DE10051564A1

DE10051564A1 - Neue Verfahren zur parallelen Sequenzierung eines Nukleinsäuregemisches an einer Oberfläche

Info

Publication number: DE10051564A1
Application number: DE2000151564
Authority: DE
Inventors: Achim Fischer
Original assignee: Axaron Bioscience AG
Current assignee: Sygnis Pharma AG
Priority date: 2000-10-18
Filing date: 2000-10-18
Publication date: 2002-08-01

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur parallelen Sequenzierung von mindestens zwei verschiedenen in einem Nukleinsäuregemisch enthaltenen Nukleinsäuren, wobei DOLLAR A (a) eine Oberfläche bereitgestellt wird, aufweisend Inseln von Nukleinsäuren jeweils gleicher Sorte, tertiäre Nukleinsäuren; DOLLAR A (b) Gegenstände der tertiären Nukleinsäuren, GTN, bereitgestellt werden; DOLLAR A (c) die GTN um ein Nukleotid verlängert werden, wobei DOLLAR A - das Nukleotid an der 2'-OH-Position oder an der 3'-OH-Position eine Schutzgruppe trägt, die eine weitere Verlängerung verhindert, DOLLAR A - das Nukleotid eine Molekülgruppe trägt, die die Identifikation des Nukleotids ermöglicht; DOLLAR A (d) das eingebaute Nukleotid identifiziert wird; DOLLAR A (e) die Schutzgruppe entfernt wird und die zur Identifikation verwendete Molekülgruppe des eingebauten Nukleotids entfernt oder verändert wird, und DOLLAR A (f) Schritt (c) und nachfolgende Schritte solange wiederholt werden, bis die gewünschte Sequenzinformation erhalten worden ist.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Festphasen-gestützten parallelen Sequenzierung von mindestens zwei verschiedenen in einem Nukleinsäuregemisch enthaltenen Nuklein säuren.

Ein wichtiges Verfahren der biologischen Analytik ist die Sequenzanalyse von Nukleinsäu ren. Hier wird die genaue Basenfolge der interessierenden DNA- oder RNA-Moleküle be stimmt. Die Kenntnis dieser Basenfolge erlaubt beispielsweise die Identifikation bestimm ter Gene oder Transkripte, also der zu diesen Genen gehörigen Boten-RNA-Moleküle, die Aufdeckung von Mutationen bzw. Polymorphismen, oder auch die Identifikation von Or ganismen oder Viren, die sich anhand bestimmter Nukleinsäuremoleküle eindeutig erken nen lassen. Üblicherweise wird die Sequenzierung von Nukleinsäuren nach dem Kettenab bruchverfahren durchgeführt (Sanger et al, (1977) PNAS 74, 5463-5467). Hierzu wird eine enzymatische Ergänzung eines Einzelstrangs zum Doppelstrang vorgenommen, indem ein an besagten Einzelstrang hybridisierter "Primer", in der Regel ein synthetisches Oligonu kleotid, mittels Zugabe von DNA-Polymerase und Nukleotidbausteinen verlängert wird. Ein geringer Zusatz von Abbruch-Nukleotidbausteinen, welche nach ihrer Inkorporation in den wachsenden Strang keine weitere Verlängerung mehr zulassen, führt zur Akkumulati on von Teilsträngen mit bekanntem, durch das jeweilige Abbruchnukleotid festgelegtem Ende. Das so erhaltene Gemisch unterschiedlich langer Stränge wird mittels Gel ektrophorese der Größe nach aufgetrennt. Aus den entstehenden Bandenmustern läßt sich die Nukleotidfolge des unbekannten Strangs ableiten. Ein großer Nachteil des genannten Verfahrens besteht im erforderlichen instrumentellen Aufwand, der den erreichbaren Durchsatz an Reaktionen begrenzt. Für jede Sequenzierungsreaktion ist, den Einsatz von mit vier unterschiedlichen Fluorophoren markierten Abbruchnukleotiden vorausgesetzt, mindestens eine Spur auf einem Flachgel oder, beim Einsatz von Kapillarelektrophorese, mindestens eine Kapillare erforderlich. Der hierdurch entstehende Aufwand begrenzt auf den derzeit modernsten kommerziell erhältlichen Sequenzierautomaten die Zahl an parallel prozessierbaren Sequenzierungen auf maximal 96. Ein weiterer Nachteil besteht in der Begrenzung der Leselänge", also der Zahl der richtig identifizierbaren Basen pro Sequenzierung, durch die Auflösung des Gelsystems. Ein alternatives Verfahren zur Sequenzie rung, die Sequenzbestimmung über Massenspektrometrie, ist schneller und erlaubt daher die Prozessierung von mehr Proben in der gleichen Zeit, ist andererseits aber auf verhält nismäßig kleine DNA-Moleküle (beispielsweise 40-50 Basen) beschränkt. Bei noch einer anderen Sequenzierungstechnik, Sequenzierung durch Hybridisierung (SBH, Sequencing By Hybridization; vgl. Drmanac et al., Science 260 (1993), 1649-1652), werden Basenfol gen durch die spezifische Hybridisierung unbekannter Proben mit bekannten Oligonukleo tiden identifiziert. Besagte bekannte Oligonukleotide werden hierzu in einer komplexen Anordnung auf einem Träger fixiert, eine Hybridisierung mit der markierten, zu sequenzie renden Nukleinsäure wird vorgenommen, und die hybridisierenden Oligonukleotide wer den ermittelt. Aus der Information darüber, welche Oligonukleotide mit der unbekannten Nukleinsäure hybridisiert haben, und aus ihrer Sequenz läßt sich dann die Sequenz der unbekannten Nukleinsäure ermitteln. Ein Nachteil des SBH-Verfahrens ist die Tatsache, daß sich die optimalen Hybridisierungsbedingungen für Oligonukleotide nicht exakt vor hersagen lassen und sich dementsprechend kein großer Satz an Oligonukleotiden entwerfen läßt, die einerseits alle bei ihrer gegebenen Länge möglichen Sequenzvariationen enthalten und andererseits exakt die gleichen Hybridisierungsbedingungen benötigen. Somit kommt es durch unspezifische Hybridisierung zu Fehlern in der Sequenz-Bestimmung. Außerdem kann das SBH-Verfahren nicht für repetitive Regionen zu sequenzierender Nukleinsäuren eingesetzt werden.

Neben der Analyse der Expressionsstärke bekannter Gene, wie sie durch Dot Blot- Hybridisierung, Northern-Hybridisierung und quantitative PCR möglich ist, sind auch Ver fahren bekannt, welche die de novo-Identifikation unbekannter zwischen verschiedenen biologischen Proben differentiell exprimierter Gene ermöglichen.

Eine solche Strategie zur Expressionsanalyse besteht in der Quantifizierung diskreter Se quenzeinheiten. Diese Sequenzeinheiten können in sog. ESTs (Expressed Sequence Tags) bestehen. Werden hinreichende Zahlen von Klonen aus cDNA-Banken, die von miteinan der zu vergleichenden Proben stammen, sequenziert, können jeweils identische Sequenzen erkannt und gezählt werden und die erhaltenen relativen Häufigkeiten dieser Sequenzen in den verschiedenen Proben miteinander verglichen werden (vgl. Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (1995), 8303-8307). Unterschiedliche relative Häufigkeiten einer bestimmten Sequenz zeigen differentielle Expression des entsprechenden Transkripts an. Allerdings ist das beschriebene Verfahren sehr aufwendig, da bereits für die Quantifizie rung der häufigeren Transkripte die Sequenzierung vieler tausend Klone erforderlich ist. Andererseits ist für die eindeutige Identifikation eines Transkripts in der Regel lediglich ein kurzer Sequenzabschnitt von ca. 13-20 Basenpaaren Länge erforderlich. Diese Tatsa che wird vom Verfahren des "Serial Analysis of Gene Expression" (SAGE) ausgenutzt (Velculescu et al, Science 270 (1995), 484-487). Hier werden kurze Sequenzabschnitte ("Tags") konkateniert, kloniert, und die resultierenden Klone werden sequenziert. Mit ei ner einzelnen Sequenzreaktion lassen sich auf diese Weise etwa 20 Tags bestimmen. Den noch ist diese Technik noch nicht sehr leistungsfähig, da bereits für die Quantifizierung der häufigeren Transkripte sehr viele konventionelle Sequenzreaktionen durchgeführt und analysiert werden müssen. Aufgrund des hohen Aufwands ist eine verläßliche Quantifizie rung seltener Transkripte mittels SAGE nur sehr schwer möglich.

Ein weiteres Verfahren zur Sequenzierung von Tags nach der US-A 5 695 934 besteht darin, kleine Kugeln mit zu sequenzierender Nukleinsäure auf eine solche Weise zu be schichten, daß jede Kugel zahlreiche Moleküle lediglich einer Nukleinsäurespezies erhält. Zur Sequenzierung wird dann das Verfahren des "stepwise ligation and cleavage" einge setzt, bei dem von einem artifiziellen Linker aus die zu sequenzierende Nukleinsäure durch Einsatz eines Typ IIS-Restriktionsenzyms basenweise abgebaut und dabei ihre Sequenz bestimmt wird. Damit eine Beobachtung und Aufzeichnung des Sequenziervorgangs mög lich ist, werden die verwendeten Kugeln in eine flachen Küvette eingebracht, die nur we nig höher ist als dem Kugeldurchmesser entspricht, um die Bildung einer einzelnen Lage zu erlauben. Weiterhin müssen die Kugeln in dichtester Packung in der Küvette vorliegen, damit es während des Sequenziervorgangs weder durch den erforderlichen Austausch der Reaktionslösungen noch durch Erschütterungen des Geräts zu einer Veränderung der Ku gelanordnung kommt. Obschon sich auf diese Weise viele Sequenzierreaktionen auf klei nem Raum durchführen lassen, hat die Anordnung in einer sehr engen Küvette (wenige Mikrometer Höhe) erhebliche Nachteile, da eine gleichmäßige Befüllung der Küvette schwer zu erreichen ist. Ein weiterer Nachteil besteht im hohen apparativen Aufwand des Verfahrens. So muß beispielsweise mit hohen Drücken gearbeitet werden, damit trotz der kleinen Küvettengröße ein effizienter Austausch der notwendigen Reaktionslösungen möglich ist. Noch ein weiterer Nachteil besteht im leichten Verstopfen der Küvette, wel ches ebenfalls durch die notwendigerweise geringen Maße der Küvette begünstigt wird.

Die bekannten Verfahren zur Nukleinsäureseanalytik weisen einen oder mehrere der fol genden Nachteile auf:

- Sie ermöglichen nur in stark eingeschränkten Umfang die parallelisierte Durchführung von einzelnen Sequenzierungsreaktionen.
- Sie benötigen relativ große Mengen der Nukleinsäure, deren Sequenz bestimmt werden soll.
- Sie sind nur zur Sequenzbestimmung kurzen Sequenzabschnitten geeignet und appara tiv aufwendig.

Es ist Aufgabe der Erfindung ein Verfahren bereitzustellen, das die Nachteile des Standes der Technik überwindet.

Die erfindungsgemäße Aufgabe wird durch ein Verfahren zur parallelen Sequenzierung von mindestens zwei verschiedenen in einem Nukleinsäuregemisch enthaltenen Nuklein säuren gelöst, wobei

a) eine Oberfläche bereitgestellt wird, aufweisend Inseln von Nukleinsäuren jeweils gleicher Sorte, tertiäre Nukleinsäuren;
b) Gegenstränge der tertiären Nukleinsäuren, GTN, bereitgestellt werden;
c) die GTN um ein Nukleotid verlängert werden, wobei
- - das Nukleotid an der 2'-OH-Position oder an der 3'-OH-Position eine Schutz gruppe trägt, die eine weitere Verlängerung verhindert,
- - das Nukleotid eine Molekülgruppe trägt, die die Identifikation des Nukleotids ermöglicht;
d) das eingebaute Nukleotid identifiziert wird;
e) die Schutzgruppe entfernt wird und die zur Identifikation verwendete Molekül gruppe des eingebauten Nukleotids entfernt oder verändert wird, und
f) Schritt (c) und nachfolgende Schritte solange wiederholt werden, bis die ge wünschte Sequenzinformation erhalten worden ist.

Eine spezielle Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens stellt das nachfolgen de dar, bei dem im Schritt (a)

1. eine Oberfläche bereitgestellt wird, an welche mindestens Primermoleküle eines ersten Primers und eines zweiten Primers und gegebenenfalls ein Nu kleinsäuregemisch umfassend die Nukleinsäuremoleküle, mit welchen beide Primer hybridisieren können, irreversibel immobilisiert worden sind, wobei beide Primer ein Primerpaar bilden;
2. Nukleinsäuremoleküle des Nukleinsäuregemischs mit einem oder mit bei den Primern desselben Primerpaares hybridisiert werden;
3. die irreversibel immobilisierten Primermoleküle komplementär zum Ge genstrang unter Bildung von sekundären Nukleinsäuren verlängert werden;
4. die Oberfläche in einer von Nukleinäuremolekülen, die nicht durch irrever sible Immobilisierung an die Oberfläche gebundenen sind, befreiten Form bereitgestellt wird;
5. die sekundären Nukleinsäuren unter Bildung von tertiären Nukleinsäuren amplifiziert werden.

Tertiäre Nukleinsäuren nach Maßgabe des Schritts (a) können bereitgestellt werden, indem man von einer Oberfläche ausgeht, an welche mindestens ein erster Primer und ein zweiter Primer und gegebenenfalls ein Nukleinsäuregemisch umfassend die Nukleinsäuremolekü le, mit welchen beide Primer hybridisieren können, irreversibel immobilisiert worden sind. Beide Primer bilden ein Primerpaar, können also an Strang bzw. Gegenstrang der Nuklein säuremoleküle binden. Wenn die Nukleinsäuremoleküle des Nukleinsäuregemischs an der Oberfläche bereits gebunden sind, dann kann die Hybridisierung in Schritt (a2) durch blo ßes Erhitzen und Abkühlen bewirkt werden. Andernfalls müssen die Nukleinsäuremole küle des Nukleinsäuregemischs in Schritt (a2) mit der Oberfläche in Kontakt gebracht werden. In diesem Zusammenhang wird auch auf die WO 00/18957 verwiesen. Eine spezielle Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens stellt das nachfolgen de dar, bei dem im Schritt (a1) eine Oberfläche, an welche mindestens ein Primerpaar bildende Primermo leküle irreversibel immobilisiert wurden, bereitgestellt wird.

Die einzelnen durchzuführenden Arbeitsschritte lassen sich bei dieser Ausführungsform auch wie folgt wiedergeben:

- Primermoleküle, die mindestens ein Primerpaar bilden, werden an eine Oberfläche ir reversibel immobilisiert;
- Nukleinsäuremoleküle werden mit einem oder mit beiden Primern desselben Primer paares hybridisiert, indem man das Nukleinsäuregemisch mit der Oberfläche in Kon takt bringt;
- die irreversibel immobilisierten Primermoleküle werden komplementär zum Ge genstrang unter Bildung von sekundären Nukleinsäuren verlängert;
- die nicht durch irreversible Immobilisierung an die Oberfläche gebundenen Nukleinäu remoleküle werden von der Oberfläche entfernt;
- die sekundären Nukleinsäuren werden unter Bildung von tertiären Nukleinsäuren am plifiziert;
- Gegenstränge der tertiären Nukleinsäuren, GTN, werden bereitgestellt;
- die GTN werden um ein Nukleotid verlängert, wobei
- das Nukleotid an der 2'-OH-Position oder an der 3'-OH-Position eine Schutzgruppe trägt, die eine weitere Verlängerung verhindert,
- das Nukleotid trägt eine Molekülgruppe, die die Identifikation des Nukleotids ermög licht;
- das eingebaute Nukleotid wird identifiziert;
- die Schutzgruppe wird entfernt und die zur Identifikation verwendete Molekülgruppe des eingebauten Nukleotids wird entfernt oder verändert, und
- der 7. Schritt und die nachfolgende Schritte werden solange wiederholt, bis die ge wünschte Sequenzinformation erhalten worden ist.

Bei dem Nukleinsäuregemisch des Schritts (a2) kann es sich zum Beispiel um eine Bi bliothek handeln, also um Nukleinsäuremoleküle, die über weite Strecken eine identische Sequenz aufweisen, sich aber in einem Teilbereich inmitten der identischen Bereiche stark unterscheiden. Häufig bestehen die Bibliotheken aus gegebenenfalls linearisierten Plasmi den, in welche verschiedene Nukleinsäurefragmente einkloniert wurden, die später sequen ziert werden sollen. Ferner kann es sich bei dem Nukleinsäuregemisch um Restriktions fragmente handeln, an deren Schnittenden Linkermoleküle gleicher Sequenz ligiert wur den. Hierbei unterscheiden sich in der Regel die Linker, die an das 5'-Ende der Fragmente gebunden werden von den Linkern, die an das 3'-Ende der Fragmente gebunden werden. Jedenfalls ist in der Regel der interessierende Sequenzabschnitt in den Nukleinsäuremole külen des Nukleinsäuregemischs von zwei flankierenden im wesentlichen bei allen Nu kleinsäuremolekülen jeweils identischen Sequenzabschnitten umgeben, von denen minde stens einer der beiden Sequenzabschnitte bevorzugt eine selbstkomplementäre Sequenz aufweist. Der betreffende Sequenzabschnitt besitzt in einzelsträngiger Form eine ausge prägte Neigung zur Ausbildung einer sogenannten Hairpinstruktur.

Die Primer oder die Primermoleküle in Schritt (a1 bis a3) sind einzelsträngige Nukleinsäu remoleküle einer Länge von etwa 12 bis etwa 60 Nukleotidbausteinen und mehr, die sich im weitesten Sinne für die Verwendung im Rahmen der PCR eignen. Es handelt sich um RNA-Moleküle, DNA-Moleküle oder deren Analoga, die zur Hybridisierung mit einer zumindest über einen Teilbereich komplementären Nukleinsäure bestimmt sind und als Hybrid mit der Nukleinsäure ein Substrat für eine Dopplestrang-spezifische Polymerase darstellen. Bei der Polymerase handelt es sich vorzugsweise um DNA Polymerase I, T7- DNA-Polymerase, das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, um Polymerasen, die bei der PCR Anwendung finden, oder auch um eine Reverse Transkriptase.

Das Primerpaar in Schritt (a2) stellt einen Satz von zwei Primern dar, die an Bereiche einer Nukleinsäure binden, die die zu amplifizierende Zielsequenz der Nukleinsäure flankieren. Bei diesen Bereichen handelt es sich bevorzugt um Sequenzabschnitte, die bei den Nukleinsäuremolekülen des Nukleinsäuregemisches identisch sind. Zum Beispiel kann es sich bei dem Nukleinsäuregemisch um eine Plasmid-Bibliothek handeln. Die Primer würden dann bevorzugt in dem Bereich der sogenannten Multiple Cloning Site (MCS) binden, und zwar einmal oberhalb und einmal unterhalb der Klonierungsstelle. Ferner könnten die Pri mer an die Sequenzabschnitte binden, die den Linkem entsprechen, die, wie oben be schrieben, an Restriktionsfragmente beidseitig ligiert wurden. Das erfindungsgemäße Ver fahren wird bevorzugt mit nur einem Primerpaar durchgeführt, etwa wie das in der US-A 5 641 658 (WO 96/04404) beschriebene Verfahren, in dem auch nur ein Primerpaar einge setzt wird. Erfindungsgemäß bevorzugt binden die Primer des Primerpaars oder oder der Primerpaare an Sequenzbereiche, die bei allen oder bei fast allen Nukleinsäuren des Nu kleinsäuregemischs im wesentlichen identisch sind (sogenannte konservierte Bereiche). Die Primer eines Primerpaars können im übrigen auch dieselbe Sequenz aufweisen. Dies kann dann von Vorteil sein, wenn die konservierten Bereiche, die die zu amplifizierende Sequenz flankieren, Sequenzen aufweisen, die zu einander komplementär sind.

Einer der Primer eines Primerpaars kann eine Sequenz, die die Ausbildung einer intramo lekularen Nukleinsäuredoppelhelix (einer sogenannten Hairpinstruktur) ermöglicht, auf weisen, wobei allerdings ein aus mindestens 13 Nukleotidbausteinen bestehender Bereich des 3'-Terminus ungepaart bleibt.

Bei der Oberfläche in Schritt (a, a1 und a2, a4) handelt es sich um die zugängliche Fläche eines Körpers aus Kunststoff, Metall, Glas, Silicium oder ähnlich geeigneten Werkstoffen. Vorzugsweise ist diese flach, insbesondere plan ausgestaltet. Die Oberfläche kann eine quellbare Schicht aufweisen, zum Beispiel aus Polysacchariden, Polyzuckeralkoholen oder quellbaren Silikaten.

Irreversible Immobilisierung meint das Ausbilden von Wechselwirkungen mit der oben beschriebenen Oberfläche, die bei 95°C und der üblichen Ionenstärke bei den PCR- Amplifikationen des Schritts (a5) im Stundenmaßstab stabil sind. Bevorzugterweise han delt es sich dabei um kovalente Bindungen, die auch spaltbar sein können. Bevorzugt wer den die Primermoleküle in Schritt (a) über die 5'-Termini irreversibel an der Oberfläche immobilisiert. Alternativ kann eine Immobilisierung auch über ein oder mehrere Nukleo tidbausteine, die zwischen den Termini des betreffenden Primermoleküls liegen, immobili siert werden, wobei allerdings ein Sequenzabschnitt von mindestens 13 Nukleotidbaustei nen gerechnet von dem 3'-Terminus ungebunden bleiben muß. Bevorzugt erfolgt die Im mobilisierung durch Ausbildung kovalenter Bindungen. Hierbei ist natürlich auf eine ent sprechende Belegungsdichte zu achten, die die Kontaktaufnahme der an der Polymerasekettenreaktion beteiligten Primer und Nukleinsäuren ermöglicht. Werden zwei Primer immobilisiert, so sollten die Primer einen mittleren Abstand auf der Oberfläche haben, der zumindest größenordnungsmäßig mit der maximalen Länge bei vollständiger Streckung der zu amplifizierenden Nukleinsäuremoleküle übereinstimmt oder aber kleiner ist. Hierbei ist im wesentlichen zu verfahren, wie in US-A 5 641 658 oder WO 96/04404 beschrieben.

Aus dem Stand der Technik sind Verfahren bekannt, chemisch geeignet derivatisierte Oli gonukleotide an Glasoberflächen zu binden. Besonders geeignet sind hierzu beispielsweise endständige, über einen mehratomigen Spacer an das 5'-Ende des Oligonukleotids gebun dene primäre Aminogruppen ("Aminolink"), welche leicht im Zuge der Oligonukleo tidsynthese inkorporiert werden können und gut mit Isothiocyanat-modifizierten Oberflä chen reagieren können. Beispielsweise beschreiben Guo et al, (Nucleic Acids Res. 22 (1994), 5456-5465) ein Verfahren, Glasoberflächen mit Aminosilan und Phenylendii sothiocyanat zu aktivieren und anschließend 5'-aminomodifizierte Oligonukleotide hieran zu binden. Besonders geeignet ist die Carbodiimid-vermittelte Bindung 5'-phosphorylierter Oligonukleotide an aktivierte Polystyrolträger (Rasmussen et al., Anal. Biochem 198 (1991), 138-142). Ein anderes bekanntes Verfahren nutzt die hohe Affinität von Gold für Thiolgruppen zur Bindung von Thiol-modifizierten Oligonukleotiden an Goldoberflächen aus (Hegner et al, FEBS Lett 336 (1993), 452-456).

Der Begriff sekundäre Nukleinsäure in Schritt (a3) bezeichnet diejenigen Nukleinsäure moleküle, die durch komplementäre Verlängerung von Primermolekülen entstehen, wobei die Verlängerung komplementär zu den Nukleinsäuremolekülen des Schritts (a2) erfolgt, die mit den Primern hybridisiert wurden.

Die Oberfläche wird in einer von Nukleinsäuremolekülen, die nicht durch irreversible Im mobilisierung an die Oberfläche gebundenen sind, befreiten Form bereitgestellt (a4). So fern die Nukleinsäuremoleküle aus Schritt (a1) in Schritt (a1) an die Oberfläche bereits irreversibel immobilisiert worden sind, werden in Schritt (a2) in der Regel keine Nuklein säuremoleküle mit der Oberfläche in Kontakt gebracht. Folglich müssen sie in den nach folgenden Schritten auch nicht entfernt werden. Wenn in Schritt (a2) Nukleinsäuremole küle zwecks Hybridisierung mit den Primern mit der Oberfläche in Kontakt gebracht wer den, etwa weil die Nukleinsäuremoleküle nicht schon in Schritt (a1) an die Oberfläche ir reversibel immobilisiert worden sind, dann können diese in Schritt (a4) durch Waschen entfernt werden. Es ist möglich, jedoch nicht bevorzugt, die Entfernung der vorgenannten Nukleinsäuremoleküle erst nach Durchlaufen eines oder mehrerer Amplifikationszyklen des Schritts (a5) vorzunehmen.

Der Begriff tertiäre Nukleinsäuren bezeichnet sekundäre Nukleinsäuren sowie diejenigen Nukleinsäuremoleküle, die aus den sekundären Nukleinsäuren nach dem Verfahren der Polymerasekettenreaktion im Schritt (a5) gebildet werden. Hierbei ist es wichtig, daß Oberfläche und der die Oberfläche umgebende flüssige Reaktionsraum frei von zu amplifi zierenden Nukleinsäuren ist, die nicht irreversibel an die Oberfläche immobilisiert sind. Durch die Amplifikation entstehen in der Regel regelrechte Inseln, das heißt diskrete Be reiche auf der Oberfläche, die tertiäre Nukleinsäuren der gleichen Sorte, das heißt identi sche oder hierzu komplementäre Nukleinsäuremoleküle, tragen.

In Schritt (b) werden Gegenstränge der tertiären Nukleinsäuren (GTN) bereitgestellt. Dies kann zum Beispiel durch eine von drei Maßnahmen geschehen, die im folgenden aufge führt werden:

- Zum einen können in Schritt (a1) Primermoleküle oder gegebenenfalls in Schritt (a1 oder a2) Nukleinsäuremoleküle (des Nukleinsäuregemischs) mit flankierenden Sequenzabschnitten verwendet werden, die selbstkomplementäre Bereiche aufwei sen und somit zur intramolekularen Basenpaarung in der Lage sind, was sich in ei ner sogenannten Hairpinstruktur äußert (siehe auch Fig. 3: Ligation von "maskier ten Hairpins" in Form doppelsträngiger Linkermoleküle). Die in Schritt (a5) gebil deten tertiären Nukleinsäuren weisen dann im einzelsträngigen Zustand, der durch Entfernung eines der beiden Stränge unter denaturierenden Bedingungen herbeige führt wird, in der Nähe ihres 3'-Terminus eine Rückfaltung in Form eines Hairpins auf. Bevorzugterweise reicht der doppelsträngige Anteil des Hairpins bis ein schließlich zur letzten Base des 3'-Endes, so daß besagter Hairpin unmittelbar als Substrat für eine zur Sequenzierung eingesetzte Polymerase dienen kann. Dies ist durch geeignete Wahl der Sequenz der Primermoleküle bzw. der die Nukleinsäu remoleküle flankierenden Sequenzabschnitte zu gewährleisten.
- Zweitens können GTN in Form von Hairpins durch Ligation von Oligonukleotiden bereitgestellt werden, die zur Hairpinbildung befähigt sind und gegebenenfalls be reits in Gestalt von Hairpins zur Ligation eingesetzt werden (siehe auch Fig. 2). Dies kann so geschehen, daß die tertiären Nukleinsäuren im doppelsträngigem (das heißt nicht denaturiertem) Zustand geschnitten und auf diese Weise einseitig von der Oberfläche abgetrennt werden. Bevorzugterweise geschieht dies durch Inkuba tion mit einer Restriktionsendonuklease, welche in genau einer der aus einem der beiden Primer stammenden Sequenzen (Primersequenzen) oder in einer an diese Primersequenzen angrenzenden Sequenzen eine Erkennungsstelle aufweist. Nach erfolgtem Restriktionsschnitt ragt dann ein freies Ende der tertiären Nukleinsäuren in den Lösungsraum, welches je nach verwendeter Restriktionsendonuklease ein überhängendes Ende voraussagbarer Sequenz besitzt und an welches das Oligonu kleotid hybridisiert und ligiert werden kann. Besonders geeignet wäre hierfür ein Oligonukleotid, welches bereits eine Hairpinstruktur ausgebildet hat, demnach also partiell doppelsträngig vorliegt, und einen zum freien Ende der tertiären Nuklein säuren komplementären Überhang besitzt. Um zu gewährleisten, daß eine Ligation ausschließlich an den irreversibel immobilisierten Strang des Doppelstrangs der tertiären Nukleinsäuren stattfindet, sollte das 5'-Ende des Oligonukleotids eine Phosphatgruppe tragen, während sich das 3'-Ende des irreversibel immobilisierten Strangs sowie das 5'-Ende des mit diesem hybridisierten Gegenstrangs eine OH- Gruppe aufweisen (siehe Fig. 2, Schritte 1 und 2). Nach erfolgter Ligation wird der nicht irreversibel immobilisierte Strang der tertiären Nukleinsäuren unter denaturie renden Bedingungen entfernt. Alternativ hierzu könnte auch, wie in der US-A 5 798 210 vorgeschlagen (siehe dort insbesondere Fig. 7), eine Ligation eines zum Hair pin rückgefalteten Oligonukleotids an den einzelsträngig vorliegenden immobili sierten Strang der tertiären Nukleinsäuren vorgenommen werden. Problematisch ist bei dieser zweiten Maßnahme, daß eine oft beobachtete unzureichende Effizienz des Ligationsschritts vor der Sequenzierung nicht mehr wie bei der ersten Maß nahme durch Amplifikationsschritte kompensiert werden kann. Dies kann dann eine zu geringe Signalstärke bei der nachfolgenden Sequenzierung zur Folge haben.
- Drittens ist es auch möglich, Oligonukleotide, die nicht zur Ausbildung einer Hair pinstruktur in der Lage sind, mit den tertiären Nukleinsäuren unter Ausbildung von GTN zu hybridisieren (vgl. US-A 5 798 210, Fig. 8). Diese Alternative käme jeden falls nur dann in Frage, wenn in Schritt (a5) Bedingungen gewählt werden, die nicht zur Denaturierung, das heißt nicht zur Aufschmelzung der Doppelstränge, be stehend aus ggf. verlängerten Oligonukleotiden und tertiären Nukleinsäuren, füh ren. Wird in Schritt (a5) unter denaturierenden Bedingungen gearbeitet (z. B. durch Einsatz stärkerer Basen), wird man vorzugsweise auf die anderen Maßnahmen zu rückgreifen.

Im Rahmen der beschriebenen Maßnahmen spielt die Länge der Oligonukleotide eine un tergeordnete Rolle. In der Regel werden die Oligonukleotide eine Länge von kleiner 100 oder von kleiner 50 Nukleotidbausteinen aufweisen, so daß man auch allgemein von Nu kleinsäuren (hier: polymere Nukleotide, die mehr als drei Nukleotidbausteine umfassen) sprechen kann. Einzelsträngige Oligonukleotide einer Länge von größer 45 Nukleotidbausteinen sind infolge unspezifischer Wechselwirkungen nur schwer handhabbar, wenn sie keine Sequenz aufweisen, die Hairpins ermöglicht. Durch die Fähigkeit, Hairpins auszu bilden, werden unspezifische Wechselwirkungen durch Kompetition vermindert. Werden doppelsträngige Oligonukleotide eingesetzt, dann spielt folglich die Länge der Oligonu kleotide kaum eine Rolle (siehe auch Fig. 3).

Alle vier Maßnahmen haben zur Folge, daß die tertiären Nukleinsäuren einen doppelsträn gigen Teilbereich aufweisen, der eine Strangverlängerung an den Gegensträngen der tertiä ren Nukleinsäuren (GTN) durch eine DNA-Polymerase oder Reverse Transkriptase er möglicht.

Bei dem Nukleotid, das in Schritt (c) komplementär zum Gegenstrang eingebaut wird, handelt es sich um ein entschützbares Abbruchnukleotid. Geeignete Abbruchnukleotide sind zum Beispiel aus US-A 5 798 210 bekannt. Canard und Sarfati (Gene 148 (1994) 1-6) beschreiben 3'-veresterte Nukleotide, welche ein zusammen mit der Schutzgruppe abspalt bares Fluorophor enthalten. Diese Nukleotidbausteine können mit allerdings niedriger Ef fizienz von verschiedenen Polymerasen in einen wachsenden Strang inkorporiert werden und wirken dann als Abbruchnukleotide, lassen also keine weitere Strangverlängerung zu. Die beschriebenen Ester lassen sich alkalisch oder enzymatisch abspalten, so daß freie, weitere Nukleotidinkorporation erlaubende 3'-OH-Gruppen entstehen. Die Esterspaltung erfolgt allerdings sehr langsam (innerhalb von 2 Stunden), so daß die beschriebenen Ver bindungen für eine Sequenzierung längerer DNA-Abschnitte (z. B. mehr als 20 Basen) un geeignet sind. Solange die Schutzgruppe in 3'-OH oder gegebenenfalls 2'-OH-Position (siehe unten) gebunden ist, stellt die um dieses Nukleotid verlängerte quartäre Nukleinsäu re kein Substrat mehr für eine Nukleinsäurepolymerase dar. Erst die Entfernung der Schutzgruppe in Schritt (e) macht eine weitere Verlängerung der quartären Nukleinsäure möglich. Die Schutzgruppe trägt außerdem in der Regel eine Molekülgruppe, die die Iden tifikation des eingebauten Nukleotids und so die Sequenzierung des wachsenden Nuklein säurestranges ermöglicht und das Nukleotid mit der Abspaltung der Schutzgruppe verläßt. Allerdings kann die identifizierende Molekülgruppe auch an einer anderen Stelle des Nu kleotids, zum Beipiel an der Base, gebunden sein. In diesem Fall ist es notwendig, nach Schritt (d) in Schritt (e) das Signal der identifizierenden Molekülgruppe zu löschen. Dies kann in der Regel auf zwei Arten erfolgen. Zum Beispiel im Falle eines Fluorophors kann die Molekülgruppe durch Ausbleichen verändern werden. Daneben kann die identifizie rende Molekülgruppe auch entfernt werden, zum Beispiel durch photochemische Spaltung einer photolabilen Bindung.

Ist die identifizierende Molekülgruppe nicht mit der Schutzgruppe verbunden und wird die identifizierende Molekülgruppe zur Signallöschung abgespalten, so ist die Bindung von Schutzgruppe an das Nukleotid und die Bindung von der identifizierenden Molekülgrup pe an das Nukleotid vorzugsweise so zu wählen, daß beide Gruppen in einem Reaktions schritt abgespalten werden können.

Bevorzugt trägt jeder der für den Einbau in Frage kommenden vier Nukleotidbausteine (G, A, T, C) eine andere identifizierende Molekülgruppe. In diesem Fall können die vier Sor ten Nukleotide in Schritt (c) gleichzeitig angeboten werden. Tragen verschiedene oder so gar alle Nukleotide dieselbe identifizierende Molekülgruppe, so ist Schritt (c) in in der Re gel vier Teilschritte zu zerlegen, in welchen die Nukleotide einer Sorte (G, A, T, C) ge trennt angeboten werden.

Bei der Molekülgruppe handelt es sich zum Beispiel um einen Fluorophor oder um einen Chromophor. Letzterer könnte sein Absorptionsmaximum im sichtbaren oder im infraroten Frequenzbereich haben. Die in Schritt (d) erfolgende Detektion erfolgt sowohl orts- als auch zeitaufgelöst, so daß die auf der Oberfläche befindlichen Inseln quartärer Nukleinsäu ren parallel sequenziert werden können.

Als Schutzgruppe des Nukleotids in Schritt (c) ist ein chemischer Substituent zu verstehen, welcher die weitere Strangverlängerung nach Einbau des Nukleotids an dessen 3'-Position verhindert. Dabei kann die Schutzgruppe die zu schützende 3'-Position besetzen, also mit dem C-3 der Ribose verbunden sein oder die zu schützende 3'-Position abschirmen und so die Srangverlängerung sterisch behindern. Im letzteren Fall würde die Schutzgruppe in benachbarter Position, insbesondere am C-2 der Ribose mit dem Nukleotid verbunden werden.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in Schritt (a1) Primer oder Nukleinsäuremoleküle mit flankierenden Sequenzabschnitten verwendet, die selbstkomplementäre Bereiche aufweisen.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in Schritt (b) die tertiären Nukleinsäuren durch eine Restriktionsendonuklase restringiert, bevor an die auf diese Weise generierten Enden Oligonukleotide, die zur Ausbildung einer Hairpin struktur fähig sind, ligiert werden. Es wird auf die Erläuterungen zu Schritt (b), Maßnah me 2 auf Seite 13 verwiesen, insbesondere auf die Erklärung des Begriffs Oligonukleotid.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die zur Aus bildung einer Hairpinstruktur befähigten Oligonukleotide einzelsträngig. Einzelsträngig meint hier nicht durchgängig doppelsträngig. Die Oligonukleotide liegen also nicht als Heterodimer vor. Dies ist zum Beispiel bei Fig. 2 der Fall.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die zur Aus bildung einer Hairpinstruktur befähigten Oligonukleotide doppelsträngig. Die Oligonu kleotide liegen also als Heterodimer vor. Dies ist zum Beispiel bei Fig. 3 der Fall.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in Schritt (b) einzelsträngige Oligonukleotide, die zur Ausbildung einer Hairpinstruktur fähig sind, an tertiäre Nukleinsäuren hybridisiert, bevor tertiäre Nukleinsäuren und vorgenannte ein zelstängige Oligonukleotide ligiert werden. Dies ist zum Beispiel bei Fig. 2 der Fall.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in Schritt (a, a1) die Primermoleküle durch Ausbildung einer kovalenten Bindung an eine Oberfläche irreversibel immobilisiert.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens trägt in Schritt (c) die Base die Molekülgruppe, die die Identifikation des Nukleotids ermöglicht.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens trägt in Schritt (c) das Nukleotid an der 3'-OH-Position die Schutzgruppe.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens weist die Schutz gruppe eine spaltbare Ester-, Ether-, Anhydrid- oder Peroxid-Gruppe auf.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Schutzgrup pe über eine Sauerstoff-Metall-Bindung mit dem Nukleotid verbunden.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt in Schritt (e) die Entfernung der Schutzgruppe durch ein komplexbildendes Ion, vorzugsweise durch Cyanid, Thiocyant oder Fluorid oder Ethylendiamintetraacetat.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens weist die Schutz gruppe in Schritt (c) einen Fluorophor auf und in Schritt (c) wird das Nukleotid fluorome trisch identifiziert.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in Schritt (e) die Schutzgruppe photochemisch abgespalten.

Die Erfindung wird durch die Zeichnung näher beschrieben, wobei die Zeichenblätter mit fortlaufenden Ziffern versehen sind (1/10 bis 10/10).

Es zeigt

Fig. 1 die Amplifikation einzelner Nukleinsäuremoleküle mittels Oberflächen- gebundener Primer zu Inseln aus jeweils identischen amplifizierten Nukleinsäu remolekülen;

Fig. 2 die Sequenzierung Oberflächen-gebundener Amplifikationsprodukte [Fig. 2 um faßt zwei Zeichenblätter (2/10, 3/10), die Fig. 2 ergeben, indem man sie mit ihrer längeren Seite aneinander legt. Dabei liegt das Blatt mit der niedrigeren fortlau fenden Ziffer (2/10) oben];

Fig. 3 die Bereitstellung eines GTN durch Ausbildung einer Hairpinstruktur in Sequenz abschnitten, die Linker entstammen [Fig. 3 umfaßt zwei Zeichenblätter (4/10, 5/10), die Fig. 3 ergeben, indem man sie mit ihrer längeren Seite aneinander legt. Dabei liegt das Blatt mit der niedrigeren fortlaufenden Ziffer (4/10) oben];

Fig. 4 die Parallele Sequenzierung an einer Oberfläche;

Fig. 5 die Assemblierung der Detektions- und Identifikationsergebnisse zu zusammen hängenden Sequenzen;

Fig. 6 die Bereitstellung primärer Nukleinsäuren zur Anwendung in der Expressions analyse;

Fig. 7 die Bereitstellung primärer Nukleinsäuren zur Sequenzierung genomischer Klone,

Fig. 8 das Ergebnis der Amplikation einzelner Nukleinsäuremoleküle gemäß Fig. 1

Fig. 1 zeigt die Amplifikation einzelner Nukleinsäuremoleküle mittels Oberflächen- gebundener Primer zu Inseln aus jeweils identischen amplifizierten Nukleinsäuremolekü len, wobei im einzelnen

1. die irreversible Immobilisierung von ein Primerpaar bildenden Oligonukleoti den,
2. die Hybridisierung der primären Nukleinsäuren mit den Oberflächen- gebundenen Primern,
3. die Bildung sekundärer Nukleinsäuren durch Strangverlängerung der Primer,
4. die Entfernung der nicht irreversibel gebundenen primären Nukleinsäuremo leküle und Amplifikation der sekundären Nukleinsäuren,
5. Inseln mit jeweils identischen tertiäreren Nukleinsäuremoleküle bezeichnet.

Fig. 2 veranschaulicht die Sequenzierung Oberflächen-gebundener Amplifikationspro dukte, wobei

1. das Lösen der Amplifikationsprodukte durch Restriktionsdau der Amplifikati onsprodukte (Unterstrichen: die Erkennungsstelle für die Restriktionsendonu klease SphI) (SEQ ID NO: 4);
2. die Dephosphorylierung;
3. die Ligation eines Hairpin-Oligonukleotids (fett)
4. die Entfernung des nicht irreversibel immobilisierten Nukleinsäurestrangs (SEQ ID NO: 6);
5. den Einbau und Identifikation eines ersten geschützten Nukleotids;
6. die Entfernung von Schutzgruppe und Markierungsgruppe unter Wiederher stellung einer freien 3'-OH-Gruppe;
7. den Einbau und Identifikation eines zweiten geschützten Nukleotids;
8. die Wiederholung der Schritte 5 und 6 zeigt.

Fig. 3 zeigt die Bereitstellung eines GTN durch Ausbildung einer Hairpinstruktur in Se quenzabschnitten die Linker entstammen. Die zu sequenzierende Nukleinsäure (Restrikti onsfragment mit zwei unterschiedlichen Enden, eines hiervon durch die Restriktionsendo nuklease NlaIII erzeugt) ist grau hinterlegt. CATG, durch Restriktionsendonuklease NlaIII generierter Überhang; GCATGC, Erkennungsstelle für Restriktionsendonuklease SphI (enthält die Erkennungsstelle für NlaIII, CATG); NNNNNNNNNN und MMMMMMMMMM, "inverted repeats" (zueinander komplementäre Sequenzen, die in tramolekulare Rückfaltung eines Einzelstrangs erlauben); XXXXX und YYYYY, Spacer region zur Oberfläche. Im einzelnen beschreibt

1. die Ligation eines Linkers mit "inverted repeat" und SphI-Schnittstelle an zu sequenzierendes Fragment;
2. die Denaturierung und Hybridisierung mit an einer Oberfläche immobilisier tem Primer;
3. die Amplifikation mit zwei an Oberfläche immobilisierten Primern (Gegen primer nicht gezeigt);
4. das "halbseitige Lösen" der Amplifikationsprodukte von der Oberfläche durch Restriktionsendonuklease SphI (Pfeile);
5. die Denaturierung und Entfernung des nicht an der Oberfläche immobilisier ten Strangs;
6. die Renaturierung unter Ausbildung eines Hairpins, Beginn der Sequenzierung durch Inkorporation entschützbarer Abbruchnukleotide.

Fig. 3 zeigt eine bevorzugte Vorgehensweise zur Bereitstellung von als Sequenzierprimer dienenden Gegensträngen der tertiären Nukleinsäuren, GTN, indem die durch Behandlung mit einer ersten Restriktionsendonuklease (in Fig. 3 etwa die Erkennungssequenz CATG aufweisend) mit überhängenden Enden ausgestatteten Nukleinsäuremoleküle zunächst über eine Ligation mit flankierenden Sequenzabschnitten in Form doppelsträngiger Linkermo leküle versehen werden, welche erstens selbstkomplementäre Bereiche umfassen und zweitens distal an diese angrenzend eine Erkennungssequenz bzw. Schnittstelle für eine zweite Restriktionsendonuklease aufweisen. Bevorzugterweise handelt es sich hierbei wie in Fig. 3 gezeigt um eine Schnittstelle, deren innere Basen auf dem selben Strang identisch mit den Basen des besagten Überhangs sind (in Fig. 3 die Basenfolge CATG), mindestens eine der äußeren Basen jedoch sich von der entsprechenden, besagte Überhangsequenz vor oder nach Ligation flankierenden Base unterscheidet. Beispielsweise ist in Fig. 3 gezeigt, daß der zur Ligation verwandte Überhang "CATG" nach der Ligation an seinem 3'-Ende von der Base "T" flankiert wird. Wird nun nach erfolgter Amplifikation der Nukleinsäu remoleküle in Schritt (a5) mittels eines Primerpaars, von dem ein Primer mit einem Strang besagter Linkermoleküle hybridisieren kann, mit einer zweiten Restriktionsendonuklease geschnitten, welche beispielsweise die Erkennungssequenz "GCAGTC" besitzt, und wurde diese Erkennungssequenz in besagten flankierenden Sequenzabschnitten (also als Teilse quenz der angefügten Linker) bereitgestellt, so erfolgt ein Schnitt innerhalb der bereitge stellten Sequenzabschnitte. Nach erfolgter Entfernung des dann nicht mehr irreversibel an die Oberfläche gebundenen Strangs kann der 3'-Terminus des immobilisiert bleibenden Strangs intramolekular zu einem Hairpin rückfalten. Dabei ist bevorzugt, daß, wie in Fig. 3 gezeigt, die Erkennungssequenz besagter ersten und zweiten Restriktionsendonuklease unmittelbar an die eingeführten selbstkomplementären Bereiche grenzen, so daß diese Be reiche durch besagte Ligation um die beiden besagten Erkennungsstellen gemeinsamen Basen verlängert werden. Hierbei weisen die verlängerten selbstkomplementären Bereiche dort eine Fehlpaarung auf, wo sich nach der Ligation die die Überhang-Sequenz flankie rende Base (bzw. Basen) von der Erkennungssequenz der zweiten Restriktionsendonu klease unterscheidet bzw. unterscheiden (in Fig. 3 eine G/T-Fehlpaarung). Gleichzeitig gewährleistet die hier beschriebene Vorgehensweise, in der die Erkennungsstelle der ersten Restriktionsendonuklease Bestandteil der längeren Erkennungsstelle der zweiten Restrikti onsendonuklease ist, daß die tertiären Nukleinsäuremoleküle bei der Inkubation mit der zweiten Restriktionsendonuklease keine internen Erkennungsstellen für die zweite Re striktionsendonuklease haben können, sondern lediglich exakt einmal im Bereich der flan kierenden Sequenzen geschnitten werden.

Fig. 4 beschreibt die parallele Sequenzierung an einer Oberfläche. "Inseln" identischer Nukleinsäuremoleküle sind in dieser Figur vereinfacht durch einen einzigen Strang sym bolisiert. Im einzelnen zeigt

1. die Befestigung eines Sequenzierprimers, Einbau des ersten Abbruchnukleo tids und parallele Detektion und Identifikation des jeweils ersten Nukleotid bausteins,
2. die Entfernung von Schutzgruppe und Markierungsgruppe des ersten Nukleo tids, Einbau des zweiten Abbruchnukleotids und parallele Detektion und Identifikation des jeweils zweiten Nukleotidbausteins;
3. das Detektions- und Identifikationsergebnis der ersten Base;
4. das Detektions- und Identifikationsergebnis der zweiten Base.

Fig. 5 beschreibt die Assemblierung der Detektions- und Identifikationsergebnisse zu zu sammenhängenden Sequenzen, wobei

1. die Detektions- und Identifikationsergebnis der ersten Base,
2. die Detektions- und Identifikationsergebnis der zweiten Base,
3. die Detektions- und Identifikationsergebnis der n-ten Base,
4. die assemblierten Sequenzen der Nukleinsäuremoleküle in einzelnen Inseln bezeichnet.

Fig. 6 zeigt die Bereitstellung primärer Nukleinsäuren zur Anwendung in der Expressionsanalyse, wobei im einzelnen

1. die cDNA-Synthese mit biotinyliertem Primer, Bindung der doppelsträngigen cDNA an Streptavidin-beschichtete Oberfläche;
2. den Restriktionsschnitt mit dem ersten Enzym (RE1), Fortwaschen der freige setzten Fragmente, und den zweiter Restriktionsschnitt mit dem zweiten En zym (RE2);
3. die Ligation zweier verschiedener Linker;
4. mRNA;
5. doppelsträngige an Festphase immobilisierte cDNA;
6. ein cDNA-Fragment, das von zwei verschiedenen "überhängenden" Enden flankiert wird,
7. ein von zwei verschiedenen Linkem (L1, L2) flankiertes cDNA-Fragment zeigt.

Fig. 7 zeigt die Bereitstellung primärer Nukleinsäuren zur Sequenzierung genomischer Klone, wobei im einzelnen

1. einen Restriktionsschnitt eines genomischen Klons parallel mit jeweils zwei verschiedenen Restriktionsendonukleasen (RE1-4), Ligation verschiedener Linker (L1-4);
2. einen genomischen Klon;
3. zwei überlappende Sätze mit Linkem ligierter Fragmente bezeichnet.

Symmetrisch von identischen Linkem flankierte Fragmente (durchgestrichen) lassen sich nicht sequenzieren.

Fig. 8 zeigt das Ergebnis der Amplifikation einzelner Nukleinsäuremoleküle mittels Ober flächengebundener Primer zu Inseln aus jeweils identischen amplifizierten Nukleinsäure molekülen, visualisiert durch Anfärbung mit SYBR Green I.

Die Erfindung wird im folgenden durch die Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1 Vorbereitung von Nukleinsäuremolekülen

4 µg Gesamt-RNA aus Rattenleber wurde mit Ethanol gefällt und in 15,5 µl Wasser gelöst. Es wurden 0,5 µl 10 cDNA-Primer CP28V (5'- ACCTACGTGCAGATTTTTTTTTTTTTTTTTTV-3', SEQ ID NO: 1) hinzugegeben, 5 Minuten bei 65°C denaturiert und auf Eis gestellt. Die Mischung wurde mit 3 µl 100 mM Dithiothreitol (Life Technologies GmbH, Karlsruhe), 6 µl 5 × Superscript-Puffer (Life Technologies GmbH, Karlsruhe), 1,5 µl 10 mM dNTPs, 0,6 µl RNase Inhibitor (40 U/µl; Roche Molecular Biochemicals) und 1 µl Superscript II (200 U/µl, Life Technologies) ver setzt und zur cDNA-Erststrangsynthese 1 Stunde bei 42°C inkubiert. Zur Zweitstrangsyn these wurden 48 µl Zweitstrang-Puffer (vgl. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1999), John Wiley & Sons), 3,6 µl 10 mM dNTPs, 148,8 µl H₂O, 1,2 µl RNaseH (1,5 U/µl, Promega) und 6 µl DNA Polymerase I (New England Biolabs GmbH Schwal bach, 10 U/µl) hinzugefügt und die Reaktionen 2 Stunden bei 22°C inkubiert. Es wurde mit 100 µl Phenol, dann mit 100 µl Chloroform extrahiert und mit 0,1 Vol. Natriumacetat pH 5,2 und 2,5 Vol. Ethanol gefällt. Nach Zentrifugation für 20 Minuten bei 15.000 g und Waschen mit 70% Ethanol wurde das Pellet in einem Restriktionsansatz aus 15 µl 10 × Universal buffer, 1 µl MboI und 84 µl H₂O gelöst und die Reaktion 1 Stunde bei 37°C in kubiert. Es wurde mit Phenol, dann mit Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Das Pellet wurde in einem Ligationsansatz aus 0,6 µl 10 × Ligationspuffer (Roche Molecular Biochemicals), 1 µl 10 mM ATP (Roche Molecular Biochemicals), 1 µl Linker ML2025 (hergestellt durch Hybridisierung von Oligonukleotiden ML20 (5'- TCACATGCTAAGTCTCGCGA-3', SEQ ID NO: 5) und LM25 (5'- GATCTCGCGAGACTTAGCATGTGAC-3', SEQ ID NO: 7), ARK), 6,9 µl H₂O und 0,5 µl T4 DNA Ligase (Roche Molecular Biochemicals) gelöst und die Ligation über Nacht bei 16°C durchgeführt. Die Ligationsreaktion wurde mit Wasser auf 50 µl aufgefüllt, mit Phenol, dann mit Chloroform extrahiert und nach Zugabe von 1 µl Glycogen (20 mg/ml, Roche Molecular Biochemicals) mit 50 µl 28% Polyethylenglycol 8000 (Promega)/10 mM MgCl₂ gefällt. Das Pellet wurde mit 70% Ethanol gewaschen und in 100 µl Wasser aufge nommen.

Beispiel 2 Beschichtung mit Oligonukleotiden

Lyophilisierte, an ihrem 5'-Ende Aminolink-Gruppen tragende Oligonukleotide Amino- M13rev (5'-Amino-CAGGAAACAGCGATGAC-3', SEQ ID NO: 8) und Amino-T7 (5'- Amino-TAATACGACTCACTATAGG-3', SEQ ID NO: 10) (ARK Scientific GmbH, Darmstadt) wurden zu einer Endkonzentration von 1 mM in 100 mM Natriumcarbonatpuf fer pH 9 aufgenommen. Mikroskopie-Objektträger aus Glas ("Slides"; neoLab Migge La borbedarf-Vertriebs GmbH, Heidelberg) wurden 1 Stunde in Chromschwefelsäure gerei nigt und danach 4 × mit destilliertem Wasser gewaschen. Nach Lufttrocknung wurden die Slides 5 Minuten in einer 1%igen Lösung von 3-Aminopropyltrimethoxysilan ("Fluka": Sigma Aldrich Chemie GmbH, Seelze) in 95% Aceton/5% Wasser behandelt. Danach wurde zehnmal für je 5 Minuten in Aceton gewaschen und 1 Stunde auf 110°C erhitzt. Dann wurden die Slides für 2 Stunden in 0,2% 1,4-Phenylendiisothiocyanat ("Fluka": Sigma Aldrich Chemie GmbH, Seelze) in einer Lösung aus 10% Pyridin in trockenem Di methylformamid (Merck KGaA, Darmstadt) eingelegt. Nach 5 Waschschritten in Methanol und 3 Waschschritten in Aceton wurden die Slides luftgetrocknet und direkt zur Be schichtung weiterverarbeitet. Selbstklebende "Frame Seal"-Rähmchen für 65 µl- Reaktionskammern (MJ Research Inc., Watertown, Minnesota, USA) wurden aufgebracht, 65 µl Oligonukleotid-Lösung wurden in die so gebildeten Reaktionskammern pipettiert, und die Kammern wurden durch Aufkleben eines Polyester-Deckblatts (MJ Research Inc.) unter Ausschluß von Luftblasen versiegelt. Die genaue Position der Reaktionskammer wurde mit einem wasserfesten Filzschreiber auf der Unterseite der Slides gekennzeichnet. Die Bindung der Oligonukleotide via Aminolink an die Oberfläche der aktivierten Slides fand über 4 Stunden bei 37°C statt. Anschließend wurden die Kleberahmen entfernt und die Slides mit deionisiertem Wasser abgespült. Um verbliebene reaktive Gruppen zu inak tivieren, wurden die Slides für 15 Minuten in auf 50°C temperierter Blockierungslösung (50 mM Ethanolamin ("Fluka": Sigma Aldrich Chemie GmbH, Seelze), 0,1 M Tris pH 9 ("Fluka": Sigma Aldrich Chemie GmbH, Seelze), 0,1% SDS ("Fluka": Sigma Aldrich Chemie GmbH, Seelze) behandelt. Zur Entfernung nicht kovalent gebundener Oligonu kleotide wurden die Slides 5 Minuten in 800 ml 0,1 × SSC/0,1% SDS (vgl. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1999), John Wiley & Sons) gekocht. Die Slides wurden mit deionisiertem Wasser gewaschen und luftgetrocknet.

Beispiel 3 Beschichtung mit Oligonukleotiden

Lyophilisierte, an ihrem 5'-Ende Aminolink-Gruppen tragende Oligonukleotide Amino- M13rev (5'-Amino-CAGGAAACAGCGATGAC-3', Abfolge der Nukleotide gemäß SEQ ID NO: 8) und Amino-T7 (5'-Amino-TAATACGACTCACTATAGG-3', Abfolge der Nukleotide gemäß SEQ ID NO: 10) (ARK Scientific GmbH, Darmstadt) wurden zu einer Endkonzentration von 100 µmol/µl in deionisiertem Wasser aufgenommen. Je 1,4 µl dieser Primerlösungen wurden mit 32,2 µl Wasser und 35 µl 2 × Bindepuffer (300 mM Natriump hosphat pH 8,5) vermischt. Selbstklebende "Frame Seal"-Rähmchen für 65 µl- Reaktionskammern (MJ Research Inc., Watertown, Minnesota, USA) wurden auf "3D- Link activated slides" (zur Bindung Amino-modifizierter Nukleinsäuren aktivierte Objekt träger aus Glas; (Surmodics, Eden, Prairie, Minnesota, USA) aufgebracht. 65 µl Oligonu kleotid-Lösung wurden in die so gebildeten Reaktionskammern pipettiert, und die Kam mern wurden durch Aufkleben eines Polyester-Deckblatts (MJ Research Inc., Watertown, Minnesota, USA) unter Ausschluß von Luftblasen versiegelt. Die genaue Position der Re aktionskammer wurde mit einem wasserfesten Filzschreiber auf der Unterseite der Slides gekennzeichnet. Die Bindung der Oligonukleotide via Aminolink an die Oberfläche der aktivierten Slides fand über Nacht bei Raumtemperatur statt. Anschließend wurden die Kleberahmen entfernt und die Slides mit deionisiertem Wasser abgespült. Um verbliebene reaktive Gruppen zu inaktivieren, wurden die Slides für 15 Minuten in auf 50°C tempe rierter Blockierungslösung (50 mM Ethanolamin ("Fluka": Sigma Aldrich Chemie GmbH, Seelze), 0,1 M Tris pH 9 ("Fluka": Sigma Aldrich Chemie GmbH, Seelze), 0,1% SDS ("Fluka": Sigma Aldrich Chemie GmbH, Seelze) behandelt. Zur Entfernung nicht kovalent gebundener Oligonukleotide wurden die Slides 5 Minuten in 800 ml 0,1 × SSC/0,1% SDS (vgl. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1999), John Wiley & Sons) gekocht. Die Slides wurden mit deionisiertem Wasser gewaschen und luftgetrocknet.

Beispiel 4

Plasmide pRNODCAB (enthält Basen 982 bis 1491 des Transkripts von Ornithindecar boxylase aus Ratte, AC-Nummer J04791, kloniert in Vektor pCR II (Invitrogen BV, Groningen, Niederlande) und pRNHPRT (enthält Basen 238 bis 720 des Transkripts Hypoxanthinphosphoribosyltransferase aus Ratte, AC-Nummer M63983, kloniert in Vektor pCR II (Invitrogen)) wurden linearisiert, indem je 1 µg Plasmid in einem Volumen von 20 µl 1 × Restriktionspuffer H ("Roche Molecular Biochemicals": Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) mit je 5 U der Restriktionsenzyme BglII und ScaI (Roche Molecular Bioche micals) für 1,5 Stunden bei 37°C inkubiert wurde. Anschließend wurde eine Amplifikation der Vektor-Inserts vorgenommen, indem je 1 µl der Restriktionsansätze in einem Volumen von 100 µl PCR-Puffer II (Perkin-Elmer, Foster City, California, USA)mit 4 µl 10 mM Primer T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGG-3', SEQ ID NO: 10), 4 µl 10 mM Primer M13 (5'-CAGGAAACAGCGATGAC-3', SEQ ID NO: 8) (ARK), 4 µl 50 mM MgCl₂ ("Fluka": Sigma Aldrich Chemie GmbH, Seelze), 5 µl Dimethylsulfoxid ("Fluka": Sigma Aldrich Chemie GmbH, Seelze), 1 µl 10 mM dNTPs (Roche Molecular Biochemicals), und 1 µl AmpliTaq DNA Polymerase (5 u/µl; Perkin-Elmer) versetzt wurde. Anschließend wurden die Reaktionen in einem Gene Amp 9700 Thermocycler (Perkin-Elmer) einem Temperaturprogramm bestehend aus 20 Zyklen Denaturierung für 20 Sekunden bei 95°C, Primerannealing für 20 Sekunden bei 55°C und Primerextension für 2 Minuten bei 72°C unterworfen. Die Amplifikationsprodukte wurden elektrophoretisch auf einem 1,5% Aga rosegel auf ihre richtige Größe hin untersucht. Zur Entfernung uninkorporierter Primer wurden die Reaktionen mittels QiaQuick-Säulen (Qiagen AG, Hilden) gemäß den Anga ben des Herstellers gereinigt und in 50 µl deionisierten Wassers eluiert.

Beispiel 5 Amplifikation

Zur Befestigung von in Beispiel 2 vorbereiteten Nukleinsäuren an Glasträgern wurden An nealing-Mischungen aus je 1 µl unverdünnter oder in parallelen Ansätzen 1 : 10, 1 : 100 bzw. 1 : 1000 mit Wasser verdünnter Amplifikationsprodukt-Lösungen, je 4 µl 50 mM MgCl₂- Lösung, je 1 µl Rinderserumalbumin (20 mg/ml; Roche Molecular Biochemicals), je 5 µl Dimethylsulfoxid, je 1 µl 10 mM dNTPs und je 1 µl AmpliTaq in einem Gesamtvolumen von je 100 µl 1 × PCR-Puffer II hergestellt. Unter Beachtung der Filzschreiber- Markierungen auf der Slide-Unterseite wurden Frame-Seal-Kammern in den zur Oligonu kleotid-Beschichtung verwendeten Positionen auf die in Beispiel 1 vorbereiteten Slides aufgebracht. Dann wurden je 65 µl der Annealing-Mischungen in die Reaktionskammern pipettiert und die Kammern wie oben versiegelt. Die Slides wurden auf den Heizblock ei nes UNO II-in situ-Thermocyclers (Biometra biomedizinische Analytik GmbH, Göttingen) gelegt, mit einem Polster aus Papiertüchern abgedeckt und mittels des höhenverstellbaren Heizdeckels an den Heizblock gepreßt. Zum Annealing und der nachfolgenden Primerex tension kam folgendes Temperaturprogramm zur Anwendung: Denaturierung 30 Sekunden bei 94°C, Annealing 10 Minuten bei 55°C, Primerextension 1 Minute bei 72°C. Nach erfolgter Reaktion wurden die Reaktionskammern entfernt und die Slides wurden mit deioni siertem Wasser abgespült. Zur Entfernung der nicht kovalent gebundenen Stränge wurde 1 Minute in 800 ml 0,1 × SSC/0,1% SDS gekocht, die Slides mit Wasser abgespült und luft getrocknet. Um eine kompartimentierte Amplifikation der an den Träger gebundenen Nu kleinsäuremoleküle vorzunehmen, wurden erneut an den zuvor gewählten Positionen Re aktionskammern aufgebracht und 65 µl einer Amplifikationsmischung aufgetragen, zu sammengesetzt wie folgt: 4 µl 50 mM MgCl₂, 1 µl Rinderserumalbumin (20 mg/ml), 5 µl Dimethylsulfoxid, 1 µl AmpliTaq (5 U/µl), 1 µl 10 mM dNTPs, in 100 µl 1 × PCR-Puffer II. Nach Versiegelung der Kammern wurde auf dem in situ-Thermocycler folgendes Tem peraturprogramm angewendet: Denaturierung 20 Sekunden bei 93°C, Primerannealing 20 Sekunden bei 55°C, Extension 1 Minute bei 72°C, für 50 Zyklen. Nach beendeter Am plifikation wurden die Kammern entfernt und die Slides mit Wasser abgespült und luftge trocknet. Zur Detektion der durch kompartimentierte Amplifikation entstandenen klonalen Inseln wurden 40 µl SYBR Green I-Lösung (Molecular Probes; Lösung 1 : 10.000 in Was ser) auf die Slides pipettiert und mit Deckgläsern #2 (MJ) abgedeckt. Die Detektion er folgte auf einem konfokalen Mikroskop DMRBE (Leica Microsystems Heidelberg GmbH, Heidelberg) bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm und einer Detektionswellenlänge von 530 nm. Es konnten klonale Inseln kompartimentiert amplifizierter Nukleinsäuremole küle detektiert werden, die sich in einer Zufallsanordnung über die Slideoberfläche im Be reich der Reaktionskammern verteilten (vergl. Fig. 8). Im Bereich von Reaktionskammern, in denen als Negativkontrolle entweder keine Oligonukleotide an den Träger gebunden worden waren oder in denen die Amplifikationsreaktion ohne vorherige Hybridisierung von Template-Molekülen vorgenommen worden war, wurden hingegen keine von klonalen Inseln stammende Signale detektiert. Weiterhin zeigte der Vergleich der Slide-Oberflächen im Bereich von Reaktionskammern, in denen unterschiedliche Konzentrationen von Tem plate eingesetzt worden war, eine klare Abhängigkeit der Anzahl gebildeter klonaler Inseln von der Menge an eingesetzten Molekülen.

Beispiel 6

Zur Identifikation der Nukleinsäuremoleküle in den detektierten klonalen Inseln wurden die Slides nach der Detektion der mittels SYBR Green angefärbten doppelsträngigen DNA 10 Minuten in Wasser entfärbt. Dann wurden erneut Reaktionskammern an den gleichen Positionen wie zuvor aufgeklebt und eine Restriktionsmischung, bestehend aus 12 µl 10 × Universal buffer (Stratagene GmbH, Heidelberg), 1 µl Rinderserumalbumin, 3 µl Restrik tionsendonuklease MboI (1 U/µl; Stratagene) und 64 µl Wasser, hinzupipettiert. Zur Re striktion der Nukleinsäuremoleküle mittels der internen MboI-Schnittstelle wurde 1,5 h bei 37°C inkubiert, dann wurden die Reaktionskammern entfernt und die Slides mit Wasser gewaschen. Die nicht kovalent an den Glasträger gebundenen Strangfragmente wurden duch Denaturierung für 2 Minuten in 800 ml kochendem 0,1 × SSC/0,1% SDS entfernt. Nach erneutem Waschen in Wasser und Lufttrocknung wurden neue Reaktionskammern aufgebracht. Pro Hybridisierungsexperiment wurde eine Hybridisierungslösung aus 8 µl 10 × PCR-Puffer II, 3,2 µl 50 mM MgCl₂, 2 µl 100 µmol/µl Oligonukleotidsonde Cy5- HPRT (5'-Cy5-TCTACAGTCATAGGAATGGACCTATCACTA-3', SEQ ID NO: 3; ARK), 2 µl 100 µmol/µl Oligonukleotidsonde Cy3-ODC (5'-Cy3- ACATGTTGGTCCCCAGATGCTGGATGAGTA-3', SEQ ID NO: 2) und 65 µl Wasser hergestellt. Für jedes Hybridisierungsexperiment wurden 65 µl hiervon in die jeweilige Reaktionskammer gegeben und 3 Stunden bei 50°C hybridisiert. Nach Beendigung der Hybridisierung wurden die Reaktionskammern entfernt und die Slides 5 Minuten bei Raumtemperatur in 30 ml 0,1 × SSC/0,1% SDS gewaschen. Die Slides wurden kurz mit destilliertem Wasser abgespült, luftgetrocknet und zur Detektion eingesetzt. Die Detektion erfolgte wie oben mit Hilfe eines konfokalen Lasermikroskops. Als Anregungswellenlän gen wurden 568 nm und 647 nm verwendet, nachgewiesen wurden Signale bei 600 nm und bei 665 nm. Es konnte gezeigt werden, daß die zuvor mit SYBR Green detektierten klona len Inseln zum Teil durch die Sonde Cy3-ODC und zum Teil durch die Sonde Cy5-HPRT detektiert wurden.

Beispiel 7 Expressionsanalyse durch hochparallele Sequenzierung von Nukleinsäuremolekülen

Die in Beispiel 1 erhaltenen Ligationsprodukte wurden 1 : 1000 mit Wasser verdünnt und 1 µl dieser Verdünnung wie in Beispiel 5 beschrieben für 50 Zyklen kompartimentiert ampli fiziert. Hierfür wurden wie beschrieben mit den Amplifikationsprimern Amino-CP28V (5'- Amino-ACCTACGTGCAGATTTTTTTTTTTTTTTV-3', Abfolge der Nukleotide gemäß SEQ ID NO: 1) und Amino-ML20 (5'-Amino-TCACATGCTAAGTCTCGCGA-3', Ab folge der Nukleotide gemäß SEQ ID NO: 5) beschichtete Glasslides verwendet. Zur ein seitigen Ablösung der Amplifikationsprodukte vom Träger wurde die Amplifikationsmi schung durch eine Restriktionsmischung ersetzt, bestehend aus 12 µl 10 × Universal buffer (Stratagene), 1 µl Rinderserumalbumin, 4 µl Restriktionsendonuklease MboI, in einem Endvolumen von 65 µl. Nach Inkubation bei 37°C für 2 h wurde die Restriktionsmischung ersetzt durch eine Dephosphorylierungsmischung aus 1 U alkalischer Phosphatase aus ark tischen Krabben (Amersham) in 65 µl des mitgelieferten Reaktionspuffers. Nach Inkubati on für 1 Stunde bei 37°C und Inaktivierung für 15 Minuten bei 65°C wurden Reaktions kammern und die Dephosphorylierungsmischung entfernt, die Slides gründlich mit destil liertem Wasser gewaschen, erneut Reaktionskammern aufgebracht und mit 65 µl einer Li gationsmischung gefüllt, bestehend aus 3 U T4 DNA-Ligase (Roche Diagnostics) und 500 ng am 5'-Ende phosphoryliertem Hairpin-Sequenzierprimer SLP33 (5'- TCTTCGAATGCACTGAGCGCATTCGAAGAGATC-3', SEQ ID NO: 9) in 65 µl des mitgelieferten Ligationspuffers. Es wurde 14 Stunden bei 16°C ligiert, dann wurden Liga tionsmischung und Reaktionskammern entfernt. Zur Entfernung der nicht kovalent an den Glasträger gebundenen Strangfragmente wurde für 2 Minuten in 800 ml kochendem 0,1 × SSC/0,1% SDS behandelt und mit destilliertem Wasser nachgewaschen. Zur Herstellung geeigneter entschützbarer Abbruchnukleotide wurden dATP, dCTP, dGTP und dTTP (Ro che Molecular Biochemicals) an ihrer 3'-OH-Gruppe mit 4-Aminobuttersäure verestert. Diese Derivate wurden mit den Fluoreszenzgruppen FAM (dATP, dCTP) und ROX (dGTP, dTTP) markiert (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, USA). Zur parallelen Bestimmung der ersten Base wurden erneut Reaktionskammern auf die Slides aufgebracht und eine Primerextensionsmischung aus 1 mM FAM-dATP, 1 mM ROX-dGTP und 2 U Sequenase (United States Biochemical Corp., Cleveland, Ohio, USA) in 65 µl Reakti onspuffer (40 mM Tris-HCl pH 7,5, 20 mM MgCl₂, und 25 mM NaCl) eingefüllt. Nach Inkubation bei 37°C für 5 Minuten wurde mit Reaktionspuffer gewaschen und auf dem Laserscanningmikroskop detektiert. Anregungswellenlängen waren 488 nm und 568 nm, detektiert wurde bei 530 nm und bei 600 nm. Nach der Detektion wurde erneut Primerex tensionsmischung zugegeben, welche nun die übrigen beiden markierten Nukleotide, FAM-dCTP und ROX-dTTP, enthielt. Nach erfolgter Inkorporation wurde erneut gewa schen und detektiert, und die Schutzgruppen wurden durch enzymatische Spaltung ent fernt. Hierzu wurde mit 5 mg/ml Chirazyme L Lipase (Roche Diagnostics) in 100 mM Kaliumphosphatpuffer pH 9 für 1 h bei 35°C behandelt. Anschließend wurde die Sequen zierung wie oben beschrieben für 15 weitere Zyklen durchgeführt.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Verfahren zur parallelen Sequenzierung von mindestens zwei verschiedenen in einem Nukleinsäuregemisch enthaltenen Nukleinsäuren, wobei

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei im Schritt (a)

1. eine Oberfläche bereitgestellt wird, an welche mindestens Primermoleküle eines ersten Primers und eines zweiten Primers und gegebenenfalls ein Nu kleinsäuregemisch umfassend die Nukleinsäuremoleküle, mit welchen beide Primer hybridisieren können, irreversibel immobilisiert worden sind, wobei beide Primer ein Primerpaar bilden;
2. Nukleinsäuremoleküle des Nukleinsäuregemischs mit einem oder mit bei den Primern desselben Primerpaares hybridisiert werden;
3. die irreversibel immobilisierten Primermoleküle komplementär zum Ge genstrang unter Bildung von sekundären Nukleinsäuren verlängert werden;
4. die Oberfläche in einer von Nukleinäuremolekülen, die nicht durch irrever sible Immobilisierung an die Oberfläche gebundenen sind, befreiten Form bereitgestellt wird;
5. die sekundären Nukleinsäuren unter Bildung von tertiären Nukleinsäuren amplifiziert werden;

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei im Schritt (a1) eine Oberfläche, an welche mindestens ein Primerpaar bildende Primermo leküle irreversibel immobilisiert wurden, bereitgestellt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (a1) Primer oder Nukleinsäuremoleküle mit flankierenden Sequenzabschnitten ver wendet werden, die selbstkomplementäre Bereiche aufweisen.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (b) die tertiären Nukleinsäuren durch eine Restriktionsendonuklase restringiert werden bevor an die auf diese Weise generierten Enden Oligonukleotide, die zur Ausbildung einer Hairpinstruktur fähig sind, ligiert werden.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Ausbildung einer Hairpinstruktur befähigten Oligonukleotide einzelsträngig sind.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Ausbildung einer Hairpinstruktur befähigten Oligonukleotide doppelsträngig sind.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (b) einzelsträngige Oligonukleotide, die zur Ausbildung einer Hairpinstruktur fähig sind, an tertiäre Nukleinsäuren hybridisiert werden, bevor tertiäre Nukleinsäuren und vorgenannte einzelstängige Oligonukleotide ligiert werden.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 8 dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (a1) die Primermoleküle durch Ausbildung einer kovalenten Bindung an eine Oberflä che irreversibel immobilisiert werden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (c) die Base die Molekülgruppe trägt, die die Identifikation des Nukleotids ermöglicht.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (c) die Schutzgruppe die Molekülgruppe trägt, die die Identifikation des Nukleotids ermöglicht.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (c) das Nukleotid an der 3'-OH-Position die Schutzgruppe trägt.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (c) die Schutzgruppe eine spaltbare Ester-, Ether-, Anhydrid- oder Peroxid-Gruppe aufweist.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (c) die Schutzgruppe über eine Sauerstoff-Metall-Bindung mit dem Nukleotid verbun den ist.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (e) die Entfer nung der Schutzgruppe durch ein komplexbildendes Ion, vorzugsweise durch Cyanid, Thiocyant oder Fluorid oder Ethylendiamintetraacetat erfolgt.

16. Verfahren einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (e) die Schutzgruppe photochemisch abgespalten wird.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (c) die Schutzgruppe einen Fluorophor aufweist und in Schritt (d) das Nukleotid fluo rometrisch identifiziert wird.