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DE10016523A1 - Klonierungssystem zur Konstruktion von homologen Rekombinationsvektoren - Google Patents

Klonierungssystem zur Konstruktion von homologen Rekombinationsvektoren

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Publication number
DE10016523A1
DE10016523A1 DE2000116523 DE10016523A DE10016523A1 DE 10016523 A1 DE10016523 A1 DE 10016523A1 DE 2000116523 DE2000116523 DE 2000116523 DE 10016523 A DE10016523 A DE 10016523A DE 10016523 A1 DE10016523 A1 DE 10016523A1
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DE
Germany
Prior art keywords
sfi
vector
nucleotide sequence
restriction
homologous recombination
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
DE2000116523
Other languages
English (en)
Inventor
Michael Nehls
Sigrid Wattler
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ingenium Pharmaceuticals GmbH
Original Assignee
Ingenium Pharmaceuticals GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ingenium Pharmaceuticals GmbH filed Critical Ingenium Pharmaceuticals GmbH
Priority to DE2000116523 priority Critical patent/DE10016523A1/de
Priority to PCT/DE2001/001133 priority patent/WO2001075127A2/de
Priority to AU50285/01A priority patent/AU5028501A/en
Publication of DE10016523A1 publication Critical patent/DE10016523A1/de
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Abstract

Die Erfindung besteht aus ein neues Klonierungssystem, bestehend aus einem Vektor- und Adaptersystem, das die Konstruktion von homologen Rekombinationsvektoren zur Mutagenese von Genen in lebenden eukaryontischen Zellen erheblich vereinfacht. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung homologer Rekombinationsvektoren. Darüber hinaus betrifft die Erfindung die Verwendung des Klonierungssystems, um in eukaryontischen Zellen, insbesondere embryonalen Stammzellen, das Genom an definierten Loci zu verändern.

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Klonierungssystem, bestehend aus einem Vektor- und Adaptersystem, das die Konstruktion von homologen Rekombinationsvektoren zur Mutagenese von Genen in lebenden eukaryontischen Zellen erheblich vereinfacht. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung homologer Rekombinationsvektoren. Darüber hinaus betrifft die Erfindung die Verwendung des Klonierungssystems, um in eukaryontischen Zellen, insbesondere embryonalen Stammzellen, das Genom an definierten Loci zu verändern.
In der Literatur sind zahlreiche Verfahren beschrieben, wie anhand chromosomaler Veränderungen an Genen deren Expression bzw. Struktur verändert werden kann. (Capechi, M.R. (1989), Altering the genome by homologous recombination, Science 244: 1288-1292; Bradley, A., Hasty, P., Davis, A. and Ramirez-Solis, R. (1992), Modifying the mouse: design and desire, Bio/Technology 10: 534-539.)
Die gezielte Mutagenese wird mit dem Verfahren der homologen Rekombination durchgeführt. Dabei rekombiniert ein in eine Zelle eingebrachter synthetischer Vektor, der Teile des zu verändernden chromosomalen Lokus enthält, mit der genomischen DNA der Zelle. (Clarke, A.R. (1994), Murine genetic models for human diseases, Curr. Opin. Genet. Dev. 4: 453-460; Melton, D.W. (1994), Gene targeting in the mouse, Bioassays 16: 633-638.)
Die Isolierung der Zellen, in die die Vektor-DNA chromosomal integriert hat, aus dem Pool nicht-rekombinierter Zellen wird durch eine positive Selektionskassette im Vektor ermöglicht, die von der chromosomalen Vektor-DNA flankiert wird. Jede stabile Integration der Vektor- DNA führt zur dauerhaften Resistenz gegen ein zytotoxisches pharmakologisches Agens, welches von einem spezifischen Resistenzgen exprimiert wird. Beispiele dafür sind die Resistenz gegen Geniticin (G418) durch das integrierte Neomycingen oder die Resistenz gegen Hygromycin durch die Integration des Hygromycingens.
Die eingebrachte positive Selektionskassette kann durch die Wahl der Insertion in der chromosomalen Vektor-DNA zu einer Mutation des Gens im Sinne eines klassischen Knock­ outs, das heißt Inaktivierung der Genfunktion, führen. Inaktivierung bzw. Modifikation eines die Genexpression beeinflussenden regulativ wirkenden genetischen Elements bzw. funktionellen Teilbereichs des transkribierten/translatierten Genprodukts kann sowohl positiven, negativen, als auch modifizierenden Einfluß auf die Genfunktion haben. (Bradley, A., Hasty, P., Davis, A. and Ramirez-Solis, R. (1992), Modifying the mouse: design and desire, Bio/Technology 10: 534-539; Van der Neut, R. (1997), Targeted gene disruption: Applications in Neurobiology J. Neurosci. Methods 71: 19-27.)
Die gewünschte homologe Rekombination, die über die positive Selektionskassette verläuft, muß gegen die unerwünschte nicht-homologe Rekombination, die über die Vektorenden verläuft, selektioniert werden. Dazu werden die Vektorenden mit negativen Selektionskassetten ausgestattet, die dann häufig bei der nicht-homologen Rekombination ins Genom integriert werden (Mansour, S. L., Thomas, K. R. and Capechi, M.R. (1988), Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes, Nature 336: 348-352). Ein normalerweise nicht zytotoxisches Agens wird bei stabiler Expression der negativen Selektionskassetten zytotoxisch. Beispiel hierfür ist die aktivierte Zytotoxizität von Gancyclovir durch das Herpes simplex Virus Thymidinkinase-Gen (HSV-tk) (Mansour, S.L., Thomas, K.R. and Capechi, M.R. (1988), Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non- selectable genes, Nature 336: 348-352).
Die Wahrscheinlichkeit einer homologen Rekombination ist abhängig von deren Isogenie mit der genomischen DNA der Zielzelle (te Riele, H., Maandag, E.R. and Berns, A. (1992), Highly efficient gene targeting in embryonic stem cells through homologous recombination with isogenic DNA constructs, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5128-5132.)
Die Klonierung von chromosomalen DNA-Abschnitten des zu verändernden Lokus, der molekularbiologische Zusammenbau eines bakteriellen Plasmid-Vektors mit der entsprechenden chromosomalen DNA, die gezielte Integration der positiven Selektionskassette und das Ausstatten beider homologer Fragmente mit negativen Selektionskassetten ergeben zwangsläufig, dass die Konstruktion eines homologen Rekombinations-Vektors meist zu einem langwierigen und technisch aufwendigen Unterfangen wird. Zeitlimitierend erweist sich dabei die Notwendigkeit, für das Einbringen der positiven Selektionskassette in die Ziel-DNA auf einzigartige Restriktionsenzymerkennungssequenzen (Restriktionsschnittstellen) angewiesen zu sein. Daraus ergeben sich aufwendige, zeit- und arbeitsintensive Klonierungen. Bei der gezielten Mutagenese eines eukaryontischen Genoms mittels homologer Rekombination stellt die Konstruktion des Rekombinationsvektors daher oft den zeitlimitierenden Schritt dar. Bei den bisher bekannten Systemen, die auf der Nutzung homologer Rekombination in Hefe oder in Bakterien beruhen, sind zur Konstruktion des Rekombinationsvektors mehrere Wochen erforderlich. Es existiert bisher kein experimentelles System, welches die Fertigstellung eines Vektors für die homologe Rekombination in kurzer Zeit ermöglicht.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein System bereitzustellen, welches die Konstruktion eines für die homologe Rekombination geeigneten Vektors ohne aufwendige Klonierungsschritte ermöglicht.
Der Erfindung liegt weiterhin die Aufgabe zugrunde, ein Klonierungssystem bereitzustellen, welches für das Einbringen der positiven Selektionskassette nicht auf einzigartige Restriktionsenzymerkennungssequenzen angewiesen ist.
Die Aufgabe wird gelöst durch den Gegenstand der Patentansprüche.
Die Erfindung betrifft daher ein Klonierungssystem zur homologen Rekombination in eukaryontischen Zellen, bestehend aus einem Vektor-Adaptersystem, umfassend einen Lambda-Vektor mit mindestens zwei negativen Selektionskassetten, mindestens zwei in gleicher Orientierung vorliegenden loxP-Stellen, einen zwischen den loxP-Stellen befindlichen Replikationsursprung, einen Resistenzmarker für Bakterien und ein genomisches Stuffer- Fragment, flankiert von je einem 5' und 3' Restriktionsschnittstellenlinker und vier verschiedene Adapteroligonukleotide A, B, C und D, wobei die 5'-Nukleotidsequenz der Adapteroligonukleotide A, B, C und D ein zum Restriktionsenzym Sfi kompatibles Ende enthält und die 3'-Nukleotidsequenz der Adapteroligonukleotide A, B, C, und D zum jeweiligen Zielgen homolog ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der 5'-Restriktionsschnittstellenlinker die Restriktionsschnittstellen 5'-BamHI-Sfi-C, SalI, Sfi-A, BamHI und der 3'- Restriktionsschnittstellenlinker die Restriktionsschnittstellen 3'-BamHI, Sfi-B, SalI, Sfi-D, BamHI.
Besonders bevorzugt ist ein Klonierungssystem, wobei die 5'-Nukleotidsequenz der Adapteroligonukleotide A und C die Restriktionsschnittstellen SfiA und SfiC und die 5'- Nukleotidsequenz der Adapteroligonukleotide B und D die Restriktionsschnittstellen SfiB und SfiD umfasst.
Überraschenderweise wird durch das erfindungsgemäße Klonierungssystem die Konstruktion eines positiven/negativen Rekombinationsvektors stark verkürzt und vereinfacht. Bei Verwendung des erfindungsgemäßen Klonierungssystems wird die Klonierungszeit auf drei Tage verkürzt und die Bearbeitung mehrerer Projekte in einer Zeiteinheit ermöglicht. Ein bisher aufwendiges Verfahren wird somit erheblich verkürzt und kostengünstiger.
Das erfindungsgemäße Klonierungssystem bestehend aus einem Vektor-Adaptersystem erlaubt es, jede beliebige DNA durch einen einzigen Klonierungsschritt in einen vollständigen Rekombinationsvektor mit flankierenden negativen Selektionskassetten umzuwandeln.
Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Klonierungssystem umfasst einen neu konstruierten Lambda-Vektor (Lambda-KO-Sfi), wie in Abb. 1 dargestellt.
Die im erfindungsgemäßen Klonierungssystem eingesetzten Adapteroligonukleotide ermöglichen die effiziente Amplifikation der zu mutierenden genomischen Sequenz (nachfolgend auch als rechter und linker Homologiearm bezeichnet).
Die Adapteroligonukleotide sind so aufgebaut, dass 15-50, vorzugsweise 20-25 Basenpaare (bp) der 3'-Nukleotidsequenz zum jeweiligen Zielgen homolog sind und die 5'- Nukleotidsequenz ein zum Restriktionsenzym Sfi kompatibles Ende enthält. Das Restriktionsenzym Sfi ermöglicht die Konstruktion von mehreren unabhängigen Schnittstellen aufgrund der frei wählbaren mittleren drei Basenpaare seiner Restriktionserkennungssequenz.
Zur Amplifikation der Homologiearme werden für den rechten Arm die Adapteroligonukleotide mit den Restriktionsschnittstellen SfiB und SfiD und für den linken Arm Adapteroligonukleotide mit den Restriktionsschnittstellen SfiA und SfiC definiert. Demgemäß werden der rechte Homologiearm mit den Adapteroligos B und D und der linke Homologiearm mit den Adapteroligonukleotiden A und C amplifiziert. Die Amplifikation erfolgt dabei unter Verwendung einer Polymerase mit 3'-5' Exonuklease-Aktivität, so dass die Wahrscheinlichkeit falsch eingebauter Basen minimiert wird.
Die Größe der PCR-Produkte und damit die Länge der Homologie ist frei wählbar. Die beiden PCR-Produkte werden in einem Ligationsansatz mit der positiven Selektionskassette, die die Restriktionsschnittstellen SfiA und SfiB besitzt, sowie mit dem Lambda-KO-Sfi-Gerüst, das die Restriktionsschnittstellen SfiC und SfiD enthält, ligiert. Es sind somit mittels nur einem Restriktionsenzym vier nicht kompatible Restriktionsschnittstellen konstruiert worden, wodurch die Ligation der vier Fragmente nur in einer Weise erfolgen kann und die Klonierung ohne falsche Ligationsprodukte verläuft, die ansonsten zu background führen. Darüberhinaus macht sich die Erfindung die hohe Klonierungskapazität von Lambdaphagen zunutze.
Die PCR-Produkte der Homologiearme sind auch dann klonierbar, wenn nur geringste Mengen synthetisiert worden sind. Damit wird ein aufwendiges Austesten von Idealbedingungen für PCR-Reaktionen mit Proof-Reading-Polymerasen vermieden. Die Klonierung des Rekombinationsvektors ist unabhängig von in der genomischen DNA vorhandenen Restriktionsschnittstellen, dies erlaubt die positive Selektionskassette an jede beliebige Position im Genom zu plazieren und auch größere Deletionen zu setzen. Nach Erhalt der Adapteroligonukleotide ist der Rekombinationsvektor in drei Tagen fertig gestellt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung Der Lambdavektor KO-Sfi
Der Lambdavektor KO-Sfi (siehe Fig. 1) ist von dem Lambdavektor KO (Nehls et al. (1994), Biotechniques 17, 4: 770-775) abgeleitet. Der Lambdavektor KO beruht auf dem Vektor Lambda 2001 (Ausubel et al., (1994), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York). Jedes in den Vektor inserierte genomische Fragment ist automatisch von zwei negativen Selektionskassetten, zum Beispiel HSV-tk, flankiert. Der Vektor enthält weiterhin zwei in gleicher Orientierung gerichtete loxP-Stellen mit der Nukleotidsequenz ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT. Diese loxP-Stellen ermöglichen nach Infektion des Phagen mit einem cre-Rekombinase exprimierenden Bakterienstamm (wie z. B. BNN132) die Konvertierung des Phagen in ein Plasmid. Die Propagation des Plasmids wird durch einen innerhalb der loxP-Stellen befindlichen Replikationsursprung und Resistenzmarker für Bakterien ermöglicht, wie zum Beispiel pBluescript (Stratagene, Bestellnummer #211201).
Bei der Konstruktion des Lambdavektors wurde zwischen die beiden Thymidinkinasegene (HSV-tk) ein genomisches Fragment des Phagen, vorzugsweise von ca. 5 Kb, (hier auch als Stuffer-Fragment bezeichnet) plaziert, um die Propagation des Phagen zu gewährleisten. Dabei wurde ein Restriktionsschnittstellenlinker mit folgenden Aufbau eingesetzt (siehe auch Fig. 1):
5'-BamHI, Sfi-C, SalI, Sfi-A, BamHI
3'-BamHI, Sfi-B, SalI, Sfi-D, BamHI
Die Sfi-Schnittstellen besitzen die folgenden Sequenzen:
Sfi A: ggcentagnggcc
Sfi B: ggccngcgnggcc
Sfi C: ggccnctgnggcc
Sfi D: ggccncagnggcc
Aus den vorstehend genannten neu eingebrachten Linkersequenzen wurden zudem zwei, für die jeweiligen Enden spezifischen Sequenzierprimer abgeleitet:
MM-D 5'-gacggatcctcggccactg
MM-C 5'-ctcgaggatccggccactg
Zur Verwendung als Klonierungsvektor wird die Lambdaphagen-DNA zunächst mit Sfi hydrolytisch gespalten. Die erhaltenen Fragmente werden gereinigt und in einem zweiten Verdau mit dem Restriktionsenzym SalI geschnitten. Damit sollte jedes Ende dreimal geschnitten sein und Religationsprodukte bei der Klonierung vermieden werden. Die Lambda- Arme werden dann durch Sucrosegradientenzentrifugation gereinigt und auf diese Weise von dem Stuffer-Fragment getrennt. Die Ligation der PCR-Produkte erfolgt unter Standardbedingungen und die in vitro Verpackung erfolgt unter Verwendung eines von Stratagene hergestellten Verpackungsextraktes (Gigapack plus).
Die Adapteroligonukleotide (siehe auch Fig. 1)
Die Adapteroligonukleotide dienen zur Amplifikation der Homologiearme (0.8-12 kb) der zu mutierenden genomischen Sequenz und zum Einbau dieser amplifizierten Sequenzen in den Klonierungsvektor Lambda-KO-Sfi.
Die 5'-Enden der Adapteroligonukleotide A, B, C und D definieren jeweils die vier verschiedenen Sfi-Schnittstellen. Nach Amplifikation der genomischen Sequenzen, d. h. des rechten und linken Homologiearmes, und Aufreinigung der beiden PCR-Produkte werden diese mit Sfi hydrolytisch gespalten. Um eine vollständige Spaltung zu gewährleisten, wurden an den 5'-Enden der Adapteroligonukleotide zusätzlich drei Nukleotide plaziert (in nachfolgender Aufstellung unterstrichen dargestellt). Am 3'-Ende der Adapteroligonukleotide befindet sich eine zur Nukleotidsequenz des jeweiligen Kandidatengens homologe Nukleotidsequenz (in nachfolgender Aufstellung als (Ngenomisch)25 dargestellt).
Sfi-A: cga ggc cgc tat ggc c(Ngenomisch)25
Sfi-B: gac ggc cag cga ggc c(Ngenomisch)25
Sfi-C: cag ggc cac tgc ggc c(Ngenomisch)25
Sfi-D: cag ggc cac tgc ggc c(Ngenomisch)25
Die Selektionskassette
Um bei einem Knockout eines Gens gleichzeitig die Expression des endogenen Gens überwachen zu können, wurde eine IRES-β-Galaktosidase-MCS-Neomycin-Kassette mit den Sfi Schnittstellen A und B versehen und in den LambdaKO-Sfi-Vektor als Stuffer-Fragment einkloniert. Auf diese Weise kann gleichzeitig die Expression des endogenen Gens überwacht werden. Bei einer Lambda-Phagen-DNA-Präparation fällt daher auch DNA der Selektionskassette im molaren Verhältnis an, die gleichzeitig mitgereinigt werden kann.
Die verwendeten Abkürzungen besitzen erfindungsgemäß die folgende Bedeutung.
Außer den im Duden gebräuchlichen Abkürzungen, den üblichen Codes für Aminosäuren und Nukleotide sowie den gängigen Kürzeln für Restriktionsenzyme, Polymerasen, usw. wurden folgende Abkürzungen verwendet:
Bp: Basenpaar
ES-Zellen: embryonale Stammzellen
hprt-Gen: Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferasegen
HSK: Herpes Simplex Virus
MCS: multiple cloning site
µl: Mikroliter
Ng: Nanogramm
Ori: Origin of replication PCR: Polymerasekettenreaktion
tk-Gen: Thymidin-Kinase-Gen
U: Unit
Die Erfindung wird weiter durch die folgende Zeichnung erläutert:
Fig. 1A zeigt eine graphische Darstellung eines erfindungsgemäßen Klonierungssystems, bestehend aus einem Lambda-Vektor (Lambda-KO-Sfi) und vier Adapteroligonukleotiden A, B, C und D.
Der Lambda KO-Sfi: Der LambdaKo-Sfi Vektor besteht aus dem rechten und linken Arm des Lambda2001 (Ausubel, F.M., Brent, R., Klingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. and Struhl, K. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York), der von Nehls et al. abgeändert wurde (Nehls et al. (1994), Biotechniques 17, 4: 770-775): angrenzend an die Lambdaarme wurden zwei in gleicher Orientierung gerichtete loxP-Stellen eingebracht. Zwischen die loxP-Stellen wurde in den rechten Lambdaarm das Gen für die β-Lactamase sowie ein Replikationsursprung (ori) inseriert. Ein genomisches Stuffer-Fragment ist beidseits von zwei Kassetten für die negative Selektion flankiert. (Mansour, S.L., Thomas, K.R. and Capechi, M.R. (1988), Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes, Nature 336: 348-352). An das 5'-Ende des Stuffer- Fragmentes wurde folgender Restriktionschnittstellenlinker neu eingebracht: BamHI, Sfi-C, SalI, Sfi-A, BamHI und ein zweiter Restriktionschnittstellenlinker an das 3'-Ende des Stuffer- Fragmentes: BamHI, Sfi-B, SalI, Sfi-D, BamHI. Die Sfi-Schnittstellen sind folgendermaßen definiert: Sfi-A: ggccNTAGNggcc; Sfi-B: ggccNGCGNggcc; Sfi-C: ggccNCTGNggcc; Sfi-D: ggccNCAGNggcc.
Fig. 1B zeigt einen homologen Rekombinationsvektor zur gezielten Mutagenese von ES- Zellen, der aus den gereinigten, Sfi geschnittenen Lambda KO-Sfi-Armen besteht, in denen die PCR-Produkte (rechter und linker Homologiearm) und die ES-Zell-Selektionskassette in einem Ligationschritt ligiert wurden. Dazu wurde der linke Homologiearm mit den Adapteroligonukleotiden C und A amplifiziert, der rechte Arm mit den Adapteroligonukleotiden B und D. Die Gesamtgröße der beiden PCR-Produkte kann dabei in den Grenzen von 0.8-12 kb frei gewählt werden.
Beispiele
Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung, sind jedoch nicht begrenzend zu verstehen.
Beispiel 1 Konstruktion eines homologen Rekombinationsvektors für das Hprt-Gen
Zur Konstruktion eines homologen Rekombinationsvektors für das Hprt-Gen wurden die folgenden experimentellen Schritte durchgeführt:
A. Auswählen genomischer Olisonukleotide für die PCR der Homologiearme
Im gewählten Beispiel wird das Exon III des Hprt-Gens deletiert. Diese Mutation führt zum Funktionsverlust von Hprt, wie bereits von Hasty et al. (1991), Mol. Cell. Biol. 11: 5586-5591, beschrieben.
Der linke Homologiearm von Hprt ist 3639 bp lang und endet mit der 17ten Base des 3ten Exons. Der rechte Homologiearm, der 950 bp lang ist, beginnt im 3ten Intron mit der 39ten Base. Die in der nachfolgenden Aufstellung fettgedruckten Basen kennzeichnen die Adaptersequenzen.
B. Genomische PCR
Die PCR wurde mit den folgenden Reagenzien durchgeführt:
Die Denaturierung erfolgte für 45 Sekunden bei 94°C, das Anlagern der Oligonukleotide ("Annealing") für 1 Minute bei 56°C, die Synthese für 3 Minuten bei 72°C. Dieser Zyklus wurde 34 mal wiederholt.
C. Aufreinigung der PCR-Produkte
Die PCR-Produkte wurden unter Verwendung des QIAquick PCR Purification Kit (Bestellnummer #21806) nach den Beschreibungen des Herstellers aufgereinigt. Das Elutionsvolumen betrug 30 µl.
D. Sfi-Verdau der PCR-Produkte
Das aufgereinigte PCR-Produkt wurde im 50 µl Ansatz mit 40 U Sfi (Biolabs, Bestellnummer #123L) drei Stunden bei 50°C verdaut und anschließend wiederum unter Verwendung des QIAquick PCR Purification Kit aufgereinigt und in 30 µl von der Säule eluiert.
E: Ligation der Sfi-geschnittenen PCR-Produkte mit Lambda-KO-Sfi und der positiven Selektionskassette
Ein typischer Ligationsansatz bestand aus folgenden Mengen in einem 10 µl Ansatz:
50 ng Lambda-KO-Sfi-Arme (Sfi geschnitten)
10 ng Selektionskassette (Sfi geschnitten)
1 ng rechter Homologiearm
1 ng linker Homologiearm
1× Ligationspuffer (Boehringer)
1 U T4-Ligase (Boehringer, Bestellnummer #716354)
Die Ligation erfolgte bei Raumtemperatur für zwei Stunden.
F. In vitro-Verpackung
2 µl des vorstehend genannten Ligationsansatzes wurden für 1.5 Stunden bei Raumtemperatur mit 10 µl Verpackungsextrakt in vitro verpackt (Stratagene, Gigapack III plus, Bestellnummer #200204).
G. Plattierung der Library
Je 10 und 50 µl der Verpackungsreaktion wurden zur Infektion mit je 300 µl einer wachsenden Kultur von C600-Bakterien (Stratagene, Bestellnummer #200261) verwendet und auf Lambda-Platten (Current Protocol in Molecular Biology) über Nacht inkubiert.
H. Plasmidkonvertierung
Einzelplaques wurden in 500 µl SM-Phagenpuffer (Ausubel, F. M. et al., (1994) Current Protocol in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York) aufgenommen. Je 50 µl Phagen in SM-Phagenpuffer wurden mit 100 µl einer wachsenden Kultur BNN 132 infiziert (30 Minuten, 37°C) und dann eine Flüssigkultur TB Medium (Ausubel, F.M. et al., (1994) Current Protocol in Molecular Biology John Wiley & Sons, New York) plus 100 µg Ampicillin/ml (Amersham, Bestellnummer #US11259-25) angeimpft und über Nacht bei 30°C im Bakterienschüttler inkubiert.
I. Plasmidpräparation
Die Plasmid-DNA wurde über QIAgen-Säulenchromatografie (Qiagen, Bestellnummer #12143) nach den Angaben des Herstellers gewonnen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims (7)

1. Klonierungssystem zur homologen Rekombination in eukaryontischen Zellen, bestehend aus einem Vektor-Adaptersystem, umfassend einen Lambda-Vektor, gekennzeichnet dadurch, dass dieser
  • a) mindestens zwei negative Selektionskassetten;
  • b) mindestens zwei in gleicher Orientierung vorliegende loxP-Stellen;
  • c) einen zwischen den loxP-Stellen befindlichen Replikationsursprung;
  • d) einen Resistenzmarker für Bakterien; und
  • e) ein genomisches Stuffer-Fragment, flankiert von je einem 5' und 3' Restriktionsschnittstellenlinker, enthält;
und vier verschiedene Adapteroligonukleotide A, B, C und D, wobei die 5'- Nukleotidsequenz der Adapteroligonukleotide A, B, C und D ein zum Restriktionsenzym Sfi kompatibles Ende enthält und die 3'-Nukleotidsequenz der Adapteroligonukleotide A, B, C und D zum jeweiligen Zielgen homolog ist.
2. Klonierungssystem gemäß Anspruch 1, wobei der 5'- Restriktionsschnittstellenlinker die Restriktionsschnittstellen 5'-BamHI-Sfi-C, SalI, Sfi-A, BamHI und der 3'-Restriktionsschnittstellenlinker die Restriktionsschnittstellen 3'-BamHI, Sfl- B, SalI, Sfi-D, BamHI umfasst.
3. Klonierungssystem gemäß Anspruch 1, wobei
die 5'-Nukleotidsequenz der Adapteroligonukleotide A die Restriktionsschnittstellen SfiA,
die 5'-Nukleotidsequenz der Adapteroligonukleotide C die Restriktionsschnittstellen SfiC,
die 5'-Nukleotidsequenz der Adapteroligonukleotide B die Restriktionsschnittstellen SfiB, und
die 5'-Nukleotidsequenz der Adapteroligonukleotide D die Restriktionsschnittstellen SfiD umfasst.
4. Klonierungssystem gemäß Anspruch 1, wobei die zum jeweiligen Zielgen homologe 3' Nukleotidsequenz der Adapternukleotide A, B, C, und D 15 bis 50 bp, vorzugsweise 20-25 bp umfasst.
5. Verfahren zur Herstellung eines homologen Rekombinationsvektors, bestehend aus
einem Lambda-Vektor,
mindestens zwei negativen Selektionskassetten,
mindestens einer positiven Selektionskassette und
einem linken und rechten Homologiearm;
umfassend die Schritte:
  • a) Auswählen von zum Zielgen homologer Sequenzen (genomischer Oligonukleotide) zur Amplifikation der 5'- und 3'-Homologiearme mittels PCR;
  • b) Amplifikation der 5'- und 3'-Homologiearme mittels PCR und Aufreinigung der PCR-Produkte;
  • c) Restriktionsverdau der aufgereinigten PCR-Produkte mittels Restriktionsenzym Sfi;
  • d) Ligation der Sfi-geschnittenen Fragmente mit einem Sfi-geschnittenen Lambda- Vektor und einer Sfi-geschnittenen positiven Selektionskassette;
  • e) in vitro-Verpackung der Ligationsprodukte und Plattierung der Phagenbibliothek; und
  • f) Plasmidkonvertierung und Gewinnung der DNA des homologen Rekombinationsvektors.
6. Verfahren zur Herstellung eines homologen Rekombinationsvektors gemäß Anspruch 5, gekennzeichnet dadurch, dass der Lambda-Vektor Lambda KO-Sfi ist.
7. Verwendung des Klonierungssystems gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, um in eukaryontischen Zellen, insbesondere embryonalen Stammzellen, das Genom an definierten Loci zu verändern.
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