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DE69610410T2 - Verwendung eines Osmolyten zur Verringerung oder Aufhebung von nichtkovalenten Bindungen biologischer Moleküle an inerten Oberflächen - Google Patents

Verwendung eines Osmolyten zur Verringerung oder Aufhebung von nichtkovalenten Bindungen biologischer Moleküle an inerten Oberflächen

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DE69610410T2
DE69610410T2 DE69610410T DE69610410T DE69610410T2 DE 69610410 T2 DE69610410 T2 DE 69610410T2 DE 69610410 T DE69610410 T DE 69610410T DE 69610410 T DE69610410 T DE 69610410T DE 69610410 T2 DE69610410 T2 DE 69610410T2
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osmolyte
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pcr
zwitterionic
betaine
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Elmar Maier
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Qiagen GmbH
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Qiagen GmbH
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
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Description

  • Verwendung eines Osmolyten zur Verringerung oder Aufhebung von nicht-kovalenten Bindungen biologischer Moleküle an inerten Oberflächen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines zwitterionischen Osmolyten mit der Formel wie in Anspruch 1 beschrieben zur Aufhebung von nicht-kovalenten Interaktionen biologischer Moleküle mit inerten Oberflächen. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung Kits, welche für Verwendungen gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können.
  • Die Entwicklung neuer Materialien hatte einen erheblichen Einfluss auf eine große Vielfalt moderner Technologien. Die Einführung von z. B. Silicium, Galliumarsenit oder von Polykristall-Materialien hat in der Vergangenheit die Halbleiter-Technologie stark vorangebracht. In der modernen Biologie sind ähnliche Entwicklungen beobachtet worden. So sind während der vergangenen zwei Jahrzehnte in immunometrischen Verfahren wie ELISAs Materialien entwickelt worden, welche eine Standardisierung der experimentellen Protokolle und eine Minimierung der Material-begründeten Fehlerraten bei experimentellen Ergebnissen erlauben. Eine davon verschiedene, jedoch gleichermaßen wichtige Entwicklung beschäftigt sich mit der Förderung neuer Trägermaterialien, welche in der (Säulen)-Chromatographie für die Reinigung und Isolierung interessierender biologischer Stoffe verwendet werden sollen.
  • Eines der Hauptprobleme, mit welchem Wissenschaftler in einer großen Anzahl biologischer Analyse- und Isolierungsverfahren konfrontiert wurden, ist, dass experimentelle Exaktheit und Herstellungserträge durch Hintergrund oder Probleme mit unerwünschten und möglicherweise unspezifischen Interaktionen beeinträchtigt werden können. Solche Probleme können zum Beispiel durch nicht-kovalente Bindungsinteraktionen von Proteinen oder anderen biologischen Stoffen an Träger- Oberflächen entstehen. Um solche Probleme in ELISA-Verfahren zu überwinden, werden freie Bindungsstellen auf Trägermaterialien wie Polystyrol mit nicht-verwandten biologischen Materialien wie heterologe Proteine geblockt, bevor auf den interessierenden Stoff getestet wird.
  • Zum Beispiel wird in Zouali et al., "A rapid ELISA for measurement of antibodies to nucleic acid antigens using UVtreated polystyrene microplates", Rinder-Serumalbumin (BSA) als Absättigungswirkstoff verwendet, bevor auf die entsprechenden Antikörper oder das Serum getestet wird. Andere Verfahren zur Reduzierung unspezifischer Bindung und/oder von Rand-Effekten auf ELISA-Mikrotiterplatten umfassen die Zugabe von Zucker und/oder Alkohol wie Glycerin zu den Reaktionsgemischen, wie in EP-A-0153875 offenbart. Ein Verfahren, welches in jüngster Vergangenheit die Molekularbiologie revolutioniert hat, ist die PCR- Technologie. Natürlich sind im Hinblick auf die breite Anwendbarkeit der PCR große Anstrengungen unternommen worden und werden gegenwärtig unternommen, um Facetten dieser Technologie weiter zu verbessern. Einer dieser Fortschritte ist auf die Herstellung von Mikro-Reaktionsvolumina bei PCR- Chips gerichtet, d. h. im Mikrobereich hergestellte Silicium- Chips, gebunden an ein flaches Stück Glas, wobei eine PCR- Reaktionskammer gebildet wird; siehe z. B., Shoffner et al., "Chip PCR. I. Surface passivation of microfabricated siliconglass chips for PCR", Nucl. Acids Res. 24 (1996), 375-379. Da es sich zeigte, dass natives Silicium, welches bis jetzt für die Herstellung von PCR-Chips verwendet wurde, ein Hemmstoff für die PCR ist, suchten diese Forscher nach Materialien und Verfahren, um verlässliche PCR-Ergebnisse zu erhalten, unbeeinträchtigt von solchen Problemen mit Hemmung oder Hintergrund. Sie schlagen vor, eine oxidierte Silicium- (SiO&sub2;)-Oberfläche zu verwenden, um ihr Ziel zu erreichen.
  • Trotz dieser Leistungen wäre es in höchstem Maße wünschenswert und vorteilhaft, einen Weg zu finden, unspezifische oder nicht-kovalente Interaktionen zwischen inerten Oberflächen und biologischen Molekülen zu reduzieren oder zu eliminieren, ohne die üblicherweise erhältlichen Oberflächen verändern zu müssen oder auf die Verwendung von nur einer kleinen Auswahl geeigneter inerter Oberflächen eingegrenzt zu sein. Eine erfolgreiche Entwicklung eines solchen Mittels würde in der modernen Biologie natürlich eine weit verbreitete Anwendbarkeit haben und nicht auf die Verwendung in der PCR-Technologie eingegrenzt sein. Zum Beispiel haben Volkmuth und Austin ein Verfahren zur Mikro- Elektrophorese von DNA-Molekülen entworfen (Volkmuth and Austin, "DNA electrophoresis in microlithographic arrays", Nature 358 (1992), 600-602). Solche Verfahren könnten ebenfalls vom Einschluss von Osmolyten wie Betain in die Puffer-Systeme profitieren.
  • Damit war das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende technische Problem, die hierin vorstehend detailliert beschriebenen Schwierigkeiten im Stand der Technik zu überwinden und ein System zu entwickeln, welches unerwünschte Interaktionen biologischer Moleküle mit inerten Oberflächen reduziert oder eliminiert.
  • Die Lösung des technischen Problems wird erreicht, indem die Ausführungsformen, welche in den Ansprüchen gekennzeichnet sind, bereitgestellt werden.
  • Demgemäss betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines zwitterionischen Osmolyts mit der Formel wie in Anspruch 1 zur Reduzierung oder Aufhebung nicht-kovalenter Interaktionen von biologischen Molekülen mit inerten Oberflächen.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung hat man überraschenderweise herausgefunden, dass die Zugabe eines zwitterionischen Osmolyten mit der Strukturformel
  • in der R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; ein H-Atom, eine CH&sub3;-, C&sub2;H&sub5;-Gruppe oder einen beliebigen anderen Alkylrest bedeuten, und R' ein beliebiger Aminosäurerest ist, in einer geeigneten Konzentration zu einer Lösung, welche ein biologisches Molekül enthält, die nicht-kovalente Interaktion des Moleküls mit der Oberfläche reduzieren, wenn nicht verhindern wird. Osmolyte (oder osmotische Lösungen) sind in einer großen Vielfalt Wasser-gestresster prokaryotischer und eukaryotischer Organismen zu finden. Die drei Arten osmolytischer Systeme, die in allen solchen Organismen, ausgenommen die Halobakterien, gefunden werden, sind mehrwertige Alkohole (wie Glycerin und Sacharose), freie Aminosäuren und ihre Derivate (wie Taurin und β-Alanin) und Methylamine (z. B. Trimethylamin-N-oxid (TMAO), Betain und Sarcosin) oder Kombinationen von Methylaminen und Harnstoff (siehe für einen Überblick Yancey et al., "Living with water stress: evolution of osmolyte systems" Science 217 (1982), 1214-1222).
  • Einer der hauptsächlichen Vorteile der vorliegenden Erfindung ist, dass die einfache Zugabe eines zwitterionischen Osmolyten mit der Formel wie in Anspruch 1 beschrieben zu einer solchen Lösung in günstiger Weise die Interaktion der Moleküle mit einer großen Vielfalt inerter Oberflächen reduziert oder verhindert. Die spezifische Gestaltung oder Auswahl einer geeigneten Oberfläche für einen spezifischen experimentellen Aufbau oder Zweck ist aufgrund dessen nicht länger notwendig.
  • Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass sie die einfache Gestaltung einer Vielzahl von zuvor kritischen Experimenten erlaubt und dem interessierten Forscher Zeit und Kosten erspart.
  • Der Begriff "biologisches Molekül", wie er hierin verwendet wird, betrifft organische Moleküle, die ein Teil eines Organismus oder einer lebenden Zelle sind, oder Derivate solcher Moleküle. Diese Moleküle können natürlichen, synthetischen oder halbsynthetischen Ursprungs sein.
  • Wie hierin verwendet, hat der Begriff "inert" die Bedeutung von "geringe oder keine Fähigkeit zu einer chemischen Reaktion". Er besitzt deshalb die gleiche Bedeutung wie Trägheit in Verbindung mit Stickstoff, welcher in freier Form in der Atmosphäre vorkommt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Anwendung der vorliegenden Erfindung ist der zwitterionische Osmolyt eine Aminosäure oder deren Methylierungsprodukt.
  • In einer zusätzlichen am meisten bevorzugten Ausführungsform der Verwendung der vorliegenden Erfindung ist besagter zwitterionische Osmolyt Betain und bevorzugt Glycin-Betain.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt der Osmolyt in einer Endkonzentration von 1-2,5 M vor. Die vorteilhaften Eigenschaften des Osmolyts treten auch auf, wenn er in einer Konzentration, die niedriger als 1 M ist, in dem Reaktionsgemisch enthalten ist. Besonders vorteilhafte Ergebnisse werden jedoch erhalten wenn der Osmolyt in einer Endkonzentration von 1-2,5 M vorhanden ist.
  • In einer zusätzlichen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das biologische Molekül ein Makromolekül. Der Begriff "Makromolekül" in Verbindung mit dem Begriff "biologisches Molekül" ist dem Fachmann vollkommen klar und muss hier nicht weiter beschrieben werden.
  • In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform der Verwendung der vorliegenden Erfindung sind die Makromoleküle ein Kohlenhydrat, eine Polynucleinsäure oder ein Polypeptid, oder Kombinationen oder Modifikationen davon. Die Kombinationen oder Modifikationen müssen nicht notwendigerweise eine biologische Funktion besitzen.
  • Alternativ dazu kann ihre biologische Funktion im Stand der Technik (noch) nicht bekannt sein; siehe zum Beispiel die Diskussion über Peptid-Nucleinsäuren (Nielsen et al., Science 254 (1991), 1497-1500). Die modifizierten biologischen Makromoleküle können jedoch nahezu die gleichen physikochemischen Eigenschaften wie die biologischen Makromoleküle besitzen, von welchen sie abstammen und können die gleichen oder ähnliche Anwendungen in z. B. der Molekularbiologie besitzen.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das biologische Molekül ein Peptid, ein Oligonucleotid oder eine Kombination oder Modifikation davon.
  • In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Polynucleinsäure oder das Oligonucleotid DNA.
  • Der Begriff "DNA", wie er hierin verwendet wird, umfasst jede Art von DNA, im Besonderen cDNA und genomische DNA.
  • In einer weiteren am meisten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Polynucleinsäure oder das Oligonucleotid RNA.
  • Der Begriff "RNA", wie er im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet wird, umfaßt jede Art von RNA und im Besonderen mRNA.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die inerte Oberfläche eine Siliciumoberfläche, ein Silicium-Wafer, eine Glasoberfläche oder Kombinationen oder chemische Modifikationen davon. Am geeignetsten ist besagte Substanz ein hergestelltes Silicium. Das Silicium kann erhalten werden z. B. durch Standard-Herstellungsverfahren oder Bearbeitungstechniken wie Photolithographie.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft zusätzlich einen Kit, umfassend mindestens
  • (a) eine konzentrierte Stammlösung eines Osmolyten wie hierin vorstehend spezifiziert;
  • (b) eine Reaktionspuffer-Formulierung, welche einen Osmolyten wie hierin vorstehend spezifiziert enthält; und/oder
  • (c) eine Enzym-Formulierung, welche einen Osmolyten wie hierin vorstehend spezifiziert enthält.
  • Die verschiedenen Komponenten des erfindungsgemäßen Kits sind vorzugsweise in Standard-Reaktionsgefäßen und unabhängig voneinander formuliert. Die Konzentrationen, welche für die Stammlösungen verwendet werden, die in dem erfindungsgemäßen Kit enthalten sind, eignen sich dazu, eine angemessene Verdünnung des Osmolyten zu erlauben, die für die Lehren der vorliegenden Erfindung zweckmäßig ist. In den Ausführungsformen b) und c) des erfindungsgemäßen Puffers ist der Osmolyt vorzugsweise in seiner Endkonzentration enthalten. Die Bereiche und Grenzen besagter Endkonzentrationen sind hierin vorstehend in der Beschreibung bereitgestellt.
  • Die Figuren zeigen:
  • Fig. 1: PCR in Anwesenheit von Siliciumpartikeln und zwitterionischen Osmolyten
  • Die PCRs wurden mit einem 1,2 kb-Fragment menschlicher genomischer DNA in Anwesenheit von Siliciumpartikeln (ungefähr 0,5 mm · 0,5 mm · 0,3 mm) und 1 M Betain durchgeführt.
  • Spur 1: λ-BstEII-Marker; Spuren 2-5: PCR (50 ul) durchgeführt in Puffer mit Wasser und verschiedenen Mengen von Siliciumpartikeln: Spur 2: 10 Partikel; Spur 3: 50 Partikel; Spur 4: 75 Partikel; Spur 5: keine Partikel als eine Kontrolle; Spuren 6-9: PCRs (50 ul) durchgeführt in Puffer mit 1 M Betain und verschiedenen Mengen von Siliciumpartikeln: Spur 6: 10 Partikel; Spur 7: 50 Partikel; Spur 8: 75 Partikel; Spur 9: keine Partikel als eine Kontrolle.
  • Fig. 2: PCR in Anwesenheit von Siliciumpulver und zwitterionischen Osmolyten
  • PCRs wurden mit einem 1,5 kb-Fragment menschlicher genomischer DNA in Anwesenheit von Siliciumpulver und molaren Konzentrationen von Betain durchgeführt. Beachte, dass die PCRs in molaren Konzentrationen von Betain die wirkungsvolle und spezifische PCR-Amplifikation erlauben und den hemmenden Effekt von Siliciumoberflächen reduzieren.
  • Spur 1: X-BstEII-Marker; Spur 2: PCR, durchgeführt in einem Standard-PCR-Puffer ohne irgendwelches Siliciumpulver; Spuren 3-6: PCR-Reaktion, durchgeführt mit 4,6 mg Siliciumpulver in 100 fll PCR-Volumen; Spur 3: auf Wasser basierender Puffer; Spur 4 : 0,5 M Betain; Spur 5: 1 M Betain; Spur 6: 2 M Betain.
  • Die Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
    • Beispiel 1: PCR in Anwesenheit von Siliciumpartikeln und zwitterionischen Osmolyten
  • In diesem Beispiel ist gezeigt, dass der hemmende Effekt inerter Oberflächen wie reine Siliciumoberflächen in einer PCR als einer Nucleinsäure-Matrize-abhängigen Reaktion durch die Anwesenheit von Osmolyten wie Betain (in den Beispielen wurde Glycin-Betain von Sigma verwendet) reduziert werden kann.
  • Silicium ist ein sehr interessantes Material, nicht nur für die Halbleiter-Technologie, sondern auch auf dem biologischen Gebiet, da es ein Material ist, mit welchem sehr einfach umgegangen werden kann und aus welchem sehr schnell dreidimensionale Mikrostrukturen hergestellt werden können. Deshalb sind Experimente wie PCR in Anwesenheit von reinem Silicium in der Zukunft sehr wichtig im Hinblick auf die Miniaturisierung biologischer Verfahren wie z. B. bei Silicium-Wafern. Es ist im Allgemeinen bekannt, dass reines Silicium aus vielen Gründen biologische Verfahren wie PCRs hemmen kann. Einer dieser Gründe ist, dass die Moleküle mit relativ großen Oberflächen im Vergleich zu den kleinen Volumen, welche in z. B. Mikro-Reaktionskammern verwendet werden, interagieren. Um die hemmende Wirkung reiner Siliciumoberflächen in einer PCR zu testen, wurden PCR- Experimente mit einem 1,2 kb-Fragment genomischer menschlicher DNA, welche in einen M13-Vektor cloniert wurde, in Anwesenheit von zerdrückten Siliciumpartikeln (ungefähr 0,5 mm · 0,5 mm · 0,3 mm) als ein Modellsystem, durchgeführt. Die Reaktionen wurden mit 1 ng M13-DNA in 1 x-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8, 8 und 50 mM KCl) mit ansteigenden Mengen (10, 50, 75) von Siliciumpartikeln in Wasser (Fig. 1, Spuren 2-5) und 1 M Betain (Fig. 1, Spuren 6-9)), 0,2 uM von jedem Primer (M13-40 (24 -mer): 5' -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'; M13-Rev (24-mer): 5 '-TTTCACACAGGAAACAGCTATGAC-3'), 100 > IM von jedem dNTP, 1,5 mM MgCl&sub2; und 2,5 Einheiten Taq DNA-Polymerase in einem Gesamtvolumen von 50 ul durchgeführt.
  • Die Betain enthaltenden Reaktionsgemische wurden durch Zugabe des erforderlichen Gemisches von Wasser und einer 5 M- Stammlösung von Betain auf ein Endreaktionsvolumen von 50 ul hergestellt.
  • Die Gemische wurden während 30 Zyklen bei 94ºC für 20 Sek., 55ºC für 30 Sek. und bei 73ºC für 2 Min. 30 Sek. umgesetzt. 1 ug einer λ-BstEII-Verdauung wurde als Marker auf das Gel aufgetragen. Weiterhin wurden 5 ul des PCR-Produktes zusammen mit 2 ul Gelauftragspuffer (70% Glycerin, 0,02 mg/ml Bromphenolblau) auf die Agarosegele aufgetragen.
  • Die Ergebnisse (siehe Fig. 1) zeigen, dass die hemmende Wirkung ansteigender Mengen von Siliciumpartikeln durch Zugabe von Betain in molaren Konzentrationen zu dem PCR- Puffer überwunden werden kann.
    • Beispiel 2: PCR in Anwesenheit von Siliciumpulver und zwitterionischen Osmolyten
  • In diesem Beispiel ist gezeigt, dass der hemmende Effekt von Siliciumpulver in einer PCR, welcher kürzlich gezeigt wurde (Shoffner et al., loc. cit), durch die Anwesenheit von Osmolyten wie dem zwitterionischen Osmolyt Betain im Reaktionsgemisch wirkungsvoll verringert werden kann.
  • PCR-Experimente wurden unter Verwendung eines 1,5 kb- Fragments menschlicher genomischer DNA, welche in einen M13- Vektor cloniert wurde, als ein Modellsystem durchgeführt. Die PCR mit Silicium wurde mit 4,6 mg Siliciumpulver (Sigma, Vernetzungsgrad 325, 99%, Nr. 21.561-9) in einem Endvolumen von 100 ul durchgeführt. Es wurde kürzlich gezeigt, dass diese Konzentration an reinem Siliciumpulver PCRs hemmt (Shoffner et al., loc. cit.).
  • PCRs wurden in 1 · Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8, 8 und 50 mM KCl), in ausschließlich Wasser (Fig. 2, Spur 2) und 4,6 mg Siliciumpulver (Fig. 2, Spuren 3-6) in Wasser (Fig. 2, Spur 3), 0,5 M Betain (Fig. 2, Spur 4), 1 M Betain (Fig. 2, Spur 5), 2 M Betain (Fig. 2, Spur 6), 1 ng M13 DNA, 0,3 uM von jedem Primer (M13-40 (24-mer): 5'- CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'; M13-Rev. (24-mer): 5' - TTTCACACAGGAAACAGCTATGAC-3fl, 200 uM von jedem dNTP, 1,5 mM MgCl&sub2; und 10 Einheiten Taq DNA-Polymerase in einem Gesamtvolumen von 100 ul durchgeführt. Die Reaktionsgemische, welche Betain enthalten, wurden durch Zugabe des erforderlichen Gemisches an Wasser und einer 5 M Stammlösung von Betain zu dem Endreaktionsvolumen von 100 ul hergestellt. Die Gemische wurden während 30 Zyklen bei 94ºC für 20 Sek., 55ºC für 30 Sek. und bei 73ºC für 2 Min. 30 Sek. umgesetzt. 1 ug einer λ-BstEII-Verdauung wurde als Marker auf das Gel aufgetragen. Weiterhin wurden 5 ul des PCR-Produkts zusammen mit 2 ul Gelauftragslösung (70% Glycerin, 0,02 mg/ml Bromphenolblau) auf die Agarosegele aufgetragen.

Claims (10)

1. Verwendung eines zwitterionischen Osmolyts zur Reduzierung oder Aufhebung nicht-kovalenter Interaktionen von biologischen Molekülen mit inerten Oberflächen, wobei der zwitterionische Osmolyt die Strukturformel
besitzt, in der R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; ein H-Atom, eine CH&sub3;-, C&sub2;H&sub5;-Gruppe oder einen beliebigen anderen Alkylrest bedeuten, und R' ein beliebiger Aminosäurerest ist.
2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei der zwitterionische Osmolyt eine Aminosäure oder deren Methylierungsprodukt ist.
3. Verwendung nach Anspruch 1, in wobei der zwitterionische Osmolyt Betain und bevorzugt Glycin-Betain ist.
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Osmolyt in einer Endkonzentration von 1 bis 2,5 M vorhanden ist.
5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das biologische Molekül ein Makromolekül ist.
6. Verwendung nach Anspruch 5, wobei das Makromolekül ein Kohlenhydrat, eine Polynucleinsäure, ein Polypeptid oder eine Kombination oder Modifikation dieser ist.
7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das biologische Molekül ein Peptid, ein Oligonucleotid oder eine Kombination oder Modifikation dieser ist.
8. Verwendung nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Polynucleinsäure oder das Oligonucleotid DNA ist.
9. Verwendung nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Polynucleinsäure oder das Oligonucleotid RNA ist.
10. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die inerte Oberfläche eine Siliciumoberfläche, ein Silicium-Wafer, eine Glasoberfläche oder Kombinationen oder chemische Modifikationen dieser ist.
DE69610410T 1996-05-23 1996-05-23 Verwendung eines Osmolyten zur Verringerung oder Aufhebung von nichtkovalenten Bindungen biologischer Moleküle an inerten Oberflächen Expired - Lifetime DE69610410T2 (de)

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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69833864T2 (de) * 1997-08-14 2006-12-21 Takara Bio Inc., Otsu Methoden zur dns vervielfältigung und material dafür
ATE551433T1 (de) 2005-05-06 2012-04-15 Gen Probe Inc Verfahren und produkte zum erfassen von nukleinsäurezielen
JP7096482B2 (ja) * 2017-12-05 2022-07-06 藤倉化成株式会社 感作された不溶性担体粒子を含有する免疫測定試薬の劣化防止手段

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0153875A3 (de) * 1984-03-01 1987-06-24 The State Of Victoria Festphase-Enzymimmunanalyse und Testsatz
DE3717402A1 (de) * 1987-05-23 1988-12-08 Behringwerke Ag Verfahren zur bestimmung von proteinen und mittel dazu
US5047326A (en) * 1988-10-07 1991-09-10 Eastman Kodak Company Immunmological reagent composition and its use in the determination of chlamydial or gonococcal antigens
DE69319427T2 (de) * 1992-05-01 1998-12-10 Univ Pennsylvania Analyse bei messung des durchflusswiderstandes
EP0742838B1 (de) * 1994-01-31 2003-08-13 The Regents Of The University Of California Methode zur eliminierung von sequenzierartefakten
US5512462A (en) * 1994-02-25 1996-04-30 Hoffmann-La Roche Inc. Methods and reagents for the polymerase chain reaction amplification of long DNA sequences
DE4411588C1 (de) * 1994-03-30 1995-09-28 Deutsches Rheuma Forschungszen Puffer für DNA- und RNA-Polymerase-Reaktionen

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Publication number Publication date
DE69610410D1 (de) 2000-10-26
JPH1066596A (ja) 1998-03-10
EP0808906B1 (de) 2000-09-20
JP4113603B2 (ja) 2008-07-09
EP0808906A1 (de) 1997-11-26
ATE196510T1 (de) 2000-10-15

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