DE10020885A1 - Verfahren zur Herstellung einer chemo- und thermostabilen Festphasenmatrix für Polymerase Chain Reaction (PCR) und DNA-Hybridisierungsassay - Google Patents
Verfahren zur Herstellung einer chemo- und thermostabilen Festphasenmatrix für Polymerase Chain Reaction (PCR) und DNA-HybridisierungsassayInfo
- Publication number
- DE10020885A1 DE10020885A1 DE10020885A DE10020885A DE10020885A1 DE 10020885 A1 DE10020885 A1 DE 10020885A1 DE 10020885 A DE10020885 A DE 10020885A DE 10020885 A DE10020885 A DE 10020885A DE 10020885 A1 DE10020885 A1 DE 10020885A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- solid phase
- phase matrix
- thermostable
- carrier material
- cross
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 title claims abstract description 21
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 title claims abstract description 16
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 title claims abstract description 14
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 title abstract 5
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 title abstract 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 title description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N biotin Natural products N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims abstract description 25
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims abstract description 13
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims abstract description 13
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 11
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims description 14
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 8
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 claims description 7
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 claims description 7
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 claims description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 7
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 6
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- -1 polypropylene Polymers 0.000 claims description 6
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 claims description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 6
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 5
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 claims description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 3
- ZWIBGKZDAWNIFC-UHFFFAOYSA-N disuccinimidyl suberate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O ZWIBGKZDAWNIFC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000894007 species Species 0.000 claims 2
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 claims 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 13
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 10
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N Orthosilicate Chemical compound [O-][Si]([O-])([O-])[O-] BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 238000003746 solid phase reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZRAEYQIKYCPH-UHFFFAOYSA-N 3-(trimethylsilyl)propane-1-sulfonic acid Chemical compound C[Si](C)(C)CCCS(O)(=O)=O TVZRAEYQIKYCPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 239000011665 D-biotin Substances 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000007844 allele-specific PCR Methods 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 108091006004 biotinylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000007849 hot-start PCR Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- JJGWLCLUQNFDIS-GTSONSFRSA-M sodium;1-[6-[5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]hexanoyloxy]-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].O=C1C(S(=O)(=O)[O-])CC(=O)N1OC(=O)CCCCCNC(=O)CCCC[C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1 JJGWLCLUQNFDIS-GTSONSFRSA-M 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000002344 surface layer Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010626 work up procedure Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer chemo- und thermostabilen Festphasenmatrix unter Verwendung eines inerten thermostabilen Trägermaterials, auf das ein biotinyliertes Vernetzungsprodukt V1 mit einem Molekulargewicht L 500 KD, vorzugsweise vernetztes Immunglobulin-Gamma oder Rindergammaglobulin, als Klettsubstanz in stark basischen Puffern bei einem pH-Wert L 11,0 oder in stark saurem Milieu bei einem pH 6 3,0 in Kontakt gebracht wird. Nach Adsorption an den Träger wird über die Biotinbrücke vernetztes Streptavidin und/oder Avidin als hochmolekulares Vernetzungsprodukt V2 aufgebracht. Die so hergestellte Matrix ist chemo- und thermostabil und somit zur kombinierten Verwendung von PCR und Hybridisierungsassay einsetzbar.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines
chemo- und thermostabilen, mit vernetztem Streptavidin
und/oder Avidin beschichteten Trägers, wobei die aus
vernetztem Streptavidin und/oder Avidin bestehende Schicht (V
2) über eine vernetzte und biotinylierte Klettsubstanz (V1)
für die vorzugsweise Immunglobulin-Gamma (IgG) oder
Rindergammaglobulin verwendet wird, in stark basischen Puffern
mit pH-Werten ≧ 11,0 oder in stark saurem Milieu bie pH-Werten
≦ 3,0, an die Oberfläche des festen Trägermaterials gebunden
wird. Weiterhin betrifft die Erfindung die beschichteten
Träger selbst sowie ihren Einsatz bei Festphasen-
Hybridisierungstechniken und Festphasen-PCR.
In DE 197 24 787 A1 (BioTeZ GmbH) sowie in EP 0 331 127 A1
(Boehringer-Mannheim GmbH) sind mit Streptavidin oder Avidin
beschichtete Oberflächen bereits beschrieben. Als
Trägermaterialien für solche Beschichtungen dienen geladene
Plastikoberflächen aus Polystyrol, Nylon, Nitrocellulose u. ä.
Nachteilig für diese Träger ist jedoch, dass sie nur eine
geringe Thermostabilität aufweisen, wodurch sie für eine Reihe
von Anwendungen (z. B. für die Durchführung von PCR) nicht
geeignet sind.
Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, Träger mit
solchen Beschichtungen zu entwickeln, die die Anwendung auch
bei höheren Temperaturen (≧ 60°C bis 100°C) gestatten und
die auch bei diesen Temperaturen sowohl Thermostabilität als
auch Chemostabilität besitzen.
Überraschend stellte sich heraus, dass es möglich ist, eine
chemo- und thermostabile Beschichtung auf einer inerten,
thermostabilen Festphasenmatrix zu erreichen, wenn man ein
biotinyliertes Vernetzungsprodukt V1 mit einem
Molekuklargewicht ≧ 500 KD als Klettsubstanz-Unterschicht
entweder in basischem Puffer bei pH ≧ 11,0 oder im stark
sauren Milieu bei pH ≦ 3,0, an die Oberfläche des
Trägermaterials bindet, und anschließend mit vernetztem
Streptavidin (auch rekombinantem Streptavidin), vernetztem
Avidin oder auch Streptavidin-Avidin-Vernetzungsprodukten
umsetzt. Es wurde eine stabile Streptavidin/Avidin-
Beschichtung mit wesentlich erhöhter Bindungskapazität (bei
Temperaturen von 60°C lag die Bindungskapazität noch bei 93%,
im Vergleich zu handelsüblichen Trägern, deren
Bindungskapazität bei 60°C nur noch ca. 40% aufwies) und
gesteigerter Thermo- und Chemostabilität auf den i. d. R.
ungeladenen Trägeroberflächen erzielt.
Gegenstand der Erfindung ist demzufolge ein Verfahren zur
Herstellung einer stabilen, Streptavidin und/oder Avidin
enthaltenden Festphasenmatrix, bei der die Vernetzungsprodukte
aus Streptavidin, Avidin oder auch Gemischen von diesen über
das biotinylierte Klettprotein V1 an die Oberfläche des
festen Trägermaterials gebunden sind.
Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass das
Vernetzungsprodukt V1, vorzugsweise ein Protein, insbesondere
IgG oder Rindergammaglobulin nach seiner Vernetzung unter
Verwendung an sich bekannter Reagenzien biotinyliert wird und
danach mit einem thermostabilen, vorzugsweise ungeladenen
Trägermaterial in stark basischem Milieu bei einem pH-Wert ≧
11 oder im stark sauren Milieu bei einem pH-Wert ≦ 3,0 in
Kontakt gebracht wird. Als stark basische Pufferlösungen
werden vorzugsweise Carnonatpufferlösungen und als stark
saures Milieu vorzugweise Citratpufferlösungen angewandt.
Im Vergleich zu den aus dem Stand der Technik bekannten
Verfahren, wonach Beschichtungen generell im basischen Milieu
bei pH-Werten nicht über 9,6 ablaufen, führt überraschend die
Erhöhung auf einen pH-Wert von ≧ 11 im basischen Milieu bzw.
auch eine Erniedrigung unter einen pH-Wert ≦ 3 im sauren
Milieu zu einer thermo- und chemostabilen Beschichtung mit
hoher Bindungskapazität, wenn ein vernetztes und
biotinyliertes Klettprotein V1 und ein vernetztes Protein aus
Streptavidin, Avidin oder auch Gemischen von beiden V2
verwendet wird. wobei die Beschichtung auf thermostabilen
ungeladenen Trägeroberflächen aus Kunststoff, wie Polycarbonat
und Polypropylen erfolgt.
Überraschend ist dabei insbesondere die Tatsache, dass eine
chemo- und thermostabile Beschichtung sowohl bei Umsetzung im
stark basischen als auch bei Umsetzung im sauren Milieu zu
verzeichnen ist.
Nach Fixierung an die Trägeroberfläche wird auf diese
Unterschicht eine Oberschicht aus vernetztem Streptavidin,
Avidin bzw. einem Gemisch von diesen aufgebracht.
Erfindungsgemäß besteht die vorzugsweise ungeladene
Trägeroberfläche aus Kunststoff, vorzugsweise aus Polycarbonat
oder Polypropylen. Der Träger stellt eine beschichtete
Festphase an einer thermostabilen Plastikoberfläche, bevorzugt
aus Polycarbonat, Polypropylen, silikatischen, oxydischen oder
auch metallischen und Halbleiteroberflächen sowie auch aus
Kombinationen der genannten Trägermaterialien dar.
Weiterhin sind Gegenstand der Erfindung die so hergestellten,
stabilen, mit Streptavidin und/oder Avidin beschichteten
festen Träger an sich, die aus einem thermostabilen, i. d. R.
ungeladenen Trägermaterial, einem vernetzten und
biotinylierten Protein, vorzugsweise IgG oder
Rindergammaglobulin, als Unterschicht und vernetztem
Streptavidin und/oder Avidin als Oberschicht bestehen.
Der erfindungsgemäß hergestellte neue Träger stellt eine
beschichtete Festphase an einer thermostabilen
Plastikoberfläche, bevorzugt aus Polycarbonat, Polypropylen,
silikatischen, oxydischen oder auch metallischen und
Halbleiteroberflächen sowie auch aus Kombinationen aus den
genannten Trägermaterialien dar und weist folgende
vorteilhafte Eigenschaften auf:
- - hohe Bindungskapazität an der Oberfläche (bei 60°C noch 93%),
- - ausreichende chemische Stabilität, auch gegenüber Detergenzien,
- - universelle Verwendbarkeit sowie
- - notwendige Empfindlichkeit der Bestimmungsverfahren,
- - hohe Thermostabilität bis zu 96°C, (bei 80°C noch mind. 50% Bindungskapazität).
Der beschriebene feste Träger ist demnach vorteilhaft für die
Durchführung von molekularbiologischen Festphasenreaktionen
und von Festphasen-Hybridisierungstechniken geeignet,
insbesondere für die Hybridisierung bei Temperaturen ≧ 60°C,
was mit den bisher bekannten Streptavidin-Beschichtungen nicht
möglich war, und ermöglicht erstmalig, alle möglichen
Varianten von Festphasenreaktionen, bei denen höhere
Temperaturen erforderlich sind, wie beispielsweise DNA-
Displacement-Assay, Hot-Start-PCR, allelspezifische PCR mit
markierten Primern oder Primer-Extension-Assays mit
markierten Didesoxy-Nukleotiden u. ä.
Anschließend wird die Erfindung an Ausführungsbeispielen näher
erläutert auf die sie jedoch nicht beschränkt werden soll.
120 mg γ-Globulin (Rind) werden in 13 ml 0,1 M Phosphatpuffer
(pH 7,5) gelöst. Unter Rühren werden 7,5 mg
Disuccinimidylsuberat (DSS, Fa. PIERCE), gelöst in 620 µl
Dioxan, tropfenweise im Verlaufe von 25 min zur γ-
Globulinlösung gegeben.
Nach einer Reaktionszeit von 4 Std. unter Rühren bei
Raumtemperatur werden 6,0 mg Sulfo-NHS-LC-Biotin (F. PIERCE)
in fester Form in die Reaktionslösung eingebracht, wobei
sich das Biotinylierungsreagenz sofort auflöst. Eine vorherige
Trennung durch Gelfiltration kann ausgeführt werden, ist aber
nicht erforderlich, sondern die Reaktion wird unmittelbar
weitergeführt. Dieser zweite Syntheseschritt erfolgt ebenfalls
unter Rühren bei Raumtemperatur. Die Reaktionszeit beträgt
zunächst 2,5 Std., über Nacht wird das Reaktionsgemisch im
Kühlschrank gelagert.
Die Aufarbeitung erfolgt durch Dialyse, zunächst viermal gegen
Wasser, anschließend gegen 0,05 M PBS(pH 7,4)/0,05%
Natriumazid. Das weitgehend klare Retentat wird vor der
spektralfotometrischen Messung zweckmäßigerweise durch ein 0,6
µm-Sartorius-Filter gedrückt.
Zur Grundbeschichtung der Kavitäten (Wells) einer
Mikrotiterplatte (MTP) aus thermostabilem Polycarbonat werden
in jedes Well 50-250 µl hochvernetztes biotinyliertes γ-
Globulin (Rind) gemäß Beipiel 1 in einer Konzentration von 10-
20 µg/ml in 0,1 M Carbonatpuffer (pH ≧ 11) pipettiert und 12
Stunden bei 25°C stehen gelassen.
Zum Aufbau der Oberschicht werden die Wells nach dem Waschen
mit destilliertem Wasser mit dem Zusatz von 0,9% NaCl 12
Stunden bei 25°C mit einer Lösung des hochvernetzten
Streptavidins (V2) in 0,05/0,15 M PBS-Puffer (pH 7,2)
behandelt. Nach erneutem Waschen mit destilliertem Wasser mit
dem Zusatz von 0,9% NaCl und Blocken mit destilliertem Wasser
mit Zusatz von 0,1% Casein und 0,9% NaCl wird die Schicht
mit Denhardt'scher Lösung in 0,1 M Mc Ilvaine-Puffer (pH 6,0)
konserviert. Nach Trocknung können die beschichteten MTP (mit
Trockenmittel) in Folienbeuteln verschweißt und im Kühlschrank
gelagert werden.
Das Beispiel beschreibt die Bestimmung der Biotin-
Bindungskapazität thermostabil beschichteter MTP nach
differenten Temperaturbelastungen. Die unterschiedlichen
Molekülgrößen von Biotin, biotinylierten Oligonukleotiden oder
anderen biotinylierten Verbindungen, aber auch chemische
Einflüsse führen zu unterschiedlichen Ergebnissen. Als
Bestimmungsverfahren für die Biotin-Bindungskapazität der
Streptavidinbeschichtung wird ein kompetitiver
Enzymimmunoassay mit Hilfe von Biotin (biotinylierte
Verbindungen) und biotinylierter Meerrettich-Peroxidase
(Biotin-POD) eingesetzt. Die Bindungsausbeute wird durch
Differenzmessung in der flüssigen freien Phase ermittelt. Aus
der Differenz zwischen dem Totalwert (Enzymaktivität der
eingesetzten Biotin-POD) und der ungebundenen Enzymaktivität
in der überstehenden freien Phase des Assays kann die Biotin-
Bindungskapazität der Trägerschicht berechnet werden.
Zur Charakterisierung der Thermostabilität der beschichteten
Platten werden die Wells mit einem PCR-Puffergemisch (0,01 M
Tris/HCl, 0,15 M NaCl, 0,002 M MgCl2; pH 7,9) gefüllt und über
einen fixierten Zeitraum festgelegten Temperaturen
ausgesetzt:
25°C, 60°C, 80°C, 90°C und 96°C.
25°C, 60°C, 80°C, 90°C und 96°C.
Zum Vergleich werden an sich bekannte MTP aus Polystyrol mit
Standard-Beschichtung (biotinyliertes Rinderserumalbumin in
0,1 M Carbonatpuffer (pH 9,6) und Streptavidin oder Avidin)
dem gleichen Temperaturregime ausgesetzt.
Die chemothermische Stabilität wird durch Belastung bei 25°C
mit 0,15 M NaOH, bei 65°C mit 0,1 M NH4OH und bei 85°C mit
PCR-Puffer ermittelt. Die chemothermische Belastung der
Streptavidin-Schichten wird durch Waschen der Wells mit
destilliertem Wasser mit Zusatz von 0,9% NaCl und 0,1% Tween
20 bei Raumtemperatur beendet und die noch vorhandene
Bindungskapazität für Biotin oder biotinylierte Verbindungen
mit Hilfe eines kompetitiven Biotin-EIA bestimmt.
In diesem kompetitiven Biotin-EIA kommen Reaktionsmischungen
aus verschiedenen konzentrierten Lösungen von d(+)-Biotin oder
biotinylierter Verbindung (Biot-Oligonukleotid, Biot-IgG) und
einer Lösung einer konstanten Konzentration an Biotin-POD in
0,005 M PBS-Puffer (pH 7,4/0,1% BSA) zur Anwendung. Diese
Reaktionsmischungen (50-200 µl) sollte mindestens 2 Stunden
bei 25°C mit den beschichteten Wells der chemothermisch
belasteten MTP reagieren. Der Biotin-POD-Gehalt wird über eine
Enzymimmunoassay-Standardkurve der Extinktionen der
Substratreaktion mit o-Phenylendiamin(OPD) fotometrisch in der
flüssigen Phase bestimmt. Dabei wird die Extinktion des an der
festen Phase Gebundenen (B) als Differenz des Totalwertes der
Extinktion (T) und der in der freien Phase des
Reaktionsüberstandes (F) gemessenen Extinktion bestimmt (B = T -
F). Statt der Extinktionswerte werden für die weitere
Auswertung die Bindungsraten B/T durch Division der Extinktion
der gebundenen Phase durch die Extinktion des Totalwertes
verwendet. Nach Ausführung des o. g. Experiments können
Enzymimmunoassay-Standardkurven aufgestellt werden, in der wie
in anliegender Abbildung die sich ergebenen B/T-Werte in
Abhängigkeit zu den eingesetzten Biotin-Konzentrationen
dargestellt sind. Mit Hilfe eines Kurven-Fits unter Verwendung
des Hill-Modells kann die Biotin-Bindungskapazität der
Oberflächenschicht ermittelt werden. Die Unterschiede der
Biotin-Bindungskapazität zwischen den erfindungsgemäß mit
vernetztem thermostabilen Streptavidin und den mit
Streptavidin/Avidin nach Standard beschichteten Oberflächen
werden in den folgenden Tabellen aufgezeigt:
Claims (13)
1. Verfahren zur Herstellung einer chemo- und thermostabilen
Festphasenmatrix zur Kombination von PCR und
Hybridisierungsassay,
dadurch gekennzeichnet, dass
ein biotinyliertes Vernetzungsprodukt V1 mit einem
Molekulargewicht ≧ 500 KD als Klettsubstanz mit einem
inerten, thermostabilen Trägermaterial in stark
basischem Puffer bei einem pH-Wert ≧ 11,0 oder in stark
saurem Milieu bei einem pH-Wert ≦ 3,0 in Kontakt gebracht
wird und nach Fixierung an der Trägeroberfläche über die
Biotinbrücke vernetztes Avidin, vernetztes Streptavidin
oder vernetztes rekombinantes Streptavidin oder auch
Gemische dieser als hochmolekularen Vernetzungsprodukte V
2 aufgebracht werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, dass
das Vernetzungsprodukt V1 ein Protein ist, vorzugsweise
Rindergammaglobulin oder Immunglobulin-Gamma einer
anderen Spezies.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet, dass
die Oberfläche des Trägermaterials aus bis 100°C
thermostabilem Kunststoff, vorzugsweise aus Polycarbonat
oder Polypropylen, besteht oder dass als Träger auch
silikatische, oxydische oder metallische und
Halbleiteroberflächen sowie auch Kombinationen aus den
genannten Trägermaterialien eingesetzt werden.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet, dass
Vernetzung des Klettsubstanz V1 und der Vernetzungs
produkte V2 nach an sich bekannten Verfahren unter
Verwendung an sich bekannter bifunktioneller Linker,
vorzugsweise Disuccinimidylsuberat (DSS), ausgeführt
wird.
5. Chemo- und thermostabile Festphasenmatrix zur
Durchführung von PCR und Hybridisierungsassays,
dadurch gekennzeichnet, dass
diese aus einem inerten, thermostabilen Trägermaterial
besteht und einer thermostabilen Schicht, die sich aus
einem biotinyliertem Vernetzungsprodukt V1 mit einem
Molekulargewicht ≧ 500 KD in Kombination mit einem
hochmolekularem Vernetzungsprodukt V2 zusammensetzt.
6. Festphasenmatrix nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet, dass
das Vernetzungsprodukt V1 ein Protein, vorzugsweise
Rindergammaglobulin oder Immunglobulin-gamma einer
anderen Spezies ist.
7. Festphasenmatrix nach Anspruch 5 oder 6,
dadurch gekennzeichnet, dass
das Vernetzungsprodukt V2 vernetztes Avidin,
vernetztes Streptavidin oder rekombinantes Streptavidin
oder auch Gemische der genannten Substanzen sind.
8. Festphasenmatrix nach einem der Ansprüche 5 bis 7,
dadurch gekennzeichnet, dass
das inerte, thermostabile Trägermaterial eine
Kunststoffoberfläche, vorzugsweise aus Polycarbonat oder
Polypropylen, aufweist.
9. Festphasenmatrix nach einem der Ansprüche 5 bis 8,
dadurch gekennzeichnet, dass
die Träger silikatische, oxydische, metallische oder
Halbleitermaterialien sowie auch Kombinationen aus den
genannten Trägermaterialien sind.
10. Verwendung einer Festphasenmatrix nach einem der
Ansprüche 5 bis 9 zur PCR und Hybridisierungsassays,
wobei diese auch als Kombination an derselben
Festphasenmatrix durchgeführt werden.
11. Verwendung nach Anspruch 10,
dadurch gekennzeichnet, dass
an ihrer Oberfläche biotinylierte Oligonukleotide,
biotinylierte DNS- oder RNS-Fragmente sowohl chemo- als
auch thermostabil fixiert werden.
12. Verwendung der Festphasenmatrix nach einem der Ansprüche
10 bis 11,
dadurch gekennzeichnet, dass
alle Varianten von Festphasen-Hybridisierungstechniken an
ihr durchgeführt werden.
13. Verwendung der Festphasenmatrix nach Anspruch 5 bis 12,
dadurch gekennzeichnet, dass
dass Hybridisierungs-, Denaturierungs- Kettenverlän
gerungs- oder sonstige Reaktionsschritte ebenfalls bei
Temperaturen ≧ 60°C erfolgen.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10020885A DE10020885A1 (de) | 1999-05-03 | 2000-04-28 | Verfahren zur Herstellung einer chemo- und thermostabilen Festphasenmatrix für Polymerase Chain Reaction (PCR) und DNA-Hybridisierungsassay |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19921099 | 1999-05-03 | ||
| DE10020885A DE10020885A1 (de) | 1999-05-03 | 2000-04-28 | Verfahren zur Herstellung einer chemo- und thermostabilen Festphasenmatrix für Polymerase Chain Reaction (PCR) und DNA-Hybridisierungsassay |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE10020885A1 true DE10020885A1 (de) | 2001-01-18 |
Family
ID=7907316
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE10020885A Withdrawn DE10020885A1 (de) | 1999-05-03 | 2000-04-28 | Verfahren zur Herstellung einer chemo- und thermostabilen Festphasenmatrix für Polymerase Chain Reaction (PCR) und DNA-Hybridisierungsassay |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE10020885A1 (de) |
| WO (1) | WO2000066770A2 (de) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004018707A3 (de) * | 2002-08-15 | 2004-07-08 | Biotez Berlin Buch Gmbh | Verfahren zum nachweis von einzelnukleotid-polymorphismen (snp) in genen des arzneimittelmetabolismus und testkit zur durchführung des verfahrens |
| EP1561823A1 (de) * | 2004-02-04 | 2005-08-10 | Biotez Berlin-Buch GmbH | Verfahren zum Nachweis von Einzelnukleotid-polymorphismen (SNP) in Genen des Arzneimittelmetabolismus und Testkit zur Durchführung des Verfahrens |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3806431A1 (de) * | 1988-02-29 | 1989-09-07 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur herstellung einer festphasenmatrix |
| ATE131617T1 (de) * | 1988-10-17 | 1995-12-15 | Molecular Devices Corp | Haptenderivatisierte aufnahmemembran und diagnostische tests, die eine solche membran verwenden |
| FR2724461B1 (fr) * | 1994-09-09 | 1996-12-20 | Prolabo Sa | Microsphere de latex biotinylee, procede de preparation d'une telle microsphere et utilisation en tant qu'agent de detection biologique |
| DE19724787A1 (de) * | 1997-06-06 | 1998-12-10 | Biotez Berlin Buch Gmbh Bioche | Streptavidin/Avidin beschichtete Oberflächen |
| WO1998059243A1 (en) * | 1997-06-24 | 1998-12-30 | The Trustees Of Boston University | High density streptavidin supports |
-
2000
- 2000-04-28 DE DE10020885A patent/DE10020885A1/de not_active Withdrawn
- 2000-04-28 WO PCT/DE2000/001309 patent/WO2000066770A2/de not_active Ceased
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004018707A3 (de) * | 2002-08-15 | 2004-07-08 | Biotez Berlin Buch Gmbh | Verfahren zum nachweis von einzelnukleotid-polymorphismen (snp) in genen des arzneimittelmetabolismus und testkit zur durchführung des verfahrens |
| EP1561823A1 (de) * | 2004-02-04 | 2005-08-10 | Biotez Berlin-Buch GmbH | Verfahren zum Nachweis von Einzelnukleotid-polymorphismen (SNP) in Genen des Arzneimittelmetabolismus und Testkit zur Durchführung des Verfahrens |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2000066770A2 (de) | 2000-11-09 |
| WO2000066770A3 (de) | 2001-08-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE60123480T2 (de) | Behandlung von hydrophoben oder hydrophilen oberflächen mit polymeren | |
| DE69614539T2 (de) | Immunoassay und kit mit zwei reagenzien, die vernetzt werden, wenn sie an einem analyten haften | |
| DE69526479T2 (de) | Stoff für die Immobilisierung von biologisch-aktiver Substanz und Verfahren zur Immobilisierung von dieser Substanz unter Gebrauchnahme selbigen Stoffes | |
| DE69032847T2 (de) | Hydrophobe Nukleinsäure-Sonde | |
| DE770876T1 (de) | Screening-Verfahren zur Ligand-Identifizierung von Zielproteinen | |
| CH686518A5 (de) | Granulares Polymerkomposit, Herstellungsverfahren fur dieses und diagnostische Mittel. | |
| DE3209149A1 (de) | Verfahren zur gemeinsamen immunologischen bestimmung von prokollagen-peptid (typ iii) und prokollagen-peptid col 1 (typ iii) und verfahren zur herstellung von anti-prokollagen-peptid col 1 (typ iii)-serum | |
| EP1589028A3 (de) | Modifizierte Oligonukleotide, deren Herstellung sowie deren Verwendung | |
| DE3715485A1 (de) | Stabilisierung von ss-galactosidase | |
| EP0408078B1 (de) | Verfahren zur Herstellung einer mit einer immunologisch aktiven Substanz beschichteten Festphasenmatrix | |
| CH654016A5 (de) | Verfahren zur fixierung von biologisch aktivem protein oder von substrat von biologisch aktivem protein an polyamid. | |
| DE3407814A1 (de) | Phasentraeger fuer die verteilungschromatographie von makromolekuelen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung | |
| DE3717209C2 (de) | ||
| CH626092A5 (de) | ||
| EP1380839B1 (de) | Erzeugung räumlich scharf begrenzter Festphasen für Bindungsassays | |
| DE10020885A1 (de) | Verfahren zur Herstellung einer chemo- und thermostabilen Festphasenmatrix für Polymerase Chain Reaction (PCR) und DNA-Hybridisierungsassay | |
| EP0986755B1 (de) | Streptavidin/avidin beschichtete oberflächen | |
| DE69925870T2 (de) | Verfahren zur bereitstellung von wachstumsfaktozubereitungen (tgf-beta und igf-1) mit niedriger gegenseitiger verunreinigung aus milchprodukten | |
| EP0134025B1 (de) | Makromolekulare Massen mit chemisch aktiven Füllstoffen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung | |
| DE68921261T2 (de) | Auf menschlichem Serum basierende stabile Kontrolle. | |
| DE3806431A1 (de) | Verfahren zur herstellung einer festphasenmatrix | |
| DE3802452A1 (de) | Verfahren zur blutgruppenbestimmung mit hilfe der festphasen-methode unter verwendung blutgruppenspezifischer antikoerper vom igm-typ, sowie traeger und kit zur durchfuehrung des verfahrens | |
| DE10158713A1 (de) | Träger mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern und Verfahren zu dessen Herstellen | |
| DE69610410T2 (de) | Verwendung eines Osmolyten zur Verringerung oder Aufhebung von nichtkovalenten Bindungen biologischer Moleküle an inerten Oberflächen | |
| EP1532454A2 (de) | Verfahren zum nachweis von antikörpern und/oder antigenen in einer testflüssigkeit, insbesondere bei der blutgruppenbestimmung |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8139 | Disposal/non-payment of the annual fee |