für die Oligonukleotidsynthese, die nach erfolgter Synthese die Abspaltung des Oli gonukleotids vom festen Träger erlauben. Auch solche Linker können statt der Gruppierung der allgemeinen Formel II eingesetzt werden, sofern man diese ab weichend von der in Venkatesan und Greenberg vorgeschlagenen Vorgehenswei se mit dem 5'-Ende der Oligonukleotide verbindet, so daß eine Verlängerung der Oligonukleotide durch eine Polymerase möglich bleibt.

Der Begriff der Oberfläche bezeichnet eine zugängliche Fläche eines Körpers aus Kunststoff, Metall, Glas, Silicium oder ähnlich geeigneten Werkstoffen. Vor zugsweise ist diese flach, insbesondere plan ausgestaltet. Die Oberfläche kann eine quellbare Schicht aufweisen, zum Beispiel aus Polysacchariden, Polyzucke ralkoholen oder quellbaren Silikaten.

Immobilisierung meint das Ausbilden von Wechselwirkungen mit der oben be schriebenen Oberfläche, die bei 95°C und der üblichen Ionenstärke und den Tem peraturen der PCR stabil sind, d. h. eine Halbwertszeit größer 1 Minute, bevorzugt größer 5 Minuten aufweisen. Bevorzugterweise handelt es sich dabei um kova lente Bindungen, die auch spaltbar - insbesondere durch Einwirkung elektroma gnetischer Strahlung sowie durch geeignete Reagenzien - sein können. Bevorzugt werden die Primermoleküle über die 5'-Termini an der Oberfläche immobilisiert. Alternativ kann eine Immobilisierung auch über ein oder mehrere Nukleotidbau steine, die zwischen den Termini des betreffenden Primermoleküls liegen, erfol gen, wobei allerdings ein Sequenzabschnitt von mindestens 10 Nukleotidbaustei nen gerechnet vom 3'-Terminus ungebunden bleiben muß.

Aus dem Stand der Technik sind Verfahren bekannt, chemisch geeignet derivati sierte Oligonukleotide an Glasoberflächen zu binden. Besonders geeignet sind hierzu beispielsweise endständige, über einen mehratomigen Spacer an das 5'- Ende des Oligonukleotids gebundene primäre Aminogruppen ("Aminolink"), welche leicht im Zuge der Oligonukleotidsynthese inkorporiert werden können und gut mit Isothiocyanat-modifizierten Oberflächen reagieren können. Bei spielsweise beschreiben Guo et al. (Nucleic Acids Res. 22 (1994), 5456-5465) ein Verfahren, Glasoberflächen mit Aminosilan und Phenylendiisothiocyanat zu akti vieren und anschließend 5'-aminomodifizierte Oligonukleotide hieran zu binden. Besonders bevorzugt ist die Carbodiimid-vermittelte Bindung 5'-phosphorylierter Oligonukleotide an aktivierte Polystyrolträger (Rasmussen et al., Anal. Biochem. 198 (1991), 138-142). Ebenfalls möglich ist die Verwendung kommerziell erhält licher Glasträger, welche einerseits zur Bindung von Aminolink-modifizierten Oligonukleotiden aktiviert sind und andererseits eine strukturierte Oberfläche aufweisen, welche gegenüber einer planen Oberfläche eine größere Bindungska pazität besitzt (Fa. Surmodics, Eden Prairie, Minnesota, USA). Ein anderes be kanntes Verfahren nutzt die hohe Affinität von Gold für Thiolgruppen zur Bin dung von Thiol-modifizierten Oligonukleotiden an Goldoberflächen aus (Hegner et al., FEBS Lett. 336 (1993), 452-456).

Bei dem Nukleinsäuregemisch in kann es sich zum Beispiel um eine Bibliothek handeln, also um Nukleinsäuremoleküle, die über weite Strecken eine identische Sequenz aufweisen, sich aber in einem Teilbereich inmitten der identischen Berei che deutlich unterscheiden. Häufig bestehen die Bibliotheken aus gegebenenfalls linearisierten Plasmiden, in welche verschiedene Nukleinsäurefragmente einklo niert wurden. Ferner kann es sich bei dem Nukleinsäuregemisch um Restriktions fragmente handeln, an deren Schnittenden Linkermoleküle gleicher Sequenz li giert wurden. Hierbei unterscheiden sich in der Regel die Linker, die an das 5'-Ende der Fragmente gebunden werden, von den Linkern, die an das 3'-Ende der Fragmente gebunden werden. Jedenfalls ist in der Regel der interessierende Se quenzabschnitt in den Nukleinsäuremolekülen des Nukleinsäuregemischs von zwei flankierenden im wesentlichen bei allen Nukleinsäuremolekülen jeweils identischen Sequenzabschnitten umgeben.

In Schritt b) werden die Nukleinsäuren des Nukleinsäuregemischs so mit der Oberfläche in Kontakt gebracht, daß Hybridisierung zwischen Primermolekülen und Nukleinsäuremolekülen stattfinden kann. Zunächst müssen dazu die Wasser stoffrücken, die sich zwischen den Primermolekülen und zwischen den Nuklein säuremolekülen des Nukleinsäuregemisches gebildet haben, durch Denaturierung (in der Regel durch thermische Denaturierung) gelöst werden. Dann erfolgt der Übergang zu nicht-denaturierenden Bedingungen, der sich in einer bestimmten Geschwindigkeit vollziehen muß, um spezifische Hybridisierung zu ermöglichen. Diese Vorgänge sind dem Fachmann aus der Polymerasekettenreaktion bekannt.

Der Begriff sekundäre Nukleinsäure bezeichnet diejenigen Nukleinsäuremoleküle, die durch komplementäre Verlängerung von Primermolekülen entstehen, wobei die Verlängerung komplementär zu den Nukleinsäuremolekülen erfolgt, die mit den Primern hybridisiert wurden. Da die zu verlängernden Primermoleküle an eine Oberfläche immobilisiert sind, sind auch die aus dieser Verlängerung resul tierenden sekundären Nukleinsäuremoleküle an der Oberfläche immobilisiert.

Die nicht durch die Immobilisierung an die Oberfläche gebundenen Nukleinsäre moleküle werden in Schritt d) von der Oberfläche entfernt. Dies gilt sowohl für verlängerte oder unverlängert gebliebene mit Primermolekülen hybridisierte Nu kleinsäuremoleküle als auch für die unhybridisiert gebliebenen Nukleinsäuremo leküle des Nukleinsäuregemischs. In der Regel erfolgt diese Entfernung unter de naturierenden Bedingungen (hohe Temperatur und/oder chaotrope Reagenzien), so daß auch über Wasserstoffbrückenbindungen an immobilisierte Moleküle ge bundene (hybridisierte) Nukleinsäuremoleküle entfernt werden können. Hierbei ist es möglich, jedoch nicht bevorzugt, die Entfernung der vorgenannten Nuklein säuremoleküle erst nach Durchlaufen eines oder mehrerer Amplifikationszyklen vorzunehmen.

Der Begriff tertiäre Nukleinsäuren bezeichnet die als Matrize fungierenden se kundären Nukleinsäuren sowie diejenigen Nukleinsäuremoleküle, die nach dem Verfahren der PCR gebildet werden. Hierbei ist es wichtig, daß die von der Ober fläche entfernten Nukleinsäuren auch aus dem die Oberfläche umgebenden flüssi gen Reaktionsraum entfernt werden. Hierbei entstehen in der Regel regelrechte Inseln, das heißt diskrete Bereiche auf der Oberfläche, die tertiäre Nukleinsäuren der gleichen Sorte, das heißt identische oder komplementäre Nukleinsäuremole küle, tragen.

In Schritt (f) werden die tertiären Nukleinsäuren durch Denaturierung in ihre ein zelsträngige Form überführt, um die Hybridisierung zwischen den tertiären Nu kleinsäuren und der Sonde oder den Sonden zu ermöglichen. Hierbei ist bevor zugt, zur Vermeidung der Rekombination und Renaturierung aufgeschmolzener Nukleinsäuredoppelstränge einen der beiden zueinander komplementären Einzel stränge im wesentlichen von der Oberfläche zu entfernen. In der Regel geschieht dies in zwei aufeinanderfolgenden Schritten, wobei zunächst die nach Amplifika tion vorliegenden Nukleinsäuredoppelstränge, bevorzugt durch Einsatz einer Re striktionsendonuklease, geschnitten werden. In einem zweiten Schritt wird dann durch Denaturierung und Waschen das jeweils nicht mehr durch kovalente Bin dungen immobilisierte Einzelstrangfragment von Oberfläche und aus Lösungs raum entfernt. Ebenfalls denkbar ist es, eines von zwei ein Primerpaar bildenden Primermolekülen mittels einer chemisch, photochemisch oder thermisch spaltba ren Atomgruppe an der Oberfläche zu immobilisieren und diese Gruppe in Schritt (f) zu spalten. In jedem Fall wird in der darauffolgenden Denaturierung der voll ständige Gegenstrang zum nach wie vor immobilisierten Nukleinsäurestrang frei gesetzt und entfernt. Danach werden die in Schritt (f) erzeugten immobilisierten einzelsträngigen Nukleinsäuren unter Hybridisierungsbedingungen mit minde stens einer geeignet markierten, als Sonde dienenden Sorte von Nukleinsäuremo lekülen in Kontakt gebracht. Besonders geeignet als Sonde sind aus mRNA bzw. cDNA oder aus genomischer DNA erzeugte Nukleinsäuremischungen. Diese Mi schungen können eine einheitliche Markierungsgruppe enthalten. Bevorzugter weise jedoch enthalten die Nukleinsäuremischungen mindestens zwei unter scheidbare Markierungsgruppen, welche die Unterscheidung ansonsten weitge hend identischer Moleküle aus verschiedenen biologischen Quellen ermöglichen.

Eine Sonde ist im Rahmen der Erfindung ein Gemisch aus mindestens zwei ver schiedenen Nukleinsäurespezies, welche eine oder mehrere detektierbare Markie rungen, vorzugsweise fluoreszente Markierungsgruppen oder durch Kopplung an Fluoreszenzgruppen nachweisbare Gruppen, tragen. Eine Sonde kann im Rahmen der Erfindung sowohl aus einer als auch aus mehreren biologischen Proben, ins besondere RNA bzw. mRNA oder genomischer DNA aus einem bestimmten Ge webe oder aus einem Gewebe in einem bestimmten physiologischen Zustand, hergestellt werden. Ebenfalls unter Sonde zu verstehen ist ein Gemisch von Son den in obigem Sinn, welche jedoch aus verschiedenen biologischen Proben herge stellt wurden. In dem Fall, daß die Sonde aus verschiedenen biologischen Proben hergestellt wurde, ermöglicht die probenspezifische Markierung der Nukleinsäu respezies die eindeutige Zuordnung zwischen Nukleinsäurespezies und der Her kunft der betreffenden Nukleinsäurespezies aus einer bestimmten biologischen Probe.

In Schritt (g) werden die auf der Oberfläche statt gefundenen differentiellen Hy bridisierungsereignisse bestimmt. Differentielle Hybridisierungsereignisse zeigen an, daß eine auf einer Stelle der Oberfläche konzentrierte Sorte von Nukleinsäu remolekülen mit einer Sonde oder mit einem Sondengemisch stärker hybridisiert als mit einer anderen Sonde oder mit einem anderen Sondengemisch.

Besonders zuverlässig lassen sich solche Ereignisse erkennen, wenn wie in Schena et al. (Science 1995 Oct 20; 270(5235): 467-70) beschrieben eine kompeti tive Hybridisierung durchgeführt wird, bei der die eingesetzte Sonde aus einer Mischung von unterschiedlich fluoreszenzmarkierten, aus unterschiedlichen (ins besondere zwei) Proben gewonnenen Nukleinsäuren besteht. Zunächst wird die Oberfläche, auf der die Hybridisierung stattgefunden hat, abgetastet, das heißt es wird die lokal gebundene Sondenmenge (etwa durch Messen der Fluoreszenzakti vität) bestimmt. Bei Einsatz einer Sonde, die aus einer Mischung von unter schiedlich fluoreszenzmarkierten, aus unterschiedlichen (insbesondere zwei) Pro ben gewonnenen Nukleinsäuren besteht, kann Abtasten das zeitgleiche oder nach einander erfolgende Bestimmen der Fluoreszenzaktivität bei zwei unterschiedli chen Anregungs- und/oder Emissionswellenlängen bedeuten. Die ortsaufgelösten Fluoreszenzsignale müssen für jeden Fluorophor kalibriert werden. Diese Kali brierung kann auf unterschiedliche Weise geschehen. Zum Beispiel ist es möglich, mit einem internen Standard zu arbeiten, wie dies in Schena et al. beschrieben wird. In diesem Fall würde als Sonde ein Gemisch aus unterschiedlich markierter cDNA unterschiedlicher Herkunft eingesetzt, indem man zunächst eine mRNA bestimmter Herkunft zusammen mit einer bekannten mRNA bekannter Konzen tration revers transkribiert und Fluoreszenz-markiert (z. B. mit Fluoreszein) und dasselbe mit der mRNA der anderen Herkunft durchführt, aber einen anderen Fluoreszenz-Marker benutzt (z. B. Lissamin). Wenn man eine definierte Menge Nukleinsäure, an welcher die unterschiedlich markierten Proben des internen Standards binden, auf eine definierte Stelle der Oberfläche aufbringt, dann können die durch Abtasten der Oberfläche ermittelten örtlichen Fluoreszenzsignale auf den internen Standard bezogen werden, so wie in Schena et al. beschrieben. Alternativ kann man auch den Quotient aus der örtlichen Signalintensität bezüglich beider Fluorophore bilden und über die Anzahl der Meßorte arithmetisch mitteln. Der auf diese Weise erhaltene Selektivitätsfaktor

gibt näherungs weise die relative Sensitivität der Detektion der beiden Fluorophore a und b an, wenn sich die mRNA-Proben unterschiedlicher Herkunft nicht zu stark unter scheiden (Sa(x,y) = Fluoreszenzintensität, die auf den Fluorophor a zurückgeht am Meßpunkt mit den Koordinaten x,y in einer Matrix von x = 1 bis X und y = 1 bis Y, Sb(x,y) analog). Häufig erscheint es angebracht, Signale die auf unspezifi sche Bindung zurückgehen, vom Fluoreszenzsignal abzuziehen, bevor der Selek tivitätsfaktor und alle anderen Daten aus den Rohdaten ermittelt werden. Dies setzt allerdings voraus, daß sich die unspezifische Bindung genau genug bestim men läßt, was nicht immer der Fall sein wird, so daß häufig auf eine solche Kor rektur verzichtet wird.

Der Selektivitätsfaktor _ab kann also in Analogie zu Schena et al. unter Verwen dung eines internen Standards berechnet werden oder es kann die oben genannte vereinfachte Definition zugrunde gelegt werden. Ein differentielles Hybridisie rungsereignis hat per definitionem stattgefunden, wenn der örtliche Quotient aus den auf Fluorophor a und Fluorophor b zurückgehenden Fluoreszenzintensitäten größer als g._ab oder kleiner als 1/g._ab ist, wobei g größer 1,5, bevorzugt größer als 2, vor allem größer als drei ist.

Ein differentielles Hybridisierungsereignis weist am Ort x,y in einer Matrix von x = 1 bis X und y = 1 bis Y einen Quotienten Sa/Sb auf, der durch eine der folgen den Ungleichungen gekennzeichnet ist:

Die Auflösung, das heißt die Werte X und Y der x,y-Matrix werden durch die Auflösung des Abtastvorganges begrenzt. Wird ein CCD-Chip eingesetzt, so kann X.Y die Auflösung des Chips bedeuten.

Es ist ebenfalls möglich, auf den gleichzeitigen Einsatz zweier oder mehr Fluoro phore, die jeweils mit einer mRNA einer bestimmten Herkunft gekoppelt sind, zu verzichten. In diesem Fall müßte man zwei (oder mehr) Sonden einsetzen, die denselben Fluorophor tragen, die aber auf mRNA unterschiedlicher Herkunft zu rückgehen. Dann würde man zunächst eine erste Hybridisierung mit Sonde a durchführen, das erste Hybridisierungsergebnis durch ortsaufgelöste Fluoreszenz messung detektieren, die hybridisierte Sonde a entfernen, eine zweite Hybridisie rung mit Sonde b durchführen, das zweite Hybridisierungsergebnis detektieren (und gegebenenfalls noch weitere Zyklen bestehend aus Entfernung einer hybridi sierten Sonde, Hybridisierung einer weiteren Sonde und Detektion des Hybridi sierungsergebnisses durchführen) und die erhaltenen Hybridisierungsergebnisse miteinander vergleichen. Die oben aufgeführte Gleichung und die Ungleichungen bleiben anwendbar, allerdings bedeuten die Indices a und b dann die jeweiligen Meßdurchgänge bei Anwendung von Sonden a und b, die auf Proben unterschied licher Herkunft zurückgehen.

Um zu entscheiden, ob ein Ort x,y Teil eines authentischen differentiellen Hybri disierungsereignisses ist, sollten die Quotienten Sa(x,y)/Sb(x,y) benachbarter Orte verglichen werden. Flächen, die ein differentielles Hybridisierungsereignis auf weisen, gehen in der Regel auf klonale Inseln auf der Oberfläche zurück und ha ben somit eine im wesentlichen runde Form und einen Durchmesser größer 0,1 µm, bevorzugt größer 0,75 µm oder 1,0 µm auf der Oberfläche, vor allem 1,2-2,0 µm. Mit diesem Filterkriterium lassen sich Artefakte weitgehend vermeiden (siehe Beispiel 7).

Die Bereiche, an denen differentielle Hybridisierungsereignisse stattgefunden ha ben, werden selektiv derart behandelt, daß die dort immobilisierten Moleküle mindestens zum Teil von der Oberfläche abgelöst werden. Bevorzugt geschieht dies durch lokal begrenzte Einwirkung elektromagnetischer Strahlung, insbeson dere UV-Strahlung oder Strahlung im sichtbaren Bereich, die in der Lage ist, photochemische Spaltung einer photolabilen Gruppe herbeizuführen, die mit ei nem Primermolekül eines Primerpaars verbunden ist. Wichtig hierbei ist, daß le diglich diejenigen Bereiche der elektromagnetischen Strahlung ausgesetzt werden, von denen eine Ablösung und Wiedergewinnung der Nukleinsäuremoleküle ge wünscht ist. Nach selektiver Ablösung der Nukleinsäuremoleküle, die an einem differentiellen Hybridisierungsereignis beteiligt sind, werden diese vom Träger abgewaschen.

Zur Analyse der in (g) von der Oberfläche abgelösten sowie in Waschlösung über führten Nukleinsäuremoleküle wird in der Regel zunächst eine Vervielfältigung erforderlich sein, welche bevorzugt mittels in-vitro-Amplifikation oder über Klo nierung oder eine Kombination hiervon erfolgt. Die weiter vorzunehmenden Analyseschritte richten sich im Rahmen der dem Fachmann geläufigen Vorge hensweisen nach der verfolgten Fragestellung, werden aber in der Regel eine Se quenzierung der erhaltenen Nukleinsäuren beinhalten. Oft werden die erhaltenen Nukleinsäuren auch zum Durchsuchen genomischer oder cDNA-Bibliotheken eingesetzt. Bei einer Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Expres sionsanalyse wird meist eine Überprüfung der erhaltenen Sequenzen mittels eines Quantifizierungsverfahrens, beispielsweise Northern-Hybridisierung oder quanti tative PCR, erfolgen. Weiterhin können die Ergebnisse zur Abfrage elektronischer Datenbanken, beispielsweise Sequenzdatenbanken, eingesetzt oder ihrerseits in Datenbanken eingespeist werden.

In einer anderen Ausführung von Schritt (g) werden die an nicht-differentiellen Hybridisierungsereignissen beteiligten Nukleinsäuremoleküle und/oder die an sie hybridisierten Sondenmoleküle so verändert, daß sie für eine Ablösung und/oder spätere Vervielfältigung nicht mehr zur Verfügung stehen, also entfernt oder in aktiviert werden.

Inaktivierung

Bevorzugt werden die nicht an nicht-differentiellen Hybridisie rungsereignissen beteiligten Nukleinsäuremoleküle mit elektromagnetischer Strahlung geeigneter Wellenlänge sowie einem Vernetzungsreagenz behandelt, so daß es zu die durch Hybridisierung entstandenen Doppelstränge vernetzenden Photoreaktionen kommt. Beispielsweise beschreiben Spielmann et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 4514-8) die kovalente Verknüpfung miteinander hy bridisierter DNA-Stränge durch Interkalation von 4'-Hydroxymethyl-4,5,8- trimethylpsoralen mit anschließender Bestrahlung bei 366 nm. Ferner kann auch auf ein Vernetzungsagens verzichtet werden, indem man die entsprechenden Nu kleinsäuremoleküle und Sonden infolge elektromagnetischer Einwirkung irrever sibel kreuzvernetzt (Thymidign-Dimer-Bildung). Eine weitere Möglichkeit ist das irreversible Verbinden der entsprechenden Nukleinsäuremoleküle und Sonden mit der Oberfläche durch lokale Erhitzung.

Entfernung

Natürlich können in Schritt (g) auch zunächst die an nicht differentiellen Hybridisierungsereignissen beteiligten Nukleinsäuremoleküle und Sonden entfernt werden. Dies kann z. B. durch die Spaltung photolabiler Gruppen inmitten des Linkers bewirkt werden, der die verlängerten Primermoleküle, also die Nukleinsäuremoleküle mit der Oberfläche verbindet. Zum Beispiel könnte ein Konstrukt wie in Formel II angegeben zum Einsatz kommen.

Die an differentiellen Hybridisierungsereignissen beteiligten Nukleinsäuremole küle und Sonden werden dann in einem zweiten Schritt entfernt, der nicht mehr selektiv sein muß. Diese in einem zweiten Schritt freigesetzten Nukleinsäuremo leküle und Sonden werden, wie oben beschrieben, analysiert.

Im Ergebnis äquivalent wäre im übrigen auch der Einsatz von LCM (Laser captu re microdissection, Emmert-Buck et al., Science 274 (1996), 998-1001) zur Iso lation derjenigen Nukleinsäure-Inseln, an denen differentielle Hybridisierungs ereignisse stattgefunden haben, sofern die zur Immobilisierung verwandte Ober fläche hierfür geeignete Eigenschaften aufweist. Zur Anwendung von LCM im Sinne des erfindungsgemäßen Verfahrens wäre es erforderlich, eine Oberfläche zur Verfügung zu stellen, welche einerseits gegen die während der Amplifikation und Hybridisierung herrschenden Bedingungen beständig ist, sich andererseits aber nach Kontakt mit thermisch erweichter und wieder abgekühlter Polyethylenviny lacetat-Transferfolie lokal gemeinsam mit dieser vom Träger abziehen läßt. Hier für könnte beispielsweise eine zur Bindung von Nukleinsäuren chemisch geeignet modifizierte (Rasmussen et al.) Polystyrolfolie auf einen Kunststoff oder Gla sträger aufgepreßt werden. Um die nach erfolgtem Transfer zwischen Transferfo lie und und Polystyrolfolie eingeschlossenen Nukleinsäuren zugänglich zu ma chen, könnte die Polystyrolfolie mit geeigneten Lösungsmitteln, beispielsweise Aceton, aufgelöst werden.

Anwendungsbereiche des erfindungsgemäßen Verfahrens sind insbesondere all diejenigen Fragestellungen, bei denen zwei oder mehrere Nukleinsäuremischun gen daraufhin untersucht werden sollen, ob einzelne Nukleinsäurespezies in den Mischungen in unterschiedlicher Häufigkeit enthalten sind, und die diese Spezies repräsentierenden sekundären und tertiären Nukleinsäuren isoliert werden sollen.

Dies ist beispielsweise bei der Expressionsanalyse der Fall, bei der häufig die Zu sammensetzung verschiedener cDNA-Präparationen verglichen wird und die Auf gabe in der Identifikation derjenigen cDNA-Spezies besteht, welche sich in ihrer Häufigkeit zwischen den Präparationen unterscheiden. Eine andere Anwendung ist der Vergleich von Mischungen von aus genomischer DNA gewonnenen DNA- Fragmenten, wobei oftmals bestimmte Fragmente (beispielsweise durch "Doppel restriktionsverdau" mit zwei verschiedenen Restriktionsendonukleasen gewon nen) lediglich in einem Teil der untersuchten Präparationen vorhanden sind. Der artige Fragmente, die bisher meist über das bekannte RFLP (Restriktionsfrag mentlängenpolymorphismus)-Verfahren (Kiko et al., Mol. Gen. Genet. 172 (1979), 303-12) identifiziert werden, eignen sich beispielsweise für genomische Kartierungen sowie zur Analyse von SNPs (single nucleotide polymorphisms) (Palmatier et al., Biol. Psychiatry 46 (1999), 557-67). Ein weiterer Anwendungs bereich, welcher vor allem in der Pflanzenzüchtung eine wichtige Rolle spielt, besteht in der Untersuchung von genomischen Fragmenten, die auf einer Seite von einer Erkennungsstelle für eine bestimmte Restriktionsendonuklease und auf ihrer anderen Seite von einer aus einem Transposon stammenden Sequenz flankiert werden (Arbuckle et al., WO 99/41415). Da die Insertion bzw. Exzision von Transposons Eigenschaften eines Organismus beeinflussen können, ist die Kennt nis solcher Prozesse und ihrer genauen Lage im Genom, etwa für Züchtungs zwecke, von großem Interesse.

Soll das Verfahren beispielsweise zur Expressionsanalyse zweier biologischer Proben eingesetzt werden, so werden häufig die folgenden Schritte zur Anwen dung kommen: zunächst werden Aliquots der aus beiden Proben gewonnenen RNAs vereinigt und in doppelsträngige cDNA überführt, welche ihrerseits einem Restriktionsverdau, beispielsweise mit einem häufig schneidenden Enzym wie MboI, unterworfen wird. Nach Ligation doppelsträngiger Linker wird eine Fest phasenamplifikation durchgeführt. Hierzu werden Primermoleküle, welche an die durch den verwendeten cDNA-Primer eingeführte Sequenz bzw. an die durch die Linker vorgegebene Sequenz binden können, auf einer Oberfläche immobilisiert.

Hierbei wird eine der Primerspezies über eine photolabile kovalente Bindung an die Oberfläche gebunden. Der andere der Primer enthält die Sequenz einer Schnittstelle für ein Enzym, welches die cDNA-Restriktionsfragmente in der Re gel nicht schneiden wird. Meist wird hierfür ein nicht-häufig schneidendes Enzym gewählt, dessen Erkennungsstelle die Erkennungsstelle des oben eingesetzten häufig schneidenden Enzyms beinhaltet, also beispielsweise BamHI, wenn als häufig schneidendes Enzym MboI gewählt wurde. Nach Aufbringen einer Reak tionskammer sowie einer Annealingmischung auf die Oberfläche, wobei die An nealingmischung neben den für die Durchführung einer Primerextension erforder lichen Reagenzien auch ein Aliquot der mit Linkern versehenen cDNA-Fragmente enthält, werden wie oben beschrieben sekundäre Nukleinsäuren erzeugt. Nach Entfernung nicht-immobilisierter Nukleinsäuren und Einbringen einer Amplifika tionsmischung, welche die für die Durchführung der Polymerasekettenreaktion erforderlichen Reagenzien enthält, werden "Inseln" durch Festphasenamplifikation entstandener tertiärer Nukleinsäuren erzeugt. Um hybrisisierungsfähige einzel strängige Moleküle zu erhalten, wird mit BamHI geschnitten und der jeweils nicht mehr kovalent immobilisierte Strang durch Denaturierung und Waschen entfernt. Zur Identifikation derjenigen Inseln, welche differentiell exprimierte Gene enthalten, werden weitere Aliquots der isolierten RNAs in Gegenwart von fluoreszenzmarkierten Nukleotidanaloga, beispielsweise Cy3-dUTP oder Cy5-dUTP, separat revers transkribiert. Dabei wird die aus einer Probe gewonnene cDNA mit einer Markierung und die aus der anderen Probe gewonnene cDNA mit der anderen Markierung versehen. Die Proben werden miteinander vermischt, denaturiert und unter Hybridisierungsbedingungen mit der vorbereiteten, die se kundären und tertiären Nukleinsäuren tragenden Oberfläche in Kontakt gebracht. Nach Hybridisierung und Waschen werden die von beiden Sondentypen stam menden Fluoreszenzsignale detektiert, und es werden wie in Beispiel beschrieben die Positionen derjenigen Inseln (in Beispiel 7 in Hinblick auf ihre Fluoreszenz auch als "spots" bezeichnet) bestimmt, an welchen überdurchschnittlich viel oder überdurchschnittlich wenig Moleküle des einen Sondentyps im Vergleich zu Mo lekülen des anderen Sondentyps hybridisiert sind. Diese Inseln, nunmehr beste hend aus mit Sondenmolekülen hybridisierten sekundären und tertiären Nuklein säuremolekülen, werden nun photolytisch von der Oberfläche gelöst und abgewa schen. Die Waschlösung enthält nun eine Mischung von cDNA- Restriktionsfragmenten, welche in beiden biologischen Proben unterschiedlich stark exprimierte Gene repräsentieren. Um die entsprechenden Gene zu identifi zieren, werden die cDNA-Restriktionsfragmente mittels PCR reamplifiziert; hier bei kommen Primer zur Anwendung, die die gleiche Sequenz aufweisen wie zu vor die immobilisierten, zur Festphasenamplifikation eingesetzten Primer. Da es sich in der Regel um eine Mischung verschiedener Fragmente handeln wird, muß eine Möglichkeit zur Auftrennung geschaffen werden. Diese Auftrennung kann durch Klonierung der Reamplifikationsprodukte erfolgen, es ist aber auch eine Größauftrennung über präparative Gelelektrophorese, besonders Polyacrylamid gelelektrophorese, möglich. Zur Identifikation werden die aufgetrennten Produkte in der Regel sequenziert und die Sequenz für Datenbankabfragen verwendet. Oft wird auf diese Weise bereits eindeutig klar, welches der bereits beschriebenen und in den abgefragten Datenbanken eingetragenen Gene zu den zwischen den unter suchten Proben differentiell exprimierten Genen gehört. In vielen Fällen führt die Datenbankabfrage allerdings nicht zu einem bereits charakterisierten Gen, sondern liefert lediglich sequenzidentische DNA-Abschnitte (sog. ESTs, expressed se quence tags), denen bisher keine Funktion und insbesondere auch noch keine voll ständige cDNA bzw. ein korrespondierender genomischer Locus zugeordnet wur de. In noch anderen Fällen führt die Datenbankabfrage zu gar keiner ähnlichen oder signifikant partiell identischen Sequenz. In den beiden letzten Fällen wird man in der Regel versuchen, längere (möglichst vollständige) cDNA-Moleküle des jeweiligen Gens zu erhalten. Dies ist über das Durchsuchen von cDNA- Banken möglich, bisweilen wird man aber auch das Durchsuchen genomischer Banken vorziehen. Eine Alternative besteht im von Frohman et al. (Proc Natl. Acad Sci USA 85 (1988): 8998-9002) beschriebenen Verfahren des "rapid am plification of cDNA ends", welches die Isolation vollständiger cDNA-Moleküle mittels in-vitro-Amplifikation erlaubt. Weiterhin wird man eine Expressionsquan tifizierung der identifizierten Gene anschließen. Da keine eindeutige Zuordnung einer einzelnen der zahlreichen simultan abgelösten Nukleinsäureinseln zu einem nachfolgend identifizierten Gen mehr möglich ist, kann das an einer bestimmten Insel erhaltene Verhältnis der Signalstärken beider Sonden-Fluorophore nicht zur Bestimmung eines Regulationsfaktors des entsprechenden Gens herangezogen werden. Vielmehr wird man sich der dem Fachmann geläufigen Techniken wie etwa quantitative PCR oder Northern Blotting bedienen, um das Maß der Expres sionsveränderung jedes einzelnen identifizierten Gens zu ermitteln. In jedem Fall liefert das Verfahren, wenn es zur vergleichenden Expressionsanalyse zweier Pro ben eingesetzt wird, eine Mischung von cDNA-Fragmenten, die zwischen beiden Proben differentiell exprimierte Gene repräsentieren. Beim analog verlaufenden Einsatz zum Genomvergleich hingegen werden genomische Abschnitte isoliert, welche eine veränderte Kopienzahl aufweisen (z. B. "loss of heterozygosity" oder auch Amplifikation bestimmter genomischer Abschnitte in Tumorgewebe) oder auch nur in einem Teil der untersuchten Genome vorkommt (z. B. Insertionen oder Deletionen oder auch Fragmente, die genomische Umlagerungen repräsentieren).

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden nach Schritt e) die folgenden Schritte durchgeführt:

a) Die Oberfläche aus Schritt e) des bereits beschriebenen Verfahrens, die er ste Oberfläche, wird mit einer zweiten Oberfläche in Kontakt gebracht, auf welcher Primermoleküle, die mindestens ein Primerpaar bilden, immoblili siert sind, unter Bedingungen, bei welchen die Primermoleküle der zwei ten Oberfläche mit den tertiären Nukleinsäuren der ersten Oberfläche hy bridisieren können;
b) Die immobilisierten Primermoleküle der zweiten Oberfläche werden kom plementär zum Gegenstrang unter Bildung sekundärer Nukleinsäuren ver längert;
c) Die nicht durch die Immobilisierung in Schritt a) an die zweite Oberfläche gebundenen Nukleinsäremoleküle werden von der zweiten Oberfläche ent fernt;
d) Die sekundären Nukleinsäuren werden amplifiziert, wobei tertiäre Nu kleinsäuren erhalten werden;
e) Schritte a) bis d) werden analog wiederholt, bis die gewünschte Anzahl von präparierten Oberflächen hergestellt worden ist;
f) Die in Schritt e) hergestellten Oberflächen werden den Schritten f) und g) des bereits beschriebenen Verfahrens unterzogen.

In dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zwischen Schritt e) und f) des bereits beschriebenen Verfahrens eine Kontaktreplikation durchgeführt. Dabei werden die beiden beteiligten, so plan wie möglich ausge führten Oberflächen in so große Nähe gebracht, daß die an den Oberflächen ge bundenen Primermoleküle bzw. Nukleinsäuremoleküle miteinander hybridisieren können und eine Primerextension möglich wird. Nach Trennung der Oberflächen erfolgt Amplifikation nach Maßgabe der Polymerasekettenreaktion auf die an sich bekannte Art und Weise. Diese Kontaktreplikation kann beliebig oft wiederholt werden, wobei das neu hergestellte Replikat durch eine unbehandelte Oberfläche ausgetauscht wird, die ausschließlich die immobilisierten Primermoleküle auf weist. Die hergestellten Replikate und das Original werden vollständig oder zu einem Anteil den Schritten f) und g) des bereits beschriebenen Verfahrens unter worfen.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird weiterhin eine Vor richtung bereitgestellt, mit folgenden Bestandteilen:

a) eine Reaktions- und Hybridisierungskammer in Form einer Durchflußzelle,
b) mindestens eine Lichtquelle zur Anregung von zur Markierung eingesetzten Fluorophoren,
c) mindestens eine Lichtquelle zur Photolyse zur Spaltung vorgesehener Bindun gen,
d) optional mindestens eine Lichtquelle zur photochemischen oder thermischen Veränderung von Nukleinsäure- bzw. Sondenmolekülen,
e) mindestens ein Photodetektor zur Messung der emittierten Fluoreszenzstrah lung,
f) gegebenenfalls eine Vorrichtung zur Abtastung der in der Durchflußzelle be findlichen Oberfläche in XY-Richtung,
g) gegebenenfalls mindestens ein Vorratsgefäß für frische Reaktionslösungen sowie mindestens ein Gefäß für verbrauchte Reaktionslösungen sowie minde stens eine Vorrichtung zur Flüssigkeitsförderung,
h) gegebenenfalls ein elektronischer Rechner, welcher die gemessene Fluores zenzintensität in Abhängigkeit von der Position auf der Oberfläche speichert, gegebenenfalls die so erhaltenen Datensätze weiterverarbeitet und gegebenen falls eine automatische Auswahl der interessierenden Bereiche auf der Ober fläche trifft sowie die hierfür vorgesehene Einwirkung elektromagnetischer Strahlung steuert.

Die Reaktions- und Hybridisierungskammer enthält die Oberfläche, an welcher die Hybridisierung der einzelsträngigen sekundären und tertiären Nukleinsäuren mit Sondenmolekülen (Schritt (f) des erfindungsgemäßen Verfahrens) sowie ge gebenenfalls zuvor die Amplifikation stattfinden. Beispielsweise kann besagte Oberfläche gleichzeitig als Wand, bevorzugt als die obere oder untere Wand, der Reaktions- und Hybridisierungskammer dienen. Hierbei muß die Kammer zur Beobachtung der an der Oberfläche stattfindenden Prozesse mindestens teilweise transparent ausgeführt sein. Um geeignete Reaktionsbedingungen herstellen zu können, ist die Reaktionskammer bevorzugterweise temperierbar ausgestaltet, beispielsweise mittels eines Peltier-Elements.

Bevorzugt ist die Lichtquelle zur Photolyse zur Spaltung vorgesehener Bindungen und/oder die Lichtquelle zur photochemischen oder thermischen Veränderung von Nukleinsäure- bzw. Sondenmolekülen als Laser-Lichtquelle ausgestaltet. Der Ein satz gepulster Laser ist bevorzugt.

Im Rahmen der Erfindung kann eine photolytisch spaltbare Verbindung eingesetzt werden, welche bevorzugterweise während der Oligonukleotidsynthese in das Nukleinsäure-Rückgrat inkorporiert werden kann und die nachfolgende photolyti sche Abspaltung mindestens eines Teils des Oligonukleotids von einer Oberfläche ermöglicht. In einer bevorzugten Form weist besagte photolytisch spaltbare Ver bindung die o-Nitrobenzyl-Grundstruktur auf, wobei die Verbindung als spaltba rer Linker zwischen der 5'-OH-Gruppe einer Ribose- oder Desoxyribosegruppe und entweder der 3'-OH-Gruppe einer weiteren Ribosegruppe oder einer Atom gruppe, welche die Immobilisierung eines Oligonukleotids vermitteln kann, posi tioniert werden kann. Besonders bevorzugt sind Verbindungen, die mit den bei der automatischen Oligonukleotidsynthese herrschenden Reaktionsbedingungen kompatibel sind und daher bei der automatischen Synthese direkt in das betref fende Oligonukleotid inkorporiert werden können.

Eine solche Verbindung wird durch die allgemeine Formel I beschrieben,

wobei n und m unabhängig voneinander 1 bis 30 bedeuten,
R¹ Dimethoxytrityloxy (DMTO) oder eine Gruppe bedeutet, welche die Im mobilisierung an eine Oberfläche ermöglicht oder welche eine Kopplung an eine immobilisierbare Verbindung erlaubt, und
R² die Bedeutung -OP(OC₂H₄CN)N(CH(CH₃)₂)₂ oder -OP(OCH₃)N(CH(CH₃)₂)₂,

trägt, sowie ihre Salze.

Bevorzugt sind Verbindungen, bei welchen R¹ die Bedeutung Dimethoxytrityloxy (DMTO), -NH₂, -OH, -OPO₃H₂, -SH, -NCS, -NCO oder

N-Succinimidyloxycarbonyl (siehe oben) trägt.

Ein weiterer Gegenstand ist ferner die Verwendung der beschriebenen Verbin dungen als photochemisch spaltbare Gruppe bei der Immobilisierung von Nu kleinsäuren. Die Gruppe kann durch Licht einer Wellenlänge von 400 nm gespal ten werden.

Die Zeichnung dient der Erläuterung der Erfindung.

Es zeigt:

Fig. 1 die Amplifikation einzelner Nukleinsäuremoleküle mittels Oberflächen gebundener Primer zu Inseln aus jeweils identischen amplifizierten Nu kleinsäuremolekülen;

Fig. 2 die Vorbereitung klonaler Nukleinsäure-Inseln zur Hybridisierung;

Fig. 3 die Hybridisierung klonaler Inseln aus einzelsträngigen Nukleinsäuren mit markierten Nukleinsäuremolekülen;

Fig. 4 die Isolation von Nukleinsäuremolekülen, die an einem differentiellen Hy bridisierungsereignis beteiligt sind, durch photolytische Spaltung und Re amplifikation;

Fig. 5 die Auswertung und Verarbeitung der Nukleinsäure-Inseln tragenden Oberflächen;

Fig. 6 die Bereitstellung primärer Nukleinsäuren zur Anwendung in der Expres sionsanalyse;

Fig. 7 die Bereitstellung primärer Nukleinsäuren zur Anwendung in der Geno manalyse;

Fig. 8 die Bereitstellung primärer Nukleinsäuren zur Anwendung in der Transpo son-vermittelten Genomanalyse;

Fig. 9 das Ergebnis der Amplifikation an einer Oberfläche.

Fig. 1 zeigt die Amplifikation einzelner Nukleinsäuremoleküle mittels Oberflä chengebundener Primer zu Inseln aus jeweils identischen amplifizierten Nuklein säuremolekülen, wobei im einzelnen
1 die irreversible Immobilisierung von ein Primerpaar bildenden Oli gonukleotiden,
2 die Hybridisierung der primären Nukleinsäuren mit den Oberflä chengebundenen Primern,
3 die Bildung sekundärer Nukleinsäuren durch Strangverlängerung der Primer,
4 die Entfernung der nicht irreversibel gebundenen, primären Nuklein säuremoleküle und Amplifikation der sekundären Nukleinsäuren,
5 Inseln mit jeweils identischen, tertiären Nukleinsäuremolekülen bezeichnet.

Fig. 2 veranschaulicht die Vorbereitung klonaler Nukleinsäure-Inseln zur Hybri disierung. Die verdickten Linien (schwarz bzw. gerastert) symbolisieren bekannte Sequenzen, welche eine unbekannte Sequenz (dünne schwarze Linien) flankieren.

Ph steht für eine photolytisch spaltbare Gruppe, welche in das Zuckerphosphat- Rückgrat eines der für die in Fig. 1 eingesetzten Amplifikationsprimer eingefügt wurde. GGATCC ist eine in den zweiten eingesetzten Amplifikationsprimer in korporierte Erkennungsstelle für die Restriktionsendonuklease BamHI. Im einzel nen beschreibt
1 das halbseitige Lösen der Amplifikationsprodukte aus Fig. 1 durch Schnitt mit der Restriktionsendonuklease BamHI,
2 die Entfernung des nun nicht mehr kovalent an die Oberfläche ge bundenen Nukleinsäurestrangs durch Denaturierung und anschlie ßendes Waschen.

Fig. 3 zeigt die Hybridisierung klonaler Inseln aus einzelsträngigen Nukleinsäuren mit markierten Nukleinsäuremolekülen (gestrichelte Linie).

Fig. 4 beschreibt die Isolation von Nukleinsäuremolekülen, die an einem diffe rentiellen Hybridisierungsereignis beteiligt sind, durch photolytische Spaltung und Reamplifikation, wobei im einzelnen
1 die Abspaltung der hybridisierten Nukleinsäuremoleküle von der Oberfläche durch Photolyse,
2 die Denaturierung der von der Oberfläche abgespaltenen Nuklein säure-Hybride sowie das Annealing eines ersten Amplifikationspri mers an die erste bekannte, flankierende Sequenz der an der Oberflä che amplifizierten Nukleinsäuremoleküle,
3 die Extension des in (2) hybridisierten Amplifikationsprimers sowie die Amplifikation des freigesetzten Nukleinsäurestrangs unter Zuga be eines zweiten Amplifikationsprimers, welcher mit der zweiten bekannten flankierenden Sequenz der an der Oberfläche amplifi zierten Nukleinsäuremoleküle hybridisieren kann, bedeutet.

Fig. 5 zeigt die Auswertung und Verarbeitung der Nukleinsäure-Inseln tragenden Oberflächen, wobei
1 eine Oberfläche mit durch Amplifikation mit immobilisierten Pri mern entstandenen Nukleinsäure-Inseln (schwarze Punkte),
2 die Umwandlung der zunächst doppelsträngigen Nukleinsäuremo leküle in einzelsträngige Moleküle durch Restriktionsverdau und anschließende Denaturierung sowie die Hybridisierung mit zwei unterschiedlich markierten Nukleinsäure-Proben,
3 das durch Detektion der ersten Probe erhaltene Fluoreszenzbild (Fluoreszenzsignale gepunktet dargestellt),
4 das durch Detektion der zweiten Probe erhaltene Fluoreszenzbild (Fluoreszenzsignale schraffiert dargestellt),
5 die Überlagerung beider Fluoreszenzbilder,
6 das durch Überlagerung beider Fluoreszenzbilder erhaltene Bild (gleich starke Signale in beiden Kanälen: weiß; stärkeres Signal in Kanal 1: gepunktet; stärkeres Signal in Kanal 2: schraffiert),
7 die Isolation von Nukleinsäuremolekülen, die an einem differenti ellen Hybridisierungsereignis beteiligt sind, durch photolytische Ablösung vom Träger sowie Reamplifikation
zeigt.

Fig. 6 zeigt die Bereitstellung primärer Nukleinsäuren zur Anwendung in der Ex pressionsanalyse, wobei im einzelnen
1 die cDNA-Synthese mit biotinyliertem Primer und nachfolgend Bindung der doppelsträngigen cDNA an eine Streptavidin- beschichtete Oberfläche,
2 den Restriktionsschritt mit einer ersten Restriktionsendonuklease (RE1), Fortwaschen der freigesetzten Fragmente und zweiter Re striktionsschritt mit einer zweiten Restriktionsendonuklease (RE2),
3 die Ligation zweier verschiedener Linker,
4 mRNA,
5 doppelsträngige an Oberfläche immobilisierte cDNA,
6 ein cDNA-Fragment, das von zwei verschiedenen "überhängen den" Enden flankiert wird,
7 ein von zwei verschiedenen Linkern (L1, L2) flankiertes cDNA- Fragment
zeigt.

Fig. 7 zeigt die Bereitstellung primärer Nukleinsäuren zur Anwendung in der Ge nomanalyse, wobei im einzelnen
1 einen Restriktionsschnitt genomischer DNA mit zwei verschiede nen Restriktionsendonukleasen (RE1, RE2) und die nachfolgende Ligation verschiedener Linker (L1, L2),
2 die Amplifikation der Ligationsprodukte mit Primern, welche komplementär zu jeweils einem der Linkerstränge sind, wobei nur diejenigen Fragmente effizient amplifiziert werden können, welche von zwei unterschiedlichen Primersequenzen flankiert sind,
zeigen.

Fig. 8 zeigt die Bereitstellung primärer Nukleinsäuren zur Anwendung in der Transposon-vermittelten Genomanalyse, wobei im einzelnen
1 den Schnitt genomischer DNA (dünne Doppellinie), welche be kannte Transposons enthält (dicke punktierte Doppellinie), mit ei ner Restriktionsendonuklease (RE), gefolgt von der Ligation von Linkern (dicke schwarze Doppellinien),
2 die Amplifikation der erhaltenen Ligationsprodukte mit einem Primer, der komplementär zu einem der Linkerstränge ist (dicker schwarzer Pfeil), und mit einem Primer, der komplementär zu einer bekannten Region eines Transposons ist, (dicker punktierter Pfeil)
zeigt.

Fig. 9 zeigt das Ergebnis der Amplifikation an einer Oberfläche, visualisiert durch Einbau von Cy3-dUTP während der Amplifikationsreaktion. Es wurden 60 Am plifikationszyklen angewendet; zur Detektion mittels des Konfokalmikroskops wurden folgende Einstellungen gewählt: Objektiv 10×, Zoom 4×, Anregungswel lenlänge 568 nm, Detektionswellenlänge 600 nm, PMT-Spannung 860 V, Pinhole 1, Offset-16.

Die Erfindung wird durch die Beispiele näher beschrieben.

Beispiel 1 Vorbereitung von Nukleinsäuremolekülen

Männlichen Sprague-Dawley-Ratten wurden per Schlundsonde jeweils 50 mg/kg Körpergewicht Phenobarbital (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim) in 500 µl Maiskeimöl (Sigma-Aldrich) gelöst verabreicht. Kontrolltiere erhielten die gleiche Menge Maiskeimöl ohne Zusatz von Phenobarbital. Nach 4 Stunden wur den die Tiere decapitiert, die Lebern entnommen und zur Präparation von RNA nach Standard-Protokollen (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biolo gy (1999), John Wiley & Sons) eingesetzt. Die RNA von je 5 mit Phenobarbital behandelten Tieren bzw. von je 5 Kontrolltieren wurde gepoolt, jeweils 10 µg der gepoolten RNAs wurden mit Ethanol gefällt und in je 15,5 µl DEPC-behandeltem Wasser gelöst. Es wurden 0,5 µl 10 µM cDNA-Primer CPB28 V (5'-Amino-ACC TAC GTG GAT CCT TTT TTT TTT TTT TV-3'; ARK Scientific GmbH, Darm stadt) hinzugefügt, 5 Min. bei 65°C denaturiert und auf Eis gestellt. Die Mischung wurde mit 3 µl 100 mM Dithiothreitol (Life Technologies GmbH, Karlsruhe), 6 µl 5× Superscript-Puffer (Life Technologies), 1,5 µl 10 mM dNTPs, 0,6 µl RNase- Inhibitor (40 U/p.l, Roche Molecular Biochemicals) und 1 µl Superscript II (200 U/µl, Life Technologies) versetzt und zur cDNA-Erststrangsynthese 1 Stunde bei 42°C inkubiert. Zur Zweitstrangsynthese wurden 48 µl Zweitstrang-Puffer (Ausu bel et al.), 3,6 µl 10 mM dNTPs, 148,8 µl Wasser, 1,2 µl RNaseH (1,5 U/µl, Pro mega Corporation, Madison, Wisconsin/USA) und 6 µl DNA-Polymerase I (10 U/µl, New England Biolabs GmbH, Schwalbach) hinzugefügt und die Reaktionen 2 Stunden bei 22°C inkubiert. Es wurde mit 100 µl Phenol, dann mit 100 µl Chlo roform extrahiert und mit 0,1 Vol. Natriumacetat pH 5,2 und 2,5 Vol. Ethanol gefällt. Nach Zentrifugation für 20 Min. bei 15 000 g und Waschen mit 70% Et hanol wurde das Pellet in einem Restriktionsansatz aus 15 µl 10× Universal buffer (Stratagene GmbH, Heidelberg), 1 µl MboI (Stratagene, 4 U/µl) und 84 µl deioni siertem Wasser gelöst und die Reaktion 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Es wurde mit Phenol, dann mit Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Das Pellet wurde in einem Ligationsansatz aus 0,6 µl 10× Ligationspuffer (Roche Molecular Biochemicals), 1 µl 10 mM ATP (Roche Molecular Biochemicals), 4 µg Linker ML2025 (hergestellt durch Hybridisierung von Oligonukleotiden ML20 [5'-TCA CAT GCT AAG TCT CGC GA-3'; ARK] und LM25 [5'-GAT CTC GCG AGA CTT AGC ATG TGA C-3'; ARK] in 1× Ligationspuffer), 6,9 µl deionisiertem Wasser und 0,5 U T4 DNA-Ligase (Roche Molecular Biochemicals) gelöst und die Ligation über Nacht bei 16°C durchgeführt. Die Ligationsreaktion wurde mit Wasser auf 50 µl aufgefüllt, mit Phenol, dann mit Chloroform extrahiert und nach Zugabe von 1 µl Glycogen (20 mg/ml, Roche Molecular Biochemicals) mit 50 µl 28% Polyethylenglycol 8000 (Promega)/10 mM MgCl₂ gefällt. Das Pellet wurde mit 70% Ethanol gewaschen und in 100 µl Wasser aufgenommen.

Beispiel 2 Beschichtung von Oberflächen mit Oligonukleotiden

Es wurde eine Primerbindungslösung hergestellt, bestehend aus 19 mg 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid (Sigma-Aldrich), 100 µl 1 M 1- Methylimidazol (Sigma-Aldrich), je 20 µl 5'-aminomodifizierte Primer-Amino- CPB34 V (5'-Amino-TTA TTA ACC TAC GTG GAT CCT TTT TTT TTT TTT TV-3'; ARK) und Amino-MLISPh20 (5'-Amino-TTT TTT TTT TTT TTT X TCA CAT GCT AAG TCT CGC GA-3' mit

R = 3'-Ribosyl; R' = 5'-Ribosyl Eurogentec, Herstal, Belgien). Je 50 µl dieser Lösung wurden in NucleoLink- Gefäße (Nung GmbH & Co KG, Wiesbaden) gegeben und über Nacht bei 50°C inkubiert. Anschließend wurde die Primerbindungslösung entfernt, und die be schichteten NucleoLink-Gefäße wurden nach Herstellerangaben gewaschen.

Beispiel 3 Amplifikation an einer Oberfläche

Zur Erzeugung oberflächengebundener, sekundärer und tertiärer Nukleinsäuren wurde je 1 µl der in Beispiel 1 erzeugten Ligationsprodukte (Kontrollgruppe so wie Phenobarbital-behandelte Gruppe) mit 2 µl 50 mM MgCl₂-Lösung, 0,5 µl Rinderserumalbumin (20 mg/ml; Roche Molecular Biochemicals), 2,5 µl Dime thylsulfoxid, 0,5 µl 10 mM dNTPs, 0,5 µl AmpliTaq (5 U/µl; Perkin-Elmer, Fo ster City, California/USA), 5 µl 10× PCR-Puffer II (Perkin-Elmer) und deioni siertem Wasser in einem Endvolumen von 50 µl vermischt. Diese Annealing- Mischung wurde in eines der in Beispiel 2 mit Oligonukleotiden beschichteten NucleoLink-Gefäße gegeben. Das Gefäß wurde in eine Vertiefung eines UNO II- Thermocyclers (Biometra medizinische Analytik GmbH, Göttingen) gestellt. Zum Annealing und zur nachfolgenden Primerextension kam folgendes Temperatur programm zur Anwendung: Denaturierung 60 Sekunden bei 95°C, Annealing 5 Minuten bei 60°C, Primerextension 1 Minute bei 72°C. Nach erfolgter Primerex tension wurde das Gefäß 3× mit deionisiertem Wasser ausgespült. Zur Entfernung der nicht-kovalent gebundenen Stränge wurde 3× mit je 80 µl 0,1× SSC/0,1% SDS aufgefüllt, im Thermocycler für jeweils 30 sec. auf 95°C erhitzt, die Lösung verworfen und mit deionisiertem Wasser nachgewaschen. Dann wurde mit 50 µl einer Amplifikationsmischung aufgefüllt, bestehend aus 2 µl 50 mM MgCl₂, 0,5 µl Rinderserumalbumin (20 mg/ml), 2,5 µl Dimethylsulfoxid, 0,5 µl 10 mM dNTPs, 0,5 µl AmpliTaq und 5 µl 10× PCR-Puffer II in deionisiertem Wasser. Das Reaktionsgefäß wurde mit dem mitgelieferten Klebeband versiegelt, in den Thermocycler überführt und folgendem Temperaturprogramm unterworfen: De naturierung 20 sec. bei 95°C, Annealing 30 sec. bei 60°C, Extension 60 sec. bei 72°C, für 60 Zyklen. Nach beendeter Amplifikation wurde die Versiegelung ent fernt, und das Reaktionsgefäß wurde 3× mit deionisiertem Wasser ausgespült.

Beispiel 4 Sondenmarkierung

Die in Beispiel 1 gewonnene Gesamt-RNA wurde zur Isolation von poly(A)-RNA mittels (Oligo dT)-Dynabeads (Dynal AS, Oslo, Norwegen) gemäß der Anleitung des Herstellers eingesetzt. Zum Primer-Annealing wurden 2 µg der so erhaltenen poly(A)-RNA mit 6 µl oligo(dT)₂₁ (50 µM; ARK) mit DEPC-behandeltem Was ser auf 15 µl aufgefüllt, für 5 Min. auf 70°C erhitzt und auf Eis abgekühlt. Dann wurden 6 µl 5× Erststrang-Puffer (Life Technologies), 1 µl RNase-Inhibitor (Ro che Molecular Biochemicals), 100 mM Dithiothreitol (Life Technologies), 0,6 µl 50× dNTP-T (je 25 mM dATP, dCTP und dGTP; 10 mM dTTP; Roche Molecular Biochemicals), 2 µl Cy3-dUTP oder Cy5-dUTP (1 mM; Amersham-Pharmacia Biotech Europe GmbH, Freiburg), 2 µl Superscript II (200 U/µl; Life Technolo gies) hinzugefügt. Die Synthese fluoreszenzmarkierter Erststrang-cDNA erfolgte für 2 Std. bei 42°C im vorgeheizten Thermocycler. Zur RNA-Denaturierung wur den 2,5 µl 1N NaOH hinzugefügt und für 10 Min. auf 65°C erwärmt. Nach Ab kühlung auf Eis wurde mit 6,2 µl 1M Tris-HCl pH 7,5 neutralisiert, mit TE-Puffer pH 8,0 (Ausubel et al.) auf 400 µl verdünnt und auf einer Microcon-30-Säule (Millipore GmbH, Eschborn; Zentrifugation 10 Min. bei 13 000 rpm) auf 10 µl eingeengt.

Beispiel 5 Hybridisierung

Zur Linearisierung der in Beispiel 3 vorbereiteten klonalen DNA-Inseln wurden je 50 µl einer Restriktionsmischung, bestehend aus 5 µl 10× Restriktionspuffer B (Roche), 0,5 µl Rinderserumalbumin, und 2 µl BamHI (5 U/µl; Roche Molecular Biochemicals) in deionisiertem Wasser, in die NucleoLink-Gefäße gegeben und für 1,5 h bei 37°C inkubiert. Um die nach erfolgter Restriktion nicht mehr kova lent an die Oberfläche gebundenen Stränge zu entfernen, wurde die Restriktions mischung entfernt, die Gefäße wurden mit deionisiertem Wasser gespült und dann mit 80 µl 1,0× SSC/0,1% SDS aufgefüllt. Es wurde im Thermocycler für 60 sec. auf 95°C erhitzt, der Überstand verworfen und mit deionisiertem Wasser nachge waschen. Zur Hybridisierung wurden je 5 µl Cy-3- und Cy-5-markierter cDNA miteinander vermischt und mit 50 µl Hybridisierungspuffer (0,25× SSC, 0,02% SDS, 1% N-Lauroylsarcosin, 1% Blocking-Reagenz (Roche Molecular Biochemi cals), 1 µg humaner C_ot1-DNA (Life Technologies) versetzt. Diese Hybridisie rungslösung wurde in die in Beispiel 3 vorbereiteten Nucleolink-Gefäße gegeben und diese versiegelt. Es wurde im Thermocycler 2 Min. bei 95°C denaturiert, dann wurde die Temperatur auf 50°C reduziert und 14 Std. hybridisiert. Die Hy bridisierungslösung wurde entfernt, und die Gefäße wurden 3× 5 Min. bei Raum temperatur mit 2× SSC/0,1% SDS gewaschen, gefolgt von 3× 5 Min. mit 0,2× SSC/0,1% SDS bei 42°C und abschließend 1× 5 Min. mit 0,1× SSC/0,1% SDS bei 42°C.

Beispiel 6 Identifikation differentiell exprimierter Gene

Die in Beispiel 6 erhaltenen hybridisierten und gewaschenen DNA-Arrays wurden auf dem Konfokalmikroskop analysiert. Hierfür wurden die Böden der Nucleo link-Gefäße abgetrennt und mittels Tesa-PowerStrips (Beiersdorf AG, Hamburg) auf Objektträger für die Mikroskopie (neoLab Migge Laborbedarf-Vertriebs GmbH, Heidelberg) geklebt. Zur Untersuchung der Hybridisierungsergebnisse wurde ein Leica-TCS-NT-Konfokalmikroskop (Leica-Microsystems Heidelberg GmbH, Heidelberg), ausgestattet mit ArKr-Laser und ArUV-Laser sowie einem UV 10 × 0,4 NA dry-Objektiv, verwendet. Die Arrays wurden nacheinander bei 568 nm und bei 647 nm angeregt; detektiert wurde die Emission bei 600 nm bzw. bei ≧ 665 nm. Mittels der Steuerungssoftware TCS-NT für Windows NT 4.0 (Lei ca) wurde jeweils der gesamte Bereich des zu untersuchenden Arrays in einzelnen 250 × 250 nm-Kacheln gescannt. Die Zoom-Einstellung hierfür betrug 4×; die Photomultiplierspannung betrug 850 V. Offset-Werte betrugen -16, die Pinhole- Einstellung war 0,5. Mittels des Programms TCS Mosaic (Leica) wurden die für jede Kachel erhaltenen Bilder zu einem Gesamtbild des Arrays zusammengesetzt. Mit Hilfe des QWin-Programms (Leica) wurden die Signale identifiziert, bei wel chen sich die Signalstärke beider Kanäle um mindestens den Faktor 3 unterschied. Die zugehörigen Koordinaten wurden ermittelt, und die jeweiligen Bereiche wur den erneut angefahren. Nach Wechsel des Lasers wurden die Bereiche des Arrays, von denen die identifizierten "differentiellen" Signale stammten, bei 10 W Aus gangsleistung mit einer Wellenlänge von 350 nm für jeweils 500 Millisekunden bestrahlt. Zu dieser regioselektiven Bestrahlung wurde der Scanspiegel nicht be wegt. Der Wert der Pinhole-Einstellung betrug 3. Nach abgeschlossener Behand lung aller ausgewählten Bereiche wurden die Arrays wieder von den Objektträ gern entfernt und zur Ablösung der nicht mehr kovalent gebundenen DNA- Moleküle über Nacht in einem 2-ml-Eppendorf-Gefäß (Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg) mit 50 µl 1,2× PCR-Puffer II mit 2mM MgCl₂ inkubiert. Die so erhaltene Fragmentlösung wurde in ein PCR-Reaktionsgefäß überführt und auf Eis mit 2,5 U AmpliTaq, 100 µM dNTPs (Endkonzentration) und je 0,5 µM CPB28V und ML20 (5'-TCA CAT GCT AAG TCT CGC GA-3'; ARK) (End konzentrationen) versetzt. Zur Reamplifikation der abgelösten Fragmente wurde ein Temperaturprogramm angewendet, bestehend aus 1 Min. initialer Denaturie rung bei 94°C, dann 35 Zyklen aus je 30 Sec. Denaturierung bei 95°C, 30 Sec. Annealing bei 55°C, und 90 Sec. Elongation bei 72°C. Die Produktmischung wurde mittels QiaQuick-Säulen (Qiagen AG, Hilden) gereinigt und kloniert (TOPO TA cloning kit, Invitrogen BV, Groningen/Niederlande). Einzelne Klone wurden für die Sequenzierung der klonierten Inserts herangezogen.

Beispiel 7 Algorithmus zur Bestimmung der Orte, an denen differentielle Hybridisierungs ereignisse stattgefunden haben

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1. Detektion von räumlicher Verteilung der Intensitäten in ausreichend großer Auflösung über die Oberfläche aus (a) in beiden Farbkanälen simultan oder getrennt mittels eines CCD-Systems oder eines Scanningsystems. Ablage der XY-Koordinaten und der zugehörigen Intensitätsmeßwerte in Listenformat.
2. Ermitteln der Intensitätsverteilung (Histogramm) über alle Pixel getrennt für beide Kanäle.
3. Ein Hintergrundwert wird als durchschnittliche Intensität der Pixel bestimmt, die sich innerhalb im unteren Bereich des Histogramms festzulegender Per centilgrenzen (z. B. von 10%-20%) befinden. Dies wird für beide Kanäle ge trennt ermittelt.
4. Ermittlung aller aus benachbarten Pixeln gebildeter Bereiche (nachfolgend als Spots bezeichnet), deren Pixel-Intensitätswerte um einen festgelegten Faktor über dem Hintergrund liegen, nach folgendem (oder daraus abgewandeltem) Algorithmus:

Initialbedingungen

a) alle Pixel gelten als nicht klassifiziert.
b) Pixel mit gleicher x,y-Koordinate der beiden Kanäle gehören zusam men.

Iterationsschritt

a) Nehme den ersten, nicht klassifizierten Pixel (neuer Betrachtungspunkt).
b) Wenn der Pixel in keinem Kanal den festgelegten Faktor zu seinem Hintergrundwert übersteigt, wird er zur Hintergrundklasse klassifiziert.
c) Wenn der Pixel in einem Kanal oder beiden Kanälen den festgelegten Faktor zu seinem Hintergrundwert übersteigt, wird er zu einem neuen Spot klassifiziert (Klassifizierung über einen eindeutigen Bezeichner).
- 1. Iterative Betrachtung aller Pixel, die an den betrachteten Pixel an grenzen
  - 1. Pixel, die schon als klassifiziert gelten, werden nicht weiter betrachtet.
  - 2. Pixel, die in keinem Kanal den festgelegten Faktor zu seinem Hintergrundwert übersteigen, werden zur Hintergrundklasse klassi fiziert.
  - 3. Pixel, die in einem Kanal oder beiden Kanälen den festge legten Faktor zu seinem Hintergrundwert übersteigen, werden als zu dem Spot gehörig klassifiziert.
  - 4. Für jeden in (cc3) neu klassifizierten Pixel wird die Prozedur ab (c1) mit dem neu klassifizierten Pixel als Betrachtungspunkt wiederholt (rekursives Verfahren).
- 2. Diese Schritte sind erst beendet, wenn keine neuen Pixel mehr als zu dem Spot gehörig klassifiziert werden können.
d) Fortsetzung mit a) bis alle Pixel als klassifiziert gelten.

5. Für alle ermittelten Spots werden folgende Größen unter Berücksichtigung aller als zugehörig klassifizierten Pixel bestimmt und in eine Listendatei ausgege ben:

a) durchschnittliche Intensität getrennt für beide Kanäle
b) Standardabweichung der Intensitäten getrennt für beide Kanäle
c) Mittelpunkt der Pixelfläche im festgelegten x,y-Koordinatensystem
d) Intensitäten aus (a) minus ermitteltem Hintergrundwert getrennt für beide Kanäle
e) Quotient der beiden Ergebnisse aus (d).

6. Zur Bekämpfung von Artefakten werden nachfolgend nur Spots betrachtet, die einen festzulegenden Set der nachfolgend aufgeführten Filterkriterien erfüllen. Dabei ist es zum Beispiel sinnvoll, Spots, die einen Durchmesser kleiner 1 µm aufweisen, zu vernachlässigen.

a) Eine bestimmte Anzahl Pixel wird überschritten (Spotgröße)
b) Eine bestimmte Anzahl Pixel wird nicht unterschritten
c) Ein festzulegender Proportionsbereich des Spots wird nicht verletzt (Län ge/Breite, wobei Länge = x_max-x_min und Breite = y_max-y_min)
d) Ein Kriterium zur Formbeschreibung der Pixelfläche wird erfüllt (z. B. an nähernd runder Spot beurteilt über den durchschnittlichen Abstand zum Mittelpunkt aus (5c) bezogen auf die Pixelanzahl)
e) Standardabweichung aus (5b) überschreitet in keinem Kanal einen festge legten Wert.

7. Ermittlung des durchschnittlichen Quotienten für alle die Filterkriterien aus (6) erfüllenden Spots, unter Zugrundlegung der Quotienten aus 5(e).
8. Division aller unter (7) berücksichtigten Quotienten durch den durchschnittli chen Quotienten aus (7) = Normalisierung der Quotienten auf den Mittelwert aller Quotienten.
9. Ermittlung aller Spots, deren normalisierter Quotient aus (8) mindestens um einen festgelegten Faktor von n oder 1/n vom Mittelwert aller Quotienten ab weicht.

Claims

1. Verfahren zur Nukleinsäureanalytik, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

a) Primermoleküle, die mindestens ein Primerpaar bilden, werden auf einer Oberfläche immobilisiert;
b) Ein aus mindestens zwei verschiedenen Nukleinsäuremolekülen bestehendes Nukleinsäuregemisch wird so mit der Oberfläche aus a) in Kontakt gebracht, daß Hybridisierung zwischen Primermolekülen und Nukleinsäuremolekulen stattfinden kann;
c) Die immobilisierten Primermoleküle werden komplementär zum Gegenstrang unter Bildung sekundärer Nukleinsäuren verlängert;
d) Die nicht durch die Immobilisierung in Schritt a) an die Oberfläche gebundenen Nukleinsäuremoleküle werden von der Oberfläche entfernt;
e) Die sekundären Nukleinsäuren werden amplifiziert, wobei tertiäre Nukleinsäuren erhalten werden;
f) Die tertiären Nukleinsäuren werden mit einer Sonde oder einem Gemisch aus mehreren Sonden so in Kontakt gebracht, daß Hybridisierung zwischen den tertiären Nukleinsäuren und der Sonde oder den Sonden stattfinden kann;
g) Die tertiären Nukleinsäuren und/oder Sonden, die sich an Orten, an denen ein differentielles Hybridisierungsereignis lokalisiert ist, befinden, werden von den anderen Nukleinsäuren und/oder Sonden, die sich an Orten, an denen kein differentielles Hybridisierungsereignis lokalisiert ist, befinden, getrennt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß nach Schritt e) die folgenden Schritte durchgeführt werden:

a) die Oberfläche aus Schritt e) gemäß Anspruch 1, die erste Oberfläche, wird mit einer zweiten Oberfläche in Kontakt gebracht, auf welcher Primermoleküle, die mindestens ein Primerpaar bilden, immobilisiert sind, unter Bedingungen, bei welchen die Primermoleküle der zweiten Oberfläche mit den tertiären Nukleinsäuren der ersten Oberfläche hybridisieren können;
b) die immobilisierten Primermoleküle der zweiten Oberfläche werden komplementär zum Gegenstrang unter Bildung sekundärer Nukleinsäuren verlängert;
c) die nicht durch die Immobilisierung in Schritt a) an die zweite Oberfläche gebundenen Nukleinsäremoleküle werden von der zweiten Oberfläche entfernt;
d) die sekundären Nukleinsäuren werden amplifiziert, wobei tertiäre Nukleinsäuren erhalten werden;
e) Schritte a) bis d) werden analog wiederholt, bis die gewünschte Anzahl von präparierten Oberflächen hergestellt worden ist;
f) die in Schritt e) hergestellten Oberflächen werden den Schritten f) und g) von Anspruch 1 unterzogen.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt g) von Anspruch 1 die Sonden und/oder Nukleinsäuren, die ein differentielles Hybridisierungsereignis hervorgerufen haben, von der Oberfläche gelöst werden.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonden und/oder Nukleinsäuren, die ein differentielles Hybridisierungsereignis hervorgerufen haben, durch photolytische Spaltung des Hybridisierungspartners von der Oberfläche gelöst werden.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonden und/oder Nukleinsäuren, die ein differentielles Hybridisierungsereignis hervorgerufen haben, durch lokale Temperaturerhöhung von der Oberfläche gelöst werden.

6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt g) von Anspruch 1 die Sonden und/oder Nukleinsäuren, die kein differentielles Hybridisierungsereignis hervorgerufen haben, entweder infolge thermischer Einwirkung oder durch Kreuzvernetzung an die Oberfläche gebunden werden.

7. Verbindung der allgemeinen Formel I
wobei n und m unabhängig voneinander 1 bis 30 bedeuten,
R¹ Dimethoxytrityloxy (DMTO) oder eine Gruppe bedeutet, welche die Immobilisierung an eine Oberfläche ermöglicht oder welche eine Kopplung an eine immobilisierbare Verbindung erlaubt, und
R² die Bedeutung -OP(OC₂H₄CN)N(CH(CH₃)₂)₂ oder -OP(OCH₃)N(CH(CH₃)₂)₂,
trägt, sowie ihre Salze.

8. Verbindung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß R¹ die Bedeutung Dimethoxytrityloxy (DMTO), -NH₂, -OH, -OPO₃H₂, -SH, -NCS, -NCO oder N- Succinimidyloxycarbonyl trägt.

9. Verwendung der Verbindungen gemäß Anspruch 7 oder 8 als photochemisch spaltbare Gruppe bei der Immobilisierung von Nukleinsäuren.

10. Vorrichtung zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, aufweisend

a) eine Reaktions- und Hybridisierungskammer in Form einer Durchflußzelle,
b) mindestens eine Lichtquelle zur Anregung von zur Markierung eingesetzten Fluorophoren,
c) mindestens eine Lichtquelle zur Photolyse zur Spaltung vorgesehener Bindungen,
d) optional mindestens eine Lichtquelle zur photochemischen oder thermischen Veränderung von Nukleinsäure- bzw. Sondenmolekülen,
e) mindestens einen Photodetektor zur Messung der emittierten Fluoreszenzstrahlung,
f) gegebenenfalls eine Vorrichtung zur Abtastung der in der Durchflußzelle befindlichen Oberfläche in XY-Richtung,
g) gegebenenfalls mindestens ein Vorratsgefäß für frische Reaktionslösungen sowie mindestens ein Gefäß für verbrauchte Reaktionslösungen sowie mindestens eine Vorrichtung zur Flüssigkeitsförderung,
h) gegebenenfalls einen elektronischer Rechner, welcher die gemessene Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit von der Position auf der Oberfläche speichert, gegebenenfalls die so erhaltenen Datensätze weiterverarbeitet und gegebenenfalls eine automatische Auswahl der interessierenden Bereiche auf der Oberfläche trifft sowie die hierfür vorgesehene Einwirkung elektromagnetischer Strahlung steuert.