DE10021515A1 - Verfahren zur Herstellung von Erdalkalisalzen der D-Pantothensäure - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von Erdalkalisalzen der D-PantothensäureInfo
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Abstract
Die Erfindung betrifft die Herstellung von Erdalkalisalzen der D-Pantothensäure, bei dem man die Fermentation in Gegenwart von Erdalkaliverbindungen durchführt.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von
Erdalkalisalzen der D-Pantothensäure aus
Fermentationsbrühen.
Die Pantothensäure stellt ein kommerziell bedeutendes
Vitamin dar, das in der Kosmetik, der Medizin, der
Humanernährung und in der Tierernährung Anwendung findet.
Pantothensäure kann durch chemische Synthese oder
biotechnisch durch Fermentation geeigneter Mikroorganismen
in geeigneten Nährlösungen hergestellt werden. Bei der
chemischen Synthese ist das DL-Pantolacton eine wichtige
Verbindung. Es wird in einem mehrstufigen Verfahren aus
Formaldehyd, Isobutylaldehyd und Cyanid hergestellt. In
weiteren Verfahrensschritten wird das racemische Gemisch
aufgetrennt und D-Pantolacton mit β-Alanin kondensiert und
man erhält D-Pantothensäure.
Der Vorteil der fermentativen Herstellung durch
Mikroorganismen liegt in der direkten Bildung der korrekten
stereoisomeren Form nämlich der D-Form von Pantothensäure
frei von L-Pantothensäure.
Verschiedene Arten von Bakterien, wie z. B. Escherichia
coli, Arthrobacter ureafaciens, Corynebacterium
erythrogenes, Brevibacterium ammoniagenes und auch Hefen,
wie z. B. Debaromyces castellii können wie in
EP-A-0 493 060, EP-A-0 590 857 und WO 97/10340 gezeigt,
unter geeigneten Fermentationsbedingungen D-Pantothensäure
produzieren. Besonders geeignete Mikroorganismen sind die
dort beschriebenen Derivate von Escherichia coli IFO3547,
wie zum Beispiel die Stämme FV5069/pFV31 oder
FV5069/pFV202.
Bei der fermentativen Herstellung der D-Pantothensäure, wie
sie in EP-A-0 493 060, EP-A-0 590 857 und WO 97/10340
beschrieben ist, wird ein zur D-Pantothensäure Produktion
befähigter Mikroorganismus in einem geeignetem Nährmedium
kultiviert und die gebildete D-Pantothensäure anschließend
in aufwendiger Weise isoliert, gereinigt und als
Calciumsalz dargestellt.
Geeignete Nährmedien enthalten eine Kohlenstoffquelle wie
z. B. Glucose oder Stärkemehlhydrolysat, Vorstufen wie z. B.
β-Alanin, D,L-Pantoinsäure oder D,L-Pantolacton, eine
Stickstoffquelle wie z. B. Ammoniumsulfat, eine Phosphor-
Quelle wie z. B. Kaliumphosphat und weitere Salze,
Spurenelemente, Aminosäuren und Vitamine und gegebenenfalls
komplexe Medienzusätze wie z. B. Hefeextrakt oder
Maisquellwasser. Die Mikroorganismen werden dann in diesem
Medium bei einem geeignetem pH-Wert unter entsprechender
Belüftung und Rührung inkubiert, wobei diese dann D-
Pantothensäure ausscheiden.
In der EP-A-0 590 857 wird beispielhaft ein fed batch
Verfahren (Zulaufverfahren) zur Herstellung von
Pantothensäure in einem 5 l Reaktor beschrieben, der mit
2,3 l bzw. 2,5 l Kultur gefüllt war. Bei diesem
Versuchsbeispiel wurde festes Calciumcarbonat vermutlich
zur Regulation des pH-Wertes vorgelegt. Die Vorlage bzw.
Zugabe von festem Calciumcarbonat ist jedoch in einem
grosstechnischen Reaktor, der ein Volumen von vielen
Kubikmetern hat, extrem ungünstig, weil durch die
Calciumcarbonat-Ablagerungen an Rührerblättern,
Innenoberflächen und Dichtungsringen die Materialbelastung
zunimmt und die Strömungseigenschaften der
Kulturflüssigkeit und die steriltechnischen Eigenschaften
ungünstig beeinflusst werden.
Nach dem derzeitigen Stand der Technik, der in WO 96/33283
und EP-A-0 590857 dargestellt ist, wird das Calciumsalz der
D-Pantothensäure durch eine aufwendige Isolierung und
Reinigung ausgehend von einer pantothensäurehaltigen
Fermentationsbrühe gewonnen. Nach einer ersten Abtrennung
der Biomasse durch Filtration oder Zentrifugation erfolgt
die weitere Aufarbeitung des Filtrates durch Reinigung
mittels Aktivkohle oder durch Säulenchromatographie. Nach
Zusatz von Calciumhydroxid zum vorbehandelten Filtrat bzw.
Eluat erfolgt die abschliessende Reinigung durch
Kristallisation.
Bei der in WO 96/33283 beschriebenen Reinigungsmethode wird
folgendermassen vorgegangen. Mittels Aktivkohle wird das
Filtrat an einer ersten Säule entfärbt. Mit konzentrierter
Salzsäure wird ein pH-Wert von 3,0 eingestellt und die
Flüssigkeit anschließend kontinuierlich über zwei mit
Aktivkohle gepackten Säulen gereinigt. Die Elution der D-
Pantothensäure erfolgt mit Hilfe von Methylalkohol. Eine
anschließende Neutralisaton erfolgt mit Ca(OH)2-Pulver
unter guter Durchmischung. Das Calcium D-Pantothenat wird
durch anschließende Kristallisation bei 5°C gewonnen.
Bei der in EP-A 0 590 857 beschriebenen Reinigungsmethode
wird folgendermassen vorgegangen. Das Filtrat wird zunächst
mit Hilfe von Kationen- und Anionenaustauschersäulen
gereinigt. Die Elution erfolgt mit Salzsäure. Die eluierte
Fraktion wird anschließend mit Ca(OH)2 neutralisiert, mit
Aktivkohle versetzt und abfiltriert. Das gewonnene Filtrat
wird in einem niedermolekularen Alkohol (Methanol, Ethanol,
Isopropanol) extrahiert und das Calcium D-Pantothenat durch
Kristallisation gewonnen.
Das auf die beschriebene Weise hergestellte Calcium D-
Pantothenat wird als Futtermittelzusatz für die
Tierernährung verwendet.
Die Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, ein
verbessertes Verfahren zur Herstellung von Erdalkalisalzes,
insbesondere des Calcium- und Magneslumsalzes, der D-
Pantothensäure bereitzustellen, die als Futtermittelzusatz
für die Tierernährung geeignet sind.
Das Vitamin D-Pantothensäure stellt ein kommerziell
bedeutendes Produkt dar, das in der Tierernährung, der
Medizin, der Humanernährung und in der Kosmetik Anwendung
findet. Es besteht daher ein allgemeines Interesse daran
neue Verfahren zur Herstellung von Pantothensäure oder
deren Salze bereitzustellen.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung
von Erdalkalisalzen der D-Pantothensäure oder diese
enthaltende Mischungen aus Fermentationsbrühen, das dadurch
gekennzeichnet ist, daß man
- a) die Fermentation in Gegenwart von Erdalkaliverbindungen durchführt,
- b) nach Abschluss der Fermentation die Biomasse gegebenenfalls ganz oder teilweise entfernt,
- c) die so bearbeitete Fermentationsbrühe aufkonzentriert und daraus
- d) das oder die Erdalkalisalz(e) der D-Pantothensäure in reiner Form oder als Mischung, die Bestandteile der Fermentationsbrühe enthält, gewinnt.
Gegenstand der Erfindung ist ebenso ein Verfahren, das
dadurch gekennzeichnet ist, daß man der Bestandteile der
Fermentationsbrühe und eines oder mehrere der
Erdalkalisalze der D-Pantothensäure enthaltenden Mischung
ein oder mehrere verschiedene Erdalkalisalz(e) der D-
Pantothensäure in der gewünschten Menge zusetzt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur
Herstellung von Erdalkalisalzen der D-Pantothensäure,
dadurch gekennzeichnet,
- a) dass man aus einer Erdalkalisalz(e) der D- Pantothensäure enthaltenden Fermentationsbrühe die Biomasse abtrennt,
- b) die zellfreie Fermentationsbrühe aufkonzentriert,
- c) das so erhaltene Konzentrat mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel, insbesondere Ethanol, Methanol oder Aceton, versetzt, anschließend
- d) die oder das Erdalkalisalz(e) der Pantothensäure isoliert, dies(e) gegebenenfalls mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel wäscht und anschließend, wenn es gewünscht wird,
- e) in einer wasserhaltigen Lösung eines hydrophilen organischen Lösungsmittel, gegebenenfalls unter Zusatz von Aktivkohle, umkristallisiert und in einer hohen Reinheit gewinnt.
Geeignet für das erfindungsgemäße Verfahren sind alle
Mikroorganismen, die zur Produktion von D-Pantothensäure
befähigt sind und unter geeigneten Fermentationsbedingungen
D-Pantothensäure produzieren. Die Mikroorganismen können
Pantothensäure aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose,
Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und
Ethanol herstellen.
Es kann sich um Pilze oder Hefen wie z. B. Debaromyces
castellii oder Saccharomyces cerevisiae oder Gram-positive
Bakterien z. B. der Gattung Corynebacterium oder um Gram
negative Bakterien wie z. B. die der Enterobacteriaceae
handeln. Bei der Familie der Enterobacteriaceae ist
besonders die Gattung Escherichia mit der Art Escherichia
coli zu nennen. Innerhalb der Art Escherichia coli sind die
sogenannten K-12 Stämme wie z. B. die Stämme MG1655 oder
W3110 (Neidhard et al.: Escherichia coli and Salmonella.
Cellular and Molecular Biology (ASM Press, Washington
D.C.)) oder der Escherichia coli Wildtypstamm IFO3547
(Institut für Fermentation, Osaka, Japan) und davon
abgeleitete Mutanten zu nennen. Unter den aus IFO3547
hergestellten Stämmen zeichnen sich wiederum FV5069/pFV31
(EP-A-0 590 857, US-A 5 518 906)und FV5069/pFV202
(WO 97/10340, US-A-5 932 457) aus. Bei der Gattung
Corynebacterium ist insbesondere die Art Corynebacterium
glutamicum zu nennen.
Die oben beschriebenen Mikroorganismen können
kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren
(Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder
repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren)
zum Zwecke der Produktion von Erdalkalisalzen der D-
Pantothensäure kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über
bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel
(Bioprozesstechnik 1. Einführung in die
Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart,
1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und
periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag,
Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den
Ansprüchen der jeweiligen Mikroorganismen genügen.
Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener
Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for
General Bacteriology" der American Society for Bacteriology
(Washington D.C., USA, 1981) enthalten. Als
Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z. B.
Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse,
Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl,
Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B.
Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie
z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B.
Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln
oder als Mischung verwendet werden. Als Stickstoffquelle
können organische stickstoffhaltige Verbindungen wie
Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt,
Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder
anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat,
Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und
Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen
können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als
Phosphorquelle können Kaliumdihydrogenphosphat oder
Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium
haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß
weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B.
Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum
notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe
wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben
genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium
können überdies Vorstufen wie beispielsweise β-Alanin oder
gegebenenfalls deren Salze zugesetzt werden. Die genannten
Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen
Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der
Kultivierung zugefüttert werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen
wie Ammoniak oder Ammoniakwasser oder saure Verbindungen
wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise
eingesetzt, sofern durch das erfindungsgemäße Verfahren
keine anderen Maßnahmen ergriffen werden. Zur Kontrolle der
Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B.
Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur
Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem
Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe z. B. Antibiotika
hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen
aufrechtzuerhalten werden Sauerstoff oder Sauerstoff
haltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur
eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise
bei 20°C bis 50°C und vorzugsweise bei 25°C bis 45°C. Die
Kultur wird solange fortgesetzt bis sich ein Maximum an D-
Pantothensäure gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise
innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Es wurde gefunden, dass man die Erdalkalisalze,
insbesondere das Calciumsalz und Magnesiumsalz der D-
Pantothensäure, auf einfache Weise dadurch herstellen kann,
dass man während der Fermentation die Lösung oder
Suspension einer erdalkalihaltigen anorganischen
Verbindung wie beispielsweise Calciumhydroxid,
Magnesiumhydroxid, insbesondere Calciumhydroxid, oder
Magnesiumoxid oder auch das Erdalkalisalz einer organischen
Säure wie beispielsweise Calciumacetat, Calciumfumarat oder
Calciumaspartat zur Fermentation kontinuierlich
hinzufüttert. Es ist ebenfalls möglich, die Erdalkali
haltige Verbindung diskontinuierlich zuzufüttern. Auf diese
Weise wird das zur Darstellung des gewünschten
Erdalkalisalzes der D-Pantothensäure nötige Kation direkt
in die Fermentationsbrühe eingetragen.
Das erfindungsgemäße Fermentationsverfahren ist im
allgemeinen dadurch gekennzeichnet, daß man einen zur D-
Pantothensäure-Produktion befähigten Mikroorganismus
zunächst in bekannter Weise unter Verwendung von Ammoniak
als pH-Regulator und Stickstoffquelle kultiviert und in der
sich anschließenden Produktionsstufe die pH-Einstellung
bevorzugt mit der Lösung oder Suspension einer Erdalkali
haltigen Verbindung wie beispielsweise Calciumhydroxid,
Magnesiumhydroxid, Magnesiumoxid, Calciumacetat,
Calciumfumarat oder Calciumaspartat durchführt. Werden
Calciumsalze organischer Säuren eingesetzt, werden die
organischen Reste im allgemeinen als Kohlenstoffquelle von
den Mikroorganismen verwertet.
Die eingesetzten Lösungen oder Suspensionen Erdalkali
haltiger Verbindungen, insbesondere Calciumhydroxid und
Magnesiumhydroxid, haben eine Konzentration von 5-50 Gew.-%,
vorzugsweise 5-30 Gew.-%, wobei der Bereich von
10-25 Gew.-% ganz besonders bevorzugt wird.
Erfindungsgemäß ist es auch möglich, Mischungen
verschiedener erdalkalihaltiger Verbindungen mit diesen
Konzentrationsbereichen einzusetzen.
Die Zufütterung der Erdalkali-Verbindung erfolgt
dergestalt, daß das molare Verhältnis Erdalkali-Verbindung
zu der gebildeten D-Pantothensäure sich im Bereich 1 : 0,5
bis 1 : 20, vorzugsweise im Bereich 1 : 1,3 bis 1 : 10,
vorzugsweise im Bereich 1 : 1,3 bis 1 : 2,5, wobei der
stöchiometrische Bereich von 1 : 1,8 bis 1 : 2,2 ganz
besonders bevorzugt wird. Gegebenenfalls wird im Verlauf
der Fermentation bei übermässiger Bildung Carboxyl-Gruppen
tragender Nebenprodukte auf die pH-Einstellung durch
Dosieren von Ammoniak in wässriger Form oder als Gas
zurückgegriffen, um das Verhältnis Erdalkali-Verbindung zu
gebildeter D-Pantothensäure im gewünschten Bereich zu
halten.
Die Zufütterung der Erdalkali-Verbindung kann nach 1-70
Stunden, vorzugsweise 10-40 Stunden und ganz besonders 20-25
Stunden Fermentationszeit erfolgen. Die Konzentration
an D-Pantothensäure beträgt zum Zeitpunkt des Beginn der
Zufütterung der Erdalkali-Verbindung im allgemeinen
0,5-70 g/l, vorzugsweise 5-35 g/l und ganz besonders
20-25 g/l. Die Konzentration an Biomasse beträgt zum
Zeitpunkt der Zufütterung der Erdalkali-Verbindung im
allgemeinen 1-30 g Trockengewicht/l, vorzugsweise 10-23 g
Trockengewicht/l und ganz besonders 17-21 g
Trockengewicht/l.
Gegenstand der Erfindung ist ebenso ein Verfahren,
Erdalkalisalze, insbesondere das Calcium- oder Magnesium-
Salz der D-Pantothensäure haltige Pulver bzw.
Futtermitteladditive auf schnelle und kostengünstige Weise
herzustellen. Hierzu wird eine nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren hergestellte, insbesondere Calcium- oder
Magnesium-D-Pantothenat haltige Fermentationsbrühe mit
bekannten Methoden z. B. mit Hilfe eines
Rotationsverdampfer, Dünnschichtverdampfers oder
Fallfilmverdampfers eingedickt. Die dergestalt
aufkonzentrierte Fermentationsbrühe wird anschließend durch
Methoden der Sprühtrocknung oder Gefriertrocknung, wie sie
beispielsweise im Lehrbuch von M. L. Shuler und F. Kargi
"Bioprocess Engineering, Basic Concepts" (Prentice Hall
Inc., Englewood Cliffs, New Jersey, USA, 1992 beschrieben
werden, oder durch anderweitige Verfahren zu einem
vorzugsweise rieselfähigen Pulver bzw. Futtermitteladditiv.
Gegebenenfalls wird auf einer geeigneten Verfahrensstufe
ein(e) Calcium- oder Magnesium D-Pantothenat haltiger Stoff
oder Zubereitung hinzugefügt, um einen gewünschten Gehalt
zu erzielen. Der Gehalt an Calcium oder Magnesium D-
Pantothenat - angegeben als D-Pantothensäure - im
erhaltenen Produktes beträgt 20 bis 80 Gew.-%, vorzugsweise
30 bis 75 Gew.-%. Das Produkt ist als Futtermittelzusatz
für die Tierernährung geeignet.
Die Erfinder fanden eine weitere Methode, um Calcium oder
Magnesium D-Pantothenat haltige Pulver bzw.
Futtermitteladditive herzustellen. Hierzu wird eine wie
oben beschrieben hergestellte, insbesondere Calcium oder
Magnesium D-Pantothenat haltige Fermentationsbrühe zunächst
durch bekannte Separationsmethoden wie z. B. der
Zentrifugation, der Filtration, dem Dekantieren oder einer
Kombination hieraus ganz oder teilweise von der Biomasse
befreit. Anschließend wird die zellfreie Fermentationsbrühe
mit bekannten Methoden z. B. mit Hilfe eines
Rotationsverdampfers, Dünnschichtverdampfers oder
Fallfilmverdampfers eingedickt. Die dergestalt
aufkonzentrierte Suspension wird anschließend durch
Methoden der Sprühtrocknung oder Gefriertrocknung oder
durch anderweitige Verfahren zu einem vorzugsweise
rieselfähigen Pulver verarbeitet. Gegebenenfalls wird auf
einer geeigneten Verfahrensstufe ein(e) Calcium oder
Magnesium D-Pantothenat haltiger Stoff oder Zubereitung
hinzugefügt, um einen gewünschten Gehalt zu erzielen. Der
Gehalt an Calcium oder Magnesium D-Pantothenat - angegeben
als D-Pantothensäure - im erhaltenen Produktes beträgt 20
bis 80 Gew.-%, vorzugsweise 30 bis 75 Gew.-%. Das Produkt
ist als Futtermittelzusatz für die Tierernährung geeignet.
Die Erfinder fanden ebenso eine Methode, um Calcium- oder
Magnesium-D-Pantothenat-haltige Kristalle auf schnelle und
kostengünstige Weise herzustellen. Hierzu wird eine wie
oben beschrieben hergestellte Calcium oder Magnesium D-
Pantothenat haltige Fermentationsbrühe zunächst wie oben
beschrieben von der Biomasse befreit. Anschließend wird die
zellfreie Fermentationsbrühe mit bekannten Methoden z. B.
mit Hilfe eines Rotationsverdampfer, Dünnschichtverdampfers
oder Fallfilmverdampfers konzentriert. Die dergestalt
aufkonzentrierte Suspension wird anschließend mit einem
hydrophilen, organischen Lösungsmittel zum Beispiel
Ethanol, Methanol, Aceton versetzt. Durch Abkühlen auf
0-8°C vorzugsweise 0-5°C wird restlicher Feststoff
ausgefällt. Anschließend wird durch Animpfen mit
kristallinem Calcium- oder Magnesium-D-Pantothenat oder
kristallines Calcium- oder Magnesium-D-Pantothenat
enthaltenden Stoffen das gewünschte Salz kristallisiert.
Die Kristallisation findet bei 0-8°C vorzugsweise 0-5°C
statt und dauert 1 Stunde bis 12 Tage, vorzugsweise 1
Stunde bis 10 Tage, ganz besonders bevorzugt 1 Stunde bis 8
Tage. Das so erhaltene Kristallisat wird vorzugsweise mit
Methanol gewaschen und anschließend getrocknet. Wird ein
Produkt mit höherer Reinheit gewünscht, nimmt man das
Kristallisat in einer wasserhaltigen Lösung von Methanol
auf und kristallisiert gegebenenfalls unter
Aktivkohlezusatz um. Die wasserhaltige Lösung von Methanol
hat einen Methanolgehalt von 70 bis 99 Vol.-%, vorzugsweise
80 bis 99 Vol.-% und ganz besonders bevorzugt von 90 bis
99 Vol.-%.
Der Gehalt des derart erhaltenen kristallinen Produktes an
Calcium- oder Magnesium-D-Pantothenat liegt bei 60 bis
99 Gew.-%, vorzugsweise bei 70 bis 99 Gew.-% und ganz
besonders bevorzugt bei 80 bis 99 Gew.-%. Das Produkt ist
als Futtermittelzusatz für die Tierernährung geeignet.
Der Gehalt an D-Pantothensäure kann mit bekannten Verfahren
(Velisek; Chromatographic Science 60, 515-560 (1992))
bestimmt werden. Reines Calcium D-Pantothenat (< 99 Gew.-%)
hat einen Gehalt von 91,16 Gew.-% D-Pantothensäure. Reines
Magnesium D-Pantothenat (< 99 Gew.-%) hat einen Gehalt von
94,73 Gew.-% D-Pantothensäure.
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von
Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Zu diesem Zweck wurden Versuche mit dem D-Pantothensäure
produzierenden Stamm Escherichia coli 5069/pFV31
durchgeführt, der als FERM-BP 4395 gemäss Budapester
Vertrag beim Fermentation Research Institute, Agency of
Industrial Science and Technology in 1-1-3, Higashi,
Tsukuba-shi, Ibaraki (Japan) hinterlegt ist
(US-A-5 518 906).
Darüber hinaus wurden Fermentationsversuche mit dem das
Calciumsalz der Fumarsäure oder der Asparaginsäure zur
direkten Darstellung des Calcium D-Pantothenats der
Fermentationsbrühe zugesetzt wurde.
Eine Probe von Escherichia coli FV5069/pFV31 wurde auf LBG-
Agar ausgestrichen, der mit 50 µg pro ml Ampicillin
supplementiert worden war. Diese Agarplatten-Kultur wurde
17 Stunden bei 37°C inkubiert und dann im Kühlschrank bei
+4°C aufbewahrt. Ausgewählte Einzelkolonien wurden
anschließend in LBG-Bouillion weiter vermehrt. LBG-
Bouillion hat folgende Zusammensetzung: 10 g/l Pepton,
5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl und 1 g/l Glucose. LBG-Agar
enthält zusätzlich 12 g/l Agar. Vorgefertigte Zubereitungen
können von der Firma Gibco/BRL (Paisley, Schottland,
Grossbritanien) als LB Broth Base oder LB-Agar bezogen
werden. Nach Zusatz von 1 g/l Glucose erhält man dann die
angegebenen Medien. Kulturen von 10 ml, die in 100 ml
Erlenmeyerkolben enthalten waren, wurden für 16 Stunden bei
37°C und 180 rpm auf einem ESR Inkubator der Firma Kühner
AG (Birsfelden, Schweiz) inkubiert. Im Anschluß wurde die
Zellsuspension auf einer J-6B Zentrifuge der Firma-Beckmann
(Hannover, Deutschland) 15 Minuten bei 4000 rpm
abzentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 10 ml LBG-Medium,
das mit 20% Glycerin supplementiert worden war,
resuspendiert, in 10 Aliquots je 1 ml unter sterilen
Bedingungen abgefüllt und bei -70°C eingefroren. Diese
Kulturen wurden als "master"-Zellbank (master cell bank)
verwendet.
Für die Herstellung einer Arbeitszellbank (working cell
bank) wurde LBG-Medium, das mit 50 µg/ml Ampicillin
supplementiert worden war, in 10 ml Portionen in 100 ml
Erlenmeyerkolben verteilt und anschließend mit 100 µl der
oben beschriebenen "master"-Zellbank beimpft. Die
Inkubation erfolgte für 16 Stunden bei 37°C und 180 rpm auf
einem ESR Inkubator der Firma Kühner AG (Birsfelden,
Schweiz).
Nach der Inkubation wurde die optische Dichte (OD) der
Kultursuspension mit einem LP2 W-Photometer der Firma Dr.
Lange (Berlin, Deutschland) bei einer Messwellenlänge von
660 nm bestimmt. Sie betrug 3,5. Anschließend wurde die
Zellsuspension in sterilen 30 ml Polyethylenröhrchen der
Firma Greiner (Frickenhausen, Deutschland) unter sterilen
Bedingungen abgefüllt und bei 2500 rpm für 15 Minuten mit
einer Zentrifuge vom Typ J-6B der Firma Beckmann (Hannover,
Deutschland) abzentrifugiert. Die abgetrennte Biomasse
wurde in 10 ml LBG-Medium, das mit 20% Glycerin
supplementiert worden war, resuspendiert. Im Anschluß wurde
die Zellsuspension in 500 µl Portionen in 1 ml sterilen
Röhrchen, der Firma Nalgene (New York, USA) unter
sterilen Bedingungen abgefüllt und bei -70°C eingefroren.
Die auf diese Weise hergestellten Konserven wurden als
Arbeitszellbank (working cell bank) verwendet.
Zur Herstellung einer Calcium-D-Pantothenat-haltigen
Fermentationsbrühe wurde die Arbeitszellbank zunächst in
einer Schüttelkolbenkultur vermehrt und diese zur Beimpfung
eines Vorfermenters verwendet. Die Kultur des Vorfermenters
wurde zur Beimpfung des Produktionsfermenters verwendet.
Für die Schüttelkolbenkultur wurde das Medium SKA verwendet
(Tabelle 1). SKA-Medium wurde folgendermaßen zubereitet: In
einem 1 l Becherglas wurden 7,0 g (NH4)2SO4, 0,5 g KH2PO4,
1,0 g K2HPO4, 0,5 g MgSO4.7 H2O, 0,01 g MnSO4.H2O,
0,01 g ZnSO4.7 H2O, 0,005 g Fe2(SO4)3 und 20 g
Maisquellwasser abgewogen, das zuvor mit 25%iger
Ammoniaklösung auf pH 6,8 eingestellt worden war, und
anschließend auf 825 g mit destilliertem Wasser aufgefüllt.
Diese Maisquellwasser-haltige Salzlösung wurde im Autoklav
bei 121°C für 20 Minuten sterilisiert. Weiterhin wurde eine
Lösung bestehend aus 24 g Glucose und 0,002 g Thiamin.HCl,
mit destilliertem Wasser auf 125 g aufgefüllt, durch
Filtration sterilisiert. 10 g CaCO3 wurden in einem 100 ml
Kolben abgewogen und im Autoklaven bei 123°C für 20 Minuten
sterilisiert. Durch Vereinigung der beiden oben genannten
Komponenten mit der Maisquellwasser haltigen Salzlösung
wurde das Medium SKA erhalten.
Dieses Medium SKA wurde in 12,5 ml Portionen in 100 ml
Erlenmeyerkolben verteilt und anschließend mit 0,5 ml einer
Zellsuspension beimpft. Als Zellsuspension wurde eine mit
steriler physiologischer Kochsalzlösung 1 : 100 verdünnte
Konserve der Arbeitszellkultur verwendet. Die Inkubation
erfolgte für 20 Stunden bei 32°C und 150 rpm auf einem RC-
1-TK Inkubator der Firma Infors AG (Bottmingen, Schweiz).
Die im Anschluß daran bestimmte optische Dichte bei einer
Meßwellenlänge von 660 nm (OD 660) betrug 12,5.
Zur Inokulierung von 20 kg des Vorkulturmediums A1-102, das
in einem 42 l Rührreaktorfermenter der Firma Bioengineering
(Wald, Schweiz, Modell LP-42) enthalten war, wurden 0,5 ml
des SKA-Mediums 1 : 100 verdünnt und 50 ml dieser Suspension
in den Fermenter zugegeben. Das Vorkulturmedium A1-102
enthielt die in Tabelle 2 aufgeführten Bestandteile. Die
Kultur wurde für 15,5 Stunden bei einer Temperatur von
37°C, einer volumenspezifischen Belüftung von 0,5 vvm,
einem Sauerstoffpartialdruck von 20% der Luftsättigung und
einem pH von pH 6,5 bis zum Erreichen einer OD660 von 11,3
kultiviert.
Zur Inokulierung von 5830 g des Hauptkulturmediums M1-425,
das in 14 l Rührreaktor-Fermentern der Firma B. Braun (BBI,
Deutschland, Melsungen, Modell Biostat E/ED) enthalten war,
wurden 423 ml der zweiten Vorkultur in Medium A1-102
zugegeben. Das Hauptkulturmedium M1-425 enthielt die in
Tabelle 3 aufgeführten Bestandteile. Die Kultur wurde
zunächst für 6,5 Stunden bei einer Temperatur von 37°C,
einer volumenspezifischen Belüftung von 0,75 vvm, einer
minimalen Rührung von 400 rpm und einem pH von 6,5 bis zum
Erreichen einer OD660 von 18,6 und einem
Sauerstoffpartialdruck von 2% der Luftsättigung
kultiviert. Die Kultur wurde anschließend für weitere 41
Stunden bei einer Temperatur von 37°C, einem
Sauerstoffpartialdruck von 2% der Luftsättigung und einem
pH-Wert von pH 6,0 bis zum Erreichen einer OD660 von 66,8
kultiviert. Nach einer Fermentationszeit von 13 Stunden
wurde β-Alanin in einer Konzentration von 152,7 g in 570 ml
H2O über einen Zeitraum von 34,5 Stunden zugefüttert. Nach
einer Fermentationszeit von 21,5 Stunden wurde eine zehn
prozentige Ca(OH)2-Lösung über einen Zeitraum von
26 Stunden zur pH-Statisierung zudosiert. 3,43 kg des
Mediums M2-257 mit einer Glucose-Konzentration von
650,8 g/l und einer Thiamin HCl Konzentration von 35,7 mg/l
wurde innerhalb von 41 Stunden zugefüttert.
Anschließend wurden die optische Dichte (OD) mit einem
Digitalphotometer vom Typ LPIW der Firma Dr. Bruno Lange
GmbH (Berlin, Deutschland) bei einer Meßwellenlänge von
660 nm und die Konzentration an gebildeter D-
Pantothensäure mittels HPLC (Hypersil APS 2 5 µm, 250 × 5 mm,
RI-Detektion) bestimmt.
In der Fermentationsendprobe wurde nach 47,5 Stunden eine
Calcium D-Pantothenat Konzentration von 49,8 g/l gemessen
als D-Pantothensäure festgestellt.
Der Stamm Escherichia coli FV5069/pFV31 wurde wie in
Beispiel 1 beschrieben im Schüttelkolbenmedium SKA
(Tabelle 1) angezogen. Anschließend wurde die Suspension
1 : 100 verdünnt und 17,5 ml in dieser Verdünnung zur
Inokulation von 7 kg Medium A1-102 (Tabelle 2) in einem
14 l Rührreaktorfermenter (BBI, Deutschland, Melsungen,
Modell Biostat E) eingesetzt.
Die Kultur wurde für 15,5 Stunden bei einer Temperatur von
37°C, einer volumenspezifischen Belüftung von 0,5 vvm,
einem Sauerstoffpartialdruck von 20% der Luftsättigung und
einem pH von pH 6,5 bis zum Erreichen einer OD660 von 11,6
kultiviert.
Nach Überimpfen in den Produktionsfermenter (14 l
Rührreaktorfermenter, BBI, Deutschland, Melsungen, Modell
Biostat ED) wurden die gleichen Kultivierungsbedingungen
eingestellt wie in Beispiel 1 beschrieben. Zur pH-Regelung
wurde eine Lösung von 25 Gew.-% Calcium-Acetat verwendet.
Der Wechsel von Ammoniakwasser auf Calcium-Acetat wurde
nach 24 Stunden vollzogen. Die komplette Prozeßzeit der
Fermentation betrug 52 Stunden. Die Zufütterung von 3,4 kg
M2-Medium erfolgte in einem Zeitraum von 40 Stunden. Am
Ende der Fermentation wurde eine Calcium-D-Pantothenat-
Konzentration von 43,7 g/l, gemessen als D-Pantothensäure,
festgestellt.
1,0 l der nach dem Beispiel 1 beschriebenen Verfahren
hergestellten Calcium-D-Pantothenat haltigen
Fermentationsbrühe wurde zunächst bei 60°C im
Rotationsverdampfer (Laborrotationsverdampfer Büchi
Rotavapor RE-120, Büchi-Labortechnik GmbH, Konstanz,
Deutschland) unter Vakuum der Flüssigkeitsanteil auf etwa
50% Trockengehalt reduziert. Die so eingeengte Brühe wurde
anschließend zur Darstellung des Calciumsalzes der
Pantothensäure sprühgetrocknet (Laborsprühtrockner Büchi-190,
Eingangstemperatur 107°C, Ausgangstemperatur 78°C,
-40 mbar, 600 NL/h, Büchi-Labortechnik GmbH, Konstanz,
Deutschland).
Das so hergestellte Produkt hatte einen Gehalt von
42 Gew.-% gemessen als D-Pantothensäure.
In 1,0 l der nach dem Beispiel 1 beschriebenen Verfahren
hergestellte Calcium-D-Pantothenat-haltigen
Fermentationsbrühe wurde zunächst durch Zentrifugation
(Laborzentrifuge Biofuge-Stratos, Heraeus, Düsseldorf,
Deutschland; 20 Minuten, 4000 rpm) (Laborzentrifuge
Biofuge-Stratos, Heraeus, Düsseldorf, Deutschland;
20 Minuten, 4000 rpm) die Biomasse abgetrennt. Bei 60°C
wurde dann die so behandelte Brühe im Rotationsverdampfer
(Laborrotationsverdampfer Büchi Rotavapor RE-120, Büchi-
Labortechnik GmbH, Konstanz, Deutschland) unter Vakuum der
Flüssigkeitsanteil auf etwa 50% Trockengehalt reduziert.
Die so eingeengte Brühe wurde anschließend zur Darstellung
des Calciumsalzes der Pantothensäure sprühgetrocknet
(Laborsprühtrockner Büchi-190, Eingangstemperatur 107°C,
Ausgangstemperatur 78°C, -40 mbar, 600 NL/h, Büchi-
Labortechnik GmbH, Konstanz, Deutschland).
Das so hergestellte Produkt hatte einen Gehalt von
64 Gew.-%, gemessen als Pantothensäure.
3600 g der nach Beispiel 1 hergestellten Calcium D-
Pantothenat-haltigen Fermentationsbrühe wurden durch
Filtration von der Biomasse abgetrennt und das so erhaltene
Filtrat bei 60°C im Rotationsverdampfer
(Laborrotationsverdampfer Büchi Rotavapor RE-151, Büchi-
Labortechnik GmbH, Konstanz, Deutschland)auf 700 g
reduziert. Der Rückstand wurde anschließend zur Lösung in
3200 g Methanol aufgenommen. Nach Abkühlung auf
Raumtemperatur wurde mittels Zentrifugieren
(Laborzentrifuge Biofuge-Stratos, Heraeus, Düsseldorf,
Deutschland; 20 Minuten, 4.000 rpm) die nicht löslichen
Bestandteile abgetrennt. Der auf diese Weise geklärte
Überstand wurde erneut im Rotationsverdampfer bis zur
Trockne eingeengt und der Rückstand in 950 g Methanol
wieder aufgenommen. Nach Abkühlung auf eine Temperatur von
2°C wurde die Kristallisation des Calciumsalzes der
Pantothensäure aus der so erhaltenen konzentrierten Lösung
durch Animpfen mit 2,5 g kristallinem D-Calcium-Pantothenat
gestartet.
Nach Abtrennen der organischen Phase unter Vakuum erhielt
man ein kristallines Produkt mit einem Gehalt an Calcium D-
Pantothenat von 84 Gew.-%.
In einem weiteren Schritt der Umkristallisierung gelang es,
die Konzentration auf 96 Gew.-% zu steigern.
Die Bereitstellung des Inokulums für die Hauptkultur
erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben. Zur Inokulierung
von 5830 g des Hauptkulturmediums M1-425, das in 14 l
Rührreaktor-Fermentern der Firma B. Braun (BBI, Deutschland,
Melsungen, Modell Biostat E/ED) enthalten war, wurden
846 ml der zweiten Vorkultur in Medium A1-102 zugegeben.
Das Hauptkulturmedium M1-425 enthielt die in Tabelle 3
aufgeführten Bestandteile. Die Kultur wurde zunächst für
6,5 Stunden bei einer Temperatur von 37°C, einer
volumenspezifischen Belüftung von 0,75 vvm, einer minimalen
Rührung von 400 rpm und einem pH von 6,5 bis zum Erreichen
einer OD660 von 22,0 und einem Sauerstoffpartialdruck von
2% der Luftsättigung kultiviert. Die Kultur wurde
anschließend für weitere 48 Stunden bei einer Temperatur
von 37°C, einem Sauerstoffpartialdruck von 2% der
Luftsättigung und einem pH-Wert von pH 6,0 bis zum
Erreichen einer OD660 von 67,6 kultiviert. Nach einer
Fermentationszeit von 23,0 Stunden wurde eine fünfzehn
prozentige Mg(OH)2-Suspension über einen Zeitraum von
31,5 Stunden zur pH-Statisierung zudosiert. 4,28 kg des
Mediums M2-261 mit einer Glucose-Konzentration von
584,7 g/l, einer β-Alanin-Konzentration von 50,7 g/l und
einer Thiamin HCl-Konzentration von 35,7 mg/l wurde
innerhalb von 48,0 Stunden zugefüttert.
Anschließend wurden die optische Dichte (OD) mit einem
Digitalphotometer vom Typ LP1W der Firma Dr. Bruno Lange
GmbH (Berlin, Deutschland) bei einer Meßwellenlänge von
660 nm und die Konzentration an gebildeter D-
Pantothensäure mittels HPLC(Hypersil APS 2 5 µm, 250 × 5 mm,
RI-Detektion) bestimmt.
In der Fermentationsendprobe wurde nach 54,5 Stunden eine
Magnesium D-Pantothenat Konzentration von 48,2 g/l gemessen
D-Pantothensäure festgestellt.
Claims (8)
1. Verfahren zur Herstellung von Erdalkalisalzen der D-
Pantothensäure oder diese enthaltende Mischungen aus
Fermentationsbrühen,
dadurch gekennzeichnet,
daß man
dadurch gekennzeichnet,
daß man
- a) die Fermentation in Gegenwart von Erdalkaliverbindungen durchführt,
- b) nach Abschluss der Fermentation die Biomasse gegebenenfalls ganz oder teilweise entfernt,
- c) die so bearbeitete Fermentationsbrühe aufkonzentriert und daraus
- d) das oder die Erdalkalisalz(e) der D-Pantothensäure in reiner Form oder als Mischung, die Bestandteile der Fermentationsbrühe enthält, gewinnt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß man beginnt, die Erdalkaliverbindung zuzusetzen,
wenn die Konzentration der D-Pantothensäure bei 0,5
bis 70 g/l, vorzugsweise bei 5 bis 35 g/l liegt.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß man der Fermentationsbrühe die Erdalkaliverbindung
in einem molaren Verhältnis 1 : 0,5 bis 1 : 20,
insbesondere 1 : 1,3 bis 1 : 10, zur D-Pantothensäure
zusetzt.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3,
dadurch gekennzeichnet,
daß man der Fermentationsbrühe während der
Fermentation erdalkalihaltige Verbindungen
chargenweise oder kontinuierlich einzeln oder im
Gemisch mindestens in dem stöchiometrischen Verhältnis
zusetzt, wie D-Pantothensäure gebildet wird.
5. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1, 2 oder 3,
dadurch gekennzeichnet,
daß man ein Calciumsalz einer oder mehrerer
organischer Säuren, insbesondere der Fumar- oder
Asparaginsäure, zusetzt.
6. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2 oder 3,
dadurch gekennzeichnet,
daß man als Erdalkaliverbindungen Calciumhydroxid,
Calciumoxid, Magnesiumoxid oder Magnesiumhydroxid
einsetzt.
7. Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
- a) dass man aus der Erdalkalisalze der D- Pantothensäure enthaltenen Fermentationsbrühe die Biomasse abtrennt,
- b) die zellfreie Fermentationsbrühe aufkonzentriert,
- c) das so erhaltene Konzentrat mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel versetzt und anschließend
- d) die Erdalkalisalze der Pantothensäure kristallisiert und gegebenenfalls weiter aufreinigt.
8. Verfahren nach einem oder mehreren der Vorhergehenden
Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß man der Bestandteile der Fermentationsbrühe und
eines oder mehrere Erdalkalisalze der D-Pantothensäure
enthaltenden Mischung ein oder mehrere verschiedene
Erdalkalisalz(e) der D-Pantothensäure zusetzt.
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