DE10010118A1

DE10010118A1 - Beschichtungssystem auf der Basis von Pyranosyl-Nukleinsäuren

Info

Publication number: DE10010118A1
Application number: DE2000110118
Authority: DE
Inventors: Roland Breves; Stefan Muellner; Albrecht Weiss
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 2000-03-03
Filing date: 2000-03-03
Publication date: 2001-09-20
Also published as: AU2001233799A1; WO2001064808A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Beschichtungssystem auf der Basis von Pyranosyl-Nukleinsäuren (p-NA) zur Ausbildung von Adhäsionsverbindungen, insbesondere von elektrisch leitenden Adhäsionsverbindungen, ein Verfahren zur Ausbildung von Adhäsionsverbindungen sowie verschiedene Verwendungen eines erfindungsgemäßen Beschichtungssystems.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Beschichtungssystem auf der Basis von Pyranosyl-Nukleinsäuren (p-NA) zur Ausbildung von Adhäsionsverbindungen, ein Verfahren zur Ausbildung von Adhäsionsverbindungen sowie verschiedene Verwendungen eines erfindungsgemäßen Beschichtungssystems.

Die Miniaturisierung von technischen Bauelementen, insbesondere von miniaturisierten, integrierten elektronischen Schaltungen, dringt mittlerweile in den Bereich molekularer Größenordnungen vor.

Von besonderem Interesse sind neuartige Werkstoffe, die sich in Form von Paarungssystemen selbst organisieren können. Paarungssysteme sind supra molekulare Systeme nicht-kovalenter Wechselwirkung, die sich durch Selektivi tät, Stabilität und Reversiblität auszeichnen, und deren Eigenschaften bevor zugt thermodynamisch, z. B. durch Temperatur, pH-Wert und Konzentration beeinflußt werden.

DNA und RNA spielen dabei als Träger der Erbanlagen eine fundamentale Rolle.

Solche Paarungssysteme können z. B. aufgrund ihrer selektiven Eigenschaften aber auch als "molekularer Klebstoff" für die Zusammenführung von unter schiedlichen Metallclustern zu Cluster-Verbänden mit potentiell neuen Eigen schaften verwendet werden (Mirkin, C. A. et al. Nature, 1996. 382, 607-9, Alivi satos, A. P. et al., Nature, 1996, 382, 609-11). Die Paarungs- bzw Hybridisie rungseigenschaften von natürlich vorkommender DNA wurden z. B. verwendet, um an DNA-Stränge gebundene Metallcluster mit einem komplementären DNA- Strang paaren zu lassen. Hierdurch wurden Cluster-Verbände mit potentiell neuen Materialeigenschaften gewonnen. Derartige Paarungssysteme können daher als "molekulare Maschinen" bzw. funktionelle "molekulare Schaltungen" angesehen werden.

DNA- bzw. RNA-Bausteine weisen jedoch folgende Nachteile auf:

a) Die Kräfte, die zwei Stränge zusammenhalten, vor allem Wasserstoffbrücken und Stapeleffekte, sind naturgemäß sehr gering. Solche Duplices weisen daher eine geringe Stabilitat auf. Folglich sind für die Herstellung von Paarungssyste men relativ lange Einzelstränge notwendig, d. h. die "Nukleotidlast" ist hoch.
b) Durch die Ausbildung von Hoogsteen-Paarungen, die alternativ zu Watson- Crick-Paarungen möglich sind, nimmt die Selektivität ab. Damit sind oftmals parallele Duplices oder irreversible Paarungsvorgänge verbunden.
c) Durch die hohe Flexibilitat des Zucker-Phosphat-Rückgrates bilden sich heli cale Konformationen, anstelle der zur Ausbildung insbesondere elektrisch lei tender Verbindungen erwünschten linearen Ausrichtung.
d) Eine mögliche Interferenz mit dem genetischen Material biologischer Syste me ist nicht auszuschließen, falls die supramolekularen Einheiten in einem biologischen System zum Einsatz kommen.

Aus der WO 98/25943 ist ein supramolekulares Nanosystem bekannt, das im wesentlichen nicht-helikale Oligomere und als bevorzugte Ausführungsform zwei Pyranosyl-RNA Oligomere aufweist, die miteinander spezifisch nicht- kovalent paaren. Zwingend vorgeschrieben ist jedoch, daß eines der Oligomere (Oligomer B) an funktionelle Einheiten gebunden ist. Als funktionelle Einheiten des Oligomers B sollen sich beispielsweise Metalle, vorzugsweise Metallcluster, insbesondere Edelmetalle, vor allem Gold, Silber und/oder Platin eignen. Zur Herstellung leitender "Nano-Wires" wird empfohlen, die Nukleobasen durch Chelatbildner zu ersetzen, die in Anwesenheit von Metallionen zu einer Paa rung zwischen den Oligomeren führen.

Nachteiligerweise ist eine so modifizierte Pyranosyl-RNA jedoch toxikologisch und ökologisch nicht unbedenklich, da die funktionellen Einheiten ihre biologi sche Abbaubarkeit bei der Entsorgung verringern. Außerdem ist ihre Bereitstel lung naturgemäß mit höherem Aufwand verbunden, als die unmodifizierter Pyranosyl-Nukleinsäuren.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, unter Vermei dung der obengenannten Nachteile ein selektives Paarungssystem bereitzustel len. Das Paarungssystem sollte vorteilhafterweise elektrisch leitfähig sein.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß Pyranosyl-Nukleinsäuren auch ohne die oben beschriebene Funktionalisierung oder den Ersatz der Nukleoba sen durch Chelatbildner elektrisch leitende Eigenschaften aufweisen, die die Ausbildung elektrisch leitender Adhäsionsverbindungen ermöglichen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Beschichtungssystem auf der Basis von Pyranosyl-Nukleinsäuren (p-NA) zur Ausbildung von Adhäsions verbindungen, insbesondere von elektrisch leitenden Adhäsionsverbindungen,
das dadurch gekennzeichnet ist, daß es mindestens zwei Beschichtungsmittel A und B umfaßt,
wobei das Beschichtungsmittel A eine Pyranosyl-Nukleinsäure enthält, und das Beschichtungsmittel B ein weiteres Oligo- oder Polymer enthält, das geeignet ist, mit der Pyranosyl-Nukleinsäure in dem Beschichtungsmittel A nicht- kovalente Bindungen einzugehen und
daß die Pyranosyl-Nukleinsäure aus einem Pyranosephosphat-Rückgrat und daran gebundenen Purin- oder Pyrimidinbasen besteht.

"Nicht-kovalente Bindung" im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet eine Assoziation der p-NA des Beschichtungsmittels A mit dem Oligo- oder Polymer des Beschichtungsmittels B über nicht-kovalente Wechselwirkungen, wie zum Beispiel Wasserstoffbrücken, Salzbrücken, Stapelungen ("Stacking"), Metalligandierun gen, oder hydrophobe Wechselwirkungen.

Das erfindungsgemäße Beschichtungssystem bildet vorteilhafterweise elek trisch leitende Adhäsionsverbindungen aus, obwohl es keine an die p-NA ge bundenen funktionellen Einheiten oder Chelatbildner anstelle von Nukleobasen aufweist.

Eine (die Erfindung in keiner Weise einschränkende) Begründung für diese überraschende elektrische Leitfähigkeit liegt möglicherweise in der spezifischen Ausbildung von Salzbrücken oder der spezifischen Ausbildung der Basenstapel in Pyranosyl-Nukleinsäuren.

Die Adhäsionsverbindungen sind überraschenderweise auch dann leitfähig, wenn im Beschichtungsmittel B keine p-NA sondern ein anderes Oligo- oder Polymer enthalten ist, das geeignet ist, mit der p-NA in dem Beschichtungsmit tel A nicht-kovalente Bindungen einzugehen, beispielsweise ein Oligonukleotid mit phosphatfreiem Rückgrat, wie in Meyers, R. A.; Molecular Biology and Bio technology; VCH; 1995; S. 617-621; beschrieben.

Vorzugsweise ist das Oligo- oder Polymer in dem Beschichtungsmittel B jedoch eine Pyranosyl-Nukleinsäure.

Vorzugsweise sind die p-NA des Beschichtungsmittels A und das Oligo- oder Polymer des Beschichtungsmittels B zueinander komplementär. Die Komple mentarität kann jedoch erfindungsgemäß je nach Art und Reihenfolge der Mo nomere des Oligo- oder Polymers in B bzw. der Art und Reihenfolge der Mo nomere der p-NA in A eingeschränkt oder unvollständig sein. Dies ermöglicht vorteilhafterweise eine präzise Einstellung der Adhäsionsstärke zwischen den Beschichtungsmitteln.

Gleichfalls können Änderungen der Adhäsionsverbindung durch eine Änderung der Gleichgewichtsbedingungen, wie Konzentration der Beschichtungsmittel A und B, Salzkonzentration, pH-Wert, Druck und/oder Temperatur, hervorgerufen werden. Durch die Einstellung bestimmter Gleichgewichtsbedingungen können auch verschiedene Bereiche zum Paaren bzw Entpaaren gebracht werden, so daß reversibel zunächst entfernte Molekülreste in unmittelbare Nähe gebracht werden können. Durch diesen Mechanismus lassen sich mithilfe des erfin dungsgemäßen Beschichtungssystems molekulare Schalter darstellen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Pyranosyl-Nukleinsäure um eine Pentopyranosyl-Nukleinsäure, insbesondere eine Ribo-, Arabino-, Lyxo- und/oder Xylo-pyranosyl- Nukleinsäure, vorzugsweise eine Ribopyranosyl-Nukleinsäure, auch Pyranosyl- RNA (p-RNA) genannt.

Pyranosyl-Nukleinsäuren (p-NA's) sind im allgemeinen zur natürlichen RNA isomere Strukturtypen, bei denen die Pentose-Einheiten in der Pyranoseform vorliegen und durch Phosphodiestergruppen zwischen den Positionen C-2' und C-4' repetitiv verknüpft sind Unter "Basen" oder "Nukleobasen" werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung die kanonischen Nukleobasen A, T, U, C, G, aber auch die Paare Isoguanin/Isocytosin und 2,6-Diaminopurin/Xanthin und auch andere Purine und Pyrimidine verstanden. p-NA's, und zwar die von der Ribose abgeleitete p-RNA's, wurden zum erstenmal von Eschenmoser et al. beschrieben (s. S. Pitsch et al., Helv. Chim. Acta 76,2161 (1993); S. Pitsch et al., Helv. Chim Acta 78,1621 (1995); R. Krishnamurthy, Angew. Chem. 108,1619-1623 (1996)). Sie bilden ausschließlich sogenannte Watson-Crick gepaarte, d. h. Purin-Pyrimidin- und Purin-Purin-gepaarte, antiparallele, reversi bel "schmelzende", quasi-lineare und stabile Duplices. Homochirale p-RNA- Stränge entgegengesetzten Chiralitätssinns paaren ebenfalls kontrollierbar und sind in der gebildeten Duplex streng nicht-helical. Diese für die Ausbildung von Adhäsionsverbindungen wertvolle Spezifität hängt mit der relativ geringen Fle xibilität des Ribopyranosephosphat-Rückgrats sowie mit der starken Neigung der Basenebene zur Strangachse und der hieraus folgenden Tendenz zu inter catenarer Basenstapelung im resultierenden Duplex zusammen und läßt sich letzlich auf die Teilnahme eines 2',4'-cis-disubstituierten Ribopyranoserings am Aufbau des Rückgrates zurückführen. Diese wesentlich besseren Paarungsei genschaften machen p-NA's gegenüber DNA und RNA für die Ausbildung von Adhäsionsverbindungen zu bevorzugten Paarungssystemen. Sie bilden ein zu natürlichen Nukleinsäuren orthogonales Paarungsystem, d. h. sie paaren nicht mit in der natürlichen Form vorkommenden DNA's und RNA's. Eine Paarung mit Oligonukleotiden mit phosphatfreiem Rückgrat, wie in Meyers, R. A.; Molecular Biology and Biotechnology; VCH; 1995; S. 617-621; beschrieben, ist jedoch nicht ausgeschlossen.

Als Bestandteil des erfindungsgemäßen Beschichtungssystems einsetzbare p- RNA kann, wie von Eschenmoser et al. (1993, supra) beschrieben und nach stehend erläutert, hergestellt werden.

Hierbei wird eine geeignete geschützte Nukleobase mit dem Anomerengemisch der Tetrabenzoyl-Ribopyranose durch Einwirken von Bis(trimethylsilyl)acetamid und einer Lewis-Säure wie z. B. Trimethylsilyl-trifluormethansulfonat zur Reakti on gebracht (analog H. Vorbrüggen, K. Krolikiewicz, B. Bennua, Chem. Ber. 1981, 114, 1234). Unter Baseneinwirkung (NaOH in THF/Methanol/Wasser im Falle der Purine; gesättigter Ammoniak in MeOH im Falle der Pyrimidine) wird die Acylschutzgruppen vom Zucker abgespalten, und das Produkt unter saurer Katalyse mit p-Anisaldehyddimethylacetal in 3',4'-Position geschützt. Das Di astereomerengemisch wird in 2'-Stellung acyliert, das 3',4'-methoxybenzyliden geschützte 2'-Benzoat durch saure Behandlung, z. B. mit Trifluoressigsäure in Methanol deacetalisiert, und mit Dimethoxytritylchlorid umgesetzt. Die 2'-3'- Wanderung des Benzoats wird durch Behandlung mit p-Nitro-phenol/4- (Dimethylamino)pyridin/Triethylamino/Pyridin/n-Propanol eingeleitet. Die Reak tionen werden durch Säulenchromatographie aufgearbeitet. Der so synthetisier te Schlüsselbaustein, das 4'-DMT-3'-benzoyl-1'-Nukleobasen-Derivat der Ribo pyranose, wird dann zum Teil phosphityliert bzw. über einen Linker an eine feste Phase gebunden.

Bei der anschließenden automatisierten Oligonukleotidsynthese wird die trägergebundene Komponente in 4'-Position wiederholt sauer entschützt, ein Phosphoramidit unter Einwirkung eines Kupplungsreagenz, z. B. ein Tetrazolderivat, angekuppelt, noch freie 4'-Sauerstoffatome werden acetyliert und das Phosphoratom wird oxidiert, um so das oligomere Produkt zu erhalten. An schließend werden die restlichen Schutzgruppen abgespalten, das Produkt über HPLC gereinigt und entsalzt.

Ein weiteres Verfahren zur Herstellung von Pentopyranosyl-Nukleinsäuren wird in der DE-A-197 41 715 beschrieben, auf die hiermit vollumfänglich Bezug genommen wird.

Vorzugsweise stellt man die als Bestandteil des erfindungsgemäßen Beschich tungssystems einsetzbare p-RNA jedoch her, wie in der DE-A-198 15 901 be schrieben, auf die hiermit ebenfalls in vollem Umfang Bezug genommen wird.

Bei diesem Verfahren wird die Ausbeute bei der Herstellung des 3',4'-cyclischen Acetals eines Pentopyranosyl-Nukleosids, das ein Zwischenprodukt bei der obenbeschriebenen Eschenmoser-Synthese ist, dadurch optimiert, daß das Pentopyranosyl-Nukleosid unter Unterdruck mit einem Aldehyd oder Keton bzw. mit einem Acetal oder Ketal umgesetzt wird.

Unter dem Begriff Unterdruck versteht man hierbei insbesondere einen Druck von weniger als ca. 500 mbar, vorzugsweise von weniger als ca. 100 mbar, insbesondere von weniger als ca. 50 mbar, vor allem von ca. 30 mbar. Der Aldehyd ist beispielsweise Formaldehyd, Acetaldehyd, Benzaldehyd oder 4-Me thoxybenzaldehyd; das Acetal Formaldehyd-dimethylacetal, Acetaldehyd- dimethylacetal, Benzaldehyd-dimethylacetal oder 4-Methoxybenzaldehyd- dimethylacetal; das Keton Aceton, Cyclopentanon oder Cyclcohexanon und das Ketal Acetondimethylketal, Cyclopentanon-dimethylketal, Cyclohexanon- dimethylketal oder in Form von 2-Methoxypropen. In einer besonderen Ausfüh rungsform wird das Pentopyranosyl-Nukleosid vor der Umsetzung beispielswei se über SiO₂, vorzugsweise über SiO₂ in Form von Kieselgel, gereinigt. Hierzu eignet sich beispielsweise eine Reinigung über eine Kieselgel- Chromatographiesäule. Für die Elution des Pentopyranosyl-Nukleosids eignet sich z. B. ein Gradient von ca. 1-20% oder ca. 5-15% Methanol in Dichlormethan. Besonders vorteilhaft ist es, wenn das Pentopyranosyl-Nukleosid vor der Reinigung beispielsweise mit einer 1-%igen Salzsäurelösung oder mit fes tem Ammoniumchlorid neutralisiert wird und gegebenenfalls die Lösemittel abgezogen werden.

Als Pentopyranosyl-Nukleosid eignet sich im allgemeinen ein Ribo-, Arabino-, Lyxo- oder Xylo-pyranosyl-Nukleosid. Beispiele von geeigneten Pentopyrano syl-Nukleosiden sind ein Pentopyranosyl-purin, -2,6-diaminopurin, -6-purin thiol, -pyridin, -pyrimidin, -adenosin, -guanosin, -isoguanosin, -6-thioguanosin, - xanthin, -hypoxanthin, -thymidin, -cytosin, -isocytosin, -indol, -tryptamin, -N- phthaloyltryptamin, -uracil, -coffein, -theobromin, -theophyllin, -benzotriazol oder -acridin.

Das erfindungsgemäß bevorzugte Verfahren wird im allgemeinen bei einer Temperatur von ca. 40-70°C, vorzugsweise von ca. 50-60°C, insbesondere von ca. 50-55°C durchgeführt. Ferner wird die Umsetzung im allgemeinen unter saurer Katalyse beispielsweise in Gegenwart von p-Toluolsulfonsäure, Methan sulfonsäure, Tetrafluoroborsäure, Schwefelsäure, sauren Ionenaustauschern, wie z. B. saurem Amberlite® (Rohm & Haas) und/oder Lewissäuren, wie z. B. Zinkchlorid, Trimethylsilyltriflat oder Pyridiniumparatoluolsulfonat, durchgeführt. Die Reaktionszeiten betragen üblicherweise ca. 1-1,5 Stunden, vorzugsweise ca. 1,5 Stunden. In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäß bevorzugten Verfahrens kann in einem weiteren Schritt das gemäß dem obigen Verfahren erhaltene 3',4'-cyclische Acetal eines Pentopyranosyl-Nukleosids an der 2'-Position geschützt werden, Vorzugsweise wird die 2'-Position durch eine basenlabile oder metallkatalysiert abspaltbare Schutzgruppe, insbesondere durch eine Acylgruppe, vor allem durch eine Acetyl-, Benzoyl-, Nitrobenzoyl- und/oder Methoxybenzoylgruppe, nach dem Fachmann bekannten Verfahren beispielsweise mit Benzoylchlorid in einer Dimethylaminopyridin/Pyridin-Lösung bei Raumtemperatur geschützt. In einer weiteren Ausführungsform des erfin dungsgemäß bevorzugten Verfahrens kann das an der 2'-Position geschützte 3',.4'-cyclische Acetal eines Pentopyranosyl-Nukleosids deketalisiert werden. Im allgemeinen erfolgt die Deketalisierung in Gegenwart einer Säure, vorzugswei se in Gegenwart einer starken Säure, wie z. B. Trifluoressigsäure. Die Aufarbeitung des erhaltenen Reaktionsproduktes erfolgt vorzugsweise trocken-basisch, beispielsweise in Anwesenheit von festem Hydrogencarbonat, Carbonat und/oder basischem Ionenaustauscher, wie z. B. basischem Amberlite® (Rohm & Haas), Anschließend kann das aufgearbeitete Reaktionsprodukt beispiels weise über SiO₂, insbesondere über SiO₂ in Form von Kieselgel, gereinigt wer den.

In einer weiteren Ausführungsform dieses Verfahrens kann in einem weiteren Schritt auch die 4'-Position geschützt werden. Als Schutzgruppe eignet sich im allgemeinen eine säure- oder basenlabile Schutzgruppe, vorzugsweise eine Trityl-Gruppe, insbesondere eine DMT-Gruppe, und/oder eine β-eliminierbare Gruppe, insbesondere eine Fmoc-Gruppe.

Die Einführung einer Schutzgruppe erfolgt nach allgemein bekannten Verfah ren, beispielsweise durch Dimethoxytritylchlorid in Gegenwart von z. B. N- Ethyldiisopropylamin (Hünig-Base).

In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens kann in einem weiteren Schritt eine Umlagerung der Schutzgruppe von der 2'-Position zur 3'-Position erfolgen. Im allgemeinen wird die Umlagerung in Gegenwart einer Base, insbe sondere in Gegenwart von N-Ethyldiisopropylamin und/oder Triethylamin nach allgemein bekannten Verfahren, z. B. in Gegenwart einer Mischung aus N- Ethyldiisopropylamin, Isopropanol, p-Nitrophenol und Dimethylaminopyridin in Pyridin, bei erhöhter Temperatur, z. B. ca. 60°C, durchgeführt. Die erhaltenen Produkte können anschließend mittels Chromatographie über SiO₂, insbeson dere über SiO₂ in Form von Kieselgel, und/oder Kristallisation gereinigt werden. Die Ausgangsverbindung für das beschriebene Verfahren, das Pentopyranosyl- Nukleosid, läßt sich beispielsweise dadurch herstellen, daß zuerst eine geschützte Nukleobase mit einer geschützten Ribopyranose umgesetzt wird und anschließend die Schutzgruppen von dem Ribopyranosyl-Teil abgespalten werden. Das Verfahren kann beispielsweise wie bei Pitsch et al. (1993), supra, oder Pitsch et al. (1995), supra, beschrieben durchgeführt werden. Hierbei ist es zur Vermeidung weiterer Zeit- und materialaufwendiger Chromatographien vorteilhaft, nur anomerenreine geschützte Pentopyranosen, wie z. B. Tetrabenzoylpentopyranosen, vorzugsweise β-Tetrabenzoyl-ribopyranosen (R, Jeanloz, J. Am, Chem. Soc, 1948, 70, 4052), einzusetzen.

Vorteilhaft einsetzbar ist somit ein Verfahren zur Herstellung eines Ribopyrano sylnukleosids, bei dem

A) eine geschützte Nukleobase mit einer geschützten Ribopyranose umgesetzt wird,
B) die Schutzgruppen von dem Ribopyranosyl-Teil des Produktes aus Schritt (I) abgespalten werden, und
C) das Produkt aus Schritt (II) gemäß dem oben näher beschriebenen Verfah ren umgesetzt wird.

Zur Herstellung einer Pentopyranosyl-Nukleinsäure wird das erhaltenen Pento pyranosyl-Nukleosid in einem weiteren Schritt entweder für die Oligomerisie rung phosphityliert oder für die Festphasensynthese an eine feste Phase ge bunden, Die Phosphitylierung erfolgt beispielsweise durch Phosphorigsäure monoallylesterdiisopropyl-amidchlorid in Anwesenheit einer Base, z. B. N- Ethyldiisopropylamin. Die Bindung eines geschützten Pentopyranosyl- Nukleosids an eine feste Phase, z. B. "long-chain-alkylamino-controlled pore glass" (CPG, Sigma Chemie, München) kann beispielsweise wie bei Pitsch et al. (1993), supra, beschrieben erfolgen.

Vorteilhaft einsetzbar ist somit auch ein Verfahren zur Herstellung einer Pentopyranosyl-Nukleinsäure, bei dem

1. in einem ersten Schritt ein Pentopyranosyl-Nukleosid nach dem oben be schriebenen Verfahren hergestellt wird,
2. in einem zweiten Schritt das gemäß Schritt (Ia) hergestellte Pentopyrano syl-Nukleosid an eine feste Phase gebunden wird, und
3. in einem weiteren Schritt das gemäß Schritt (IIa) an eine feste Phase gebundene Pentopyranosylnukleosid um ein phosphityliertes 3'-, 4'-geschütztes Pentopyranosyl-Nukleosid verlängert wird, und
4. Schritt (IIIa) solange mit gleichen oder verschiedenen phosphitylierten 3'-, 4'-geschützten Pentopyranosyl-Nukleosiden wiederholt wird, bis die gewünsch te Pentopyranosyl-Nukleinsäure erhalten wird.

Als Kupplungsreagenz für die Verlängerung gemäß Schritt (IIIa) werden im allgemeinen saure Aktivatoren, vorzugsweise 5-(4-Nitrophenyl)-1H-tetrazol, insbesondere Benzimidazoliumtriflat eingesetzt, da bei Benzimidazoliumtriflat im Gegensatz zu 5-(4-Nitrophenyl)-1H-tetrazol als Kupplungsreagenz keine Verstopfung der Kupplungsreagenz-Leitungen und keine Verunreinigung des Produktes erfolgt.

Weiterhin ist es vorteilhaft durch Zusatz von einem Salz, wie Natriumchlorid, zur schutzgruppenabspaltenden Hydrazinolyse die Nukleobasen, insbesondere Pyrimidinbasen, vor allem Uracil und Thymin, vor einer Ringöffnung zu schüt zen, die das Oligonukleotid zerstören würde. Allyloxygruppen können vorzugs weise durch Palladium [Pd(O)]-Komplexe z. B. vor der Hydrazinolyse ab gespalten werden.

Die Abspaltung der gebildeten Nukleinsäure von der festen Phase erfolgt im allgemeinen ebenso durch Hydrazinolyse. Daher können in einem weiteren Schritt (Va) die Schutzgruppen und die gebildete Pentopyranosyl-Nukleinsäure von der festen Phase abgespalten werden.

Im allgemeinen werden die Pentopyranosyl-Nukleinsäuren chromatographisch beispielsweise über alkylsilyliertes Kieselgel, vorzugsweise über RP-C₁₈- Kieselgel, gereinigt.

Vorzugsweise ist der der Pyranosyl-Teil der Pyranosyl-Nukleinsäure(n) in dem erfindungsgemäßen Beschichtungssystem D- oder L-konfiguriert.

Die Länge der Pyranosyl-Nukleinsäure(n) in dem erfindungsgemäßen Be schichtungssystem kann in dem Fachmann bekannter Weise variiert werden, je nach Stärke der gewünschten Adhäsionsverbindung. In der Regel weisen die Pyranosyl-Nukleinsäure(n) eine Länge von etwa 5 bis etwa 500, vorzugsweise von etwa 5 bis etwa 100, insbesondere von etwa 5 bis etwa 50, besonders bevorzugt etwa 5 bis etwa 25, ganz besonders bevorzugt etwa 5 bis 10 Mono mereinheiten auf.

Der Pyranosyl-Teil der Pyranosyl-Nukleinsäure(n) kann in dem erfindungsge mäßen Beschichtungssystem in Form eines Thiophosphates, alkylierten Phos phates, Phosphonates und/oder Amids vorliegen.

Das erfindungsgemäße Beschichtungssystem enthält insbesondere Nuklein säure(n) mit Adenosin, Guanosin, Isoguanosin, Cytosin, Isocytosin, Tymidin, Uracil, 2,6-Diaminopurin und/oder Xanthin als Nukleobasen.

Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Beschichtungssystem angewendet, indem man die Oberflächen, zwischen denen eine Adhäsionsverbindung, ins besondere eine elektrisch leitende Adhäsionsverbindung, ausgebildet werden soll, mit jeweils nur einem der beiden Beschichtungsmittel A oder B beschichtet und den beschichteten Oberflächen dann ermöglicht, miteinander in Kontakt zu treten und durch die obenbeschriebenen nicht-kovalenten Wechselwirkungen die gewünschte Verbindung zwischen mit A und mit B beschichteten Oberflä chen auszubilden.

Vorteilhafterweise ermöglicht das hier bereitgestellte Beschichtungssystem insbesondere im wäßrigen Milieu ein "auto-targeting" der zu verbindenden Oberflächen, was insbesondere für Anwendungen im industriellen Maßstab von Interesse ist.

Nach Ausbildung der Adhäsionsverbindung können die Bindungspartner auch dauerhaft verknüpft, d. h. fixiert werden. Bevorzugt ist eine chemische Fixie rung, beispielsweise eine kovalente Vernetzung, wie Metathese, Heckkupplung, Michael-Addition von Thiolen und/oder oxidative Bildung von Disulfidbrücken.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Beschichtungsmit tel, das p-NA enthält, zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen Beschich tungssystem.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Ausbildung von Adhäsionsverbindungen, insbesondere von elektrisch leitenden Adhäsionsverbindungen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

a) die Oberflächen der zu verbindenden Teile aktiviert,
b) auf die zu verbindenden Oberflächen Oligo- oder Polymere auf bringt, die befähigt sind, miteinander nicht-kovalente Bindungen auszubilden, wobei zumindest einer der Bindungspartner eine Pyranosyl-Nukleinsäure ist,
c) die Oligo- oder Polymere auf den Oberflächen immobilisiert,
d) den Oberflächen der beschichteten Teile ermöglicht, miteinander in Berührung zu kommen und die gewünschten nicht-kovalenten Bindungen auszubilden und
e) gegebenenfalls die verbundenen Teile von den nicht verbundenen trennt.

Die Aktivierung in Schritt a) erfolgt vorzugsweise durch photolithographische oder chemische Verfahren.

Die in Schritt a) zu aktivierende Oberfläche besteht vorzugsweise im wesentli chen aus Keramik, Metall, insbesondere Edelmetall wie Gold, Silber oder Platin, Glas, Kunststoffen, kristallinen Materialien oder besonders bevorzugt aus Quartz oder anderen Siliziumverbindungen.

Besonders bevorzugt setzt man in Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfah rens ein erfindungsgemäßes Beschichtungssystem ein.

Die Immobilisierung in Schritt c) erfolgt nach dem Fachmann aus der "DNA- Chip-Technologie" bekannten Verfahren; im allgemeinen kovalent, quasi- kovalent, supramolekular oder physikalisch, wie magnetisch (Shepard, AR (1997) Nucleic Acids Res, 25, 3183-3185, Nr 15), im elektrischen Feld oder durch ein Molekularsieb. Beispielsweise können die Oligo- oder Polymere ent weder direkt auf den zu verbindenden Oberflächen synthetisiert oder an be stimmte Positionen der Oberfläche "gelinkt" werden. Beispiele hierfür sind Konjugations- und Immobilisierungsverfahren über Perjodatoxidation und reduktiver Aminierung der Schiffbase, N-Hydroxysuccinimidester von vorzugsweise Dicar bonsäurelinker, Ethylendiaminphosphoamidatlinker, Mercapto-, Jodacetyl- oder Maleinimido-Verfahren und/oder kovalente oder nicht-kovalente Biotin-Linker- Verfahren.

Die Trennung der verbundenen Teile von den nicht verbundenen Teilen erfolgt in zweckmäßiger Weise; am einfachsten, indem die nicht verbundenen Teile nach Ausbildung der gewünschten Adhäsionsverbindung physikalisch abge trennt werden, beispielsweise durch Waschen oder bei kleineren Teilen durch Sedimentantion oder Filtration.

Hinsichtlich der Herstellung und der Eigenschaften der in dem erfindungsge mäßen Verfahren einsetzbaren Oligo- oder Polymere wird auf die obige Darstel lung des erfindungsgemäßen Beschichtungssystems verwiesen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Adhäsionsverbin dung, vorzugsweise eine elektrisch leitende Adhäsionsverbindung, erhältlich durch das erfindungsgemäße Verfahren und/oder durch Verwendung eines erfindungsgemäßen Beschichtungssystems.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen Beschichtungssystems oder einer erfindungsgemäßen Adhäsionsverbindung in der Mikroelektronik, insbesondere als Platinenkleber, als elektronisches Bauteil, Halbleiter oder lichtchemische Einheit.

BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1 zeigt einen Ausschnitt aus der Struktur von RNA in ihrer natürlich vor kommenden Form (links) und in Form einer p-NA (rechts).

ABKÜRZUNGEN

THF bedeutet Tetrahydrofuran
DMT bedeutet Dimethoxytrityl
CPG bedeutet "controlled pore glass".

Claims

1. Beschichtungssystem auf der Basis von Pyranosyl-Nukleinsäuren (p-NA) zur Ausbildung von Adhäsionsverbindungen, dadurch gekennzeichnet,
daß es mindestens zwei Beschichtungsmittel A und B umfaßt,
wobei das Beschichtungsmittel A eine Pyranosyl-Nukleinsäure enthält, und das Beschichtungsmittel B ein weiteres Oligo- oder Polymer enthält, das geeignet ist, mit der Pyranosyl-Nukleinsäure in dem Beschichtungsmittel A nicht- kovalente Bindungen einzugehen und
daß die Pyranosyl-Nukleinsäure aus einem Pyranosephosphat-Rückgrat und daran gebundenen Purin- oder Pyrimidinbasen besteht.

2. Beschichtungssystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Adhäsionsverbindungen elektrisch leitend sind.

3. Beschichtungssystem nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligo- oder Polymer in dem Beschichtungsmittel B eine Pyranosyl- Nukleinsäure ist.

4. Beschichtungssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Pyranosyl-Nukleinsäure eine Pentopyranosyl- Nukleinsäure, insbesondere eine Ribo-, Arabino-, Lyxo- und/oder Xylo pyranosyl-Nukleinsäure, vorzugsweise eine Ribopyranosyl-Nukleinsäure ist.

5. Beschichtungssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Pyranosyl-Teil der Pyranosyl-Nukleinsäure D- oder L- konfiguriert ist.

6. Beschichtungssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Pyranosyl-Nukleinsäure eine Länge von etwa 5 bis etwa 500, vorzugsweise von etwa 5 bis etwa 100, insbesondere von etwa 5 bis etwa 50, besonders bevorzugt von etwa 5 bis etwa 25, ganz besonders bevorzugt von etwa 5 bis etwa 10 Monomereinheiten aufweist.

7. Beschichtungssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch ge kennzeichnet, daß der Pyranosyl-Teil der Pyranosyl-Nukleinsäure in Form eines Thiophosphates, alkylierten Phosphates, Phosphonates und/oder Amids vor liegt.

8. Beschichtungssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch ge kennzeichnet, daß die Nukleinsäure als Nukleobase Adenosin, Guanosin, Iso guanosin, Cytosin, Isocytosin, Tymidin, Uracil, 2,6-Diaminopurin und/oder Xan thin enthält.

9. Beschichtungsmittel, enthaltend Pyranosyl-Nukleinsäure, zur Verwen dung in einem Beschichtungssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 8.

10. Verfahren zur Ausbildung von Adhäsionsverbindungen, insbesondere von elektrisch leitenden Adhäsionsverbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) die Oberflächen der zu verbindenden Teile aktiviert,
b) auf die zu verbindenden Oberflächen Oligo- oder Polymere auf bringt, die befähigt sind, miteinander nicht-kovalente Bindungen auszubilden, wobei zumindest einer der Bindungspartner eine Pyranosyl-Nukleinsäure ist,
c) die Oligo- oder Polymere auf den Oberflächen immobilisiert,
d) den Oberflächen der beschichteten Teile ermöglicht, miteinander in Berührung zu kommen und die gewünschten nicht-kovalenten Bindungen auszubilden und
e) gegebenenfalls die verbundenen Teile von den nicht verbundenen

trennt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivie rung in Schritt a) durch photolithographische oder chemische Verfahren erfolgt.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß die in Schritt a) zu aktivierenden Oberflächen im wesentlichen aus Keramik; Metall, insbesondere Edelmetall wie Gold, Silber oder Platin; Glas; Kunststoffen; kri stallinen Materialien oder besonders bevorzugt aus Quartz oder anderen Silizi umverbindungen bestehen.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeich net, daß man in Schritt b) ein Beschichtungssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 8, vorzugsweise ein Beschichtungssystem nach einem der Ansprüche 2 bis 8, besonders bevorzugt ein Beschichtungssystem nach einem der Ansprü che 3 bis 8 einsetzt.

14. Adhäsionsverbindung, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13 und/oder durch Verwendung eines Beschichtungssystems nach einem der Ansprüche 1 bis 8.

15. Elektrisch leitende Adhäsionsverbindung, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13 und/oder durch Verwendung eines Be schichtungssystems nach einem der Ansprüche 2 bis 8.

16. Verwendung eines Beschichtungssystems nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder einer Adhäsionsverbindung nach Anspruch 14 oder 15 in der Mikro elektronik, insbesondere als Platinenkleber, als elektronisches Bauteil, Halblei ter oder lichtchemische Einheit.